The INNO-LiPA HLA-DRB decoder amplification kit, for in vitro use, isintended for the nucleic acid amplification of the second exon of the humanleukocyte antigen (HLA) DRB1, DRB3, DRB4 and DRB5 loci. Thereaction is performed by means of the polymerase chain reaction (PCR).
Test principle
The DNA sample to be amplified by PCR is introduced in a reagentmixture containing an excess of deoxynucleoside 5'-triphosphates(dNTPs), biotinylated primers, and thermostable DNA polymerase. The primers will amplify exon 2 of all or specific DRB alleles (see below).By heating, the two strands of the DNA helix are separated (denaturation)in order to expose the target sequences to the primers. These primers arecomplementary to the regions flanking the target sequence. Therefore,upon cooling to a specific temperature, the primers will bind to theirtarget region (annealing).
At another temperature, and utilizing the dNTPs, the thermostable DNApolymerase will extend the annealed primers along the target template(extension). This way, two exact biotinylated copies of the templatesequence are produced after one cycle of denaturation, annealing andextension. After 35 cycles, a large number of biotinylated copies of thetarget sequence is obtained.
Reagents
Description, preparation and recommended storage conditions
- If kept at -15/-25°C and stored in the original vials, the reagents arestable until the expiry date of the kit. However, it is recommended toaliquot reagents (except for LiPA-Taq) after first use and then store at -15/-25°C. Do not use the reagents beyond the expiry date of the kit.
INNOGENETICS®
6
- The reagents should be stored isolated from any source ofcontaminating DNA, especially amplified DNA products.
- Alterations in physical appearance of the kit reagents may indicateinstability or deterioration.
Component Quantity Ref. DescriptionAmplification Buffer 4 x 0.3 ml 56982 Containing all dNTPs and 0.05%
NaN3 as preservative. Allowcomplete thawing before use.
DRB1+3+4+5 Primer Solution 1 x 0.3 ml 56989 Containing biotinylated primers,
MgCl2, and 0.05% NaN3 aspreservative for the amplificationof exon 2 of the DRB1+3+4+5alleles. Allow complete thawingin order to dissolve the MgCl2completely before use.
86G Primer Solution 1 x 0.3 ml 56988 Containing biotinylated primers
MgCl2, and 0.05% NaN3 aspreservative for the sequence-specific amplification of exon 2of the DRB alleles showing a Gor D sequence at codon 86. Allowcomplete thawing in order todissolve the MgCl2 completelybefore use.
86V Primer Solution 1 x 0.3 ml 56987 Containing biotinylated primers
MgCl2, and 0.05% NaN3 aspreservative for the sequence-specific amplification of exon 2of the DRB alleles showing a V sequence at codon 86. Allowcomplete thawing in order todissolve the MgCl2 completelybefore use.
INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplification
7
DRB1 Primer Solution 1 x 0.3 ml 56984 Containing biotinylated primers,
MgCl2, and 0.05% NaN3 aspreservative for the amplificationof exon 2 of the DRB1 alleles.Allow complete thawing in orderto dissolve the MgCl2 completelybefore use.
LiPA-Taq 2 x 0.035 ml 56723 Containing Taq DNA polymerase(2 U/µl) and 0.03 % NaN3 aspreservative. Keep at -15/-25°C until immediatelybefore use.
Materials required but not provided
- Materials for DNA extraction.- Disposable gloves.- Disposable sterile pipette tips (preferably cotton-plugged).- Sterile microtubes.- Microtube racks.- Microtube centrifuge.- DNA thermal cycler and equipment.- Pipettes adjustable to deliver 1 - 20 µl, 20 - 200 µl, and 200 - 1000 µl.- Autoclaved distilled water.- Mineral oil (if required).
Safety and environment
- Please refer to the Material Safety Data Sheet (MSDS) andproduct labelling for information on potentially hazardouscomponents. The most recent MSDS version is available on thewebsite www.innogenetics.com.
- Specimens should always be handled as potentially infectious.- Use of personal protective equipment is necessary: gloves and safety
spectacles when manipulating dangerous or infectious agents.- Waste should be handled according to the institution's waste disposal
guidelines. All federal, state, and local environmental regulationsshould also be observed.
INNOGENETICS®
8
Specimen collection, preparation and storage
DNA Extraction
Commonly used salting-out DNA extraction methods or methods based onspin columns can be used to prepare genomic DNA starting from acid-citrate-dextrose (ACD)- or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)-anticoagulated whole blood samples.
Store the DNA samples at -15/-25°C.
The extracted DNA should have a concentration ≥ 0.01 µg/µl. Thepurity (A260nm/A280nm) should be ≥ 1.5.
NOTE:- Reagents are not supplied.
PCR mix preparation
Each component must be added, and supplied in the right amount. Toomuch or too little sample or reagents might result in aspecificamplification or even in no amplification at all.
PCR cycling
The right temperature profile for the INNO-LiPA HLA-DRB decodershould be selected.
Remarks and precautions
- In order to avoid DNA contamination, a maximum physicalseparation between the pre- and post-amplification steps isrecommended: separate rooms, separate pipettes and other labmaterial, separate lab coats and gloves (and their stock) are minimumprecautions for good laboratory practice. The reagents should beisolated from any source of contaminating DNA, especiallyamplified DNA products. Also avoid microbial contamination ofreagents.
- The reagents for amplification processes should be handled in aroom free of amplified DNA. Autoclaved tubes and pipette tips(preferably cotton-plugged) should be used.
- Avoid any return from the post-amplification room to thepreamplification room.
INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplification
9
- All pipette tips and tubes used for the amplification process shouldbe autoclaved. Pipette tips with cotton plugs are recommended. Usea new sterile pipette tip for each aliquoted specimen.
- After thawing, vortex Amplification Buffer and Primer Solution, andspin down all reagents, especially LiPA-Taq.
Test procedure
- This protocol for the amplification of exon 2 of the DRB alleles wasdesigned for optimal amplification using GeneAmp™ PCR tubes(0.5 ml) and PE-480 (Perkin Elmer Cetus) thermal cyclers, orMicroAmp® PCR tubes (0.2 ml) and PE-2400 or PE-9600 (PerkinElmer Cetus) thermal cyclers, and LiPA-Taq. This protocol can beused for most commercial types of thermal cyclers, but may requiresome modifications indicated by the manufacturer of the cycler.
- Prior to use, determine whether the protocol is compatible with thethermal cycler in use at your laboratory. Ensure the thermal cycleris calibrated prior to use.
- Take the necessary precautions to avoid non-specific amplification,which may impair the results:• Perform the pipetting steps on ice and without delay.• Pre-heat (95°C) the heating block of the thermal cycler before
inserting the samples, and immediately start the cycling processafterwards.
1. Dilute each genomic DNA to a concentration between 0.01 and 0.02 µg/µl in TE buffer.
2. Determine the number of vials to be prepared (N) as:N = number of DNA samples + 1 (negative control; no DNA) + 1.Using cotton-plugged pipette tips prepare a master mix in anautoclaved 1.5 ml tube:For DRB1+3+4+5 and 86V amplification:
(N x 24.5 µl) autoclaved distilled water+ (N x 10 µl) Amplification Buffer + (N x 10 µl) Primer Solution (DRB1+3+4+5 or 86V)+ (N x 0.5 µl) LiPA-Taq (N x 1U)For DRB1 and 86G amplification:
(N x 24 µl) autoclaved distilled water+ (N x 10 µl) Amplification Buffer + (N x 10 µl) Primer Solution (DRB1or 86G)+ (N x 1µl) LiPA-Taq (N x 2U)
INNOGENETICS®
10
The total volume of this amplification mix is now (N x 45 µl).Vortex briefly and aliquot 45 µl of this master mix into (N-1)autoclaved amplification tubes.
3. Add 2 drops (~ 40 µl) of mineral oil into each tube if required (e.g. when using the PE-480).Pipette 5 µl (0.05 to 0.1 µg) of the genomic DNA preparation(through the mineral oil if required).Add 5 µl of distilled water (no DNA) to the negative control tube.NOTE:• Do not vortex or mix.• Check that the amplification mixture is at the bottom of the tube.
4. Place the samples into the pre-heated and calibrated thermal block(see instructions indicated by the manufacturer of the thermalcycler). Start the amplification program designed for the DRBdecoder amplification.DRB decoder amplification profile:
NOTE:• The same amplification profiles are used for all INNO-LiPA
HLA class II products, except for INNO-LiPA HLA-DPBAmplification.
5. After the amplification process, use the samples immediately withthe INNO-LiPA HLA-DRB decoder test strips or store the samples at-15/-25°C.NOTE:• Do not store the amplified DNA products together with unused
- The presence of the amplified product can be checked in a 2%agarose gel. Load 10 µl of amplified product per slot. The ampliconshould appear as a single band with a length of 280 bp.
NOTE:• The DRB1 Primer Solution is a primer set that may result in the
formation of primer-dimers. These will not affect the testresults.
- In-house observations indicate that, if a band with a length of ~ 280 bpis visible after checking 10 µl of the amplified product on a 2% agarosegel, an interpretable result should be given by the LiPA assay.
Validation
- Include at least one positive and one negative control each time anamplification is performed. As with any new laboratory procedure,the inclusion of additional positive and negative controls should beconsidered until a high degree of confidence is reached in the abilityto correctly perform the test procedure.If the inclusion of an additional positive control is desirable, use aknown positive sample.
- If a positive band is obtained in the gel for the negative control, the entirerun should be discarded and the complete procedure should be repeated.
Limitations of the procedure
- Use of this product should be limited to personnel well trained in thetechniques of amplification.
- Polymerase inhibition (e.g. by heparin, haemoglobin) might be thereason for complete failure of the assay.
- Powder from disposable gloves and sodium hypochlorite have aninhibiting effect on amplification.
- Due to the aberrant sequence of the DRB1*1130 allele at the DRB1primer position, no amplification with the DRB1 primer set isexpected for this allele.
INNOGENETICS®
12
- The sequence at the primer binding site is not known for all alleles. Therisk of mismatch at the primer site is considered to be very low asprimer failure has never been observed and more than 80 allelesspanning all groups have been tested. However, the possibility of allelicdrop-out should be considered in the event of a homozygous result.
- Good laboratory practice and careful performance of the procedurespreviously specified, allow specific amplification.
Test performance
INNO-LiPA HLA-DRB decoder has been evaluated in three European andtwo North American tissue typing laboratories on routine typing samples.
In the study a total of 136 samples were tested with INNO-LiPAHLA-DRB decoder.
There were no INNO-LiPA HLA-DRB decoder amplification failuresduring the study.
Français
Symboles utilisés
Trousse d'amplification
Fabriqué par
Produit pour diagnostic in vitro
Numéro du lot
Référence catalogue
Utiliser avant
Instructions d’emploi
Risque biologique
INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplification
13
Température de stockage
Conditionnement suffisant pour <n> tests
Tampon Amplification
Solution Primers DRB1+3+4+5
Solution Primers 86G
Solution Primers 86V
Solution Primers DRB1
LiPA-Taq
But du test
Le kit INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplification, à usage in vitro, est destiné à l'amplification des acides nucléiques de l'exon 2 des loci HLA-DRB1, DRB3, DRB4 et DRB5 (human leukocyte antigen). La réaction est réalisée par des réactions en chaîne de polymérisation (PCR).
Principe du test
L'ADN de l'échantillon à amplifier par PCR est introduit dans un milieuréactionnel contenant en excès des désoxynucléosides 5'-triphosphates(dNTPs), des primers biotinylés et de l'ADN polymérase thermostable.Les primers amplifient l'exon 2 du locus DRB1.
Par chauffage, les deux brins de l'hélice ADN se séparent (dénaturation)ouvrant les séquences cibles aux primers. En abaissant la température àune température spécifique, les primers vont se fixer aux régions deséquences complémentaires encadrant la séquence cible (annealing). A une autre température spécifique, l'ADN polymérase va utiliser lesdNTPs en excès pour faire une élongation des primers fixés le long du brind'ADN cible (extension). Ainsi, deux copies biotinylées de la séquence
-25˚C
-15˚C
INNOGENETICS®
14
d'ADN cible sont produites après un cycle. Après 35 cycles, un nombreimportant de copies biotinylées de la séquence cible sont obtenues.
RéactifsDescription, préparation et conditions de conservation
- Maintenus entre -15/-25°C, dans le flacon d'origine, les réactifs sontstables jusqu'à la date de péremption du kit. Après la premièreutilisation, il est recommandé d'aliquoter les réactifs (sauf LiPA-Taq)et de les conserver entre -15/-25°C. Ne pas utiliser les réactifs au-delà de la date de péremption du kit.
- Les réactifs doivent être stockés isolés de toute source d'ADNcontaminant, spécialement des produits ADN amplifiés.
- L'altération de l'apparence physique des réactifs peut indiquer uneinstabilité ou une détérioration.
Composant Quantité Réf. DescriptionTampon Amplification 4 x 0.3 ml 56982 Contient tous les dNTPs et 0.05%
NaN3 comme conservateur.Laisser décongeler avant emploi.
Solution PrimersDRB1+3+4+5 1 x 0.3 ml 56989 Contient les primers biotinylés
pour l'amplification de l'exon 2des allèles DRB1+3+4+5, MgCl2et 0.05% NaN3 commeconservateur. Laisser parfaitementdécongeler afin de dissoudrecomplètement le MgCl2 avantemploi.
Solution Primers 86G 1 x 0.3 ml 56988 Contient les primers biotinylés
pour l'amplification spécifique del'exon 2 des allèles DRBprésentant une séquence G ou Dau codon 86, MgCl2 et 0.05%NaN3 comme conservateur.Laisser parfaitement décongelerafin de dissoudre complètement leMgCl2 avant emploi.
INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplification
15
Solution Primers 86V 1 x 0.3 ml 56987 Contient les primers biotinylés
pour l'amplification spécifique del'exon 2 des allèles DRBprésentant une séquence V aucodon 86, MgCl2 et 0.05% NaN3comme conservateur. Laisserparfaitement décongeler afin dedissoudre complètement le MgCl2avant emploi.
Solution Primers DRB1 1 x 0.3 ml 56984 Contient les primers biotinylés
pour l'amplification de l'exon 2des allèles DRB1, MgCl2 et0.05% NaN3 commeconservateur. Laisser parfaitementdécongeler afin de dissoudrecomplètement le MgCl2 avantemploi.
LiPA-Taq 1 x 0.035 ml 56723 Contient la Taq ADN polymérase (2 U/µl) et 0.03% NaN3 commeconservateur. Maintenir entre -25/-15°C jusqu'à l'instant del'emploi.
Matériel nécessaire non fourni
- Matériels pour extraction ADN- Gants jetables- Embouts de pipette stériles jetables (de préférence, avec filtre coton)- Microtubes stériles- Portoirs pour microtubes- Centrifugeuse pour microtubes- Thermocycleur et équipement- Pipettes ajustables pour les volumes 1 - 20 µl, 20 - 200 µl,
- Veuillez vous référer à la Fiche de Données de Sécurité (FDS) et àl'étiquetage des produits pour toute information sur les composantspotentiellement dangereux. La version la plus récente de la FDS estdisponible sur notre site web www.innogenetics.com.
- Les échantillons doivent toujours être manipulés commepotentiellement infectieux
- Utiliser un équipement de protection: gants et écrans de protectionlors de la manipulation d'agents dangereux ou infectieux.
- Les déchets devront être éliminés selon les directives en vigueur etles règlements pour la préservation de l'environnement.
Echantillons: recueil, préparation et conservation
Extraction ADN
Les méthodes d'extraction ADN communément utilisées, précipitation ousur colonne, peuvent être utilisées pour préparer l'ADN génomique àpartir d'échantillons de sang recueilli sur ACD (acide -citrate-dextrose) ouEDTA (acide ethylenediaminetetraacétique).
Conserver les extraits ADN entre -15/-25°C.
Les extraits ADN doivent avoir une concentration ≥ 0.01 µg/µl. La pureté (A260nm/A280nm) devra être ≥ 1.5.
NOTE:- Les réactifs ne sont pas fournis
Préparation du mélange PCR
Chaque composant doit être ajouté et présent à la bonne concentration.Trop ou pas assez d'échantillon ou de réactifs peut conduire à uneamplification aspécifique ou même à une absence d'amplification.
Amplification PCR
Le programme d'amplification défini pour INNO-LiPA HLA-DRBdecoder doit être sélectionné.
INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplification
17
Remarques et précautions
- Pour éviter toute contamination ADN, une séparation physiquemaximale est recommandée entre les étapes de pré- et post-amplification: pièces séparées, pipettes et matériel de laboratoiredistincts, gants et blouses (et leur stock) séparés sont des précautionsminimum pour une bonne pratique de laboratoire. Les réactifsdoivent être isolés de toute source de contamination ADN, plusparticulièrement de produits amplifiés. Eviter aussi lescontaminations microbiennes des réactifs.
- Les réactifs pour amplification doivent être manipulés dans une piècedépourvue d'ADN amplifié. Utiliser des tubes et des embouts depipettes (de préférence avec filtre coton) autoclavés.
- Eviter de retourner en zone pré-amplification après un passage enpost-amplification.
- Les tubes et les embouts de pipette doivent être autoclavés. Desembouts avec filtre coton sont recommandés. Utiliser un nouvelembout stérile à chaque aliquote d'échantillon.
- Après décongélation, homogénéiser au vortex le tamponAmplification et la solution Primers, puis centrifuger brièvement tousles réactifs, spécialement LiPA-Taq.
Procédures
NOTE:- Ce protocole pour amplification de l'exon 2 des allèles DRB a été
préparé pour une amplification optimale en utilisant les tubes PCRGeneAmp™ (0.5ml) et thermocycleur PE-480 (Perkin Elmer Cetus)ou les tubes PCR MicroAmp™ (0.2 ml) et thermocycleur PE-2400,PE-9600 (Perkin Elmer Cetus) et LiPA-Taq.D'autres thermocycleurs peuvent être employés mais peuventnécessiter des modifications selon les indications du fabricant.
- Avant utilisation, déterminer si le protocole est compatible avec lethermocycleur du laboratoire. S'assurer que le thermocycleur estcorrectement calibré.
- Pendre les précautions nécessaires pour éviter toute amplificationnon-spécifique pouvant affecter les résultats:• Réaliser les étapes de pipetage en maintenant les tubes dans de
la glace, et sans interruption.• Préchauffer le bloc chauffant du thermocycleur (95°C) avant
d'insérer les tubes et démarrer immédiatement le programmed'amplification.
INNOGENETICS®
18
1. Diluer chaque extrait ADN à une concentration entre 0.01 et 0.02 µg/µl en tampon TE.
2. Déterminer le nombre de tubes (N) nécessairesN = Nombre d'échantillons + 1 Contrôle négatif (sans ADN) + 1Avec des embouts stériles munis de filtre coton, préparer unmastermix dans un tube (1.5 ml) autoclavé:Pour les amplifications DRB1+3+4+5 et 86V:
(N x 24.5 µl) Eau distillée autoclavée+ (N x 10 µl) Tampon Amplification+ (N x 10 µl) Solution Primers DRB1+3+4+5 ou 86V+ (N x 0.5 µl) LiPA-Taq (N x 1 U) Pour les amplifications DRB1 et 86G:
(N x 24 µl) Eau distillée autoclavée+ (N x 10 µl) Tampon Amplification+ (N x 10 µl) Solution Primers DRB1 ou 86G + (N x 1 µl) LiPA-Taq (N x 2 U) Le volume total du Mastermix est de N x 45 µl. Vortexer brièvement et aliquoter 45 µl de ce mastermix dans N-1.tubes autoclavés pour amplification.
3. Si nécessaire, ajouter 2 gouttes (~ 40 µl) d'huile minérale danschaque tube (e. g. PE-480). Introduire 5 µl (0.05 à 0.1 µg) d'ADN génomique extrait (à traversl'huile minérale si présente) et 5 µl d'eau distillée dans le tubeContrôle Négatif (sans ADN).NOTE: • Ne pas mélanger.• Vérifier que le mélange réactionnel est au fond du tube.
4. Placer immédiatement les tubes dans le bloc préchauffé et calibré duthermocycleur (voir les instructions fournies par le fabricant duthermocycleur). Démarrer le programme d'amplification INNO-LiPAHLA-DRB decoder.Programme d'amplification INNO-LiPA HLA-DRB decoder
Thermocycleurs PE-480 PE-2400PE-9600
Etape température temps temps±0.75°C
1. Dénaturation 95°C 5 min. 5 min.2. Dénaturation 95°C 30 sec. 20 sec. Répéter3. Annealing 58°C 20 sec. 20 sec. cycle 4. Extension 72°C 30 sec. 20 sec. < 2-4 >5. Elongation 72°C 10 min 10 min. 35 fois
INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplification
19
NOTE: • Le même programme pour amplification est utilisable pour tous
les produits INNO-LiPA HLA classe II excepté INNO-LiPAHLA-DPB Amplification.
4. Après l'amplification, procéder immédiatement au test INNO-LiPAHLA-DRB decoder ou conserver les échantillons entre -15/-25°C.NOTE:• Ne pas conserver les produits amplifiés avec des réactifs pour
amplification non utilisés.
Résultats
Visualisation
- La présence des amplicons peut être vérifiée en gel d'agarose 2%.Déposer 10 µl de chaque produit amplifié dans un puits sur le gel.L'amplicon doit apparaîre sous la forme d'une bande unique de 280 pb.NOTE: • La solution Primers DRB1 peut entraîner la formation de
primer-dimers, sans effet sur le résultat.- Sur la base d'observations internes, si une bande d'environ 280 pb est
visible après dépôt de 10µl de produit amplifié sur un gel d'agarose à2%, un résultat interprétable peut être obtenu par test LiPA.
Validation
- Inclure au moins un contrôle négatif et un contrôle positif danschaque série d'amplification. Comme pour toute nouvelle procédure,l'inclusion de contrôles négatifs et positifs supplémentaires peut êtreenvisagée jusqu'à maîtrise parfaite du test avec un niveau deconfiance élevé. Si l'inclusion d'un contrôle positif est envisagée,utiliser un échantillon positif connu.
- Si une bande positive est obtenue sur le gel pour le contrôle négatif,la série entière doit être invalidée et une procédure complète doit êtrerecommencée.
Limites du test
- L'utilisation de ce test doit être restreinte au personnel ayant reçu uneformation pour les techniques d'amplification génomique.
- Une inhibition de la polymérase (e. g. héparine, hémoglobine) peutconduire à un échec complet d'amplification.
INNOGENETICS®
20
- Le talc des gants jetables et l'hypochlorite de sodium ont un effetinhibiteur sur l'amplification.
- En raison de la séquence anormale de l'allèle DRB1*1130 au site defixation des primers DRB1, aucune amplification avec la solutionprimer DRB1 n'est attendue pour cet allèle.
- La séquence au site de fixation des primers n'est pas connue pourtous les allèles. Le risque de mésappareillement au site de fixationdes primers est considéré comme extrêmement faible puisque l'échecd'amorçage des primers n'a jamais été observé et que 80 allèlescouvrant tous les groupes ont été testés. Cependant, la possibilitéd'un manquement d'allèle ne peut pas être totalement exclue face àun résultat homozygote.
- Les bonnes pratiques de laboratoire et le respect des précautions demanipulation spécifiées assurent une amplification spécifique.
Performances
Les performances du kit INNO-LiPA HLA-DRB decoder ont été évaluéesdans 3 laboratoires européens et 2 laboratoires nord américainsd'histocompatibilité sur des échantillons de routine à typer.
Au total, 136 échantillons ont été analysés avec INNO-LiPA HLA-DRBdecoder.
Aucun échec d'amplification INNO-LiPA HLA-DRB decoder n'a étérencontré au cours de cette étude.
Deutsch
Verwendete Symbole
Amplifikationskit
Hersteller
Hilfsmittel für die medizinische In vitroDiagnostik
Chargennummer
INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplification
21
Katalognummer
Durchführung durch
Siehe Bedienungsanleitung
Biogefährdung
Temperaturlimits
Inhalt ausreichend für <n> Tests
Amplifikationspuffer
DRB1+3+4+5 Primerlösung
86G Primerlösung
86V Primerlösung
DRB1 Primerlösung
LiPA-Taq
Beabsichtigter Verwendungszweck
Der INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplifikations-Testkit istausschließlich für die in-vitro-Verwendung bestimmt. Er dient derAmplifikation der Nukleinsäuren des zweiten Exons des humanenLeukozytenantigen (HLA) Locus DRB1, DRB3, DRB4 und DRB5. Die Reaktion wird mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) ineinem Multiplexformat durchgeführt.
-25˚C
-15˚C
INNOGENETICS®
22
Funktionsweise des Tests
Die DNA-Probe, die mittels PCR amplifiziert werden soll, wird in eineReaktionsmischung gegeben, die einen Puffer mit einem Überschuss anDeoxynukleosid-5'-Triphosphaten (dNTPs), biotinylierten Primern undhitzestabiler DNA-Polymerase enthält. Die Primer amplifizieren dieDNA-Zielsequenz des Exon 2 der spezifischen DRB Allele.
Durch Erhitzen werden beide Stränge der DNA-Doppelhelix voneinandergetrennt (= Denaturierung), sodass die Zielsequenzen der Primerfreiliegen. Bei Abkühlung auf eine bestimmte Temperatur binden diesePrimer an komplementäre Regionen, die die Zielsequenz flankieren(Annealing). Bei einer anderen bestimmten Temperatur verlängert diethermostabile DNA-Polymerase mit Hilfe der überschüssigen dNTPsgebundenen Primer die Zielsequenz (Verlängern). Auf diese Weiseentstehen nach einem Zyklus zwei exakte biotinylierte Kopien derZielsequenz. Nach 35 Zyklen hat sich eine sehr große Zahl biotinylierterKopien der Zielsequenz gebildet.
Gelieferte Materialien
Beschreibung, Vorbereitung,empfohlenene Lagerung und Haltbarkeit
- Der Kit muss so aufbewahrt werden, dass er auf keinen Fall durchandere DNA, vor allem amplifizierte DNA, kontaminiert werdenkann.
- Alle Reagenzien sind bei Aufbewahrung in den Originalgefäßen bei -15/-25°C bis zum angegebenen Verfallsdatum stabil. Es wirdempfohlen, alle Reagenzien nach erstmaligen Gebrauch zualiquotieren und bei -15/-25°C einzufrieren.
- Alle Änderungen im physischen Erscheinungsbild der Kit-Reagenzien können auf Instabilität oder Zersetzung hinweisen.
- Verwenden Sie den Kit nicht nach Ablauf des Verfalldatums.
Bestandteil Menge Ref. BeschreibungAmplifikations-puffer 4 x 0.3 ml 56982 Enthält alle dNTPs und 0,05%
DRB1+3+4+5 Primerlösung 1 x 0.3 ml 56989 Enthält biotinylierte Primer,
MgCl2, Trispuffer and 0.05%Natriumazid alsKonservierungsmittel für dieAmplifikation des Exon 2 derDRB1+3+4+5 Allele. VorVerwendung vollständig auftauen.Das MgCl2 muss vollständiggelöst sein. Auf 20 - 25°Cerwärmen.
86G Primer-lösung 1 x 0.3 ml 56988 Enthält biotinylierte Primer,
MgCl2, Trispuffer and 0.05%Natriumazid alsKonservierungsmittel für dieSequenz-spezifischeAmplifikation des Exon 2 derDRB Allele mit einem G oder Din der Sequenz im Codon 86. VorVerwendung vollständig auftauen.Das MgCl2 muss vollständiggelöst sein. Auf 20 - 25°Cerwärmen
86VPrimerlösung 1 x 0.3 ml 56987 Enthält biotinylierte Primer,
MgCl2, Trispuffer and 0.05%Natriumazid alsKonservierungsmittelKonservierungsmittel für dieSequenz-spezifischeAmplifikation des Exon 2 derDRB Allele mit einem V in derSequenz im Codon 86. VorVerwendung vollständig auftauen.Das MgCl2 muss vollständiggelöst sein. Auf 20 - 25°Cerwärmen.
INNOGENETICS®
24
DRB1 Primerlösung 1 x 0.3 ml 56984 Enthält biotinylierte Primer,
MgCl2, Trispuffer and 0.05%Natriumazid alsKonservierungsmittel für dieAmplifikation des Exon 2 desDRB1 Allels. Vor Verwendungvollständig auftauen. Das MgCl2muss vollständig gelöst sein. Auf20 - 25°C erwärmen.
LiPA-Taq 2 x 0.035 ml 56723 Enthält Taq DNA-Polymerase (2 U/µl) und 0,05% Natriumazidals Konservierungsmittel. Bisunmittelbar vor Verwendung bei -15/-25°C aufbewahren.
Zusätzlich benötigte Materialien
- Materialien für die DNA-Extraktion.- Einweghandschuhe.- Sterile Einmalpipettenspitzen (möglichst mit Wattestopfen).- Sterile Mikrogefäße.- Racks für Mikrogefäße.- Mikrozentrifuge.- DNA-Thermocycler und Zubehör.- Pipetten mit variablem Volumen: 1 - 20 µl, 20 - 200 µl und
- Bitte beachten Sie die Sicherheitsdatenblätter des Herstellersund die Produktkennzeichnung bezüglich potenziell gefährlicherSubstanzen. Die neueste Version dieser Sicherheitsdatenblätterdes Herstellers finden Sie unter www.innogenetics.com.
- Behandeln Sie alle Proben als potenziell gefährdend.- Verwenden Sie Schutzkleidung, wenn notwendig: bei der Arbeit mit
infektiösen oder gefährlichen Substanzen Handschuhe undSchutzbrille tragen.
INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplification
25
- Bei Beseitigung der Chemikalien sind neben hausinternenVorschriften die entsprechenden Gesetze bzw. Verordnungen der EG-Mitgliedsländer, der Bundesrepublik Deutschland und derBundesländer zu beachten.
Entnahme, Herstellung und Aufbewahrung der Proben
HINWEIS:- Die für diese Arbeitsschritte benötigten Reagenzien sind nicht im
Lieferumfang enthalten.
DNA-Extraktion
Zur Herstellung genomischer DNA können Blutproben verwendet werden,die ACD (=Acid-Citrat-Dextrose) oder EDTA(Ethylendiamintetraessigsäure) als Antikoagulanz enthalten. Zur Isolationkönnen die bekannten Methoden (DNA-Fällung durch Aussalzen oderSäulenextraktion) verwendet werden.
DNA-Proben bei -15/-25°C aufbewahren.
Die extrahierte DNA muss in einer Konzentration von ≥ 0,01 µg/µlvorliegen. Die Reinheit (A260nm/A280nm) muss ≥ 1,5 sein.
Herstellen des PCR-Mix
Alle Bestandteile müssen in den angegebenen Mengen zugegeben werden.Bei Zugabe von zuviel oder zuwenig Probe oder Reagens kann dieAmplifizierungsreaktion unspezifisch oder möglicherweise gar nichtablaufen.
PCR-Cycling
Für den INNO-LiPA HLA-DRB decoder muss das angegebeneTemperaturprofil eingestellt werden.
INNOGENETICS®
26
Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen
- Zur Vermeidung von Kontamination sollten die Arbeitsschritte vorund nach der Amplifikation räumlich voneinander getrennt werden.Zur Einhaltung der Guten Laborpraxis (GLP) wird dringend dieVerwendung getrennter Gefäße, Pipetten etc. und auch das Tragengetrennter Laborkittel und -handschuhe empfohlen. Die Reagenziensollten so aufbewahrt werden, dass sie auf keinen Fall mit andererDNA, vor allem mit amplifizierter DNA, kontaminiert werdenkönnen. Die Reagenzien dürfen außerdem nicht mikrobiellkontaminiert sein.
- Die Reagentien für die Amplifikation sollten in einem Raumgehandhabt werden, der frei von amplifizierter DNA ist.
- Vermeiden Sie, zwischen den beiden Arbeitsplätzen hin- undherzugehen.
- Alle für die Amplifikation verwendeten Reaktionsröhrchen undPipettenspitzen (möglichst mit Wattestopfen) müssen autoklaviertsein. Verwenden Sie Einmalprodukte, und verwerfen Sie diese nacheinmaligem Gebrauch.
- Mischen Sie Amplifikationslösung und Primerlösung nach demAuftauen kurz auf einem Vortex-Mischer durch und zentrifugierenSie danach alle Reagenzien kurz, vor allem die LiPA-Taq.
Arbeitsablauf
HINWEIS:- Das hier beschriebene Amplifikationsprotokoll für die Amplifikation
von Exon 2 der HLA-DRB Allele ist optimiert für das Arbeiten mitGeneAmp™ PCR-Gefäßen (0,5 ml) und einem Thermocycler PE-480 (Perkin Elmer) oder MicroAmp® PCR-Röhrchen (0,2 ml)und einem Thermocycler PE-2400 oder PE-9600 (Perkin Elmer)unter Verwendung von LiPA-Taq.Das Arbeitsprotokoll ist für die meisten handelsüblichenThermocycler geeignet, muss aber unter Umständen für denjeweiligen Gerätetyp optimiert werden.
- Vor der Testdurchführung muss überprüft werden, inwieweit dasArbeitsprotokoll für den von Ihnen verwendeten Thermocyclergeeignet ist. Vor Verwendung muss der Thermocycler kalibriertwerden.
INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplification
27
- Treffen Sie die erforderlichen Vorsichtsmaßnahmen, umunspezifische Amplifikation und Bildung von Primer-Dimeren zuverhindern, weil dadurch die Qualität der Versuchsergebnissebeeinträchtigt werden könnte:• Alle im folgenden beschriebenen Pipettierschritte müssen
unverzüglich und im Eisbad durchgeführt werden.• Vor Einsetzen der Proben den Thermocycler auf 95°C erhitzen
und sofort mit der ersten Amplifikationsrunde beginnen.1. Genomische DNA mit TE-Puffer auf Konzentration zwischen 0,01
und 0,02 µg/µl verdünnen.2. Anzahl der benötigten Gefäße (N) bestimmen:
N = Anzahl DNA-Proben + 1 (Negativkontrolle ohne DNA) + 1. Mit Hilfe einer Pipette mit Baumwollstopfen wird in einemautoklavierten, nukleasefreien Mikrozentrifugenröhrchen eineGesamtlösung (Mastermix) hergestellt:Für die DRB1+3+4+5 und die 86V-Amplifikation:
(N x 24,5 µl) autoklaviertes destilliertes Wasser+(N x 10 µl) Amplifikationspuffer +(N x 10 µl) Primerlösung (DRB1+3+4+5 oder 86V)+(N x 0,5 µl) LiPA-Taq (N x 2 U)Für die DRB1 und 86G-Amplifikation:
(N x 24 µl) autoklaviertes destilliertes Wasser+(N x 10 µl) Amplifikationspuffer +(N x 10 µl) Primerlösung (DRB1 oder 86G)+(N x 1 µl) LiPA-Taq (N x 2 U)Das Gesamtvolumen beträgt nun (N x 45 µl). Kurz auf Vortex-Mischer durchmischen und 45-µl-Aliquots der Gesamtlösung in (N - 1) autoklavierte Amplifikationsgefäße einpipettieren.
3. Gegebenenfalls (z.B. bei Versuchsdurchführung mit PE-480) 2 Tropfen (~ 40 µl) Mineralöl in jedes Röhrchen geben.5 µl (0,05 bis 0,1 µg) der genomischen DNA zugeben(gegebenenfalls durch die Mineralölschicht hindurch). In das Röhrchen für die Negativkontrolle (ohne DNA) 5 µldestilliertes Wasser geben.HINWEIS:• Nicht schütteln (Vortex) oder mischen.• Sicherstellen, dass die Amplifikationsmischung sich auf dem
Röhrchenboden befindet!
INNOGENETICS®
28
4. Proben in den vorgeheizten und kalibrierten Thermoblock stellen(Hinweise des Geräteherstellers beachten). Das spezifischeAmplifikationsprogramm für die INNO-HLA-DRB decoder-Amplifikation starten.Amplifikationsprofil für INNO-LiPA HLA-DRB decoder:
HINWEIS:• Dieses Amplifikationsprofil ist für alle INNO-LiPA HLA Klasse II
Produkte außer für den INNO-LiPA HLA-DPB geeignet.5. Sofort nach der Amplifikation die Proben auf die INNO-LiPA
HLA-DRB decoder Streifen auftragen oder bei -15/-25°C einfrieren.HINWEIS:• Amplifizierte DNA-Produkte nicht mit unbenutzten
Amplifikationsreagenzien zusammen aufbewahren.
Ergebnisse
Visualisierung
- Die Präsenz von amplifizierten Material kann durch Trennung ineinem 2%-igen Agarosegel geprüft werden. Jede Bahn wird mit 10 µlAmplifikationsprodukt beladen. Das Amplifikat sollte ale einzelneBande einer Größe von 280 bp sichtbar sein.HINWEIS:• Die DRB1-Primerlösung ist eine Primermischeung, die Primer-
Dimere bilden kann. Dieses hat jedoch keinen Einfluß auf dieTestergebnisse.
- Interne Untersuchungen haben ergeben, dass die erhaltenenAmplifikationsprodukte für den LIPA-Test geeignet sind, wenn beiDurchführung des oben angegebenen Verfahrens (10 µlAmplifikationsprodukt, 2%-iges Agarosegel) eine normale Bandevon ca. 280 bp zu sehen ist.
Primer wiederholen 4. Primer verlängern 72°C 30 sec 20 sec5. Verlängern 72°C 10 min 10 min
INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplification
29
Validierung
- Bei jeder Amplifikationsserie müssen mindestens je eine Positiv- undeine Negativkontrolle mitgeführt werden. Wie bei jedem neuenLaborverfahren müssen so lange Positiv- und Negativkontrollenmitgeführt werden, bis die Erfahrung zeigt, dass deren Durchführungzu zuverlässigen Ergebnissen führt. Auf Wunsch kann auchzusätzlich eine bekannt positive Probe mitgeführt werden.
- Tritt bei der Negativkontrolle im Gel eine positive Bande auf, mussdie gesamte Serie verworfen werden, und der gesamte Ablauf musswiederholt werden.
Einschränkungen des Verfahrens
- Der Test darf nur von Laborpersonal ausgeführt werden, das dieTechnik der DNA-Amplifikation bereits beherrscht.
- Der Test kann vollständig zu negativen Ergebnissen führen, wenn diePolymerase z.B. durch Heparin oder Hämoglobin inhibiert wurde!
- Pulver von Einmalhandschuhen und Natriumhypochlorit inhibierendie Amplifikation.
- Wiederholtes Auftauen und Einfrieren der DNA-Proben kann denWirkungsgrad der Amplifikation beeinträchtigen.
- Bedingt durch eine abweichende Sequenz des DRB1*1130 Allels ander DRB1 Primer-Position, ist für dieses Allel keine Amplifikationzu erwarten.
- Die Sequenz an der Primerposition ist nicht für alle Allele bekannt.Die Gefahr von Fehlpaarungen an dieser Stelle ist sehr gering. Bisherwurden keine Fehlpaarungen beobachtet, obwohl mehr als 80 Allelegetestet wurde, die Allele aller Gruppen enthielt. Jedoch sollte imFall eines homozygoten Ergebnisses die Möglichkeit in Betrachtgezogen werden, dass ein Allel ausgefallen ist.
- Die Einhaltung der Guten Laborpraxis (GLP) und sorgfältigeDurchführung aller Arbeitsschritte werden dringend empfohlen, umspezifische Amplifikationsergebnisse zu erzielen.
Leistungsfähigkeit des Tests
- Der INNO-LiPA HLA-BRB decoder wurde in drei europäischen undzwei nordamerikanischen Gewebetypisierungslabors mitRoutinetypisierungsproben evaluiert. Insgesamt wurden 136 Probenmit dem INNO-LiPA HLA-DRB decoder getestet.
INNOGENETICS®
30
- Während dieser Studie gab es keine Amplifikationsausfälle mit demINNO-LiPA DRB decoder-Amplifikationskit
Italiano
Simboli utilizzati
Kit de amplificación
Prodotto da
Dispositivo medico - diagnostico in vitro
Numero di lotto
Codice
Uso
Consultare le istruzioni per l’uso
Rischio Biologico
Limiti di temperatura
Contenuto sufficiente per <n> test
Amplification Buffer
DRB1+3+4+5 Primer Solution
86G Primer Solution
86V Primer Solution
-25˚C
-15˚C
INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplification
31
DRB1 Primer Solution
LiPA-Taq
Uso previsto
Il kit (per uso diagnostico in vitro) INNO-LiPA HLA-DRB decoderamplification è stato progettato per l'amplificazione del secondo esone deiloci DRB1, DRB3, DRB4 e DRB5 dell'antigene leucocitario umano(HLA). La reazione è condotta per mezzo della reazione polimerasica acatena (PCR).
Principio del test
Il campione di DNA da amplificare mediante PCR viene aggiunto ad unamiscela di reagenti contenente un eccesso di deossinucleosidi 5'-trifosfati(dNTP), primers biotinilati e DNA polimerasi termostabile. I primersamplificheranno l'esone 2 di tutti o di specifici alleli DRB (vedi sotto).Mediante riscaldamento, le due catene dell'elica di DNA vengono separate(denaturazione) in modo da esporre le sequenze target ai primers. Questi primers sono complementari alle regioni che fiancheggiano lasequenza target. Quindi con il raffreddamento ad una specificatemperatura, i primers si legheranno alla loro regione target (appaiamento).
Ad un'altra temperatura, e utilizzando i dNTP, la DNA polimerasitermostabile estenderà i primers appaiati lungo il templato target(estensione). In tal modo, dopo un ciclo di denaturazione, appaiamento edestensione, si producono due copie identiche biotinilate della sequenzatemplate. Dopo 35 cicli si ottiene un gran numero di copie biotinilatedella sequenza target.
INNOGENETICS®
32
Reagenti
Descrizione, preparazione per l'uso e condizioni di conservazioneraccomandate
- Se mantenuti a -15/-25°C e conservati nei flaconi originali, i reagentisono stabili fino alla data di scadenza del kit. Tuttavia si raccomandadi aliquotare i reagenti (eccetto la LiPA-Taq) dopo il primo utilizzo epoi di conservarli a -15/-25°C. Non utilizzare i reagenti dopo la datadi scadenza del kit.
- I reagenti devono essere conservati lontano da fonti di contaminazionedi DNA, specialmente da prodotti di DNA amplificato.
- Alterazioni nell'aspetto fisico dei reagenti del kit possono indicareinstabilità o deterioramento.
Componente Quantità Rif. DescrizioneAmplification Buffer 4 x 0.3 ml 56982 Contiene tutti i dNTPs e 0.05%
NaN3 come conservante. Lasciarescongelare completamente primadell'uso.
DRB1+3+4+5 Primer Solution 1 x 0.3 ml 56989 Contiene primers biotinilati,
MgCl2, e 0.05% NaN3 comeconservante; per l'amplificazionedell'esone 2 degli alleliDRB1+3+4+5. Lasciarescongelare completamente perdisciogliere l'MgCl2 primadell'uso.
86G Primer Solution 1 x 0.3 ml 56988 Contiene primers biotinilati,
MgCl2, e 0.05% NaN3 comeconservante; per l'amplificazionesequenza specifica dell'esone 2degli alleli DRB che mostrano lasequenza G o D al codone 86.Lasciare scongelarecompletamente per discioglierel'MgCl2 prima dell'uso.
INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplification
33
86V Primer Solution 1 x 0.3 ml 56987 Contiene primers biotinilati,
MgCl2, e 0.05% NaN3 comeconservante; per l'amplificazionesequenza specifica dell'esone 2degli alleli DRB che mostranouna sequenza V al codone 86.Lasciare scongelarecompletamente per disciogliere l'MgCl2 prima dell'uso.
DRB1 Primer Solution 1 x 0.3 ml 56984 Contiene primers biotinilati,
MgCl2, e 0.05% NaN3 comeconservante; per l'amplificazionedell'esone 2 degli alleli DRB1.Lasciare scongelarecompletamente per disciogliere l'MgCl2 prima dell'uso.
LiPA-Taq 2 x 0.035 ml 56723 Contiene Taq DNA polimerasi (2 U/µl) e 0.03% NaN3 comeconservante. Conservare a -15/-25°C fino al momentoimmediatamente primadell'utilizzo.
Materiali richiesti ma non forniti
- Materiali per l'estrazione del DNA. - Guanti monouso.- Puntali sterili monouso (preferibilmente con filtro).- Provette sterili.- Porta provette.- Microcentrifuga.- Thermal cycler e accessori.- Pipette regolabili per volumi da 1 - 20 µl, da 20 - 200 µl,
e da 200 - 1000 µl.- Acqua distillata autoclavata.- Olio minerale (se richiesto).
INNOGENETICS®
34
Sicurezza e ambiente
- Per cortesia fare riferimento alla scheda di sicurezza del prodotto(MSDS) e alla etichettatura del prodotto per ottenere informazionisui componenti potenzialmente pericolosi. La versione più recentedella MSDS è disponibile sul sito Web www.innogenetics.com.
- I campioni devono essere sempre maneggiati come potenzialmentepericolosi.
- E' necessario l'uso di dispositivi di protezione: guanti e occhiali disicurezza quando si manipolano agenti pericolosi o infettivi.
- I rifiuti devono essere smaltiti secondo le linee guida disposte dalleistituzioni. Osservare anche tutte le disposizioni nazionali e locali.
Raccolta dei campioni, preparazione e conservazione
Estrazione del DNA
Per preparare DNA genomico partendo da campioni di sangue intero conacido-citrato-destrosio (ACD) o acido etilendiamminotetracetico (EDTA)come anticoagulante, possono essere utilizzati i comuni metodi diestrazione del DNA salting-out, o i metodi basati sull'estrazione dacolonnine.
Conservare i campioni di DNA a -15/-25°C.
Il DNA estratto dovrebbe avere una concentrazione ≥ 0.01 µg/µl. Lapurezza (A260nm/A280nm) deve essere ≥ 1.5.
NOTA:- I reagenti non sono forniti.
Preparazione della mix di PCR
Ogni componente deve essere aggiunto e dosato nella corretta quantità.Una quantità maggiore o minore di campione o reagenti può causareamplificazioni aspecifiche o anche nessuna amplificazione.
Protocollo di PCR
Deve essere impostato e selezionato il corretto profilo per INNO-LiPAHLA-DRB decoder.
INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplification
35
Note e precauzioni
- Per evitare contaminazioni da DNA, si raccomanda la massimaseparazione fisica fra i passaggi pre- e post-amplificazione: stanzeseparate, pipette e altro materiale di laboratorio dedicati, camici e guantiseparati (e loro scorte) sono le minime precauzioni per una buonapratica di laboratorio. I reagenti devono essere isolati da qualsiasisorgente di DNA contaminante, specialmente dai prodotti di DNAamplificati. Evitare anche la contaminazione microbica dei reagenti.
- Tutti i reagenti per i processi di amplificazione devono esseremaneggiati in una stanza priva di DNA amplificato. Devono essereusati puntali (preferibilmente con filtro) e provette autoclavate.
- Evitare qualsiasi rientro dalla stanza di post-amplificazione allastanza di pre-amplificazione.
- Tutti i puntali e le provette utilizzati devono essere autoclavati. Sonoconsigliati puntali con filtro. Utilizzare un nuovo puntale sterile perogni campione aliquotato.
- Dopo lo scongelamento vortexare l'Amplification Buffer e la PrimerSolution, e centrifugare brevemente i reagenti, particolarmente laLiPA-Taq.
Procedura del Test
- Questo protocollo per l'amplificazione dell'esone 2 degli alleli DRB èstato disegnato per una ottimale amplificazione utilizzando provetteGeneAmp™ PCR (0.5 ml) e thermal cyclers PE-480 (Perkin ElmerCetus), o provette MicroAmp® PCR (0.2 ml) e thermal cyclers PE-2400 o PE-9600 (Perkin Elmer Cetus), e LiPA-Taq. Questoprotocollo può essere usato anche per la maggior parte degli altrithermal cyclers, ma può richiedere alcune modifiche indicate dalproduttore dello strumento.
- Prima dell'uso, determinare se il protocollo è compatibile con ilthermal cycler in uso nel vostro laboratorio. Assicurarsi che ilthermal cycler sia calibrato, prima dell'uso.
- Adottare le necessarie precauzioni per evitare amplificazioni nonspecifiche che possano inficiare il risultato: • Eseguire i passaggi di pipettamento in ghiaccio e senza ritardi. • Preriscaldare (a 95°C) il blocco riscaldante del thermal cycler
prima di inserire i campioni e far partire immediatamente ilprogramma di amplificazione.
INNOGENETICS®
36
1. Diluire ciascun DNA alla concentrazione compresa tra 0.01 e 0.02 µg/µl in tampone TE.
2. Determinare il numero di provette da preparare (N): N = numero di campioni di DNA + 1 (controllo negativo; no DNA) + 1.Usando puntali con filtro preparare la miscela di amplificazione inuna provetta autoclavata da 1.5 ml:Per l'amplificazione DRB1+3+4+5 e 86V:
(N x 24.5 µl) acqua distillata autoclavata+ (N x 10 µl) Amplification Buffer + (N x 10 µl) Primer Solution (DRB1+3+4+5 o 86V)+ (N x 0.5 µl) LiPA-Taq (N x 1U)Per l'amplificazione DRB1 e 86G:
(N x 24 µl) acqua distillata autoclavata + (N x 10 µl) Amplification Buffer + (N x 10 µl) Primer Solution (DRB1o 86G)+ (N x 1µl) LiPA-Taq (N x 2U)Il volume totale di questa miscela di amplificazione è ora (N x 45 µl).Vortexare brevemente e aliquotare 45 µl di questa mix in (N-1)provette di amplificazione autoclavate.
3. Aggiungere 2 gocce (~ 40 µl) di olio minerale in ogni provetta, serichiesto (ad esempio quando si usa PE 480). Pipettare 5 µl (0.05 a 0.1 µg) di DNA genomico estratto (al di ladell'olio minerale, se presente). Aggiungere 5 µl di acqua distillata (no DNA) alla provetta delcontrollo negativo. NOTA:• Non vortexare o miscelare.• Controllare che la miscela di amplificazione sia sul fondo della
provetta. 4. Posizionare i campioni nel blocco del thermal cycler, preriscaldato e
calibrato (vedi le istruzioni indicate dal produttore del thermalcycler). Far partire il programma di amplificazione designato perl'amplificazione di DRB decoder amplification.
INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplification
37
Profilo di amplificazione DRB decoder:
NOTA:• Si utilizza lo stesso profilo di amplificazione per tutti i prodotti
INNO-LiPA HLA di classe II, eccetto per INNO-LiPA HLA-DPBAmplification.
5. Dopo il processo di amplificazione, usare immediatamente icampioni con le strisce del test INNO-LiPA HLA-DRB decoder oconservare i campioni a -15/-25°C.NOTA:• Non conservare i prodotti di DNA amplificato insieme ai
reagenti di amplificazione non ancora utilizzati.
Risultati
Visualizzazione
- La presenza del prodotto di amplificazione può essere verificata suun gel di agarosio al 2%. Caricare 10 µl di prodotto amplificato perpozzetto. L'amplicone dovrebbe apparire come singola banda dilunghezza di 280 bp. NOTA:• La DRB1 Primer Solution fornità è costituita da un set di primer
che può portare alla formazione di dimeri di primers. Ciò noninterferisce con i risultati del test.
- Osservazioni interne indicano che se è visibile una banda dilunghezza di circa 280 bp dopo avere caricato 10µl di prodottoamplificato su un gel di agarosio al 2%, si dovrebbe ottenere con iltest LiPA un risultato interpretabile.
- Includere almeno un controllo positivo e uno negativo ogni volta cheviene eseguita un'amplificazione. Come per ogni nuova procedura dilaboratorio, dovrebbe essere preso in considerazione l'inserimento diun controllo positivo e negativo aggiuntivi fino al raggiungimento diun alto grado di confidenza nell'esecuzione del test. Se si desideraincludere un controllo positivo aggiuntivo, utilizzare un campionepositivo conosciuto.
- Se si ottiene sul gel una banda positiva per il controllo negativo,l'intera seduta deve essere scartata e deve essere ripetuta la proceduracompleta.
Limiti della procedura
- L'uso di questo prodotto deve essere limitato solo al personaleaddestrato alle tecniche di amplificazione.
- L'inibizione della Polimerasi (es. mediante eparina) può essere lacausa di un completo fallimento del test.
- Il talco dei guanti monouso e l'ipoclorito di sodio hanno effetti diinibizione sull'amplificazione.
- A causa della sequenza aberrante dell'allele DRB1*1130 a livellodella posizione del primer DRB1, non si prevede alcunaamplificazione con il primer DRB1 per questo allele.
- La sequenza a livello del sito di legame del primer non è conosciutaper tutti gli alleli. Il rischio di mismatch a livello del sito di legamedel primer è da considerarsi molto basso, tanto che un fallimento delprimer non è mai stato osservato e sono stati testati più di 80 alleliappartenenti a tutti i gruppi. Tuttavia nel caso di un risultatoomozigote deve essere presa in considerazione la possibilità di unaperdita allelica (drop-out).
- Le buone pratiche di laboratorio e un'accurata esecuzione delleprocedure precedentemente specificate permettono un'amplificazionespecifica.
Performance del Test
INNO-LiPA HLA-DRB decoder è stato valutato in laboratori ditipizzazione tissutale, tre europei e due nord americani, su campionitipizzati in routine.
INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplification
39
Nello studio è stato testato con INNO-LiPA HLA-DRB decoder un totaledi 136 campioni.
Non vi sono stati fallimenti di amplificazione con INNO-LiPA HLA-DRBdecoder nel corso dello studio
Español
Símbolos utilizados
Kit di amplificazione
Fabricado por
Producto sanitario para diagnóstico in vitro
Número de lote
Número de catálogo
Para ser usado por
Consulte las instrucciones de uso
Riesgo biológico
Limitaciones de temperatura
Contiene suficiente producto para <n> ensayos
Tampón de amplificación
Solución de primers DRB1+3+4+5
-25˚C
-15˚C
INNOGENETICS®
40
Solución de primers 86G
Solución de primers 86V
Solución de primers DRB1
LiPA-Taq
Uso al que está destinado
El kit INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplfication, de uso in vitro, estádiseñado para la amplificación de los ácidos nucleicos del segundo exónde los locus DRB1, DRB3, DRB4 y DRB5 del antígeno leucocitariohumano (HLA). La reacción se lleva a cabo mediante la reacción encadena de la polimerasa (PCR).
Principio del ensayo
La muestra de ADN a amplificar mediante la PCR se introduce en unamezcla de reactivos que contiene un tampón con un exceso dedesoxinucleósido 5'-trifosfatos (dNTPs), "primers" (oligonucleótidoscebadores) biotinilados, y ADN polimerasa termoestable. Los primersamplificarán el exón 2 de todos los alelos DRB específicos (ver abajo).Las dos cadenas de la hélice de ADN se separan (desnaturalización) porcalentamiento, exponiendo las secuencias diana a los primers. Tras enfriarla mezcla a una temperatura concreta, estos primers se ligan a regionescomplementarias de secuencias que flanquean a la secuencia diana(anillamiento). A otra temperatura concreta, la ADN polimerasatermoestable utiliza el exceso de dNTPs, extendiendo los primersanillados a lo largo del ADN molde diana (extensión). De esta forma, tras un ciclo se obtienen dos copias exactas, biotiniladas, de la secuenciadiana. Tras 35 ciclos se obtiene un número mayor de copias biotiniladasde la secuencia diana.
INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplification
41
Reactivos
Descripción, preparación para el uso y condiciones de almacenamientorecomendadas
- Si se mantienen a una temperatura de -15/-25°C en sus vialesoriginales, los reactivos son estables hasta la fecha de caducidadindicada. No obstante, se recomienda alicuotar los reactivos (exceptoel LiPA-Taq) tras el primer uso, y luego almacenarlos a unatemperatura de -15/-25°C. No utilice los reactivos más allá de sufecha de caducidad.
- Los reactivos deben almacenarse completamente aislados decualquier fuente de ADN contaminante, especialmente productos deADN amplificado.
- Las alteraciones de la apariencia física del kit de reactivos puedenser signos de inestabilidad o deterioro.
Componente Cantidad Referencia DescripciónTampón de amplificación 4 x 0,3 ml 56982 Contiene todos los dNTPs y NaN3al 0,05% como conservante. Deje
que se descongele totalmenteantes de utilizarlo.
Solución deprimersDRB1+3+4+5 1 x 0,3 ml 56989 Contiene los primers biotinados,
MgCl2, tampón Tris, y NaN3 al0,05% como conservante para laamplificación del exón 2 de losalelos DRB1+3+4+5. Deje que sedescongele totalmente para que elMgCl2 se disuelva completamenteantes de su utilización.
Solución de primers 86G 1 x 0,3 ml 56988 Contiene los primers biotinados,
MgCl2, tampón Tris, y NaN3 al0,05% como conservante para laamplificación específica desecuencia del exón 2 de los alelosDRB que presentan una secuenciacorrespondiente a una G o una D
INNOGENETICS®
42
en el codón 86. Deje que sedescongele totalmente para que elMgCl2 se disuelva completamenteantes de su utilización.
Solución de primers 86V 1 x 0,3 ml 56987 Contiene los primers biotinados,
MgCl2, tampón Tris, y NaN3 al0,05% como conservante para laamplificación específica desecuencia del exón 2 de los alelosDRB que presentan una secuenciacorrespondiente a una V en elcodón 86. Deje que se descongeletotalmente para que el MgCl2 sedisuelva completamente antes desu utilización.
Solución de primers DRB1 1 x 0,3 ml 56984 Contiene los primers biotinados,
MgCl2, tampón Tris, y NaN3 al0,05% como conservante para laamplificación del exón 2 de losalelos DRB1. Deje que sedescongele totalmente para que elMgCl2 se disuelva completamenteantes de su utilización.
LiPA-Taq 2 x 0,035 ml 56723 Contiene Taq ADN polimerasa (2 U/µl) y NaN3 al 0,05% comoconservante. Manténgalo a unatemperatura de entre -15/-25°Chasta el momento en que vaya autilizarlo.
Materiales necesarios pero no suministrados
- Materiales para la extracción de ADN.- Guantes desechables.- Puntas de pipeta estériles desechables (preferiblemente taponadas
con algodón).- Microtubos esterilizados.- Racks de microtubos.- Centrifugadora de microtubos.
INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplification
43
- Ciclador térmico de ADN y equipo.- Pipetas ajustables para pipetear de 1 - 20 µl, de 20 - 200 µl,
y de 200 - 1000 µl.- Agua destilada esterilizada en autoclave.- Aceite mineral (en caso necesario).Seguridad y medio ambiente- Consulte la hoja de datos sobre seguridad de materiales (MSDS) y el
etiquetado del producto para obtener información acerca decomponentes potencialmente peligrosos. Encontrará la versión másreciente de la hoja MSDS en la página Web www.innogenetics.com.
- Las muestras deben manipularse siempre como productospotencialmente peligrosos.
- Es imprescindible el uso de equipo protector personal: guantes ygafas de seguridad cuando manipule agentes peligrosos oinfecciosos.
- Deseche los residuos de acuerdo con las normas de manejo deresiduos de su institución. Asimismo, cumpla con todas las normasmedioambientales nacionales, autonómicas y locales.
Recogida, preparación y almacenamiento de muestras
Extracción de ADN
Para preparar ADN genómico a partir de muestras de sangre enteratratadas con los anticoagulantes ácido-citrato-dextrosa (ACD) o ácidoetilendiaminotetraacético (EDTA) pueden utilizarse los métodos comunesde extracción del ADN por desalación o métodos basados en columnascentrífugas.
Almacene las muestras de ADN a una temperatura de -15/-25ºC.
El ADN extraído debería tener una concentración superior a 0,01 µg/µl.La pureza (A260nm/A280nm) debería ser ≥ 1,5.
NOTA: - Los reactivos de extracción no se suministran con el equipo
Preparación de la mezcla para la PCR (reacción en cadena de lapolimerasa)
Debe agregarse cada uno de los componentes, y en la cantidad correcta. Siagrega demasiada cantidad o una cantidad insuficiente de muestra o de
INNOGENETICS®
44
reactivos, puede producirse una amplificación no específica o incluso noproducirse ninguna amplificación.
Ciclos de PCR
Debe seleccionar el perfil de temperatura correcto para el INNO-LiPAHLA-DRB decoder.
Observaciones y precauciones
- A fin de evitar la contaminación del ADN, se recomienda utilizar unamáxima separación física entre los pasos de pre y posamplificación:salas separadas, pipetas (y demás material de laboratorio) separadas,trajes y guantes de laboratorio (y sus recambios) separados, son lasprecauciones mínimas para las buenas prácticas de laboratorio. Losreactivos deben aislarse de cualquier fuente de ADN contaminante,especialmente productos de ADN amplificado. Evite también lacontaminación microbiana de los reactivos.
- Los reactivos para reacciones de amplificación deberían serguardados en una habitación libre de DNA amplificado. Se deberíausar siempre eppendorfs y pipetas con filtro autoclavados.
- Una vez en la sala de posamplificación evite volver a la sala depreamplificación.
- Todas las puntas de pipeta y tubos utilizados para el proceso deamplificación deben haberse esterilizado en autoclave antes de suuso. Se recomienda utilizar puntas de pipeta taponadas con algodón.Utilice una punta nueva por cada alícuota de muestra que pipetee.
- Tras la descongelación, vortee la solución de amplificación y lasolución de primers, y centrifugue brevemente todos los reactivos,especialmente la LiPA-Taq.
Procedimiento del ensayo
- Este protocolo para la amplificación del exón 2 de los alelos DRB1fue diseñado para proporcionar una amplificación óptima utilizandotubos GeneAmp™ (de 0,5 ml) para PCR y cicladores térmicos PE-480 (Perkin Elmer), o tubos MicroAmp(r) (de 0,2 ml) para PCR ycicladores térmicos PE-2400 o PE-9600 (Perkin Elmer), y LiPA-Taq.
- Este protocolo puede utilizarse con la mayoría de los tipos decicladores térmicos comerciales, aunque es posible que debamodificarse en función de las indicaciones del fabricante delciclador.
INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplification
45
- Antes de utilizarlo, determine si el protocolo es compatible con elciclador térmico que utilice en su laboratorio. Asegúrese de calibrarel ciclador térmico antes de utilizarlo.
- Tome las precauciones necesarias para evitar la amplificación noespecífica, ya que, de lo contrario, los resultados se veríancomprometidos:• Lleve a cabo los pasos de pipeteado en hielo y sin demora.• Precaliente (a 95°C) el bloque de calentamiento del ciclador
térmico antes de insertar las muestras e inicie de inmediato elproceso de ciclado.
1. Diluya cada ADN genómico a una concentración comprendida entre0,01 y 0,02 µg/µl en tampón TE.
2. Determine el número de viales que se deben preparar (N) utilizandola siguiente fórmula:N = número de muestras de ADN + 1 (control negativo; sin ADN) + 1.Utilizando puntas taponadas con algodón, prepare la mezcla maestraen un tubo de 1,5 ml esterilizado en autoclave:Para la amplificación DRB1+3+4+5 y 86V:
(N x 24,5 µl) agua destilada esterilizada en autoclave+ (N x 10 µl) Tampón de amplificación + (N x 10 µl) Solución de primers (DRB1+3+4+5 o 86V)+ (N x 0,5 µl) LiPA-Taq (N x 1 U) Para la amplificación DRB1 y 86G:
(N x 24 µl) agua destilada esterilizada en autoclave+ (N x 10 µl) Tampón de amplificación + (N x 10 µl) Solución de primers (DRB1 o 86G)+ (N x 1 µl) LiPA-Taq (N x 2 U)El volumen total de esta mezcla de amplificación es ahora igual a (N x 45 µl). Procese brevemente en vórtice y pipetee 45 µl de estamezcla maestra en (N-1) tubos de amplificación esterilizados enautoclave.
3. Añada 2 gotas (~ 40 µl) de aceite mineral en cada tubo si esnecesario (por ejemplo, si utiliza PE-480).Pipetee 5 µl (0,05 a 0,1 µg) del preparado de ADN genómico (si esnecesario, a través del aceite mineral). Añada 5 µl de agua destilada (sin ADN) al tubo de control negativo.NOTA:• No lo vortee ni lo mezcle• Compruebe que la mezcla de amplificación esté en el fondo del
tubo.
INNOGENETICS®
46
4. Inserte las muestras en el bloque térmico precalentado y calibrado(consulte las instrucciones del fabricante del ciclador térmico). Inicieel programa de amplificación diseñado para la amplificación con elHLA-DRB decoder.Perfil de la amplificación HLA-DRB decoder:
NOTA:• Se utiliza el mismo perfil de amplificación para todos los
productos INNO-LiPA HLA de la clase II, excepto para laamplificación del INNO-LiPA HLA-DPB.
5. Concluido el proceso de amplificación, utilice las muestras deinmediato con tiras INNO-LiPA HLA-DRB decoder o almacénelas auna temperatura de -15/-25°C.NOTA: • No almacene los productos de ADN amplificado junto a los
reactivos de amplificación que no se hayan utilizado.
Resultados
Visualización
- La presencia de amplicones puede comprobarse en gel de agarosa al2%. Cargue 10 µl del producto amplificado. El producto amplificadodebería aparecer como una única banda de 280 pb. NOTA:• Esta solución de primers DRB1 es un conjunto de primers que
puede generar la formación de dímeros de primers. Esto noafectará al resultado de la prueba.
- Las observaciones realizadas en nuestros laboratorios muestran quesi es visible una banda de 280 pb tras comprobar en gel de agarosa al2% 10 µl del producto amplificado, puede obtenerse un resultadointerpretable con el ensayo LiPA.
- Incluya al menos un control negativo y uno positivo cada vez querealice una amplificación. Como con cualquier nuevo procedimientode laboratorio, deberían incluirse controles positivos y negativosadicionales hasta que el procedimiento de ensayo se consigadesarrollar correctamente con un elevado grado de confianza. Encaso de que sea aconsejable incluir un control positivo adicional,utilice una muestra positiva conocida.
- Si se obtiene una banda positiva correspondiente al control negativoen el gel, debe desecharse la totalidad de la prueba y repetirse todo elprocedimiento.
Limitaciones del procedimiento
- Este producto sólo debe ser utilizado por personal especializado entécnicas de amplificación.
- La inhibición de la polimerasa (por ejemplo, por la heparina o por lahemoglobina) puede anular el ensayo.
- Asimismo, el polvillo de los guantes desechables y el hipocloritosódico tienen un efecto inhibidor sobre la amplificación.
- Debido a una secuencia aberrante del alelo DRB1*1130 en laposición del primer DRB1 no se espera amplificación para este alelo.
- No se conoce la secuencia del lugar de unión del primer para todoslos alelos. El riesgo de unión no deseada en el lugar del primer seconsidera muy bajo, ya que nunca se ha observado y se han testadomás de 80 alelos pertenecientes a todos los grupos. Sin embargo, encaso de un resultado homocigótico debe considerarse la posibilidadde un fallo de amplificación alélica.
- La amplificación específica se asegura mediante las buenas prácticasde laboratorio y una cuidadosa ejecución de los procedimientos quese han descrito.
Eficacia del ensayo
El equipo INNO-LiPA HLA-DRB decoder ha sido evaluado en treslaboratorios europeos y dos americanos de tipaje de tejido en muestras derutina.
En el estudio se analizaron un total de 136 muestras con el INNO-LiPAHLA-DRB decoder.
INNOGENETICS®
48
No hubo fallos en la amplificación del INNO-LiPA HLA-DRB decoderdurante el estudio.
Português
Símbolos utilizados
Kit de amplificação
Fabricado por
Dispositivo medico de diagnóstico In vitro
Número de lote
Número de catálogo
Usar por
Consultar instruções de utilização
Risco biológico
Limitação de temperatura
Conteúdo suficiente <n> testes
Tampão de Amplificação
Solução de Primer DRB1+3+4+5
Solução de Primer 86G
Solução de Primer 86V
-25˚C
-15˚C
INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplification
49
Solução de Primer DRB1
LiPA-Taq
Indicações de uso
O kit de amplificação de INNO-LiPA HLA-DRB decoder, para uso in vitro, é indicado para a amplificação do ácido nucleico do segundoexon do antigénio leucocitário humano (HLA) locus DRB1, DRB3, DRB4e DRB5. A reacção é efectuada por meio duma reacção em cadeia depolimerase (PCR).
Princípio do teste
A amostra de ADN a ser amplificada por PCR é introduzida numa misturade reagentes contendo um excesso de desoxinucleósido 5'-trifosfatos(dNTPs), primers biotinilados e ADN polimerase termoestável. Os primers amplificam o exon 2 de todos ou de alelos específicos de DRB(ver adiante). Por aquecimento, as duas cadeias da hélice de ADNseparam-se (desnaturação) de modo a expor aos primers as sequênciasalvo. Estes primers são complementares às regiões que flanqueiam a sequência alvo. Portanto, ao arrefecer a uma temperatura específica, os primers ligam-se à sua região alvo (annealing).
A outra temperatura e utilizando os dNTPs, a polimerase termostável deADN estende os primers ao longo do molde alvo (extensão). Deste modo,são produzidas duas cópias exactas biotiniladas da sequência molde apósum ciclo de desnaturação annealing e extensão. Após 35 ciclos, obtém-seum grande número de cópias biotiniladas da sequência alvo.
Reagentes
Descrição, preparação e condições de conservação recomendadas
- Se conservados entre -15/-25°C e mantidos nos frascos originais, osreagentes são estáveis até ao fim da validade do kit. No entanto,recomenda-se a alíquota dos reagentes (excepto para LiPA-Taq) apósa primeira utilização e conservar então de -15/-25°C. Não utilizarreagentes para além do fim da validade do kit.
- Os reagentes devem ser armazenados isoladamente de qualquer fontede ADN contaminante, especialmente de produtos de ADNamplificado.
INNOGENETICS®
50
- Alterações na aparência física dos reagentes do kit podem indicarinstabilidade ou deterioração.
Componente Quantidade Refª. DescriçãoTampão de Amplificação 4 x 0.3 ml 56982 Contendo todos os dNTPs e
0.05% NaN3 como conservante.Deixar descongelarcompletamente antes de usar.
Solução Primer DRB1+3+4+5 1 x 0.3 ml 56989 Contendo primers biotinilados,
MgCl2, e 0.05% NaN3 comoconservante para a amplificaçãodo exon 2 dos alelos deDRB1+3+4+5. Deixardescongelar completamente antesde usar, de modo a dissolver oMgCl2 por completo.
Solução Primer 86G 1 x 0.3 ml 56988 Contendo primers biotinilados,
MgCl2, e 0.05% NaN3 comoconservante para a sequência deamplificação específica do exon 2dos alelos DRB mostrando umasequência G ou D no codão 86.Deixar descongelarcompletamente antes de usar, demodo a dissolver o MgCl2.porcompleto.
Solução Primer 86V 1 x 0.3 ml 56987 Contendo primers biotinilados,
MgCl2, e 0.05% NaN3 comoconservante para a sequência deamplificação específica do exon 2dos alelos DRB mostrando umasequência V no codão 86. Deixardescongelar completamente antesde usar, de modo a dissolver oMgCl2.por completo.
INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplification
51
Solução Primer DRB1 1 x 0.3 ml 56984 Contendo primers biotinilados,
MgCl2, e 0.05% NaN3 comoconservante para a amplificaçãodo exon 2 dos alelos DRB1Deixar descongelarcompletamente antes de usar, demodo a dissolver o MgCl2.porcompleto
LiPA-Taq 2 x 0.035 ml 56723 Contendo Taq ADN polimerase 2 U/µl) e 0.03% NaN3 comoconservante. Manter de -15/-25°Caté imediatamente antes de usar.
Materiais necessários mas não fornecidos
- Materiais para extracção de ADN.- Luvas descartáveis.- Pontas de pipeta descartáveis esterilizadas (de preferência com filtro
de algodão).- Microtubos esterilizados.- Suportes de microtubos.- Centrífuga de microtubos.- Termociclador de ADN e equipamento.- Pipetas ajustáveis para dispensar 1 - 20 µl, 20 - 200 µl, e 200 - 1000 µl.- Água destilada esterilizada em autoclave.- Óleo mineral (se necessário).
Segurança e meio ambiente
- Ter em atenção a Folha de Dados de Segurança do Material(MSDS) e os rótulos do produto para informações sobrecomponentes potencialmente perigosos. A versão mais recente daMSDS está disponível no site Web www.innogenetics.com.
- As amostras devem sempre ser manipuladas como potencialmenteperigosas.
- É imprescindível o uso de equipamento de protecção pessoal: luvas e óculos de segurança, quando manusear agentes perigosos ouinfecciosos.
INNOGENETICS®
52
- Os resíduos devem ser tratados de acordo com as regras dainstituição relativas ao tratamento de resíduos. Respeitar tambémtodos os regulamentos oficiais, locais e ambientais.
Colheita, preparação e conservação de amostras
Extracção do ADN
Para preparar o ADN genómico, a partir de amostras de sangue totaltratadas com os anticoagulantes ácido-citrato-dextrose (ACD) ou ácidoetilenodiaminotetracetético (EDTA) podem utilizar-se os métodos comunsde extracção do ADN por dessalinização (salting-out) ou os métodosbaseados em colunas.
Conservar as amostras de ADN de -15/-25°C.
O ADN extraído deve ter uma concentração ≥ 0.01 µg/µl. A pureza(A260nm/A280nm) deve ser ≥ 1.5.
NOTA:- Os reagentes não são fornecidos.
Preparação da mistura de PCR
Cada componente deve ser adicionado e fornecido na quantidade certa.Amostra ou reagentes em quantidade demasiado grande ou demasiadopequena podem resultar numa amplificação não específica ou mesmonuma não amplificação.
Ciclos de PCR
Deve ser seleccionado o perfil correcto de temperatura para o INNO-LiPAHLA-DRB decoder.
INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplification
53
Observações e precauções
- A fim de evitar a contaminação do ADN, recomenda-se utilizar amáxima separação física entre os passos de pré e pós amplificação:salas separadas, pipetas (e restante material de laboratório)separadas, batas e luvas de laboratório (e o seu stock) separadas, sãoprecauções mínimas para uma boa prática laboratorial. Os reagentesdevem ser isolados de qualquer fonte de contaminação do ADN,especialmente produtos de ADN amplificado. Evitar também acontaminação microbiana dos reagentes.
- Os reagentes para procedimentos de amplificação devem sermanuseados numa sala isenta de ADN amplificado. Devem serutilizados tubos e pontas de pipeta (de preferência com filtros dealgodão) esterilizados em autoclave.
- Evitar o regresso da sala de pós-amplificação para a de de pré-amplificação.
- Todas as pontas de pipeta e todos os tubos usados para o processo deamplificação devem ser esterilizados em autoclave. Recomenda-se ouso de pontas de pipeta com filtros de algodão. Utilizar uma novaponta de pipeta esterilizada para cada alíquota da amostra.
- Após a descongelação, agitar em vortex o Tampão de Amplificação ea Solução de Primers, e centrifugar brevemente todos os reagentes,especialmente LiPA-Taq.
Procedimento do teste
- Este protocolo para a amplificação do exon 2 dos alelos de DRB foiconcebido para proporcionar uma amplificação óptima, utilizando tubospara PCR GeneAmp™ (de 0.5 ml) e termocicladores PE-480 (PerkinElmer Cetus), ou tubos para PCR MicroAmp® (de 0.2 ml) etermocicladores PE-2400 ou PE-9600 (Perkin Elmer Cetus), e LiPA-Taq.Este protocolo pode ser usado com a maioria dos tipos determocicladores comerciais, embora possam ser necessárias algumasmodificações em função das indicações do fabricante do ciclador.
- Antes de usar, determinar se o protocolo é compatível com otermociclador utilizado no seu laboratório. Assegurar-se de que otermociclador foi calibrado antes de usar.
- Tomar as precauções necessárias para evitar amplificação nãoespecífica, a qual pode comprometer os resultados:• Realizar os passos de pipetagem no gelo e sem demora.
INNOGENETICS®
54
• Pré-aquecer (95°C) o bloco de aquecimento do termocicladorantes de juntar as amostras e começar imediatamente o processode ciclagem.
1. Diluir cada ADN genómico numa concentração compreendida entre0.01 e 0.02 µg/µl em tampão TE.
2. Determinar o número de frascos a ser preparados (N), utilizando aseguinte fórmula:N = número de amostras de ADN + 1 (controlo negativo; sem ADN) + 1Utilizando pontas de pipeta com filtro de algodão, preparar umamastermix num tubo de 1,5 ml esterilizado em autoclave:Para amplificação de DRB1+3+4+5 e 86V:
(N x 24.5 µl) água destilada esterilizada em autoclave+ (N x 10 µl) Tampão de amplificação+ (N x 10 µl) Solução de Primer (DRB1+3+4+5 ou 86V)+ (N x 0.5 µl) LiPA-Taq (N x 1U)Para amplificação de DRB1 e 86G:
(N x 24 µl) água destilada esterilizada em autoclave+ (N x 10 µl) Tampão de amplificação + (N x 10 µl) Solução de Primer (DRB1ou 86G)+ (N x 1µl) LiPA-Taq (N x 2U)O volume total desta mistura de amplificação é agora de (N x 45 µl).Vortex brevemente e alíquota 45 µl desta mastermix em (N-1) tubosde amplificação esterilizados em autoclave.
3. Juntar 2 gotas (~ 40 µl) de óleo mineral a cada tubo, se necessário(por ex. se utiliza o PE-480).Pipetar 5 µl (0.5 a 7.5 µg) da preparação de ADN genómico (atravésde óleo mineral, se necessário).Juntar 5 µl de água destilada (sem ADN) ao tubo de controlonegativo.NOTA:• Não agitar ou misturar.• Verificar se a mistura de amplificação está no fundo do tubo.
4. Colocar as amostras no bloco térmico pré-aquecido e calibrado (verinstruções do fabricante do termociclador) Iniciar o programa deamplificação concebido para a amplificação com o DRB decoder.
INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplification
55
Perfil de amplificação com o DRB decoder:
NOTA:• Os mesmos perfis de amplificação são usados para todos os
produtos INNO-LiPA HLA classe II, excepto para aAmplificação de INNO-LiPA HLA-DPB.
5. Concluído o processo de amplificação, usar de imediato as amostrascom as tiras de teste de INNO-LiPA HLA-DRB decoder ouconservar as amostras de -15 a -25°C.NOTA:• Não armazenar produtos de ADN amplificado juntamente com
reagentes de amplificação que não tenham sido ainda utilizados.
Resultados
Visualização
- A presença de produtos amplificados pode ser verificada num gel deagarose a 2%. Carregar 10 µl do produto amplificado em cadaranhura. O amplicon deve aparecer como uma banda única com umcomprimento de 280 bp.NOTA:• A Solução Primer de DRB1 é um conjunto primers que pode
resultar na formação de primer-dimer. Isto não afectará osresultados do teste.
- Observações realizadas nos nossos laboratórios mostraram que se forvisível uma banda de 280 bp após verificação de 10 µl do produtoamplificado em gel de agarose a 2%, deve obter-se um resultadointerpretável com o ensaio LiPA.
Tipo de ciclador PE-480 PE-2400PE-9600
Passo temperatura tempo tempo± 0.75°C
1. desnaturação 95°C 5 min 5 min2. desnaturação 95°C 30 seg 20 seg Repetir o 3. annealing de primers 58°C 20 seg 20 seg ciclo dos 4. extensão de primers 72°C 30 seg 20 seg passos 2-4 5. elongação 72°C 10 min 10 min 35 vezes
INNOGENETICS®
56
Validação
- Incluir, pelo menos, um controlo negativo e um positivo de cada vezque se realiza uma amplificação. Tal como em qualquer novoprocedimento laboratorial, devem incluir-se controlos positivo enegativo adicionais, até que se atinja um alto grau de confiança nacapacidade de realizar correctamente o procedimento de teste.
- Em caso de ser aconselhável a inclusão de um controlo positivoadicional, usar uma amostra positiva conhecida.Se se obtiver uma banda positiva no gel correspondente ao controlonegativo, toda a operação deve ser desprezada e o procedimento deveser repetido por completo.
Limites do procedimento
- A utilização deste produto deve ser limitada a pessoal bem treinadoem técnicas de amplificação.
- A inibição da polimerase (por ex. pela heparina ou pelahemoglobina) pode ser motivo para a completa falha do ensaio.
- O pó das luvas descartáveis e o hipoclorito de sódio têm um efeitoinibidor da amplificação.
- Devido à sequência aberrante dos alelos de DRB1*1130 na posiçãodo primer DRB1 não se espera, para este alelo, amplificação doconjunto de primers DRB1.
- Não é conhecida, para todos os alelos, a sequência do lugar deligação do primer. O risco de ligação não desejada no lugar doprimer é considerado muito baixo, uma vez que nunca se observouuma falha do primer e foram testados mais de 80 alelos abarcandotodos os grupos. No entanto, em caso de um resultado homozigóticodeve ser considerada a possibilidade de uma falha na amplificaçãoalélica.
- A amplificação específica é assegurada mediante as boas práticas delaboratório e uma cuidadosa execução dos procedimentos descritos.
Performance do teste
INNO-LiPA HLA-DRB decoder foi avaliado em três laboratóriosEuropeus e dois Norte-Americanos em rotina de tipificação de amostras.
Foram testadas, neste estudo, 136 amostras com INNO-LiPA HLA-DRBdecoder.
INNO-LiPA HLA-DRB decoder Amplification
57
Durante o estudo, não houve falhas na amplificação com o INNO-LiPAHLA-DRB decoder.
