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Inmunohistoquímica Inmunohistoquímica es toda técnica que permite detectar in situ componentes celulares y extracelulares (antígenos) mediante anticuerpos específicos. Páncreas.
Inmunohistoquímica
Inmunohistoquímica es toda técnica que permite detectar in situ componentes celulares y extracelulares (antígenos) mediante anticuerpos específicos.
Páncreas.
Metas
• Demostrar la presencia real y específica de un antígeno.
• Que se vea muy lindo!
- Preservar la morfología del tejido.
- Nada de fondo (background).
Antígeno: molécula a la cual se puede
unir un anticuerpo.
Es lo que queremos detectar en el corte histológico. Debe ser capaz de generar una respuesta inmune cuando es inyectada en un animal de experimentación.
Epitopes continuos o discontinuos.
Anticuerpos
Anticuerpos IgM e IgG son las que se encuentran en el suero. IgM penetra peor en la muestra.
Anticuerpos
Unión reversible con una afinidad (fuerza de unión entre epitope y paratope) y avidez (fuerza conjunta de un antisuero) determinada.
¿Cómo se generan los anticuerpos?
• Anticuerpos policlonales.
• Anticuerpos monoclonales.
Anticuerpos o sueros policlonales
Mezcla de Igs con diferentes especificidades, sintetizadas por distintos clones de células plasmáticas.
Ventajas:
• Alta avidez y sensibilidad.
• Al detectar varios epitopes suelen ser más seguros.
• Menor costo.
Desventajas:
• Mayor incidencia de reacciones cruzadas (inespecificidad) Background.
Puede eliminarse con cromatografía de afinidad.
• El lote de cada anticuerpo es irreproducible.
• Puede contener impurezas (Ig contra impurezas del antígeno).
Anticuerpos monoclonales
César Milstein. Premio Nobel de Medicina y Fisiología 1984.
Técnica del hibridoma
Cada clon aislado puede cultivarse:
• In vivo: trasplantando el cultivo a la cavidad peritoneal de un ratón y obteniéndose el anticuerpo a partir del líquido ascítico.
• In vitro: cultivando los clones como líneas celulares y obteniéndose el sobrenadante.
Ventajas:
• Especificidad.
• Disponibilidad.
• Reproducibilidad.
Desventajas:
• Menor sensibilidad. Reconoce sólo 1 epitope de todo el antígeno.
• Posibilidad de falsos negativos.
• Menor estabilidad al pH y concentración salina.
• Más caro.
Procesamiento de las muestras para inmunohistoquímica
La fijación y el pretratamiento de la muestra deben cumplir criterios mutuamente contradictorios: • Retener antígenos. • Preservar la antigenicidad. • Preservar la estructura. • Permitir la interacción de los anticuerpos con los antígenos tisulares.
Los antígenos son químicamente diferentes
No existe un tratamiento universal para la inmunohistoquímica
Para que el anticuerpo pueda unirse al
epitope.
¡Para que el corte se vea lindo!.
Muestras fijadas químicamente (fijadores)
Parafina (implica pasaje por calor y solventes)
Crióstato
Muestras fijadas físicamente (agentes criogénicos y congelación)
Crióstato
Vibrátomo
Procesamiento de las muestras para inmunohistoquímica
Resinas no hidrofóbicas (ej. Glicol metracrilato). Ojo! Requiere fijación con acetona
Inmunohistoquímica in toto (whole mount)
Procesamiento de las muestras para inmunohistoquímica
Fijadores reticulantes o aditivos: • Formaldehído, Paraformaldehído. Forman puentes metileno (CH=CH) entre los aminoácidos y se adicionan a los tejidos. Penetran rápidamente y preservan la morfología. Estabilizan las proteínas.
• Glutaraldehído. Gran capacidad de «cross-linking» y preservación. Preserva la ultraestructura celular. Excelente para MET pero NO aconsejable para inmunohistoquímica.
Tiempo, concentración y mezclas fijadoras.
vs. Fijadores precipitantes o coagulantes
Procesamiento de las muestras para inmunohistoquímica
Para contrarrestar el efecto de enmascaramiento de los antígenos que producen los fijadores reticulantes…
Recuperación antigénica
Enzimática
Térmica
Recuperación antigénica
Aumenta la especificidad y disminuye la tinción inespecífica.
¿Cómo se restaura la inmunorreactividad? Se desconoce… • Rotura de enlaces producidos por formol • Recuperación de cargas electrostáticas • Extracción de proteínas bloqueantes difusibles • Movilización de restos de parafina por el calor
Parámetros experimentales a poner a punto para un buen desenmascaramiento: • Buffer de incubación y pH • Método de calentamiento • Tiempo y temperatura
Métodos de detección de antígenos ¿Cómo se detecta el complejo antígeno-anticuerpo en el preparado histológico? Según la manera de visualizarlo: • Por reacción enzimática. • Por fluorocromo
(inmunofluorescencia).
La detección del antígeno puede ser: • Directa.
• Indirecta: con un anticuerpo secundario conjugado.
Es costoso y complejo. Baja sensibilidad.
Métodos de detección indirectos
PAP (peroxidasa anti-peroxidasa)
Cromógeno: tetraclorhidrato de 3,3 diaminobenzidina (DAB) Precipitado marrón insoluble en alcohol.
Métodos de detección indirectos
Ventajas de la peroxidasa: • Enzima estable. • Tamaño pequeño que no interfiere con la unión de los anticuerpos.
Desventajas de la peroxidasa: • Peroxidasas endógenas. Principalmente en órganos hemopoyéticos, hígado, músculo y
riñón.
La presencia de peroxidasas endógenas se detecta incubando los cortes con
H2O2 y DAB. (Control negativo). Se pueden bloquear con H2O2 al 3% en agua destilada. Antes o después del anticuerpo primario?? Con o sin metanol??
Método biotina-estreptavidina marcada. Conjugado a una enzima.
Métodos de detección indirectos
Ventajas: • Aumenta la sensibilidad porque amplifica la marca. • La unión biotina-estreptavidina es muy fuerte. • La biotina se conjuga fácilmente a enzimas, anticuerpos y fluorocromos
también.
Método ABC: complejo avidina-biotina. Conjugado a una enzima.
Métodos de detección indirectos
Desventajas: • Biotinas endógenas. En estructuras ricas en mitocondrias: hepatocitos, túbulos renales, conductos salivales, células de Sertoli, etc.
Se pueden bloquear las biotinas endógenas con avidina/biotina. Kits comerciales. ¡Caros!
Métodos de detección indirectos
Otras enzimas utilizadas son: • Fosfatasa alcalina. MÉTODO DE LA FOSFATASA ALCALINA ANTI FOSFATASA
(APAAP).
sustrato
Cromógeno • Fast blue • Fast red • NBT • New
fucsin • Glucosa oxidasa y beta-D-galactosidasa. Solubles en alcohol. Preparados no definitivos.
Métodos de detección indirectos
EL USO DE POLÍMEROS • Alta sensibilidad.
• Resuelve el
problema de las
biotinas
endógenas.
Doble inmunotinción simultanea
Métodos de detección indirectos
Fondo (background) ¿Cómo disminuir la inmunotinción inespecífica?
Para disminuir estas interacciones es fundamental:
• Bloquear con suero, leche o albúmina.
• Bloquear las enzimas o biotinas endógenas.
• Una buena dilución del anticuerpo.
• Buenos lavados.
• Que nunca se sequen los cortes.
• Controlar el tiempo de la reacción del marcador.
Los anticuerpos se unen a sitios inespecíficos a través de cargas elestrostáticas e interacciones hidrofóbicas.
Controles
Positivos: • Interno: estudiar la
inmunotinción de un antígeno conocido en cortes seriados para evaluar si el órgano fue fijado y procesado correctamente.
• Externo: estudiar la presencia
del antígeno de interés en cortes que presentan el antígeno y con buena
preservación.
Negativos: • Inmunotinción
en tejidos que carecen del antígeno.
• Demostrar ausencia de inmunotinción al omitir alguna de las etapas esenciales de la técnica.
Controles
Negativos: • Omisión del anticuerpo 1rio. • Preadsorción del anticuerpo 1rio con el antígeno. • Enzimas endógenas: omitir todos los pasos excepto
el que pone en evidencia la enzima. • Biotina endógena: estreptavidina + enzima +
cromógeno. • Cuidado con la especie en la cual está hecho el
anticuerpo 1rio. No puedo usar cortes de conejo y usar un anticuerpo secundario anti-conejo!!!
Tinción de una banda proteica del tamaño esperado por Western blot
Datasheets: ¿qué información brindan?
• Correspondencia entre tinción IHQ e HIS.
• Knocked out? • Método
recomendado de recuperación antigénica.
Patrón de tinción selectivo
TP: Anti-tirosina hidroxilasa Glándula adrenal de ratón.
Glándula adrenal de sapo.
PROTOCOLO
¿Sobre qué portas montamos los cortes para IHQ? El protocolo implica muchos pasos de lavados aumentando el riesgo de que se levanten los cortes.
• Silanizados. • Poli-L-lisina. • «Cargados»
Control omisión de anticuerpo primario -Desenmascaramiento. -Bloqueo de peroxidasas con H2O2. -Bloqueo de sitios inespecíficos con leche. -sin ac 1rio. -con ac 2rio. -con Estreptavidina-HRP. -Revelado con DAB.
Control biotina endógena
-Desenmascaramiento. -Bloqueo de peroxidasas con H2O2. -Bloqueo de sitios inespecíficos con leche. -sin ac 1rio. -sin ac 2rio. -Estreptavidina-HRP. -Revelado con DAB.
Control peroxidasas endógenas
-Desenmascaramiento. -Bloqueo de peroxidasas con H2O2. -Bloqueo de sitios inespecíficos con leche. -sin ac 1rio. -sin ac 2rio. -sin Estreptavidina-HRP. -Revelado con DAB.
