INDUCTION OF G2/M ARREST BY FR42 ISOLATED FROM Mitracarpus

Baturitensis Sucre (RUBIACEAE) IN SF-295 CELLS.

  MSc. Igor da Silva Bomfim

Orientadora: Prof. Drª Cláudia do Ó Pessoa

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁCENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

FACULDADE DE MEDICINAPÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

Fortaleza/CE2014

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ - UFCPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

FACULDADE DE MEDICINALABORATÓRIO DE ONCOLOGIA EXPERIMENTAL

História

Esqueletos de pessoas antiga Grécia, Egito e Chile – tumores malignos;

Diagnóstico câncer retal em uma múmia egípcia (DAVID & ZIMMERMAN,

2010)

Câncer (Grego - caranguejo)◦Hipócrates – Grécia Antiga

Conjunto de doenças ◦Crescimento desordenado◦Poder invasivo

http://www.ciclodavida.com.br

http://www.thedailygreen.com

(BROWN & ATTARDI, 2005)

Câncer

Fonte: OMS 2008

Em 2008:

7,6 milhões de mortes (13 % do total) no mundo70 % ocorreram em países de baixa ou média renda

Até 2020:Cerca de 15 milhões de novos casos60 % em países em desenvolvimento

• 2ª causa de morte no mundo → Problema de saúde pública

Brasil – 518.510 novos casos (estimativa do INCA para 2012 e 2013)

Brasil

Fonte: INCA 2011

Câncer

“ Doença complexa caracterizada pela instabilidade genética de células que tem a capacidade de se multiplicar descontroladamente.”

ATIVAÇÃODE

ONCOGENES

SILENCIAMENTO DE GENES

SUPRESSORES DE TUMOR

PROGRAMAS CELULARES:

PROLIFERAÇÃOMIGRAÇÃO

DIFERENCIAÇÃOAPOPTOSE

ALTERAÇÃO

(HAHN & WEINBERG, 2002; LUO et al., 2009)

Agentes Citotóxicos Dano ao

DNA

DNA reparadoMecanismos de mortefuncionantes

Falha mecanismos de reparo e na maquinaria apoptótica

Dano ao DNA – mutação

Reparação de céls.com menor intensidadeproliferativa

Céls. transformadas

Expanção clonal – câncer

Adaptado de ALLAN & TRAVIS, 2005

Carcinogênese

TIPOS DE MORTE CELULAR

Catástrofe Mitótica

Necrose

LC3

LC3

AutofagiaApoptose

PS

PS PS

PS P

S

PS

NECROSE

Célula normal

Alterações mitocondriais

VacuolizaçãoInchaço

Perda da integridade de membranaExtravasamento de mediadores inflamatóriosDesintegração de organelas

APOPTOSE

Célula normal

Diminuição do volume celularCondensação da cromatina

Formação de BlebsFragmentação internucleossomal do DNA

Formação dos corpos apoptóticos

Lise dos corpos apoptóticos

http://www.tendenciasemercado.com.br/

Ações Importantes:

Promoção da saúde;Detecção precoce;Assistência aos pacientes;Vigilância;Formação de recursos humanos;Comunicação e mobilização social;Na pesquisa e gestão do SUS;Desenvolvimento de tratamento mais eficazes.

Terapias Anticâncer

Cirurgia

Radiação Ionizante

Imunoterapia

Terapia Dirigida

Quimioterapia

Remoção da massa tumoral

Mata rapidamente células tumorais em divisão,

incluindo células tumorais nos tecidos adjacentes

Terapia que se utiliza do sistema imunepara combater o câncer

Inibe especificamente os processos necessários para crescimento da célula

tumoral

Mata rapidamente células em divisão (tumorais e sadias)

KUMAR et al., 2004

QuimioterapiaDefinição:

◦Consiste em um tratamento a base de fármacos que interferem em diferentes processos tais como: desenvolvimento, crescimento, disseminação e invasão de células cancerígenas (Souza et al., 2007).

Objetivo primário:◦Destruir células neoplásicas preservando

células normais.

Síntese QuímicaProdutos Naturais

MicroorganismosOrganismos Marinhos

Plantas

Papaver somniferum

Cryptotethya crypta

Penicillium notatum

PRODUTOS NATURAIS COM ATIVIDADE ANTICÂNCER

Drogas Anti-câncer Originadas de PlantasDerivados da Vinca

Vimblastina Vincristina Vindesina

Taxanos Paclitaxel Docetaxel

Camptotecinas Topotecano Irinotecano

Podofilotoxinas Etoposídeo Tenoposídeo

Camptotheca accuminata

Vinca rosea

Taxus brevifolia

Produtos Naturais x DerivadosContudo há necessidade do

desenvolvimento de novas drogas que reduzam os efeitos adversos do tratamento;

O trabalho da química medicinal tem propiciado o surgimento de novos compostos, os quais tem levado a novos protótipos de drogas;

(MARKMAN, 1998)

Produtos Naturais x Derivados

Número de drogasDerivados de prod. nat.Produtos naturais

Nº

de D

rogas

Apro

vadas

nos

EU

A a

té 2

007

anosAdaptado de LI & VEDERAS, 2010

Problemática da Quimioterapia

Esquemas terapêuticos falhos;Altos índices de recidivas;Redução da sobrevida de

pacientes;Efeitos adversos;Resistência

◦Inerente ◦Adquirida

http://www.mountnittany.org/wellness-library/healthsheets/documents?ID=4834

Mitracarpus Baturitensis Sucre (Rubiaceae)Utilizadas para tratamento:HanseníaseCefaléiaDor de denteDoenças venéreasDispepsia

OBTENÇÃO DA MOLÉCULA FR42

benzoisoquinolina-5,10-diona (FR42)

•Parte aérea seca (temp. Ambiente)•Triturada e submetida a extração exaustiva com hexano à frio seguida de EtOH.•Soluções obtidas foram destiladas sob pressão reduzida.•Resultando: Extratos hexânicos e EtOH em gel de sílica

QuinonasDefinição: Compostos oxigenados, formados a partir da oxidação de fenóis. Sua principal característica é a presença de 2 grupos carbonílicos formando um sistema conjugado.

Ampla e variada família de metabólitos de distribuição natural;

Amplo espectro de atividades biológicas:

Microbicida

Tripanossomicidas

Viruscidas

Antitumorais

naftoquinona antraquinonabenzoquinona

QUINONAS UTILIZADAS NA TERAPIA DO CÂNCER

MECANISMO DE AÇÃO DAS QUINONAS

Inibição de Topoisomerase

Geração de espécies reativas de oxigênio

ObjetivosGeral:

Estudar o potencial citotóxico em células cancerígenas e os prováveis mecanismos de ação da FR42 (benzoisoquinolina), isolada do Mitracarpus baturitensis, em ensaios in vitro.

Objetivos

Epecíficos:Determinar a IC50 da FR42 em um painel de

linhagens celulares cancerígenas: através do ensaio de MTT. Além de células normais CMSP através do ensaio Alamar Blue.

Definir a citotoxicidade da FR42 sobre as células SF-295, através do ensaio de citotoxicidade em tempo real (XCELLligence)

Avaliar o provável mecanismo de ação da FR42 através de citometria de fluxo (integridade de membrana, fragmentação de DNA, despolarização mitocondrial) a partir de células SF-295 (glioblastoma humano) tratadas com a benzoisoquinolina.

METODOLOGIARESULTADOS

DISCUSSÃO

Manutenção das Linhagens Celulares

Cultura de células

• Meio de cultura RPMI 1640;•10 ou 20% de soro fetal bovino;• 1% de antibióticos (penicilina/estreptomicina);• 3% de fitohemaglutinina (linfócitos).

10mL

37°C / 5% de CO2

Contagem/Observação

Repique em meio de cultura novo

Ensaio de Citotoxicidade em Células Tumorais e Não Tumorais – Teste MTT

Contagem

0,039 a 5µg/mL

Cultura de células

Células plaqueadas e drogas diluídasusando o HTS (High throughput screening)

72 h3 h

MTT

Absorbância em 595nm

Formasan

Formazan

Redu

ção

Citoplasma

meio extra-celularBerridge & Tan, 1993

Doadores de e-

MTT

NADH

NADPH+

Succinato

TESTE DE CITOTOXICIDADE EM CMSPENSAIO DO ALAMAR BLUE

Forma oxidada Forma reduzida

Princípio: Baseia-se na redução do alamar blue ou resazurina (azul e não fluorescente) por células viáveis à resorufina (róseo e altamente fluorescente), mensurando indiretamente a proliferação celular.

Linhagens FR42 μM DOX

Tumorais

SF-2952,0 (1,70 -2,45)

0,41 (0,34 – 046)

0,01-0,02

HCT-1162,10 (1,72 – 2,48) 0,21 (0,15 – 0,29)

OVCAR - 84,39 (3,53 – 5,40) 0,45 (0,29 – 0,52)

HL-60 2,20 (1,90 – 2,77)0,02 (0,02 – 0,03)

Normais

CMSPH 16,82 (12,18 – 23,27) 1,78 (0,52 – 1,80)

Ensaio de Citotoxicidade – MTT e Alamar Blue (CMSPH) – 72h

Ensaio de citotoxidade em tempo real (xCELLigence).

Ensaio de citotoxidade em tempo real (xCELLigence).

C-

ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO

CITOMETRIA DE FLUXO

CITOMETRIA DE FLUXO

FR42

48 h

Diluição comCorante desejado

Células SF-295

CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS

Princípio: Baseia-se na capacidade de o iodeto de propídeo penetrar as células cuja membrana esteja rompida e ligar-se ao DNA nuclear, emitindo alta fluorescência vermelha.

Viáveis Não Viáveis

Iodeto de propídeonão ligado

Iodeto de propídeo ligado

CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS

CICLO CELULAR E FRAGMENTAÇÃO DO DNADETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE DNA

Princípio: Esse teste baseia-se na capacidade do iodeto de propídeo se ligar ao DNA. Assim, pode-se determinar as diferentes fases do ciclo celular, baseando-se pelo conteúdo de DNA.

G1

G2/M DNA Fragmentado

S

Quantidade de DNApor núcleo

Mitose

Interfase

G1 G2S

4n

2n

FRAGMENTAÇÃO INTERNUCLEOSSOMAL DE DNA

CICLO CELULAR

Princípio: Seqüestro da rodamina 123, um corante fluorescente nucleofílico, para dentro da mitocôndria quando esta apresenta seu potencial transmembrânico inalterado, emitindo, assim, alta fluorescência.

Despolarizadas

Polarizadas

POTENCIAL TRANSMEMBRÂNICO DA MITOCÔNDRIA

POTENCIAL TRANSMEMBRÂNICO DA MITOCÔNDRIA

Microscopia ConfocalSF-295

20.000 céls/poço

24h

Aspirar o meio e resuspender com 200 uL de

meio novo

Tratar com os

compostos testes

24h

Adicionar 4 uL da Anexina

V/AlexaFluor568

15 min – temp. ambiente

Lavar com PBSResuspende

com 200 uL de meio novo

Hoechst – 10 min

Externalização da fosfatidilserina – Anexina V/Alexa Fluor 564

A B

C D A

B

C

D

Cont. Negativo (DMSO)

Doxorrubicina 0,3 uM

Droga 4 uM

Droga 8 uM

Escala: 50 UM

Vermelho: Anexina V/AlexaFluor 568

Azul: Núcleo/Hoechst33342

CONCLUSÃO

OBRIGADO!