“Año de la consolidación económica y social del Perú”

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGIA

“TECNICAS DE COLORACION”

DOCENTE: Angel castro

ASIGNATURA: Microbiología

CICLO: III

ESTUDIANTES:

Acosta Gonzales, Karina Paz cruz, Luis Rodríguez bayona, stefanny

Nuevo Chimbote, mayo del 2011

PRACTICA DE LABORATORIO Nº 05

TECNICAS DE COLORACION

INTRODUCCION:

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores que lo que es realmente, de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión.

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucléicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catatónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán.

Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el ácido tánico. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante.

Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía, son suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul

de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe.

La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.

Los métodos de tinción son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaución, ya que pueden conducir a errores. Las moléculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.

OBJETIVOS:

Realizar adecuadamente una coloración simple de bacterias y de levaduras de una muestra microbiana.

Ejecutar eficientemente una coloración gram de una suspensión bacteriana.

Ejecutar adecuadamente una coloración negativa de una suspensión bacteriana.

Diferenciar la bacteria ácida y no ácido alcohol resistentes. Obtener destrezas para observar nítidamente las láminas preparadas

con coloración simple y coloración gram

PROCEDIMIENTO:

1. COLORACIN SIMPLE Flamea la aza bacteriológica frente a un mechero hasta el rojo vivo.

Esperar que se enfríe:

Colocar dos azadas de la suspensión de bacillus subtilis, en forma aséptica en el centro de la lámina portaobjetos.

Proceder a fijarlo pasando el portaobjeto tres veces por la llama del mechero, cuidando que solo el lado opuesto del frontis esté en contacto con la llama, dejar enfriar.

Agregar el colorante de cristal violeta encima de la muestra seca durante un minuto.

Observar en el microscopio con los objetivos 10x, luego con 40x y 100x

2. COLORACION GRAM: Flamea la aza bacteriológica frente a un mechero hasta el rojo vivo.

Esperar que se enfríe:

Colocar dos azadas de la suspensión de bacillus subtilis, staphylococus y bacillus en forma aséptica en el centro de la lámina portaobjetos.

Agregamos a las tres muestras, el colorante de cristal violeta encima de la muestra seca durante un minuto.

Posteriormente le agregamos a las tres muestras lugol:

Lavar e inmediatamente agregar unas cuantas gotas de safranina, volver a lavar y llevar al microscopio para ser observado a 100x.

RESULTADOS:

DISCUSIONES:

E.coli

Objetivo: 40x

Staphylococus

Objetivo: 40x

Bacillus

Objetivo: 40x

Curtis (2000), nos dice que las células deben ser teñidas porque la cantidad de interferencia producida cuando la luz atraviesa las diferentes estructuras de una célula no es grande y el contraste que se detecta es escaso. Gaviño et al. (2004), menciona que los métodos de coloración vital constituyen un procedimiento intermedio entre el examen fresco y las técnicas de coloración después de la fijación, con las coloraciones vitales se hacen visibles ciertas estructuras, sin causar o causando poca alteración fisicoquímica del protoplasma, es decir, en cierta manera se deja intacta la vitalidad celular. En la práctica utilizamos diferentes colorantes para diferenciar estructuras y reconocer diferentes células.

Wistreich (1983), nos dice que la diferenciación de Gram se basa en el color que adquieren las bacterias cuando se tratan con el colorante Cristal Violeta seguido por una solución yodo yodurada de potasio. Ciertos organismos pierden la coloración violeta con suma rapidez cuando se aplica el alcohol etílico, en tanto que otros la pierden con más lentitud, después de la coloración se usa una coloración de contraste casi siempre safranina. Las bacterias resistentes a la decoloración conservan una tonalidad azul clasificándose como organismos Gram (+), los microorganismos que no pueden retener la tinción con cristal violeta, toman la coloración de contraste y, por ende, presentan una coloración rosa o roja; a estos organismos se les denomina Gram (-). Nosotros observamos que en la coloración Gram que se hizo al sarro dentario la coloración salió Gram (+).

Gaviño et al. (2004), nos dice que la mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán.

CONCLUSIONES:

En la coloración simple se utiliza un solo colorante. Las bacterias Gram positivas se tiñen de color violeta.

Las bacterias Gram negativas se decoloran y presentan un color rojo- rosado.

Los colorantes son indispensables para la diferenciación de las estructuras celulares y organismos.

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico.

La principal dificultad de la notoriedad de la célula es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes.

Los colorantes pueden emplearse para distinguir diferentes estructuras de las células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Curtis et al. 2002. “Biología” 6taedición. Edit. Panamericana. Madrid – España

Nason. A. 2006. “Biología”. Edit. Limusa. México

Gaviño et al. 2004. “Técnicas Biológicas selectas de Laboratorio y de Campo”. Edit. Limusa. México

Wistreich et al. 1983. “Prácticas de laboratorio en microbiología”. Edit. Limusa. México

PREGUNTAS

1. ¿Por qué se dice que la coloración Gram es una coloración diferencial?La coloración diferencial es aquella donde usas más de un colorante. Con esta tinción se podrá observar la morfología, tamaño, organización de las bacterias y además categorizar los microorganismos en varios grupos, según su afinidad con el colorante que utilicemos. Hay varios tipos de tinción diferencial pero las que

uno más usa son la TINCION DE GRAM O COLORACION DE GRAM y la COLORACION DE ZIEHL NEELSEN.Es decir la coloración Gram es un tipo de coloración diferencial.

2. Menciones 05 géneros microbianos de bacterias Gram positivas y 05 Gram negativas.GRAM POSITIVAS:

Micrococcus Arthrobacter Actinomyces Nocardia Mycobacterium

GRAM NEGATIVAS:

Chlamydiales Enterobacteriaceae Edwardsiella tarda Enterobacter Escherichia coli

3. ¿Qué tipo de estructuras se colorea en la coloración simple?

La tinción simple se utiliza para observar la morfología de las células y el arreglo en el crecimiento de las bacterias.

4. ¿en una coloración Gram, que tipo de color adquirirán las esporas de Bacillus subtilis?

Adquirirán un color medio violáceo.

5. ¿Mencione 3 géneros microbianos distintos que son acido alcohol resistente.El género Nocardia, Mycobacterium y Bacillus

6. ¿Cómo observarías los gránulos de poli-beta-hidroxibutirico PHB?Muchos microbios acumulan gránulos de polifosfato; se tiñen con azul de toluidina y reciben el nombre de Gránulos de poli-beta-hidroxibutirico PHB la mejor manera de observarlos seria por la coloración Gram.