INFORME DE LABORATORIO ACTIVIDAD DE ENZIMAS PROTEOLITICAS

ABSTRACT

Papain is an enzyme extracted from papaya proteolytic capable of digesting food protein. Its applications are in different areas. Today it is used in the food industry as a meat tenderizer and in the clarification of beer and other beverages.

INTRODUCCIÓN

Las plantas son una fuente tradicional de un gran número de enzimas para distintos usos a nivel mundial, como son principalmente, proteasas, amilasas, lipasas, etc. La Carica papaya es un vegetal totalmente adaptado a nuestra zona, su rápido crecimiento y la cantidad de aplicaciones posibles que tienen los productos obtenidos del mismo promueven un estudio detallado de los compuestos exudados presentes en el mismo. El aprovechamiento completo tanto de los frutos frescos, en la elaboración de dulces regionales y la extracción del látex exudado podrían originar un beneficio integral de dicho fruto.

Las proteasas se refieren a un grupo de enzimas que tienen como función catalítica hidrolizar enlaces peptídicos de proteínas. Cada tipo de proteasa tiene la capacidad de hidrolizar una clase específica de enlaces peptídicos. En este caso la papína de 343 residuos, es una proteína que pertenece al grupo de las cistein - proteasas (es decir las proteasas en cuyo sitio catalítico encontramos una cisteína), su peso molecular es de 33 KDa [3] y su precursor de 38.9 KDa. Para que la enzima sea activa es necesario hidrolizar su precursor en un sitio determinado en este caso entre los residuos 19 y 133. Esta enzima es requerida en áreas como la farmacéutica y la cosmética, donde se utiliza en la fabricación de cremas des manchadoras de la piel, que consumen aproximadamente un 10% de la producción mundial. Por otra parte, la papaína es uno de los componentes utilizados por laboratorios oftalmológicos para fabricar tabletas enzimáticas para la limpieza de lentes de contacto. Paralelamente, se comienzan a descubrir otras aplicaciones de la papaína en negocios como la industria textil para macerar las fibras de lana y algodón, papelera, curtido de cuero, así como en procesos de depuración de residuos líquidos y en investigación de química analítica.

También forma parte de suplementos dietarios, debido a su capacidad de favorecer el proceso digestivo, y de procesos de depuración de aguas.

OBJETIVOS

* Reconocer la actividad de las enzimas proteolíticas mediante la prueba de coagulación.* Distinguir algunos factores que afectan la actividad de acción enzimática.* Comprender los mecanismos de acción enzimática.* conocer en ejemplos prácticos las funciones enzimáticas.

JUSTIFICACION

Las enzimas son moléculas proteicas que catalizan reacciones químicas, siempre que sean termodinámicamente posible: una enzima hace que una reacción química que es energéticamente posible, pero que transcurre a una velocidad muy baja, sea cinéticamente favorable, es decir, transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima. En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en moléculas diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en las células necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimáticas.

Como todos los catalizadores, las enzimas funcionan disminuyendo la energía de activación de una reacción, de forma que se acelera sustancialmente la tasa de reacción, de forma que se acelera sustancialmente la tasa de reacción. Las enzimas no alteran el balance energético de las reacciones en que intervienen, ni modifican, por lo tanto, el equilibrio de la reacción pero consiguen acelerar el proceso incluso millones de veces. Una reacción que se produce bajo el control de una enzima o de un catalizador en general, alcanza el equilibrio mucho más deprisa que la correspondiente reacción no catalizada.

MATERIALES Y REACTIVOS

1 Gradilla 12 Tubos de ensayo 1 Pipeta graduada de 1m 1 Pipeta graduada de 5ml 1 Mortero con mango 1 pinza para tubo de ensayo 1 Embudo 1 Pipeteador

1 Erlenmeyer de 250 ml Balanza Incubadora Agua destilada Bicloruro de mercurio (HgCl2)

0.05M Cisteina (C3H7NO2S) 0.2 M EDTA 0.2M Peróxido de hidrogeno al 1%

DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD DE ENZIMAS PROTEOLÍTICAS.Al presente existen varios métodos para la determinación de proteasas (papaína). Cada uno tiene características ventajosas y desventajosas frente a losotros y se usan de acuerdo a los requerimientos particulares de la determinación.Método de Balls y Hoover (66), conocido como el método de coagulación de la leche, es, sin duda, uno de los métodos mas expeditos para determinar actividad enzimática de una proteinasa. Se toma como indice de actividad proteolítica, el tiempo necesario para que una cantidad conocida de enzima coagule un determinado volumen de solución de leche. La actividad se expresa en términos de unidades de leche coagulada por g de preparado enzimático. La unidad de leche coagulada se la define coma la cantidad en peso de un preparado enzimático necesario para coagular 5 ml de solución de leche estándar por minuto, cuando la temperatura es de 40°C y el pH 6. La principal desventaja de este método radica en el hecho de no medir la proteolisis total, es decir, la hidrólisis de un substrato de proteína, pero, por el contrario, mide la actividad de la coagulación de la leche. Afortunadamente, sin embargo, la coagulación de la leche parece ser una propiedad característica de los componentes proteolíticos de este grupo de enzimas y puede ser usada con seguridad en la medición proteolítica.

DESCRIPCION Y PROCEDMIENTO DE LA PRÁCTICA

PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN ENZIMÁTICA

Macerar 50 g de papaya en un mortero sin adicionar agua

Filtrar a través de una doble capa de gasa recogiendo el filtrado en un Erlenmeyer.

Rotular el filtrado como solución enzimática.

EFECTO DE SUSTACIAS QUÍMICAS SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA PAPAINA

REACTIVOS (ml) 1 2 3 4 5 6solucion enzimatica 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5agua destilada 0.1 0.1 - - - -peroxido de hidrogeno 1% - - - - 0.1 0.1bicloruro de mercurio 0.05 M - - 0.1 0.1 - - MEZCLAR, DEJAR EN REPOSO POR 15 MINUTOS Y ADICIONARagua destilada 0.4 _ 0.4 _ 0.4 _EDTA 0.2 M _ 0.2 _ 0.2 _ _Cisteina 0.2 M _ 0.2 _ 0.2 _ _

En un tubo de ensayo adicionar 0.5 ml de solución enzimática, adicionar 2.5 ml de leche en los tubos 1, 2, 3, 4 y 5. En el tubo 6 se adiciona 2.9 ml de leche. Mezclar e incubar a 50 grados C

Observar la formación del coagulo

En esta práctica, se adicionaron todos los reactivos sin dejar en

reposo 15 minutos ciertos reactivos previamente mencionados en la tabla.

La actividad enzimática está regulada principalmente por los siguientes factores: concentración de la enzima, concentración del sustrato, temperatura y pH del medio.

Debido a la amplia especificidad de la papaína y su gran estabilidad se emplea en la industria de los alimentos, en la producción de concentrados, en medicina para controlar problemas digestivos y en la industria para el tratamiento de textiles y cueros.

La capacidad de la leche se fundamenta en que normalmente la caseína de la leche se encuentra en forma de micelas y la digestión con una proteasa separa un glicopéptido de la molécula de caseína desestabilizando la micela y causando coagulación.

La papaína en su estado natural presenta una baja actividad enzimática debido a la presencia en este estado de enlaces azufre – azufre (S-S) en el sitio activo de la molécula. Para que la enzima obtenga su capacidad catalítica es necesario transformarlos enlaces S-S a enlaces sulfhídricos libres (S-H). La activación de la enzima se puede lograr adicionando agentes reductores moderados como la cisteína, sulfuros, sulfitos y cianuros. Además de la adición de agentes reductores también se utiliza un agente quelante como el EDTA el cual elimina la presencia de iones divalentes como Cd, Zn, Fe, Cu, Hg y Pb los cuales catalizan la formación de enlaces azufre – azufre (S-S).

CUESTIONARIO

1. Zimógeno

Un zimógeno o proenzima es un precursor enzimático inactivo, es decir, no

cataliza ninguna reacción como hacen las enzimas. Para activarse, necesita de un

cambio bioquímico en su estructura que le lleve a conformar un centro activo

donde pueda realizar la catálisis. En ese momento, el zimógeno pasa a ser una

enzima activa. El cambio bioquímico suele ocurrir en un lisosoma, donde una parte

específica de la enzima precursora se escinde del resto para activarla. La cadena

de aminoácidos que se libera por la activación se llama péptido de activación.

Función

Los zimógenos son utilizados en muchas reacciones biológicas, como en

la digestión o en la coagulación sanguínea. Son un brillante ejemplo de regulación

endógena de las enzimas, de cómo controlar su función. Las modificaciones que

sufren los zimógenos son irreversibles, por lo que para poder detener las

reacciones que llevan a cabo es necesario un inhibidor de la enzima a la que dan

lugar. Cabe destacar el ejemplo del tripsinógeno (zimógeno), que da lugar a

la tripsina (enzima), que a su vez activa otros zimógenos. Para poder detener la

activación de los zimógenos, la tripsina no se puede volver a convertir en

tripsinógeno, sino que debe secretarse un inhibidor de la tripsina para detener su

acción.

A continuación se indican algunos de los zimógenos más conocidos:

Angiotensinógeno.

Tripsinógeno.

Quimotripsinógeno.

Pepsinógeno.

La mayor parte de las proteínas del sistema de coagulación.

Algunas de las proteínas del sistema del complemento.

Procaspasas.

Proelastasa.

Prolipasa.

Procarboxipolipeptidasas.

2. Si hubo errores en la práctica, Cuales fueron sus causas?

Las causas presentadas

3. Aplicaciones de la papaína.

Industria textil: se usa para desengomar la seda, por lo general con un tratamiento previo al baño desgomizante principal. Tambien se utiliza en la industria de la lana para reducir el encogido al lavar y para mejorar la calidad de las tinturas usadas.

 Industria medicinal: En el tratamiento de la difteria, úlceras sifilíticas, eczemas, psoriasis, la cera que se forma en los oídos y herpes. También se han encontrado aplicaciones como analgésico y antiinflamatorios en las dismenorreas femeninas y recientemente en artrosis y osteoporosis. 

Industria de jugos: es muy utilizada en el pre-tratamiento de las frutas destinadas a jugos y aceites esenciales, y en vinos como clarificante en situación similar a la industria cervecera. 

Industria dietética: se emplea en la producción de alimentos especiales para bebés, ya que mejoran la capacidad de asimilación de los alimentos al degradar los compuestos de alto peso molecular a cadenas mas cortas de fácil incorporación al torrente circulatorio alimenticio del bebé.

 

Ventaja de la papaina frente a otras enzimas:

La papaína posee ventajas frente a otras enzimas naturales en los siguientes aspectos:

Calidad y actividad enzimática Estabilidad en condiciones desfavorables de temperatura humedad y presión

atmosférica Se encuentra en alta concentración en el látex que se extrae de la papaya. Posee un alto valor comercial por la diversidad de usos que presenta.

CONCLUSIONES

Una de las principales propiedades de la papaína es su estabilidad. Además cuando es sometida a reactivos que causan desnaturalización en otras enzimas esta sigue conservándose.

Según la información obtenida en la investigación para realizar este informe, la temperatura óptima para la mayoría de las reacciones enzimáticas se halla

entre 30°Cy 40°C. Al aumentar la temperatura, la velocidad de reacción aumenta y, para casi todas las enzimas, un incremento de 10°C duplica e incluso triplica la velocidad de reacción. Sin embargo, ese mismo aumento de temperatura acelera también la inactivación de la enzima por desnaturalización térmica.

la temperatura óptima utilizada durante el experimento para la papaína esta en un rango entre los 35ºC y 45ºC, por lo que en algunos momentos esta temperatura aumentaba y esto influye en los resultados obtenidos.