Informe sobre como hacer cultivo in vitro en plantas
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Cultivo in vitro de Plantas Nicolás Ardiles Gálvez Licenciatura en Ciencias mención Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile, Santiago, Chile La micropropagación es una técnica de cultivo in vitro que se utiliza como estrategia para propagar plantas a partir de explantes. Existen varios sistemas de micropropagación en cultivo in vitro, como la organogénesis somática directa, donde se generan brotes, hojas, raíz y hasta un organismo completo a partir de explantes de plantas. En la organogénesis somática de N. tabacum la regulación por ácido indol-3butirico y 6-Benzilaminopurina si produjo enraizamiento y brotes, respectivamente. En la embriogénesis somática de D. carota por 2,4-diclorofenoxiacético y 6-Benzilaminopurina no se obtuvieron los resultados esperados. El cultivo in vitro de un meristema de una hoja de N. tabacum generó una pequeña plántula con tallos, hojas y raíces. La inducción de desarrollo diferencial de tejido por hormonas vegetales, debe ser estrictamente analizada, antes de establecer un cultivo de regeneración. El cultivo in vitro permite el crecimiento y desarrollo de tejido vegetal en recipientes que lo separan del ambiente exterior y lo mantienen en condiciones controladas y asépticas. Entre las diversas técnicas de cultivo in vitro, la micropropagación consiste en la producción clonal de vegetales a partir, generalmente, de ápices o explantes nodales de una planta madre. La gran producción de nuevas plantas se ve favorecida gracias al rápido crecimiento del material vegetal in vitro. La organogénesis somática se caracteriza por generar
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Cultivo in vitro de Plantas
Nicolás Ardiles Gálvez
Licenciatura en Ciencias mención Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile, Santiago,
Chile
La micropropagación es una técnica de cultivo in vitro que se utiliza como estrategia para propagar
plantas a partir de explantes. Existen varios sistemas de micropropagación en cultivo in vitro, como la
organogénesis somática directa, donde se generan brotes, hojas, raíz y hasta un organismo completo
a partir de explantes de plantas. En la organogénesis somática de N. tabacum la regulación por ácido
indol-3butirico y 6-Benzilaminopurina si produjo enraizamiento y brotes, respectivamente. En la
embriogénesis somática de D. carota por 2,4-diclorofenoxiacético y 6-Benzilaminopurina no se
obtuvieron los resultados esperados. El cultivo in vitro de un meristema de una hoja de N. tabacum
generó una pequeña plántula con tallos, hojas y raíces. La inducción de desarrollo diferencial de
tejido por hormonas vegetales, debe ser estrictamente analizada, antes de establecer un cultivo de
regeneración.
El cultivo in vitro permite el crecimiento y
desarrollo de tejido vegetal en recipientes
que lo separan del ambiente exterior y lo
mantienen en condiciones controladas y
asépticas. Entre las diversas técnicas de
cultivo in vitro, la micropropagación consiste
en la producción clonal de vegetales a partir,
generalmente, de ápices o explantes
nodales de una planta madre. La gran
producción de nuevas plantas se ve
favorecida gracias al rápido crecimiento del
material vegetal in vitro. La organogénesis
somática se caracteriza por generar
primordios unipolares con el desarrollo
posterior de un brote vegetativo de hoja
(Brown D. y Thorpe T., 1986).
La micropropagación no solo ha contribuido
a un mejor entendimiento de los eventos de
la diferenciación celular, sino a un uso eficaz
de tales eventos en la explotación más
eficiente de las plantas. En este último
aspecto se destacan los siguientes usos de
las técnicas de cultivo in vitro, como el
mejoramiento genético, la obtención de
plantas libres de virus y otros patógenos,
conservación de germoplasma y
micropropagación.
El medio más común es llamado MS
(Murashige y Skoog, 1962) y permite la
micropropagación de la mayoría de las
plantas.
Las hormonas más utilizadas para el
crecimiento diferencial son las citoquininas y
las auxinas, que inducen brotes y desarrollo
de raíces, respectivamente. Diferencias de
gradientes de concentración entre ambas
A
B
C
D
hormonas determinan que tipo de tejido se
desarrolla (Stange C. 2014)
En la actualidad se utilizan análogos
sintéticos de hormonas en cultivos. Tal es el
caso de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4D)
y el ácido indol-3-butirico (IBA), ambos
análogos de auxina, y el 6-
Benzilaminopurina (BAP), análogo de
citoquinina.
En este trabajo se estudiarán los efectos de
las hormonas BAP e IBA sobre la
organogénesis somática de Nicotina
tabacum y 2,4D e IBA en la embriogénesis
somática de Daucus Carota.
RESULTADOS
Organogénesis Somática en N. tabacum
Se colocaron trozos de hojas de N. tabacum,
provenientes de cultivos in vitro y de
invernadero sobre placas en distintas
condiciones de crecimiento.
En la Figura 1B se observa el crecimiento de
raíces en los explantes que estaban en un
medio con IBA 1 mg. En la Figura 1A se
cultivaron explantes provenientes de plantas
in vitro (izquierda) y de invernadero
(derecha), donde el explante de procedencia
in vitro generó una pequeña plántula
completa, mientras que la procedente de
invernadero generó unos pequeños callos.
En la Figura 1C, en presencia de BAP,
análogo de citoquinina se generaron unos
pequeños brotes, siendo más notorios en
explantes de procedencia in vitro (izquierda)
que de procedencia de invernaderos
(derecha).
Figura 1. Organogénesis somática de N. tabacum.
Se realizaron diferentes condiciones de crecimiento, A:
MS; B: MS+1 mg IBA; C: MS+ 5 mg BAP; D: MS+ 5 mg
BAP+ 1 mg IBA. En A, B, C y D las placas de la izquierda
corresponden a explantes provenientes de cultivos in
vitro y las placas de la derecha corresponden a explantes
de procedencia de invernaderos.
A
B
C
D
Cuando se pusieron en el medio de
crecimiento citoquinina con auxina (Figura 1D),
no se observó crecimiento de raíz y sólo se
pudo apreciar unos pequeños brotes.
Embriogénesis Somática de D. carota
En la embriogénesis de D. carota, se
utilizaron cortes de tallos de esta especie,
los cuales fueron esterilizados para luego
dejarlos en placas de cultivo con distintas
condiciones de crecimiento.
En la Figura 1B, en el cultivo de tallos de
procedencia in vitro (izquierda) se observa el
desarrollo de pequeñas raíces adventicias
en presencia de un análogo de auxina. Lo
mismo se pudo observar en la Figura 1C,
donde se aumentó la cantidad de análogo de
auxina en el medio.
No se produjo inducción de desarrollo de
raíz en los explanes contenidos en la
condición de crecimiento con IBA, ni
tampoco formación de callos (Figura 2D).
DISCUSIÓN
El uso de hormonas sintéticas para la
organogénesis en medios de cultivo se ha
usado para distintas especies de vegetales.
Sin embargo, a distintas concentraciones se
producen efectos distintos en diferentes
especies.
En cultivos in vitro se debe tener en cuenta
de que debe haber rigurosidad con las
condiciones de esterilidad con las que se
trabaja para impedir contaminación en los
cultivos.
Figura 2. Organogénesis somática de D. carota.
Se realizaron diferentes condiciones de crecimiento, A:
corresponden a explantes provenientes de cultivos in
vitro y las placas de la derecha corresponden a explantes
de procedencia de invernaderos.
En la organogénesis somática de N.
tabacum, BAP, un análogo de citoquinina
produjo los efectos esperados por la acción
de esta hormona. En la Figura 1C se
observa que BAP indujo la formación de
pequeños brotes. La citoquinina produce un
aumento de la síntesis de ADN y un
aumento de la división celular (Ting, 1982),
por lo que se forman primordios de brotes.
En este caso la cantidad de BAP fue la
adecuada para inducir estos efectos. De
todas maneras para determinar la
concentración óptima de BÄP para producir
brotes se debería realizar una curva de
concentración de BAP en cultivo in vitro. En
el caso de la Figura 1D, donde se colocan
juntos BAP e IBA, análogos de citoquinina y
auxina, respectivamente, se puede observar
que se forman brotes, de manera similar a lo
que se aprecia en la Figura 1C. Se sabe que
en un medio de auxina y citoquinina juntas
predomina el efecto de la citoquinina. Cabe
mencionar que en el medio utilizado en la
Figura 1D para los explantes de tabaco se
utilizó mayor cantidad de BAP en relación a
la cantidad de IBA, por lo que esta variable
pudo contribuir también a silenciar el efecto
enraizador del análogo de auxina, ya que
está determinado que en cultivo la auxina
promueve el crecimiento adventicio de la raíz
(Mineo L., 1990). Lo mencionado
anteriormente se puede ver en la Figura 1B,
donde se observa que en un medio que
contiene se produce la formación de raíces
en los explantes de hoja de tabaco.
En la izquierda de la Figura 1A, en explantes
de hoja de tabaco provenientes de cultivos in
vitro, se puede ver que se desarrolló una
plántula completa, con raíces, tallos y hojas,
en un medio control, que sólo contenía MS.
Esto ocurrió debido a que se colocó en el
medio un explante proveniente de un tejido
meristemático, que son células poco
diferenciadas, responsables del crecimiento
vegetal y con capacidad totipotencial.
Cabe mencionar además que los efectos de
las hormonas en explantes de hojas de
tabaco tuvieron mejores efectos en los
explantes que provenían de cultivos in vitro
que en explantes que provenían de
invernaderos. Esto debe ser debido a que en
condiciones in vitro hay un mayor grado de
esterilidad y asepsia.
Durante dos semanas de incubación de un
análogo sintético de la hormona auxina, el
2,4, se induce el desarrollo del embrión a
altas concentraciones (0,1 a 10 mg/L) y
formación de la raíz a bajas concentraciones
(0,001 a 0,1 mg/L). La incubación con IBA
induce formación de raíz y embriones
somáticos (Kamada H. y Harada H., 1978).
Pese a esto, los resultados que se observan
en la Figura 2 no presentan desarrollo de
embrión y presentan un pequeño desarrollo
de raíces en los medios con presencia de
2,4D, como se observa en las Figuras 2B y
2C, en las placas de la izquierda, que
corresponden a tallos de zanahoria
procedentes de cultivos in vitro.
Cabe destacar que cada especie y para
cada condición de cultivo se debe
suministrar una cantidad adecuada de
hormona para producir los efectos que se
desea. Para esto se debería realizar una
curva concentración de hormona-efecto para
determinar la concentración óptima de la
hormona que se desea emplear.
MATERIALES Y MÉTODOS
Organogénesis Somática en N. tabacum.
Se cortaron hojas de un tamaño promedio de 2 cm2 de N. tabacum que provenían de cultivo in vitro estéril. Luego se dejaron sobre placas Petri de cultivo con las siguientes condiciones de crecimiento:
MS sin suplemento hormonalMS + 5 mg BAPMS + 1 mg IBAMS + 5 mg BAP+ 1 mg IBA.
Luego se incubaron por tres semanas, bajo las condiciones de luz, temperatura y humedad apropiada.
Embriogénesis Somática en D.carota.
Se cortaron trozos de tallos de D.carota, de un tamaño promedio de 1,5 cm. Luego se esterilizaron con Hipoclorito de Sodio 10%-Tween20 por 10 minutos en agitación. Posteriormente, se realizaron 3 lavados con agua estéril, para luego verter los fragmentos de tallos sobre placas Petri de cultivo con las siguientes condiciones de crecimiento:
MS sin suplemento hormonalMS + 1 mg 2,4DMS + 5 mg 2,4DMS + 1 mg IBA
Luego se incubaron por tres semanas, bajo las condiciones de luz, temperatura y humedad apropiada.
