Luis Fernando Sosa Tordoya

Carrera de Bioquímica

Instituto SELADIS-FCFB-UMSA

fersosat@yahoo.es

lfsosa@umsa.bo

La Paz – Bolivia

2013

AVANCES EN LOS PROCESOS DE REPROGRAMACION CELULAR A PARTIR DE

CELULAS DIFERENCIADAS

En el 2006 Kazutoshi Takahashi y Shinia Yamanaka dieron a conocer que las células madre pluripotentes podían ser inducidas a partir de células diferenciadas.

“Somatic cells can be reprogrammed into the embryonic state, 1962”

Shinya Yamanaka

Kazutoshi Takahashi

Jhon Gurdon

Ph.D. in pharmacology

Center for iPS Cell Research and Application (CiRA)

Hallazgos trascendentales que condujeron al desarrollo de las IPCS

La reprogramación celular a un estado similar a de células madres embriónicas fue conseguida gracias uso de 4 /24 factores de transcripción: OKSM (Oct3/4, Klf4, Sox2 y cMyc).

EL ACTO MAGICO DE GENERAR CELULAS MADRE PRURIPOTENTES INDUCIDAS: Muchos conejos en el sombrero

Las células madres embriónicas (ESC) tienen la capacidad de crecer indefinidamente mientras mantienen su pluripotencia (se diferencian en las tres líneas germinales endodermo, mesodermo y ectodermo) para formar todos los tipos celulares.

EpidermisEpitelio. Cartílago Músculo Tejido Neural

ESC

Hasta antes del descubrimiento de las iPCS se podían obtener células madre embriónicas a partir de animales de experimentación, a partir de embriones humanos.

Impedimento ética, En el 2001, el Pdte. George Bush y al Papa Juan Pablo II establecieron claramente que la destrucción de embriones

con propósito de generar líneas celulares de ESC viola los principios bioéticos

Paciente

Células Neurales

Células B

Células cardiacas

Hepatocitos

Terapia celular

Modelos de enfermedades para estudios de drogas

Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28

Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc

Neurona motora muerta

Neurona motora degenerada

Atrofia Muscular

Enfermedad de las Neuronas Motoras

No hay tratamiento efectivo, porque no existe un buen modelo para estudiar la enfermedad

Enfermedad de las Neuronas Motoras

Potencial de las iPSC

Tomar tejido somático del

paciente Crear línea somática del

paciente

Guardar muestra del

paciente

Introducción de factores de

reprogramaciónExpansión y

caracterización

Tomar tejido somático del

paciente

Diferenciación in vitro del tipo celular deseado

Modificación genética

Neuronas

Miocitos Cel. Hematopoyéticas

Hepatocitos

Adipocitos

Cel. Endoteliales

iPSC del paciente modelo específico

(seguro)

Las iPSC que llegaron a producir eran fenotípicamente indistinguibles de las ESC.

ES=Embrionic Stem Cell, NTERA-2=Human Fibroblast, HDF=Human Dermal Fibroblast.

Cel. Somáticas

pMX-PlatE/Flugene

Cel. SomáticasOct3/4, Klf-4,

Sox2,c-Myc

10 iPSC1x104 HDF La relación

puede variar

20%40%

iPSC iPSC

Otros retrovirus?

Riesgo tumoral

20 sitios de reintegración viral

Cel. Somáticas

Retrovirus?

Expresión de un gen de resistencia a droga como marcador de pluripotencia.

Modificación genética de la célula huésped

Problemas sustanciales que implica el uso de retrovirus:

Cel. Somáticas

Retrovirus?

Requiere la integración viral de transgenes (C-Myc) en el genoma

Problemas sustanciales que implica el uso de retrovirus:

transducen en células humanas mas eficientemente que los retrovirus.

?

SendaiLentivirus Adenovirus

transducen en células que no se dividen

tum

ores

Cel. Somáticas

Retrovirus?

Requiere la integración viral de transgenes en el genoma

Problemas sustanciales que implica el uso de retrovirus:

?

SendaiLentivirus Adenovirus

Infectan naturalmente a hepatocitos

Menos sitios de integración en fibroblastos que retrovirus.

Cel. Somáticas

Retrovirus?

Requiere la integración viral de transgenes en el genoma

Problemas sustanciales que implica el uso de retrovirus:

?

SendaiLentivirus Adenovirus

No patogénico en humanos

Alta eficiencia de reprogramación.

(no integrante)

Cel. Somáticas

Retrovirus?

Modificación genética de la célula huésped

Requiere la integración viral de transgenes en el genoma

Reactivación de c-Myc en iPSC predispone a la formación de tumores.

n-Myc una alternativa ?

Problemas sustanciales que implica el uso de retrovirus:

Con Lentivirus, las iPSC fueron similares a las ESC en cuanto a morfología, expresión de marcadores de superficie estatus de metilación en la región promotora de los genes asociados a pluripotencia e inducción de teratomas.

fluorescent protein

puromycin

Reportero Nanog

Con adenovirus se evidenció que las iPSC no expresaban transgenes de integración de los adenovirus

El virus Sendai (virus RNA(-) sirve especialmente para reprogramar LT en casos de inmunodeficiencias debidas a este tipo celular, o para el desarrollo de marcadores genéticos para futuras aplicaciones en medicina regenerativa.

Bryce Carey reportó el uso de vectores policistrónicos para reprogramar células somáticas humanas.

Demostró que se podía generar células madre paciente-específicas superando los problemas éticos y prácticos que se presentan al momento.

El apthovirus “virus de la enfermedad de pies y boca – FMDV” son vectores policistrónicos que permiten integrar información en los ribosomas. Las secuencias 2A tienen afinidad por el sitio IRES en los ribosomas.

Reportaron que una simple copia viral es suficiente para reprogramar ya sea células somáticas adultas o embrónicas de ratón. Además demostraron que el sistema podía funcionar en células humanas.

Luego, se demostró de los poli 2A afectan la producción de muchas proteinas (desventaja).

El uso de virus y plásmidos para reprogramar células en los experimentos hasta aquí presentados tienen una eficiencia que varía del 0,0001 al 0,5%)

En general se observó que el uso de vectores policitstrónicos reprogramaba las células de tal manera que eran mucho más similares a las ESC.

Un gran hallazgo en la reprogramación celular fue el uso de los transposones como piggyBac.

Los trasnposones eliminaban la necesidad de instalaciones especializadas de contención biológica o la producción de stocks de altos títulos de virus con potencial patogénico.

Los trasnposones ofrecen una baja eficiencia en la reprogramación y también implica una potencial toxicidad genómica.

Otros vectores no integradores estudiados son los episomas (autoreplicables) y vectores minicírculos.

El uso de miRNA que codifique OKSM han mostrado tener alta eficiencia en la reprogramación con efectos adversos mínimos.

Al usar RNA se previene el uso de DNA o cDNA

Se dosifican de mejor manera los constituyentes del coctel obteniendo una mejor tasa de reprogramación.

Yang Zhao, de 10000 moléculas analizadas encontró un coctel que favorece la reprogramación

“son moléculas permeables, no inmunogénicas, son costo efectivas, fácilmente sintetizables preservadas y estandarizadas. Activan proteinas especificas y pueden ser modulables en su concentración”

100% de viabilidad de las CiPSC a los 6 meses, rendimiento mayor al 0,2%. Los ratones transgénicos vivieron y ya tiene sus crías.

PRIMER ENSAYO CLÍNICO CON iPSC

A tu Memoria