Universidad Andrés bello

Departamento de Ciencias Químicas

Laboratorio de Química e Instrumental

LABORATORIO N°6

CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION (HPLC)

DETERMINACIÓN DE TEOFILINA EN UNA MUESTRA PROBLEMA

INTEGRANTES : RODRIGO AGUILAR

CHRISTOPHER ESPINOZA

GRUPO : N°4

PROFESOR : LUIS RAUL DE LA NUEZ

FECHA

ENTREGA

: 16/11/2015

RESULTADOS

Determinación de la concentración de Teofilina en una

muestra problema (MP)

Se trabajó con una fase móvil isocrática (30:70 = Metanol, Agua), a un flujo

de 1mL/min y utilizando una longitud de onda detección de 260nm.

Por el método de estándar interno (10ppm de Teobromina) se determinara la

concentración de MP, ya que se hace una curva de calibración previamente

medida usando patrones de Teofilina de 5, 10, 15, 20 y 25 ppm.

Luego del análisis en el cromatógrafo liquido de alta resolución de todos los

patrones de Teofilina y la MP, se tabularon los siguientes datos.

TABLA N°1: MEDICIÓN CROMATOGRAFICA

Flujo

1mL/min

5ppm 10ppm 15ppm 20ppm 25ppm MP

Teob Teof Teob Teof Teob Teof Teob Teof Teob Teof Teob Teof

A 25837 28760 24420 40086 24442 90427 24398 118137 24325 137076 24594 106304

Tr 5,092 6,842 5,275 7,392 5,083 6,958 5,133 7,042 5,233 7,217 5,158 7,083

w 1,12 1,37 1,23 0,99 1,16 1,63 1,18 1,56 1,14 1,43 1,18 1,52

Tm 1,617 1,592 1,583 1,583 1,583 1,592

A: área de pico; Tr: Tiempo de retención; w: Ancho de banda; Tm: Tiempo muerto

TABLA N°2: VALORES PROMEDIO DE MEDICION CROMATOGRAFICA

Valores promedio

(Flujo 1mL/min)

Teob Teof

A 24684,4 82897,2

Tr 5,1632 7,0902

w 1,166 1,369

Tm 1,5916

Influencia del flujo de la fase móvil

Se trabajo con un patrón de 10 ppm de Teofilina y una fase móvil isocrática (30:70=

Metanol, Agua). Se midió a 260 nm con flujos de 0,8 mL/min y 1,2 mL/min.

Se tabularon los siguientes datos:

TABLA N°3: FLUJO DE FASE MOVIL (10ppm) POR TIEMPO (mL/min)

Flujo 0,8 mL/min 1,0 mL/min 1,2 mL/min

Teob Teof Teob Teof Teob Teof

A 21659 44550 24420 40086 22028 49296

Tr 6,292 8,608 5,275 7,392 4,3 5,792

W 1,31 1,14 1,23 0,99 1,13 1,35

Tm 1,942 1,592 1,358

A partir de la medición se obtuvieron los siguientes datos:

TABLA N°4: CONCENTRACION DE TEOFILINA (ppm), AREA DEL PICO DE

TEOFILINA Y TEOBROMINA

Concentración

Teofilina (ppm)

Área del pico

Teofilina

Área del pico

Teobromina

5 28760 25837

10 40086 24420

15 90427 24442

20 118137 24398

25 137076 24325

Muestra 106304 24594

Para determinar la concentración de la MP, se hizo una curva de calibración en

donde se grafica área del pico de teofilina/área del pico del patrón interno en función

de la Concentración de Teofilina.

TABLA N°5: CONCENTRACION TEOFILINA V/S ATEOF/ATEOB

Concentración de Teofilina (ppm) ATeof/ATeob

5 1,113

10 1,641

15 3,699

20 4,842

25 5,635

Muestra 4,322

Según esta tabla se obtiene el siguiente gráfico:

GRAFICO N°1 CURVA DE CALIBRACION: [ ] TEOFILINA V/S COCIENTE

ENTRE AREA TEOF Y TEOB

y = 0,2449x - 0,2871R² = 0,9681

0

1

2

3

4

5

6

7

0 5 10 15 20 25 30

AT

eo

f/A

Teo

b

[TEOFILINA]ppm

[ ] Teofilina (ppm) V/S ATeof/ATeob

Para calcular la concentración de Teofilina en la muestra problema se reemplaza

Y = 4,322 (ATeof/ATeob con los datos obtenidos de la Tabla N°5 para la muestra) en

la ecuación de la recta obtenida, entonces:

𝑌 = 𝑚𝑥 + 𝑏

𝑌 = 0,2449𝑥 − 0,2871

4,322 = 0,2449𝑥 − 0,2871

𝑥 =4,322 + 0,2871

0,2449= 18,82𝑝𝑝𝑚

Por lo tanto la concentración de Teofilina la muestra problema es 18,82 ppm

Teofilina.

Determinación promedio de platos teóricos

Se procede en calcular los platos teóricos en base a la tabla N°3.

Entonces: 𝑁 = 16 ∗ (𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑡𝑒𝑛𝑐𝑖𝑜𝑛

𝑎𝑛𝑐ℎ𝑜 𝑑𝑒 𝑏𝑎𝑛𝑑𝑎)

2

- Para la Teobromina con un flujo 0,8 mL/min

𝑁 = 16 ∗ (6,292

1,31)

2

= 𝟑𝟔𝟗, 𝟏𝟏

- Para la Teofilina con un flujo de 0,8 mL/min

𝑁 = 16 ∗ (8,608

1,14)

2

= 𝟗𝟏𝟐, 𝟐𝟓

- Para la Teobromina con un flujo de 1,0 mL/min

𝑁 = 16 ∗ (5,275

1,23)

2

= 𝟐𝟗𝟒, 𝟐𝟖

- Para la Teofilina con un flujo de 1,0 mL/min

𝑁 = 16 ∗ (7,392

0,990)

2= 𝟖𝟗𝟐,02

- Para la teobromina con un flujo de 1,2 mL/min

𝑁 = 16 ∗ (4,300

1,13)

2

= 𝟐𝟑𝟏, 𝟔𝟗

- Para la Teofilina con un flujo de 1,2 mL/min

𝑁 = 16 ∗ (5,792

1,35)

2

= 𝟐𝟗𝟒, 𝟓𝟐

Con los cálculos señalados se genera esta tabla:

TABLA N°6: PLATOS TEORICOS TEOBROMINA Y TEOFILINA EN LOS 3

FLUJOS MEDIDOS

FLUJO FASE MOVIL

(mL/min)

Teobromina Teofilina

0,8 369,11 912,25

1,0 294,28 892,02

1,2 231,69 294,52

Ahora se puede calcular los promedios de los platos teóricos para cada flujo

TABLA N°7: RESUMEN CALCULOS DE PROMEDIOS PLATOS TEORICOS

FLUJO (mL/min) PROMEDIO PLATOS TEORICOS

0,8 N = 𝟗𝟏𝟐,𝟐𝟓 + 𝟑𝟔𝟗,𝟏𝟏

𝟐 = 640,68

1,0 N = 𝟐𝟗𝟒,𝟐𝟖+ 𝟖𝟗𝟐,𝟎𝟐

𝟐 = 593,15

1,2 N = 𝟐𝟗𝟒,𝟓𝟐+𝟐𝟑𝟏,𝟔𝟗

𝟐 = 263,11

DETERMINACIÓN DE ALTURA DE PLATOS TEÓRICOS

Luego calcular los platos teóricos (N) se puede obtener la altura de platos teóricos

aplicando la siguiente ecuación:

𝑁 = 𝐿

𝐻 En donde L= altura de la columna y H= altura de platos teóricos.

Para este práctico la altura de columna es de 25cm. Entonces por simple despeje

nos queda:

𝐻 =𝐿

𝑁

Entonces para cada flujo seria así:

TABLA N°8: RESUMEN DE CALCULO DE ALTURA DE PLATOS TEORICOS

POR CADA FLUJO FASE MOVIL

FLUJO FASE MOVIL (mL/min) ALTURA PLATOS TEORICOS

0,8 H =

25 𝑐𝑚

640,68 = 0,0390 cm

1,0 H =

25 𝑐𝑚

593,15 = 0,0421 cm

1,2 H =

25 𝑐𝑚

263,11 = 0,0950 cm

DETERMINACIÓN DE LA RESOLUCIÓN (Rs)

Para obtener la resolución se ocuparon los datos de la Tabla N°3 y la siguiente

ecuación:

𝑅𝑠 = 2 (𝑇𝑟(𝑇𝑒𝑜𝑓𝑖𝑙𝑖𝑛𝑎) – 𝑇𝑟(𝑇𝑒𝑜𝑏𝑟𝑜𝑚𝑖𝑛𝑎))

𝑊(𝑇𝑒𝑜𝑏𝑟𝑜𝑚𝑖𝑛𝑎) – 𝑊(𝑇𝑒𝑜𝑓𝑖𝑙𝑖𝑛𝑎)

Tr: Tiempo de retención; W= ancho de pico

Entonces para flujo 0,8 mL/min

𝑅𝑠 = 2 (8,608 − 6,292)𝑚𝑖𝑛

(1,31 + 1,14)𝑚𝑖𝑛= 1,891

Para flujo 1,0 mL/min

𝑅𝑠 = 2 (7,392 − 5,275)𝑚𝑖𝑛

(1,23 + 0,99)𝑚𝑖𝑛= 1,907

Y, para el flujo 1,2 mL/min

𝑅𝑠 =2 (5,792 −4,300)𝑚𝑖𝑛

(1,13+1,35)𝑚𝑖𝑛= 1,203

TABLA N°9: RESOLUCIONES CALCULADAS A 0,8; 1,0 Y 1,2 mL/min

FLUJO FASE MOVIL

(mL/min)

RESOLUCIÓN

(Rs)

0,8 1,891

1,0 1,907

1,2 1,203

DETERMINACIÓN DE LA SELECTIVIDAD (α)

Para calcular la selectividad de cada flujo se necesita aplicar la siguiente ecuación:

𝛼 =𝑇𝑟(𝑇𝑒𝑜𝑓𝑖𝑙𝑖𝑛𝑎) − 𝑇𝑚

𝑇𝑟(𝑇𝑒𝑜𝑏𝑟𝑜𝑚𝑖𝑛𝑎) − 𝑇𝑚

Tr: Tiempo de retención; Tm: Tiempo muerto

Entonces, para el flujo de 0,8 mL/min

𝛼 =(8,608 − 1,942)𝑚𝑖𝑛

(6,292 − 1,942)𝑚𝑖𝑛= 1,532

Para el flujo de 1,0 mL/min

𝛼 =(7,392 − 1,592)

(5,275 − 1,592)= 1,575

Y, para el flujo 1,2 mL/min

𝛼 =(5,792 − 1,358)

(4,300 − 1,358)= 1,507

TABLA N°10: RESUMEN DE CALCULO DE SELECTIVIDAD (α)

FLUJO FASE MOVIL

(mL/min)

SELECTIVIDAD

(α)

0,8 1,532

1,0 1,575

1,2 1,507

DISCUSION

En el presente practico utilizamos la técnica de cromatografía liquida de alta

resolución (HPLC), con el cual determinamos la concentración de una muestra

problema que contenía teofilina utilizando como patrón interno teobromina (10 ppm).

Para determinar la concentración de la muestra problema utilizamos una curva de

calibración con el cual preparamos soluciones con diferentes concentraciones de

teofilina y el patrón interno (teobromina) obteniendo a través de la gráfica

Aanalito/Apatron interno vs concentración del analito. La ecuación de la recta en la cual

obtuvimos el siguiente valor Y =0,2449x- 0,2871, donde “y” corresponde al valor del

área del analito de la muestra problema obtenido. Y “x” corresponde al valor de la

concentración del analito. Al despejar la x de la ecuación de la recta se obtuvo la

concentración del analito correspondiente a 18,82 ppm. El coeficiente de regresión

dio un valor lejano al ideal (R2= 0,9681), puesto que el punto N°2 correspondiente a

1,641 - 10 ppm (y,x), se desvía hacía la parte inferior del gráfico, por lo tanto el

cálculo de la concentración del analito en la muestra problema estará afectada por

algún tipo de error, lo más probable que por parte del cromatógrafo no hay mucho

error porque es manejado, entonces el error se debe con mayor certeza de una falla

humana de manipulación, ya que el cromatógrafo de alta resolución es un

instrumento extremadamente sensible se necesita una prolijidad ya sea para

maniobrar la bomba presión, la cual se encarga de introducir el soluto a presión para

una óptima separación, y por la intensidad de corriente que debe haber durante el

proceso de análisis ya que no debe hacer baja de voltaje porque el cromatógrafo es

muy costoso y también para que su análisis sea confiable.

En cuanto a la Influencia del flujo de la fase móvil podemos decir que a medida que

se aumente el flujo de la fase móvil el tiempo de retención y el área de la teofilina y

de la teobromina disminuyen, estando en una relación inversamente proporcional

entre el flujo y el área y/o el tiempo de retención (1).

En cuanto a la resolución medida a un flujo de 1mL/min que dio 1,907 comparado

con la resolución a un flujo de 1,2mL/min que dio 1,203 se evidencia claramente

que el aumento de flujo afecta la resolución pero no baja del valor aceptable que

1,0.(2).

Cada plato teórico representa un equilibrio teórico de distribución del soluto entre

las fases. El número total de platos teóricos de una columna representa el poder de

separación de la columna. Una buena columna tiene un número alto de platos

teóricos(3). En este practico se midieron los platos a 3 flujos los cuales dieron, para

un flujo de 0,8mL/min =640,68; para un flujo de 1,0mL/min = 593,15 y para un flujo

de 1,2mL/min = 263,11. Entonces en un flujo de 0,8mL/min los platos fueron

mayores contra los medidos para los otros flujos, cabe destacar que en la medición

de 1,0mL/min se produjo un error anteriormente señalado, el cual pudo haber

incidido en los cálculos de platos.

Por último se calcularon las selectividades a 0,8mL/min; 1,0mL/min y 1,2mL/min,

siendo 1,532; 1,575 y 1,507 respectivamente. Como La selectividad se refiere a la

capacidad del método para distinguir las propiedades de los componentes a nivel

molecular y que permite diferenciarlos, por eso que su selectividad son muy

parecidas porque solo medimos una mezcla de Teobromina y Teofilina las cuales

tienen igual formula molecular y solo difieren en su conformación.

CONCLUSION

Se obtuvieron resultados muy fiables, por lo que podemos decir que la

concentración de la muestra problema es de 18,82ppm de Teofilina y se obtuvo al

interpolar la señal que dio el cromatógrafo en la ecuación de la recta que dio la curva

de calibración.

Con los datos obtenidos por el análisis se pudo calcular: promedio platos teóricos

para cada flujo, altura de platos para cada flujo, resolución para cada flujo y

selectividad.

En conclusión aprendió todo el manejo para poder operar un cromatógrafo de alta

resolución ya que es una herramienta fundamental En la actualidad, ya que ha

alcanzado tal nivel de fineza y especialización que cada uno de sus tipos constituyen

herramientas imprescindibles en las áreas de la ciencia y la tecnología, en la

industria química, farmacéutica, cosmética, en estudios ambientales, en la clínica,

en alimentos, etc(4).

Buen laboratorio

BIBLIOGRAFIA

(1)Willard, HH., Instrumental Methods of Analysis, Wadsworth, Inc., U.S.A., 1988.

(2) Karger B.L., Snyder L.R. and Horvath C., An introduction to separation science.

John Wiley and Sons, Canada, 1973.

(3) Howard G.A. and Martin A.J.P., The separation of the C12C18 fatty acids by

reversedphase partition chromatography, Biochem J, 1950, 46:532538.

(4) Gooding K. and Regnier F., HPLC of Biological Macromolecules, Vol 51,

Chromatographic Science Series, Marcel Dekker Inc., USA, 1990