Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kouri” Departamento de Parasitología

Amebiasis intestinal. Un problema de salud sobredimensionado.

Tesis presentada en opción al grado de Doctor en Ciencias Médicas

Autor: Dr. Luis Fonte Galindo

Asesor: Dr. Jorge Sarracent Pérez

Ciudad de La Habana

2003

Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kouri” Departamento de Parasitología

Amebiasis intestinal. Un problema de salud sobredimensionado.

Tesis presentada en opción al grado de Doctor en Ciencias Médicas

Autor: Dr. Luis Fonte Galindo

Asesor: Dr. Jorge Sarracent Pérez

Ciudad de La Habana

2003

Síntesis

Utilizando herramientas inmunológicas y biomoleculares, una de ellas un novedoso procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (RCP) múltiple que permite la detección y diferenciación de la infección por una o ambas especies del complejo Entamoeba histolytical Entamoeba dispar, se demostró que la amebiasis intestinal en la provincia de Cienfuegos, como posiblemente en el resto del país, es un problema de salud sobredimensionado, porque: se sobrediagnostica, se desconoce la existencia de E. dispar, se considera erróneamente que existe resistencia de E. histolytica al metronidazol.

Con el objetivo de incursionar en las causas de la sobredimensión, se aplicaron encuestas sobre conocimientos, percepciones y prácticas a Médicos, Técnicos y Responsables de Laboratorio relacionados con el diagnóstico, tratamiento y control de esta parasitosis en la provincia de Cienfuegos. Éstas nos permitieron conocer que en relación con la amebiasis existían importantes deficiencias cognoscitivas y técnico - organizativas.

Para atenuar las deficiencias detectadas, procedimos a realizar un grupo de accione s en la provincia de Cienfuegos. Lugar protagónico entre estas medidas tuvo la preparación, publicación y posterior distribución gratuita en todo el país, de un libro que contendría una reestructuración y actualización de los conocimientos sobre amebiasis de los profesionales encarados al diagnóstico, tratamiento y control de esta parasitosis.

Para la evaluación de las acciones llevadas a cabo, hicimos una segunda aplicación de las encuestas arriba mencionadas. Los resultados nos permitieron conocer de una significativa mejoría en la casi totalidad de los aspectos cognoscitivos y perceptuales evaluados y de progresos parciales en los aspectos técnico -organizativos en que incursionaban los cuestionarios.

Indice

I- Introducción, Hipótesis y Objetivos ----------------------------------------------- ----- -------- 1 II- Revisión Bibliográfica ------------------------------------------------------------------------------ 7 1. Aspectos conceptuales ------ ----- ---------------------------------------------------------------- 71.1 Ameba ---------------------------------------------------------------------------------------------- 7 1.1.1 Amebas de vida libre --------------------------------------------------------------------------- 7 1.1.2 Amebas parásitas obligadas ------------------------------------------------------------------- 8 1.2 Amebiasis ------------------------------------------------------------------------------------------ 8 2. Aspectos históricos --------------------------------------------------------------------------------- 83. Entamoeba histolytica: aspectos de su biología ------------------------------------------------- 103.1 Ciclo de vida de E. histolytica ------------------------------------------------------------------- 11 3.2 Organización celular de E. histolytica ---------------------------------------------------------- 12 3.3 Metabolismo de E. histolytica ------------------------------------------------------------------- 18 4. Entamoeba histolytica: marcadores de patogenicidad ------------------------------------------ 194.1 Marcadores Funcionales ------------------------------------------------------------------------ 19 4.2 Marcadores Bioquímicos ------------------------------------------------------------------------ 20 4.3 Marcadores Inmunológicos --------------------------------------------------------------------- 20 4.4 Marcadores Genéticos --------------------------------------------------------------------------- 21 5. Factores de Virulencia ---------------------------------------------------------------------------- 235.1 Adherencia al epitelio intestinal ----------------------------- ------------ -------------------- 24 5.2 Degradación de la matriz extracelular --------------------------------------------------------- 25 5.3 Lisis extracelular de células del hospedero --------------------------------------------------- 26 5.4 Lisis intracelular de células del hospedero --------------------------------------------------- 27 5.5 Evasión de los mecanismos defensivos del hospedero -------------------------------------- 27 6. Patología de la invasión amebiana -------------------------------------------------------------- 286.1 Características histopatológicas comunes de las lesiones amebianas --------------------- 30 7. Inmunobiología de la infección amebiana ------------------------------------------------------ 317.1 Mecanismos defensivos inespecíficos a E. histolytica --------------------------------------- 31 7.2 Mecanismos defensivos específicos a E. histolytica ------------------------------------------ 33 7.3 Mecanismos de evasión de E. histolytica ------------------------------------------------------ 36 8. Formas Clínicas de la Amebiasis ---------------------------------------------------------------- 388.1 Amebiasis intestinal asintomática ------------------------------------------------------------- 38 8.2 Amebiasis intestinal sintomática --------------------------------------------------------------- 38

8.3 Amebiasis extraintestinal --------------------------------------------------------------------- 39 9. Diagnóstico de la Amebiasis------------------------------------------------------------------ 419.1 Procedimientos Diagnósticos ---------------------------------------------------------------- 41 9.2 Diagnóstico de las diferentes formas clínicas de amebiasis ------------------------------ 50 10. Tratamiento de la amebiasis ------------------------------------------------------------------ 5410.1 Drogas con actividad antiamebiana -------------------------------------------------------- 54 10.2 Empleo de procederes quirúrgicos --------------------------------------------------------- 56 10.3 Tratamiento de las formas clínicas más frecuentes de amebiasis intestinal - ........... 56 11. Epidemiología de la Amebiasis -------------------------------------------------------------- 5811.1 Distribución geográfica ---------------------------------------------------------------------- 59 11.2 Indices epidemiológicos --------------------------------------------------------------------- 60 11.3 Transmisión ----------------------------------------------------------------------------------- 61 12. Prevención y control de la amebiasis -------------------------------------------------------- 6212.1 Prevención de la transmisión fecal-oral -------------------------------------------------- 62 12.2 Tratamiento médico de pacientes y portadores -------------------------------------- ---- 64 12.3 Inmunoprofilaxis ------ --------------- ------------------------------------------------------ 65 III- Materiales y métodos --------------------------------------------------------------------------- 68 IV- Resultados ---------------------------------------------------------------------------------------- 72 V- Compilación de publicaciones del autor que forman parte del documento ............... 72 VI- Discusión General ------------------------------------------------------------------------------- 73 VII- Conclusiones ------------------------------------------------------------------------------------ 86 VIII- Recomendaciones ----------------------------------------------------------------------------- 87 IX - Referencias Bibliográficas -------------------------------------------------------------------- 88 X- Publicaciones del autor que forman parte del documento — ---------- ---------- -----101 XI- Presentaciones en Eventos--------------------------------------------------------------------103 XII- Publicaciones, Patente y Logro de la Academia de Ciencias de Cuba del autor relacionados con el tema y que no forman parte del documento ---------------- ----------106

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I- Introducción Varias fuentes estiman que la amebiasis, la infección del hombre por Entamoeba histolytica, está presente en aproximadamente 500 millones de personas (Walsh, 1986; WHO/PAHO/UNESCO, 1997). De éstas, según las mismas fuentes, 40 millones padecen anualmente una de las formas invasivas de esta parasitosis. A principios de la década de 1990, en los laboratorios del Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí” (IPK) se desarrolló un inmunoensayo para la detección en heces de histolisaina, proteasa excretada por E. histolytica (Luaces y cois., 1992). Durante la validación en Cuba de este procedimiento (Fonte y cois., 1998), al que se denominó ENZYMEBA, observamos que una proporción importante de las muestras de heces colectadas en la red de hospitales de Ciudad de La Habana como positivas a E. histolytica en realidad eran negativas. Es decir, aparentemente en dichos centros el examen microscópico de heces estaba asociado a un marcado sobrediagnóstico de amebiasis intestinal. Para confirmar la observación anterior, entre 1993 y 1994 realizamos en hospitales de Ciudad de La Habana un estudio de control de calidad del diagnóstico de amebiasis intestinal por observación microscópica de heces. En esta tarea empleamos como prueba comparativa el procedimiento ENZYMEBA, para entonces ya validado en Cuba y en el exterior. Los resultados de este estudio nos demostraron que el examen microscópico de hcces estaba asociado a un importante sobrediagnóstico de amebiasis intestinal. Es decir, estructuras presentes en las heces eran confundidas con E. histolytica. Mientras realizábamos el estudio descrito en el párrafo anterior, en la literatura internacional se fueron acumulando evidencias que nos hicieron pensar que el problema podría ir mucho más allá del sobrediagnóstico microscópico de esta parasitosis (Sargeaunt y cois., 1978; Gathiram y Jackson, 1985; Tannich y cois., 1989; Petri y cois., 1990a; Clark y Diamond, 1991). Por aquellos años, partiendo de criterios bioquímicos, inmunológicos y genéticos, quedó demostrado definitivamente que existen dos especies de amebas morfológic amente indistinguibles, sobre todo en sus estadios de quistes (Diamond y Clark, 1993). Una de ellas, Entamoeba histolytica, es responsable de la entidad que llamamos amebiasis. La otra, Entamoeba dispar, parece no ser patógena. Esta novedad taxonómica nos conducía a dos consideraciones prácticas: la primera, que aún bien realizado el diagnóstico microscópico, y sobre todo cuando se identificaban quistes, las amebas observadas podrían corresponder a la especie E. dispar y,

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en consecuencia, no tratarse de un caso de amebiasis; la segunda, que los supuestos casos de resistencia amebiana al metronidazol podrían en realidad tratarse de pacientes que acudieron a los servicios hospitalarios por presentar diarreas, se les indicó un examen microscópico de heces para confirmar la sospecha clínica y éste resultó en un falso diagnóstico de amebiasis intestinal (bien porque se confundieron con amebas estructuras presentes en las heces, bien porque se informó la presencia de E. histolytica en una muestra en que la ameba presente era E. dispar). Así, el paciente regresa con la sintomatología inicial porque se le indicó tratamiento para una enfermedad que no padecía. El conjunto de elementos hasta aquí descritos nos sugirió que la amebiasis intestinal en nuestro país, como posiblemente en otros, podría ser un problema de salud sobredimensionado: porque se sobrediagnosticaba, porque se desconocía la existencia de E. dispar y porque se consideraba erróneamente que existía resistencia de E. histolytica al metronidazol.

Con la intención de tener un acercamiento más objetivo al problema, durante 5 meses colectamos en hospitales y policlínicos de la provincia de Cienfuegos todas las muestras de heces en las que había sido detectada por los procedimientos microscópicos de rutina la presencia de “quistes y/o trofozoítos de E. histolytica". A las muestras colectadas se les aplicó el inmunoensayo ENZYMEBA, procedimiento que permite confirmar la presencia de infección por una o ambas especies del complejo E. histolytica/ E. dispar. Para precisar la especie (o las especies) presente en las muestras positivas a ENZYMEBA, se aplicó a las mismas un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (RCP). Esta prueba de RCP es el primer ensayo biomolecular desarrollado en nuestro país para discriminar entre infección por E. histolytica e infección por E. dispar. Esta se diseñó y estandarizó especialmente para este estudio y presentaba, respecto a las reportadas en la literatura internacional al momento de su desarrollo (Cruz -Reyes y cois., 1992; Romero y cois., 1992; Tachibana y cois., 1992; Acuna-Soto y cols, 1993; Katzwinkel-Wladarseh y cois., 1994; Aguirre y cois., 1995; Guo y cois., 1995; Mackenstedt y cois., 1995; Britten y cois., 1997; Mirelman y cois., 1997; Newton y cois., 1997; Troll y cois., 1997; Haque y cois., 1998; Haque y cois., 1999; Pillai y cois, 1999; Zengzhu y cois., 1999), dos novedades técnicas: 1) el bombardeo de las muestras, durante el proceso de extracción de ADN, con partículas de circonio y 2)

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la realización simultánea, en una misma reacción, de dos ensayos de RCP (de aquí la denominación de RCP Múltiple), uno para detectar E. histolytica y otro para detectar E. dispar.

Con el objetivo de demostrar que el metronidazol continúa siendo una droga eficaz en el tratamiento de la amebiasis intestinal, a los individuos con infección por una o ambas especies del complejo E. histolytica/ E. dispar, se les tomó una segunda muestra de heces inmediatamente después de finalizado el mismo. Estas muestras fueron estudiadas por los procedimientos ENZYMEBA y RCP.

Estudiados los tres componentes de la sobredimensión de la amebiasis como problema de salud, decidimos incursionar en sus posibles causas. Con ese objetivo se aplicaron encuestas sobre conocimientos, percepciones y prácticas a Médicos, Técnicos y Responsables de Laboratorio relacionados con el diagnóstico, tratamiento y con trol de esta parasitosis en la provincia de Cienfuegos. Estas nos permitieron conocer que en relación con la amebiasis existían importantes deficiencias cognoscitivas y técnico - organizativas. Para atenuar las deficiencias detectadas, además de informar de estos resultados a las autoridades correspondientes del Ministerio de Salud Pública, procedimos a realizar un grupo de acciones (que en lo adelante llamaremos intervención) en la provincia de Cienfuegos. Los resultados de estas medidas, cuya cuantía y for mas de aplicación fueron las disponibles al momento de su ejecución, permitirían la evaluación, reformulación y, eventualmente, la extensión de las mismas al resto del país. Lugar protagónico entre estas medidas tuvo la preparación, publicación y posterior distribución gratuita en todo el país, de un libro que contendría una reestructuración y actualización de los conocimientos sobre amebiasis de los profesionales encarados al diagnóstico, tratamiento y control de esta parasitosis. Para la evaluación de las acciones llevadas a cabo, a un año de su completamiento, hicimos una segunda aplicación de las encuestas arriba mencionadas. Los resultados nos permitieron conocer de una significativa mejoría en la casi totalidad de los aspectos cognoscitivos y perceptuales evaluados y de progresos parciales en los aspectos técnico - organizativos en que incursionaban los cuestionarios.

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II- Hipótesis La amebiasis intestinal es un problema de salud sobredimensionado.

III- Objetivos A- General Contribuir al mejor diagnóstico, tratamiento y control de la amebiasis intestinal en Cuba.

B- Específicos 1- Confirmar, empleando una herramienta diferente al examen microscópico de heces, que

en centros hospitalarios de Ciudad de La Habana este procedimiento se asocia a un importante sobrediagnóstico de amebiasis intestinal.

2- Desarrollar un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (RCP) que nos permita discriminar entre infección por E. histolytica e infección por E. dispar en muestras de heces.

3- Demostrar que la amebiasis intestinal en la provincia de Cienfuegos, como posiblemente en el resto del país y más allá de nuestras fronteras, es un problema de salud sobredimensionado porque:

a- Se sobrediagnostica. b- Se desconoce la existencia de E. dispar. c- Se considera erróneamente que existe resistencia de E. histolytica al metronidazol. 4- Conocer sobre los conocimientos, percepciones y prácticas en relación con el

diagnóstico, tratamiento y control de la amebiasis intestinal de los Médicos, Técnicos y Responsables de Laboratorio relacionados con el problema.

5- Tomar un grupo de medidas, a manera de intervención, con la intención de contribuir a la atenuación de la sobredimensión.

6- Como parte de las medidas antes citadas, preparar, publicar y distribuir un libro que aporte herramientas necesarias para un mejor diagnóstico, tratamiento y control de la amebiasis intestinal.

7- Transcurrido un año de completada la intervención, estudiar el impacto de ésta sobre los conocimientos, percepciones y prácticas en relación con el diagnóstico, tratamiento y control de la amebiasis intestinal de los Médicos, Técnicos y Responsables de Laboratorio relacionados con el problema.

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Novedad científica El trabajo que se describe en este documento tiene los siguientes element os de novedad científica: 1- Empleando el inmunoensayo ENZYMEBA, se demostró que en centros hospitalarios de

las provincias de Ciudad de La Habana y Cienfuegos el examen microscópico de heces se asocia a un importante sobrediagnóstico de amebiasis intestinal.

2- Se desarrolló por primera vez en nuestro país un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa que nos permite la detección y diferenciación de la infección por una o ambas especies del complejo Entamoeba histolytical Entamoeba dispar. Al momento de su desarrollo, este procedimiento tenía respecto a los reportados en la literatura internacional dos novedades técnicas: 1) la utilización de partículas de circonio durante el proceso de extracción de ADN, y 2) la realización simultánea, en una misma rea cción, de dos ensayos de RCP, uno para detectar E. histolytica y otro para detectar E. dispar.

3- Con un acercamiento simultáneo a varios aspectos del diagnóstico y tratamiento de la amebiasis intestinal en una situación concreta, se demostró que esta parasitosis en la provincia de Cienfuegos, como posiblemente en el resto del país, es un problema de salud sobredimensionado.

Valor Social 1- Partiendo del criterio de que la aproximación a un problema no debe terminar en su

demostración, se incursionó en las causas de la sobredimensión de la amebiasis intestinal como problema de salud en la provincia de Cienfuegos; se diseñó y aplicó, a manera de intervención, un grupo de medidas con la intención de atenuarla; y se realizó una evaluación del impacto de éstas, a fin de valorar su reformulación y, eventualmente y según las circunstancias de cada lugar, su extensión al resto del país.

2- Se preparó, publicó y distribuyó gratuitamente una monografía sobre la amebiasis que titulamos Amebiasis: enfoques actuales sobre su diagnóstico, tratamiento y control. Para la preparación de este libro, además de realizar una exhaustiva revisión de todo lo publicado sobre los temas en él abordados, tuvimos en cuenta, y éste es uno de sus elementos de novedad, los resultados de las i nvestigaciones

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descritas en esta tesis de doctorado (aquellos que condujeron a la intervención realizada en la provincia de Cienfuegos, de la cual el propio libro forma parte).

Premios: Los resultados contenidos en este documento fueron premiados en diferentes eventos nacionales: 1. Fonte L, Fernández MA, López A, Núñez Y. Sobredimensión de la amebiasis intestinal

como problema de salud. XV Conferencia Científica del CIMEQ. M1NSAP. Ciudad deLa Habana. Cuba. Marzo. 1997. Premio “Raúl Dorticos Torrado” al mejor trabajosobre enfermedades infecciosas.

2. Fonte L, Sánchez L, Fernández MA, Marín H, Montano I, Maestre JL. Aportes alconocimiento sobre la amebiasis intestinal en Cuba. XIII Forum Nacional de Ciencia yTécnica. MINSAP. Ciudad de La Habana. Cuba. Enero. 2001. Resultado Relevante delMINSAP.

3. Fonte L, Sánchez L, Fernández MA, Marín H, Montano I, Maestre JL. Detección ydiferenciación de la infección por una o ambas especies del complejo Entamoebahistolytica/Entamoeba dispar. IV Jornada Internacional de Infectología Pediátrica.SLIPE. Holguín. Cuba. Abril. 2001. Beca para la presentación del trabajo en CongresoLatinoamericano de Infectología Pediátrica. SLIPE. San Salvador. Salvador. Agosto.2001.

4. Fonte L, Sánchez L, Fernández MA, Marín H, Montano I, Maestre JL. Amebiasisintestinal. Resultados de una intervención para la redimensión de un problema. IIIConvención Nacional de Salud. MINSAP. Marzo. 2002. Premio al mejor trabajo sobreenfermedades parasitarias.

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II- Revisión Bibliográfica 1. Aspectos conceptualesEn relación con los vocablos ameba y amebiasis, y otros con ellos vinculados, existen algunas confusiones. Por ese motivo, nos ha parecido útil iniciar esta breve incursión por los saberes relativos a E. histolytica y la infección que produce en el humano, haciendo precisiones, a veces consideraciones, sobre los términos que abordamos a continuación.

1.1 Ameba El vocablo ameba designa un grupo de protozoos de la superclase Rhizopoda, pertenecientes a los géneros Naegleria, Acanthamoeba, Balamuthia, Entamoeba, Endolimax y lodoameba. A las especies incluidas en este grupo, coinciden los textos clásicos, les son comunes dos elementos morfológicos de su fase trófica: la presencia de un protoplasma desnudo y la formación de seudópodos lobulados como estructuras de locomoción (Beaver y cois., 1986). La cantidad de especies de amebas presentes en la naturaleza es numerosa y la relación que éstas establecen con otros seres vivos es variada. Las hay de vida completamente libre y existen las que parasitan, de manera facultativa u obligada, órganos y tejidos de una amplia gama de especies de animales. Sin embargo, sólo un número reducido de especies pertenecientes a los géneros Naegleria, Acanthomoeba, Balamuthia y Entamoeba son patógenas al hombre (Beaver y cols., 1986; Ma y cols., 1990; Visvesvara y cols., 1993).

1.1.1 Amebas de vida libre Las especies de los géneros Naegleria, Acanthomoeba y Balamuthia son denominadas de conjunto amebas de vida libre. Las amebas de los géneros Naegleria y Acanthomoeba, y muy posiblemente las del género Balamuthia, habitan libremente en aguas estancadas en el suelo y en materia orgánica en descomposición, donde tienen lugar las dos fases de sus respectivos ciclos evolutivos de vida (quiste y trofozoíto). Las amebas patógenas de estos géneros sólo parasitan excepcionalmente al hombre, lo cual puede ocurrir por el contacto de éste con aguas contaminadas con sus trofozoítos. Estos, según el género, pueden invadir directa o indirectamente el sistema nervioso central de su hospedero dando lugar a cuadros neurológicos graves, casi siempre mortales (Ma y cois., 1990; Visvesvara y cois., 1993).

1.1.2 Amebas parásitas obligadas Además de las especies de amebas de vida libre, el hombre puede ser infectado por especies amebianas de los géneros Entamoeba, Endolimax y lodoameba. Estas, a diferencia de las primeras, son parásitos obligados del hombre y de otros animales, pues deben realizar en uno de ellos parte de su ciclo evolutivo de vida (Beaver y cois. 1986). De las amebas parásitas del aparato digestivo del hombre, E. histolytica es la única especie patógena. Cuando invade los tejidos del humano, el espectro de las manifestaciones clínicas a que da lugar es tan amplio como variadas son las localizaciones que alcanza. E. histolytica, según detallaremos más adelante, puede habitar en el lumen intestinal, invadir la pared de esta viscera e, incluso, realizar migraciones a tejidos y órganos lejanos (Martínez -Palomo, 1989; Bruckner, 1992; Reed, 1992; Ravdin, 1995).

1.2 Amebiasis La infección del hombre por especies de los géneros Naegleria, Acanthomoeba y Balamuthia da lugar con relativa frecuencia a manifestaciones clínicas, generalmente cuadros de muy mal pronóstico (Ma y cois., 1990; Visvesvara y cois., 1993). La infección del humano por E. histolytica, por el contrario, es asintomática en la mayoría de las ocasiones (Martínez -Palomo, 1989; Bruckner, 1992; Reed, 1992; Ravdin, 1995). Es decir, los datos disponibles indican que la proporción de personas que enferman y la gravedad de sus lesiones son mayores entre los individuos que se infectan con amebas de vida libre. Sin embargo, las cifras de prevalencia de infección por especies de los géneros Naegleria, Acanthomoeba y Balamuthia, sobre todo si se les compara con las estimadas para la infección por E. histolytica, son extremadamente bajas. En este argumento radica que se haya reservado el término amebiasis exclusivamente para la infección producida por la especie de ameba intestinal a que estamos haciendo referencia. Por lo antes expuesto, es de aceptación universal considerar la amebiasis como la infección del hombre por E. histolytica, con independencia de que esta de lugar o no a manifestaciones clínicas (Martínez-Palomo, 1989; Matijasevic, 1992).

2. Aspectos históricosDescripciones de disentería (del griego dys: alteración, enteron: intestino) aparecen en antiquísimos documentos de muy diversas culturas e idiomas (desde hebreos y griegos,

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hasta chinos y sánscritos). Con el término disentería, aquellos remotos predecesores designaron un síndrome clínico caracterizado por la presencia de heces diarreicas muco- sanguinolentas, que era el azote de ejércitos en guerra, y de regiones pobres y muy pobladas (Matijasevic, 1992). Aunque no la nombrara de la forma que hoy lo hacemos, se considera a Fedor Aleksandrovich Lösch el descubridor de E. histolytica (Imperato, 1981). En 1875, Lösch estudió microscópicamente las heces de un campesino de San Petersburgo, Rusia, que padecía de diarreas disentéricas (Lösch y cois., 1875). Lösch observó en las heces unos microorganismos que poseían ecto y endoplasma, y contenían glóbulos rojos. Posteriormente, inoculó cuatro perros por las vías oral y rectal con las heces del paciente y logró reproducir la disentería en uno de ellos. Al sacrificar al animal enfermo, encontró en la mucosa del colon de aquél el microorganismo que antes había observado en las heces del paciente. Meses más tarde, el paciente fallece y en su autopsia fueron demostradas numerosas y extensas ulceraciones de la mucosa del colon, en las que nuevamente fueron observados los mic roorganismos antes descritos. En 1886, Robert Koch estudió cinco casos de disentería, dos de ellos complicados con absceso hepático (Koch y cois., 1887). Koch ubicó con más precisión la presencia de las amebas en la profundidad de las úlceras, en la submucosa intestinal, y lo que era más novedoso aún, demostró la presencia del parásito en las lesiones hepáticas, incluso en los capilares próximos a la pared de los abscesos. Trabajando casi simultáneamente con Koch, y motivado por los estudios de éste, Esteban Kartulis realizó 150 autopsias en pacientes egipcios que habían fallecido por disentería y observó la presencia en las úlceras colónicas de los protozoos descritos por Lösch y Koch, en todos los casos (Kartulis, 1886). Un año después, demostró la p resencia de amebas en pacientes de lo que entonces se conocía como absceso hepático tropical. Kartulis fue el primero en afirmar que la ameba era el agente causal de la disentería tropical y que el absceso hepático era una secuela de la disentería amebiana . En 1890, William Councilman y Henri La Fleur realizaron un detallado estudio de pacientes de disentería y de absceso hepático en el Hospital Johns Hopkins (Councilman y La Fleur, 1891). Como resultado de sus investigaciones, confirmaron el papel patógeno de las amebas, para las cuales propusieron el nombre de Amoebu dysenteriae, e introdujeron los términos disentería amebiana y absceso amebiano del hígado. Quincke y Roos, en 1893, descubrieron la forma quística de la ameba y su papel en la diseminación de la infección (Quincke y Ross, 1893). Estos autores reportaron, además, el

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hallazgo de otra especie de ameba, aparentemente no patógena, en las heces humanas. En 1903, Schaudinn estableció la diferencia de especie entre la ameba descrita por Lósch, a la cual nombró Entamoeba histolytica, y la especie encontrada por Quincke y Roos, a la que denominó Entamoeba coli (Schaudinn, 1903). Una observación realizada a principios de siglo originaba intensas discusiones entre los estudiosos de la infección amebiana: la ausencia de manifestaciones clínicas en la mayoría de los individuos en cuyas heces era detectada E. histolytica. Para dar solución a aquella polémica, que llegó hasta la década de 1990, varias hipótesis fueron formuladas. Los componentes esenciales de una de ellas, sobre la que hoy existen elementos probatorios, fueron presentados por Emile Brumpt en 1925, cuando, basándose en observaciones clínicas y epidemiológicas y estudios en gatos, señaló la existencia de E. histolytica como un complejo de dos especies, a las que denominó Entamoeba disentehae, causante de la infección sintomática, y Entamoeba dispar, encontrada en personas sanas (Brumpt, 1925). Un conjunto de trabajos sobre aspectos funcionales, bioquímicos, inmunológicos y genéticos de aislamientos de amebas procedentes de individuos con y sin manifestaciones clínicas de amebiasis, de los cuales fue pionero el estudio de caracterización isoenzim ática reportado por Peter Sargeaunt en 1978 (Sargeaunt, 1978), contribuyó a la acumulación de pruebas definitivas a favor de la existencia de las dos especies de amebas y condujeron a la redescripción formal de E. histolytica, separándola de E. dispar, en excelente artículo de revisión de Louis Diamond y Grahan Clark, publicado en 1993 (Diamond y Clark, 1993).

3. Entamoeba histolytica: aspectos de su biologíaComo expresáramos antes, el hombre puede ser infectado por especies amebianas de los géneros Endolimax, lodoameba y Entamoeba, miembros de la familia Endamoebidae. Las amebas de esta familia son de tamaño relativamente pequeño, carecen de vacuolas contráctiles, se multiplican por división binaria y, con la excepción de Entamoeba gingivalis, que no da lugar a quistes, sus ciclos evolutivos pasan por las fases de quistes y trofozoítos (Beaver y cols., 1986). Los miembros de esta familia se diferencian entre sí, fundamentalmente, por las características de sus núcleos. Las especies del género Entamoeba presentan un cariosoma relativamente pequeño y compacto, localizado en el centro del núcleo o cerca de él, y finos gránulos de cromatina que revisten la superficie interna de la membrana nuclear. De este género, E. histolytica,

E. dispar, E. hartmanni, E. coli y E. Polecki parasitan el intestino grueso del hombre y, por tanto, han sido halladas en sus heces. De las amebas que han sido encontradas parasitando en el aparato digestivo del hombre, sólo E. histolytica es capa/ de invadir la pared de ese órgano y, en consecuencia, producir enfermedad. Esta especie amebiana, cuya clasificación taxonómica se muestra en la tabla 1, perpetúa su existencia mediante el tránsito por un ciclo evolutivo relativamente sencillo y realiza sus actividades vitales haciendo gala de una organización celular poco compleja. A ambos aspectos, ciclo evolutivo y organización celular, haremos referencia en los acápites siguientes.

3.1 Ciclo de vida de E. histolytica La carencia de etapas sexuales y de hospederos intermediarios, que sí están presentes en el desarrollo ontogénico de otros parásitos, evidencia la sencillez del ciclo evolutivo de E. histolytica. Básicamente, este protozoo pasa por sólo dos fases: la de qu iste, forma infectante, y la de trofozoíto, forma vegetativa. Las condiciones que desencadenan el exquistamieto y el enquistamiento, como se comenta más adelante, son desconocidas (Beaver y cois. 1986, Martínez-Palomo, 1989). La infección es adquirida, casi exclusivamente, por la ingestión de quistes tetranucleados. Éstos son resistentes a los efectos del pH ácido del estómago del hospedero y la exquistación debe ocurrir más adelante, en el intestino delgado. En este segmento del tubo digestivo, la alcalinidad del medio o la acción de determinadas enzimas digestivas, o ambas circunstancias, debilitan la pared del quiste, y emerge del mismo una ameba multinucleada, denominada metaquiste. Por división citoplasmática, esta estructura da lugar a cuatro pequeñas amebas, llamadas trofozoitos metaquísticos. Una nueva división, esta vez nuclear y citoplasmática, da origen a ocho trofozoitos similares a los precedentes.

Tabla 1.- Clasificación taxonómica de la especie Entamoeba histolytica. Reino: Animaba Orden: Amoebida Subreino: Protozoa Suborden: Tubulina

Phylum: Sarconiastigophora Familia: Endamoebidae

Subphylum: Sarcodina Género: Entamoeba Superclase: Rhizopoda Especie: E. histolytica

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Los trofozoítos metaquísticos, incapaces de colonizar el intestino delgado, son arrastrados por las heces y llegan al intestino grueso. En esta región, utilizando el amplio arsenal de moléculas con actividad lítica presentes en su membrana celular y en su citoplasma, estos trofozoítos se alimentan de bacterias y otras células en contacto con su superficie. De este modo, los pequeños trofozoítos metaquísticos aumentan de tamaño y alcanzan las dimensiones definitivas de los trofozoítos maduros de la especie. En la luz y en las criptas de las glándulas de la mucosa del intestino grueso, los trofozoítos amebianos continúan multiplicándose por simple división binaria y eventualmente, por circunstancias todavía desconocidas, pueden invadir la pared de esta viscera e, incluso, hacer migraciones a órganos y tejidos distantes. Paradójicamente, la invasión de los tejidos del hospedero por trofozoítos de E. histolytica, que no es necesaria para su ciclo de vida, no da lugar a quistes y, por tanto, no contribuye a la diseminación y perpetuación de la especie. Sin embargo, la evolución de los trofozoítos amebianos en la luz intestinal sigue con más frecuencia un curso diferente al descrito en el párrafo anterior. Consecuencia de condiciones en el colon aún no bien precisadas, pero aparentemente adversas para los trofozoítos, éstos comienzan a eliminar sus vacuolas alimenticias, entre otras inclusiones citoplasmáticas, y a condensarse en una masa esférica, el prequiste. Posteriormente, esta forma celular se cubre de una pared protectora y se convierte en un quiste inmaduro. Éste, como los trofozoítos que lo preceden, sólo posee un núcleo. Dos divisiones nucleares sucesivas, que dan origen a un quiste tetranucleado, caracterizan su proceso de maduración. Se pueden encontrar trofozoítos, prequistes y quistes en diferentes fases de maduración en las heces humanas. De éstos, la única forma infectante por vía oral es el quiste maduro (quiste tetranucleado), que, en dependencia de las condiciones ambientales, puede permanecer viable semanas y meses.

3.2 Organización celular de E. histolytica 3.2.1 E. histolytica al microscopio de luz Excepto la estructura del núcleo, que en general se conserva, las características morfológicas de E. histolytica al microscopio de luz cambian de acuerdo con la fase evolutiva por la que se encuentre cursando el parásito (Beaver y cois. 1986; Martínez- Palomo, 1989; Bruckner, 1992; Ravdin, 1995).

Trofozoíto Los trofozoítos de E. histolytica presentan formas muy disímiles y miden entre 10 y 60 mieras de diámetro. Estas amplias variaciones en forma y tamaño dependen, entre otros factores, del grado de actividad del parásito, siendo mayor el pleomorfismo y la talla de los trofozoítos hallados en heces disentéricas recién evacuadas que los encontrados ocasionalmente en heces de portadores asintomáticos. El citoplasma presenta dos áreas relativamente bien definidas: una porción externa hialina, transparente, sin gránulos, que recibe el nombre de ectoplasma, y una porci ón interna granular que contiene diversas inclusiones, algunas de ellas vacuolas fagocíticas, denominada endoplasma. La presencia de eritrocitos entre los elementos fagocitados es característica de E. histolytica. En frotis directo, sobre todo de heces disentéricas, es posible observar el movimiento progresivo, en ocasiones explosivo, de los trofozoítos de E. histolytica. Este es el resultado de la aparición de prolongaciones digitiformes del ectoplasma, denominadas seudópodos, hacia cuyo interior fluye posteriormente el endoplasma. Mediante el empleo de métodos de coloración habituales, ya no es posible observar la movilidad del trofozoíto, pero se hacen evidentes características de su núcleo que permiten identificar a E. histolytica de manera más precisa. Convenientemente fijado y teñido, el núcleo es esférico y representa aproximadamente un cuarto de la talla del trofozoíto; tiene un cariosoma compacto y pequeño localizado más o menos en su centro; y su cromatina se halla dispuesta en la periferia, junto a la superficie interna de la membrana nuclear, de manera finamente granular.

Prequiste El prequiste es una célula inmóvil, de forma ovalada o redonda, de 10 a 20 mieras de diámetro, aún sin cubierta quística y con algunas inclusiones citoplasmáticas. Con r elación a la fase de trofozoíto, su citoplasma muestra dos nuevas estructuras: una vacuola de glucógeno más o menos grande y de bordes difusos, que aporta los requerimientos energéticos para la maduración del quiste, y cuerpos refringentes, de forma cilíndrica y de tipo cristalino que reciben el nombre de cuerpos cromatoidales. El núcleo muestra un tamaño superior al de la fase precedente y su cariosoma ya no es tan compacto.

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Quiste Hasta el presente, la obtención de quistes de E. histolytica no ha sido posible mediante cultivo in vitro. Por este motivo, la información de que se dispone acerca de la estructura de éstos es mucho menor que la existente con respecto a los trofozoítos. Como los prequistes que los preceden, los quistes son células inmóviles, d e formas ovaladas o redondas y miden entre 10 y 16 mieras de diámetro. A diferencia de los trofozoítos, los quistes de E. histolytica tienen tamaño y formas relativamente uniformes. Apenas se observan inclusiones citoplasmáticas en los quistes. La vacuola de glucógeno, remanente de la etapa anterior, sólo está presente en los quistes inmaduros (el glucógeno ha sido consumido durante la maduración). Se conservan los cuerpos cromatoidales surgidos en la fase anterior y, en dependencia del grado de maduración del quiste, éste contiene de uno a cuatro núcleos con las características de especie ya descritas.

3.2.2 Aspectos ultraestructurales y moleculares de E. histolytica A los aspectos ultraestructurales y moleculares de E. histolytica se les ha brindado gran atención en los últimos años. Ello ha permitido, entre otros adelantos, un mejor conocimiento de la biología de este parásito y una mejor diferenciación taxonómica del mismo respecto a otras especies aniebianas. Aquí, teniendo en cuenta las características de este documento, nos referiremos a los aspectos más relevantes de la superficie, el citoplasma y el núcleo amebianos.

La superfìcie amebiana En la superficie del trofozoíto amebiano están presentes tres tipos de especializaciones: los seudópodos, estructuras motrices orientadas frontalmente; el uroide, apéndice situado en la región caudal de la célula y relacionado con funciones defensivas de ésta; y los filopodios, proyecciones del citoplasma vinculadas con su actividad fagocítica (Mesa y cois, 1994; Martínez-Palomo, 1989). El glicocáliz, particularmente rico en carbohidratos, es la capa más superficial de los trofozoítos amebianos (Mesa y cois, 1994). Por debajo de esta delgada cubierta se encuentra la membrana plasmática, de unos 10 nm de grosor y de u na estructura que corresponde a una típica unidad de membrana (Espinosa-Castellano y cols, 1998). En

ésta tiene asiento un importante grupo de moléculas (lectinas y proteasas, entre ellas) muy vinculadas con la actividad lítica de E. histolytica (Carrero y Laclette, 1996). La observación de la superficie del quiste de E. histolytica al microscopio electrónico de barrido permite apreciar el aspecto rugoso de su pared. El grosor de ésta, cuya uniformidad puede ser observada con el empleo del microscopio electrónico de transmisión, fluctúa entre los 125 y 150 nm y está compuesta fundamentalmente por polímeros de N-acetil-D-glucosamina (Mesa y cois., 1994; Carrero y Laclette, 1996).

El citoplasma amebiano E. histolytica exhibe una organización citoplasmática muy primitiva. En el citoplasma del trofozoíto, su fase metabólicamente más activ a, están ausentes componentes tales como mitocondrias, aparato de Golgi y un sistema de lisosomas primarios y secundarios como el observado en otras células eucarióticas (Mesa y cois., 1994; Carrero y Laclette, 1996; Espinosa-Castellano y cois, 1998). La organización del citoplasma del quiste, su fase de resistencia, es aún más sencilla. En el citoplasma de los trofozoítos amebianos, observado al microscopio electrónico de transmisión, se aprecian abundantes vacuolas. Estas son relativamente uniformes en fo rma (redondas u ovaladas) y muy variables en tamaño (entre 0,5 y 9 p.m de diámetro) (Martínez-Palomo, 1989; Espinosa-Castellano y cols, 1998). El citoplasma de E. histolytica, en cualesquiera de las fases de su ciclo evolutivo, carece de un retículo endoplásmico bien desarrollado. En el de los trofozoítos se puede observar una red de túbulos y vesículas que recuerda un retículo endoplásmico liso. En esta fase evolutiva, los ribosomas se organizan en forma de cúmulos helicoidales de 300 y 40 nm de longitud y diámetro, respectivamente. En los quistes, estos cúmulos se agregan y forman grandes estructuras cristalinas, de hasta varias mieras de longitud; son los llamados cuerpos cromatoidales que se observan con el empleo del microscopio de luz ( Martínez-Palomo, 1989; Espinosa-Castellano y cois, 1998). Un componente importante del citoplasma de E. histolytica es su citoesqueleto. Varias actividades amebianas, sobre todo motrices, están relacionadas con la estructura y funciones de éste. Tres moléculas del citoesqueleto de este protozoo han sido identificadas y parcialmente caracterizadas: actina, miosina y tubulina (Carrero y Laclette, 1996). La actina es la proteína más abundante en el citoplasma amebiano. In vitro, se polimeriza formando filamentos de 7 nm. In vivo, se encuentra dispersa en el citoplasma

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o concentrada en el seudópodo frontal y en la región del uroide caudal de las amebas enmovimiento (Mesa y cols., 1994; Carrero y Laclette, 1996). La actina de E. histolytica participa en las tres fases del movimiento ameboideo: extensión del seudópodo, flujo del citoplasma hacia el interior de aquél, y retracción de la región posterior de la célula (Mesa y cois., 1994). Una actividad defensiva de la actina, muy relacionada con sus funciones motrices, es el desplazamiento de moléculas unidas a la superficie amebiana hacia la región del uroide. El desprendimiento del uroide, sin que ocurra daño celular, permite la eliminación de dichas moléculas. Aunque en los trofozoítos de E. histolytica sólo se ha podido demostrar la presencia de una forma de actina, en el genoma de este protozoo han sido identificados varios genes que codifican para esta molécula (Carrero y Laclette, 1996). A diferencia de lo que ocurre con la actina, el mareaje de trofozoítos amebianos con anticuerpos fluorescentes contra miosina ha permitido comprobar que la misma no está presente en el seudópodo frontal. Sin embargo, la miosina sí ha sido localizada en la región del uroide y en el anillo contráctil involucrado en su formación, tal como suc ede con la actina. Por este motivo, se considera que esta molécula también ejerce funciones motrices y defensivas (Rahin-Zeaur y cols, 1993). Dos publicaciones reportan la identificación de genes que codifican para la cadena pesada de la miosina de E. histolytica (Arhets y cols., 1992; Raymond-Denise y cois., 1993) La caracterización del gen que codifica para la tubulina también fue realizada. Este, del cual aparentemente existen dos copias contiguas, codifica para una proteína de 455 aminoácidos (Sánchez y cois., 1994). La tubulina amebiana, a diferencia de las identificadas en el citoesqueleto de otras células, carece de un complejo poliacídico en el extremo carboxilo -terminal, que es necesario para su polimerización. Este hecho podría explicar la menor presencia de microtúbulos en el citoesqueleto amebiano: escasos en el citoplasma y presentes en forma de haces en el núcleo de trofozoítos en división (Carrero y Laclette, 1996).

El núcleo amebiano Los núcleos de trofozoítos y quistes maduros de E. histolytica miden entre 3 y 5 pm de diámetro y, como ya se expresará anteriormente, son morfológicamente idénticos (Carrero y Laclette, 1996). Por lo regular, los trofozoítos son uninucleados. Sólo en ocasiones, posiblemente como consecuencia del desarrollo no acop lado de las divisiones

celular y nuclear, se observan trofozoítos con dos o más núcleos. Los quistes de esta especie, según su grado de maduración, exhiben de uno a cuatro núcleos. La membrana nuclear permanece intacta durante todo el ciclo celular. Se ha comprobado, utilizando técnicas microscópicas especiales, la presencia de poros en ella. Éstos están distribuidos regularmente y organizados en forma de series hexagonales (Mesa y cols., 1994). Mediante estudios citoquímicos y de incorporación de precur sores nucleotídicos marcados, se ha constatado una reorganización de los ácidos nucleicos según la fa se del ciclo celular. En la interfase, los ácidos desoxirribonucleicos (ADN) se encuentran dispersos en el núcleo; antes de la división nuclear, los ADN se concentran formando el cariosoma central (Albach, 1989). La cromatina periférica, visible al microscopio de luz, es una capa de gránulos basófilos a lo largo del borde interno de la membrana nuclear constituida, fundamentalmente, por ADN involucrado en la síntesis de ácidos ribonucleicos (ARN). En la mayoría de las células eucarióticas, la cromatina está organizada en nucleosomas. En el caso de E. histolytica, la cromatina muestra una estructura de semillas en ro sario, con nucleosomas de 10 nm de longitud (Carrero y Laclette, 1996). Los datos publicados acerca del número de cromosomas de E. histolytica no son coincidentes. Unos autores sugieren la presencia de 5 a 8 cromosomas, otros especulan con la existencia de 4 a 5 pares de éstos (Carrero y Laclette, 1996). Diferentes estudios se han realizado para determinar el contenido total de ADN de E. histolytica. Los más recientes estiman, en el caso de la cepa HM1, la presencia de 0,5 pg de ADN por núcleo y un tamaño del genoma de 4 x 10 pares de bases (Carrero y Laclette, 1996). Debido a que E. histolytica no posee mitocondrias u otros organelos citoplasmáticos que contengan ADN, este tipo de ácido nucleico sólo está presente en el núcleo. Los genes que codifican para los ARN ribosomales se encuentran, según fuera demostrado a finales de la década de 1980, en moléculas circulares de ADN situadas fuera de los cromosomas. Cada uno de estos plásmidos, cuyo número excede los 200 por núcleo, está constituido por dos unidades transcripcionales de ARN ribosomal en posición invertida. Estudios recientes han demostrado que la mayoría de las secuencias repetitivas en el genoma de E. histolytica se encuentran en estas moléculas. La comparación de las se cuencias nucleotídicas de las moléculas de ADN extracromosomal de las diferentes especies amebianas demuestra importantes diferencias entre ellas. Este

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hecho ha sido utilizado con fines taxonómicos y, sobre todo, en el desarrollo de procedimientos para el diagnóstico de amebiasis (Bhattacharya y cols., 1989; Huber y cois., 1989; Ackers, 2002).

3.3 Metabolismo de E. histolytica La información existente acerca del metabolismo de E. histolytica es incompleta y, en algunos aspectos, contradictoria. Ello es consecuencia, entre otros factores, de las condiciones en que se ha realizado el cultivo amebiano in vitro: complejas, no bien definidas y muy lejos de remedar las condiciones en que se multiplica el parásito in vivo. La principal fuente de energía de E. histolytica son los carbohidratos. En este protozoo, como clásicamente ocurre en las células eucarióticas, el catabolismo inicial de la glucosa hasta ácido pirúvico se realiza a través de la vía de Meyerhof -Embden (Carrero y Laclette; 1996). Sin embargo, E. histolytica carece de ciclo de Krebs, de citocromos y de mitocondrias. Por este motivo, y a diferencia de la mayoría de las células eucarióticas, a este parásito no le es posible la degradación aeróbica del ácido pirúvico hasta dióxido de carbono y agua (Mesa y cois., 1994). En estas circunstancias, el catabolismo final de la glucosa transcurre por vías menos conocidas y rinde como productos finales, además de energía, dióxido de carbono y etanol (Mesa y cois., 1994). En relación con las disponibilidades de oxígeno, E. histolytica debe enfrentar dos ambientes durante el proceso invasivo: uno pobre en este gas, el del intestino grueso, y otro con mayores concentraciones del mismo, el que encuentra al invadir órganos y tejidos con mayor aporte sanguíneo (Mesa y cois., 1994). En correspondencia con ello, en las décadas de 1980 y 1990 se acumularon evidencias a favor de que el metabolismo amebiano no es totalmente anaerobio. En ese sentido, se ha demostrado que en los trofozoítos de E. histolytica, a pesar de las carencias mencionadas en el párrafo anterior, se produce transferencia de electrones desde sustratos reducidos a oxígeno molecular. Aparentemente, el acarreo de electrones se produce a través de una cadena de transportadores, entre los que se incluyen flavinas y hierro (Martínez-Palomo, 1989; Carrero y Laclette; 1996). Se ha sugerido que estos procesos oxidativos actúan como mecanismo de destoxificación para remover oxígeno cuando el parásito se encuentra frente a elevadas concentraciones de aquél durant e la invasión de los tejidos.

4. Entamoeba histolytica: marcadores de patogenicidadComo expresáramos antes, durante más de seis décadas a varias generaciones de amebólogos llamó la atención la marcada diferencia siempre encontrada entre la prevalencia de infección por Entamoeba histolytica y la incidencia de enfermedad en los individuos supuestamente infectados por este protozoo. Sobre la base de estudios realizados en diferentes áreas geográficas, se estimó que alrededor de 10 % de la población mundial es taba infectada y, sin embargo, poco menos de 1 % desarrollaba manifestaciones clínicas atribuibles a esta parasitosis. Para dar explicación a este hecho, se formularon varias hipótesis. Obviando algunos detalles, éstas pueden ser resumidas en tres: 1. E. histolytica es una especie que siempre produce lesiones intestinales en el humano, y

aquéllas pueden dar lugar o no a manifestaciones clínicas.2. E. histolytica es normalmente un comensal que habita en el colon humano y, en ocasiones,

por razones no conocidas, se convierte en un patógeno invasor.3. E. histolytica es un complejo de dos especies morfológicamente idénticas: una especie

patógena que, en dependencia del contexto en que reside, exhibe diferentes grados devirulencia, y otra que no invade los tejidos.

Los componentes esenciales de la tercera hipótesis fueron presentados por Emile Brumpt en 1925 (Brumpt, 1925), cuando señaló que E. histolytica era un complejo de dos especies: Entamoeba disenteriae, causante de la infección sintomática, y Entamoeba dispar, encontrada en personas sanas. La información acumulada en las décadas de 1970, 1980 y 1990 permitió demostrar la existencia de marcadores de patogenicidad amebianos, que prueban los postulados de Brumpt. A continuación nos referiremos a esos marcadores, en orden cronológico de conocimiento.

4.1 Marcadores Funcionales La caracterización funcional de las cepas aisladas de individuos con y sin manifestaciones clínicas de amebiasis, que tuvo lugar durante las décadas de 1970 y 1980, restó partidarios a las hipótesis que proponían la existencia de una sola especie, e hicieron que se retomaran, aunque de manera indecisa aún, las ideas de Brumpt. De esos años datan la mayoría de los trabajos que probaron que las cepas aisladas de individuos sintomáticos, en relación con las obtenidas de personas asintomáticas, tenían propiedades funcionales diferentes. Ellas son: mayor capacidad de aglutinación en presencia de la lectina concanavalina A (característica asociada a la presencia de

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receptores de superficie con un alto contenido de glucosa y mañosa), carencia de carga negativa de superficie a pH neutro (lo cual favorece la adherencia a células de mamíferos cargadas negativamente), mayor habilidad para realizar eritrofagocitosis, poseer mayor efecto citopático in vitro y, finalmente, para sólo hacer referencia a las mejor caracterizadas, capacidad de producir lesiones (en colon e hígado) en animales de experimentación (Martínez-Palomo, 1989).

4.2 Marcadores Bioquímicos No fue hasta 1978, con la difusión de un importante trabajo realizado por Peter Sargeaunt y colaboradores, que el camino hacia la aceptación de la hipótesis de Brunipt se hizo menos angosto (Sargeaunt, 1978). Ese año, los citados investigadores reportaron un estudio de tipificación de isoenzimas, basándose en sus respectivas movilidades electroforéticas, que posteriormente les permitió la clasificación de las amebas procedentes de más de 6 000 aislamientos, en las que entonces se denominaron cepas de E. histolytica patógenas y no patógenas. Utilizando el análisis electroforético de isoenzimas de amebas procedentes de aislamientos clínicos, con algunas variantes de diseños en sus respectivos estudios, otros grupos de investigadores confirmaron la presencia de diferentes isoformas que permitían discriminar entre lo que entonces se denominó cepas patógenas y no patógenas de E. histolytica (Diamond y Clark, 1993). Sobre la base de la migración electroforética de algunas enzimas, con más frecuencia las que mencionamos a continuación, ha sido posible discriminar entre E. histolytica y E. dispar, hexoquinasa (EC 2.7.1.1), fosfoglucomutasa (EC 2.7.5.1), aldolasa (EC 4.1.2.13), acetilglucosaminidasa (EC 3.2.1.30), NADP-diaforasa y glucosafosfato isomerasa (EC 5.3.1.9).

4.3 Marcadores Inmunológicos Los primeros anticuerpos monoclonales que permitieron distinguir entre aislamientos con patrones isoenzimáticos patógenos y no patógenos fueron los obtenidos contra una lectina con especificidad para residuos de galactosa y N-acetil galactosamina (lectina Gal/GalNAc) (Petri y cois., 1990a; Petri y cois., 1990b). Esta molécula, a la que también nos referiremos en otros acápites, es indispensable para la adherencia de los trofozoítos a las células epiteliales del colon y a células inflamatorias. El empleo de los mencionados anticuerpos reveló que cuatro de seis epítopes de la lectina Gal/GalNAc

presente en aislamientos con zimodemos patógenos, no estaban presentes en la molécula correspondiente de amebas con zimodemos no patóge nos. Posteriormente, también con el uso de anticuerpos monoclonales, se identificaron y caracterizaron otras moléculas que permitían establecer la diferenciación. Veamos a continuación (Diamond y Clark, 1993; Jackson y Ravdin, 1996): Dos moléculas de superficie. Estas, de 29-30 y 96 kDa, están presentes en las cepas patógenas y ausentes, o presentes en menor cuantía, en las cepas no patógenas. En 1990, fue reportada la obtención de un anticuerpo monoclonal que reconocía los gránulos electrodensos relacionados con la actividad colagenolítica de E. histolytica. Éste reaccionaba solamente con los gránulos de aislamientos con zimodemos patógenos. Se ha sugerido que varias proteasas, incluida una con actividad colagenolítica, son liberadas en forma de cuerpos de membrana electrodensa, por un mecanismo similar al de exocitosis. Anticuerpos monoclonales específicos a antígenos intracelulares también han sido utilizados para distinguir entre aislamientos de las dos especies. Así, por ejemplo, se observó que uno dirigido contra una molécula de 81-84 kDa reaccionaba, en ensayo de Inmunofluorescencia indirecta, sólo con aislamientos con zimodemos patógenos.

4.4 Marcadores Genéticos Las primeras evidencias genéticas en favor de la existencia de las dos especies datan de finales de la década de 1980, cuando se clonaron y caracterizaron dos sondas de ADN, denominadas P145 y B133, procedentes de moléculas circulares de ADN extracromosoma l de cepas patógenas y no patógenas, respectivamente, que hibridaban de manera selectiva con los correspondientes aislamientos (Bhattacharya y cois., 1989; Huber y cois., 1989). Dando continuidad a estos trabajos, otras evidencias genéticas fueron halladas (Diamond y Clark, 1993; Jackson y Ravdin; 1996). A continuación nos referiremos a algunas de ellas: Dos sondas de ADNc de genes de copia única que codifican para un antígeno de superficie de 125 kDa fueron caracterizadas, una específica para aislamientos con patrones isoenzimáticos patógenos, y la otra para los no patógenos. Estas sondas, tras el análisis comparativo de sus secuencias nucleotídicas, resultaron divergentes en 12 % de sus secuencias deducidas de aminoácidos. Empleando la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) para amplificar fragmentos de estos genes, seguido de restricción enzimàtica, se pudo distinguir entre las dos especies de amebas.

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En 1991, se obtuvieron los correspondientes ADNc, de aproximadamente 400 pb, que codifican para el antígeno de 29-30 kDa en los aislamientos con zimodemos patógenos y no patógenos, y se compararon sus respectivas secuencias nucleotidicas. Se halló una diferencia de 4,5 % entre las secuencias de aminoácidos inferidas de ambas formas. Este fra gmento también puede ser utilizado para distinguir entre las dos especies mediante RCP y restricción enzimàtica. La comparación de las secuencias de ADNc de los genes de simple copia de superóxido dismutasa provenientes de aislamientos con patrones isoenzi máticos patógenos y no patógenos, reveló una divergencia nucleotídica de 5 %. Esta diferencia fue consistentemente observada tras restricción enzimàtica del ADN total e hibridación con dichas sondas marcadas. La organización de los genes para las moléculas actina del citoesqueleto amebiano también difiere entre ambos tipos de aislamientos. Estas variaciones genéticas parecen constituir un marcador de patogenicidad, pues se han obtenido mutantes de E. histolytica que carecen de una distribución regular de actina en su citoesqueleto y, en consecuencia, presentan menor movilidad y un comportamiento menos agresivo en modelos animales. Los genes de ARN ribosomal, muy conservados filogenèticamente, también han sido estudiados. Mediante la secuenciación parcial de los genes de ARN de la subunidad ribosomal pequeña de aislamientos con zimodemos patógenos y no patógenos, se pudo estimar en 2,2 % la distancia genética entre ambos, una diferencia que es mayor que la existente entre los humanos y los ratones. Mención aparte merecen las cisteíno-proteinasas amebianas. Estas, como veremos más adelante, constituyen importantes factores de virulencia de E. histolytica. Estas enzimas son codificadas por al menos siete genes, denominados EhCPl -6 y EhCP112 (Que y Reed, 2000). Al menos cuatro secuencias nucleotidicas homologas han sido identificadas en aislamientos con zimodemos no patógenos (EdCPl-4) (Que y Reed, 2000). Mediante un estudio de genes homólogos de una de estas enzimas (EhCP3 y EdCP3) en aislamientos con zimodemos patógenos y no patógenos, se encontraron diferencias estructurales y de expresión entre los mismos, y se determinó una divergencia de alrededor del 5 % entre las respectivas secuencias aminoacídicas (Bruchhaus y Tannich, 1996; Mirelman y cois., 1996). El conjunto de evidencias (funcionales, bioquímicas, inmunológicas y genéticas) hasta aquí descritas, contribuyó a la acumulación de pruebas definitivas a favor de la

existencia de las dos especies de amebas y condujeron a Louis Diamond y Graham Clark, en 1993 (Diamond y Clark, 1993) a la redescripción formal de E. histolytica, separándola de E. dispar. En enero de 1997, un Grupo de Expertos de la OMS, reunidos en Ciudad de México, evalúo las implicaciones que para la práctica médica y para la investigación sobre amebiasis tiene la confirmación de la existencia de las dos especies, implicaciones que revol ucionan ya, entre otros aspectos, la interpretación de los datos epidemiológicos, y los criterios diagnósticos y terapéuticos en relación con esta parasitosis (WHO/PAHO/UNESCO, 1997). A las conclusiones y recomendaciones devenidas de aquella reunión hacemo s referencia en otros acápites de este documento.

5. Factores de VirulenciaLa infección por E. histolytica no siempre tiene expresión clínica. Aunque en la mayoría de las ocasiones los patrones isoenzimáticos de las amebas obtenidas de individuos asintomátic os corresponden a E. dispar, se han encontrado zimodemos de E. histolytica en portadores sanos. Es decir, en determinadas condiciones, la cepa presente de la especie patógena puede ser avirulenta. No se debe olvidar que el desarrollo de enfermedad como consecuencia de la infección por un parásito, no depende exclusivamente de las características de éste. Las manifestaciones clínicas que se produzcan, y las formas que éstas asuman, serán el resultado de la interacción de tres grupos de factores: los relac ionados con el parásito, el hospedero y el medio ambiente. A continuación abordaremos los aspectos de la biología del parásito más estrechamente vinculados con su capacidad para invadir y producir daños en los tejidos (a los relacionados con el hospedero y con el medio ambiente haremos referencia en los acápites de este documento que abordan la inmunobiología y la epidemiología de la infección amebiana, respectivamente). Las fases que caracterizan la infección invasiva por E. histolytica han sido mejor estudiadas en modelos animales. De manera general, éstas se suceden así: adherencia al epitelio intestinal, degradación de la matriz extracelular, lisis extracelular (por contacto) e intracelular (por fagocitosis) de células del hospedero y evasión de los meca nismos defensivos de éste. Veamos con más detalles cada uno de estos eventos y los factores de virulencia de E. histolytica relacionados con los mismos.

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5.1 Adherencia al epitelio intestinal Como en el caso de otros microorganismos que parasitan el tubo dige stivo, E. histolytica requiere adherirse a la superficie de esa viscera. Varias moléculas han sido implicadas en la adhesión amebiana al epitelio intestinal, paso necesario para fases posteriores del proceso invasivo. Dos de ellas han recibido la mayor ate nción: la lectina Gal/GalNAc (Petri y cols. 1990a; Petri y cols, 1990b), a la cual ya nos referimos, y una adhesina de 112 kD ( García. -Rivera y cols., 1999) La lectina Gal/GalNAc es una proteína de 260 kD, integrada por una subunidad ligera, de 35 kD, y una pesada, de 170 kD. En esta última subunidad. más exactamente en un dominio de la misma rico en residuos de cisteína. reside su capacidad de unirse a residuos de galactosa y a N-acetil galactosamina presentes en la membrana de las células con las que int eractúa (Petri y cois, 1990b). Además de su acción facilitadora de la adherencia, otros dos atributos funcionales de esta lectina la hacen de los más potentes factores de virulencia de E. histolytica: 1) su necesaria presencia para el eficiente desarrollo de la actividad citolítica dependiente de contacto de este protozoo y 2) su participación en uno de los mecanismos de resistencia amebiana a la lisis mediada por la activación del sistema del complemento, a lo que haremos referencia después. Los trofozoítos de E. dispar también expresan una lectina Gal/GalNAc. A pesar del parecido estructural de ésta con la de E. histolytica, varios estudios revelaron significativas diferencias de epitopes entre ellas. Uno de éstos demostró que cuatro de seis epitopes presentes en la lectina de E. histolytica, no se expresaban en la de E. dispar (Petri y cols, 1990a; Ackers, 2002). La adhesina de 112 kD de E. histolytica está formada por dos polipéptidos (de 75 y 49 kD, respectivamente) codificados por dos genes diferentes. La caracterización de estos genes y de las moléculas recombinantes codificadas por ellos, demuestra que el polipéptido de 75 kD posee un dominio que participa en la adherencia de los trofozoítos amebianos a células epiteliales y a eritrocitos, mientras que el de 49 kD es una proteinasa cisteíno-dependiente (García-Rivera y cois, 1999). Experimentos con el empleo de microscopía confocal han demostrado la presencia de la adhesina de 112 kD en la membrana plasmática y en los bordes de los canales fagocíticos d e los trofozoítos de E. histolytica. Estos resultados sugieren que la molécula de 112 kD, además de participar en los procesos de adhesión, interviene en la ingestión amebiana de células de l hospedero (García-Rivera y cols, 1999).

5.2 Degradación de la matriz extracelular Moléculas de E. histolytica con actividad proteolítica dependiente de cisteína parecen ser las principales responsables de la degradación de la matriz extracelular ( Martínez- Palomo y cois., 1994; MaCoy y cols., 1994; Mesa y cois., 1994; Reed, 1995; Que y Reed, 1997). El papel de éstas como factor de virulencia está sustentado en su habilidad para degradar componentes de la matriz extracelular como son colágeno, elastina y fibronectina (Keene y cois., 1986; Luaces y Barrett, 1988; Que y Reed, 2000), en su capacidad para interferir con las funciones del sistema inmune del hospedero (Reed y Gigli, 1990; Reed y cois., 1995; Que y Reed, 2000), a lo cual haremos referencia después, y en el hecho de que E. histolytica, en relación con E. dispar, libera mayor cantidad de este tipo de proteinasas (Reed y cois., 1989; Que y Reed, 2000). Como antes mencionamos, las proteinasas dependientes de cisteína de E. histolytica, todas pertenecientes a la familia de la papaína, son codificadas por al menos siete genes, denominados EhCPl-6 y EhCP112 (Que y Reed, 2000). Al menos cuatro secuencias nucleotídicas homologas han sido identificadas en E. dispar (EdCPl-4) (Que y Reed, 2000). Comparando los locus genómicos que contienen los genes para CP5 (cp5), fue demostrado que la posición de cp5 está conservada dentro del contexto genómico de ambas especies, pero que el gen está altamente degenerado en E. dispar, con numerosas inserciones y delecciones que resultan en múltiples codones de parada en el fragmento de lectura de cp5. Sobre la base de éste y otros estudios comparativos de secuencias nucleotídicas de E. histolytica y E. dispar, ha sido sugerido que cp5 comenzó a degenerar en E. dispar cuando los dos organismos comenzaron a divergir a partir de un ancestro común (Willhoeft y cols, 1999). Las proteinasas resultantes de la expresión fenotípica de los genes para EhCPl -3 y EhCP5 han podido ser obtenidas en el sobrenadante de cultivos in vitro de E. histolytica. Éstas son muy activas en la degradación de proteínas de la matriz extracelular y, además, participan del efecto citopático de esta especie sobre monocapas de fibroblastos, un modelo in vitro de virulencia (Que y Reed, 2000). Como mencionáramos antes, ha sido demostrada la presenc ia de la proteinasa EhCP112 (péptido de 49 kD en la adhesina de 112 kD de E. histolytica) en la membrana plasmática y en los bordes de los canales fagocíticos de los trofozoítos de esta especie (García-Rivera y cois, 1999). La secuencia nucleotídica del gen EhCP3 tiene regiones con marcada homología con genes que codifican cisteíno-proteinasas liberadas por macrófagos activados y células

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tumorales invasivas. Estas similitudes estructurales y bioquímicas sugieren que la proteolisis por cisteíno-proteinasas excretadas pudiera constituir un mecanismo de invasión hística evolutivamente conservado (Que y Reed, 2000).

5.3 Lisis extracelular de células del hospedero Moléculas de varios tipos participan en el proceso por el cual los trofozoítos de E. histolytica lisan por contacto sus dianas celulares (Keene y cois., 1990; Reed, 1995). Dicho proceso requiere de la lectina Gal/GalNAc, de proteinasas cisteíno -dependientes y de la presencia extracelular de iones Ca Mediadores adicionales son necesarios. A continuaci ón, nos referiremos a varios de ellos.

5.3.1 Amebaporos E. histolytica posee una familia de pequeños péptidos, denominados amebaporos, que tienen la capacidad de insertarse en la bicapa lipídica de la membrana de la célula blanco y formar canales por los que difunden agua y otras moléculas, lo que produce la inmediata lisis de la célula. Las tres isoformas de esta familia, amebaporos A, B y C, son producidas en una relación de 35:10:1, están integradas por 77 aminoácidos y muestran entre sí una identidad en el rango de 35 a 57 %. E. dispar produce un amebaporo cuya secuencia aminoacídica tiene 95 % de homología con el amebaporo A de E. histolytica. Sin embargo, el nivel de síntesis y la actividad lítica de ese amebaporo son muy inferiores a los correspondientes al de la especie patógena. Los amebaporos aislados de los gránulos citoplasmáticos de E. histolytica tienen una significativa homología con otras proteínas con ac tividad lítica extracelular (por ejemplo, proteínas presentes en los gránulos de células T y células asesinas naturales humanas) (Leippe, 1997).

5.3.2 Fosfolipasa A Una fosfolipasa A de E. histolytica participa en la lisis de leucocitos polimorfonucleares en las áreas invadidas. Esta enzima, que es dependiente de la presencia de iones Ca 2+, al hidrolizar los fosfolípidos de la membrana plasmática de los leucocitos con los que interactúa, genera productos altamente tóxicos para los mismos. La actividad de la fosfolipasa A se incrementa en presencia de amebaporos. Se ha especulado con que éstos hacen más acce sibles los fosfolípidos de las membranas de las células dianas (Long-Krug y cols., 1985).

5.3.3 Otras moléculas con actividad citolítica Otras moléculas de E. histolytica han sido implicadas en el proceso lí tico y, por tanto, también han sido consideradas factores de virulencia de esta especie. Entre las más recientemente reportadas, se encuentra un grupo de hemolisinas que in vitro son citotóxicas a una línea de células epiteliales de intestino (Caco-2) (Janssen y cols., 1994).

5.4 Lisis intracelular de células del hospedero Aparentemente, tanto E. histolytica como E. dispar fagocitan y lisan intracelularmente células del hospedero. Sin embargo, E. histolytica, realiza estas actividades con mucha mayor intensidad. En las condiciones anaeróbicas del colon, la lisis intracelular de células del hospedero y de la amplia variedad de microorganismos que E. histolytica fagocita, se produce por mecanismos independientes de oxígeno (actividad lítica intravacuolar de la s proteínas formadoras de poros y de otras moléculas con actividad antibacteriana). Cuando los trofozoítos se encuentran invadiendo y, por tanto, en contacto con tejidos más oxigenados, la lisis intracelular también se produce por mecanismos dependientes de oxígeno (producción de formas reducidas del oxígeno y de óxido nítrico) (Martínez- Palomo y cois., 1994: Mesa y cois., 1994). Para el hospedero, la actividad fagocítica de E. histolytica tiene tres consecuencias adversas: 1) la alimentación del parásito a partir de componentes propios, 2) la eliminación de célulasque desempeñan importantes funciones biológicas, algunas de ellas defensivas 3) la incorporación de moléculas regulatorias del individuo infectado a la membrana plasmática del parásito (por ejemplo, la eritrofagocitosis permite a los trofozoítos de E. histolytica incorporar la molécula reguladora de los eritrocitos CD59 a su superficie y, con ello, evadir la lisis mediada por la activación del sistema del complemento) (Gutiérrez-Kobeh y cols., 1997).

5.5 Evasión de los mecanismos defensivos del hospedero Desde la llegada de E. histolytica a la luz intestinal, el hospedero opone barreras defensivas de muy diversos tipos a la multiplicación e invasión amebianas. Para vencer estos obstáculos, y poder alcanzar localizaciones tan distantes como los tejidos hepático y cerebral del individuo que parasita, E. histolytica despliega una amplia gama de mecanismos evasivos (dado que esta revisión bibliográfica contiene un acápite en el que

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se aborda la inmunobiología de la infección amebiana, hemos ubicado allí una referencia más detallada a estos mecanismos evasivos).

6. Patología de la invasión amebianaEn orden decreciente de frecuencia, los segmentos de intestino grueso por donde suele comenzar la invasión amebiana son el ciego, colon sigmoide y recto, regiones éstas donde se produce un éxtasis más prolongado del contenido intestinal (Pérez Tamayo R, 1989; Pérez Tamayo R y cois., 1994). La superficie luminal de los segmentos distales del aparato intestinal se encuentra protegida por una capa de grosor variable y apariencia viscosa, el mucus (Tse y Chad ee, 1991). Esta capa, a cuya composición y funciones defensivas nos referiremos más adelante, es notablemente más delgada sobre las áreas epiteliales situadas entre las glándulas de Liéberkuhn. Por este hecho, y porque en estas zonas es donde se renuevan l as células epiteliales (lo que las hace menos resistentes a la penetración amebiana), las áreas interglandulares constituyen el sitio histológico por donde comienza la invasión amebiana (Bruckner, 1992). Para facilitar adicionalmente su acceso al epitelio subyacente, este protozoo estimula, y a ello también nos referiremos más adelante, la secreción de un mucus “inmaduro”, incapaz de ejercer sus funciones defensivas (Tse y Chadee, 1991). Una vez traspasada la capa de mucus, E. histolytica se adhiere al epitelio intestinal y degradada la matriz extracelular más superficial. Después de ello, este protozoo invade los diferentes planos de la mucosa del colon merced a la actividad lítica a la que debe su nombre (Reed, 1995; Que y Reed, 1997). Inicialmente, se pro duce una lesión no ulcerada, en la cual la mucosa, vista al microscopio, se encuentra engrosada por hiperplasia glandular y edema del estroma (Pérez Tamayo R, 1989; Pérez Tamayo R y cois., 1994). Después de multiplicarse activamente en la mucosa, los trofo zoítos se extienden hacia planos más profundos de la pared intestinal, pasan la lámina propia, la Muscularis mucosae y llegan hasta la submucosa, donde las condiciones para su reproducción son aún más favorables. A partir de este momento, la progresión de la destrucción de los tejidos se produce en dirección horizontal. En consecuencia, se desarrolla una lesión de amplio fondo y pequeño orificio de entrada, la clásica úlcera en "botón de camisa" presente en la colitis ulcerativa amebiana (Pérez Tamayo R, 1989; Pérez Tamayo R y cols., 1994).

Formada la úlcera intestinal, a cuyas características histopatológicas nos referiremos más adelante, la invasión amebiana puede evolucionar de las siguientes maneras (Pérez Tama yo R, 1989; Pérez Tamayo R y cols., 1994): Cura espontánea o por tratamiento'. Con el tratamiento amebicida adecuado, y en ocasiones sin él, las lesiones iniciales pueden curar sin dejar huellas. Megacolon tóxico: Esta forma evolutiva, de muy mal pronóstico, es el resultado de la confluencia de numerosas úlceras y de la necrosis de grandes áreas del intestino grueso. Cuando ocurre, se producen múltiples perforaciones en la pared de este órgano, las que conducen al desarrollo de una peritonitis purulenta. Perforación intestinal'. Generalmente, los trofozoítos de E. histolytica llegan a la submucosa y no atraviesan la muscular, pero, en ocasiones, pueden penetrar esta última capa, extenderse a la serosa y aún perforarla. Esta complicación, que es más frecuente en las úlceras -situadas en el ciego, es casi siempre de evolución fatal. Ameboma: Este vocablo designa una forma evolutiva poco frecuente de la amebiasis invasiva, macroscópicamente caracterizada por el desarrollo de una masa tumoral que tiende a obstruir la luz intestinal y a simular un adenocarcinoma. Esta tumoración, que puede llega r a medir hasta 30 cm en su eje mayor, suele ser única y de forma irregular. Como las úlceras, de las cuales se origina, el ameboma se ubica, en orden decreciente de frecuencia, en ciego, colon sigmoide y recto. En términos microscópicos, la principal cara cterística de esta lesión es la presencia de tejido de granulación, con linfocitos y células gigantes, y la ausencia de trofozoitos en el interior de la misma. El ameboma puede coexistir con úlceras en las que sí es posible el hallazgo de trofozoítos. Diseminación hematógena al hígado y de éste a otras localizaciones: A pesar de que con cierta frecuencia se han observado trofozoítos en vasos linfáticos de la pared intestinal, éstos raras veces son encontrados en los ganglios linfáticos mesentéricos. De aquí que exista acuerdo en que la principal vía de diseminación extraintestinal de la infección amebiana sea la hematógena. Desde la submucosa intestinal, y después de digerir la pared de pequeñas vénulas mesentéricas, los trofozoitos llegan al hígado en la circulación portal. En este órgano forman uno o más abscesos, la mayoría de las veces en su lóbulo derecho. El absceso hepático es la más frecuente de las lesiones extraintestinales de la amebiasis invasiva. Desde él puede haber diseminación a sitios extrahe páticos, por ruptura (a peritoneo, estómago, duodeno, vías biliares, colon, pleura, pulmón, pericardio y mediastino), por continuidad (a pared abdominal y piel) y por vía

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hematógena (a cerebro). La migración sanguínea de trofozoítos desde la submucosa in testinal a localizaciones extrahepáticas, sin afectación del hígado, es muy rara. Extensión directa a la piel: Esta evolución, poco frecuente, se observa en pacientes con disentería y, sobre todo, en hombres homosexuales. Úlceras en las regiones perianal y perineal, de bordes irregulares, tamaño variable y muy dolorosas, constituyen su expresión clínica más característica.

6.1 Características histopatológicas comunes de las lesiones amebianas Un acercamiento al estudio de las características histopatológicas de las lesiones amebianas revela en éstas, con excepción del ameboma, dos elementos protagónicos comunes: la escasa presencia de células inflamatorias y, en parte vinculado con lo anterior, el desarrollo de extensas zonas de necrosis en las mismas. Para explicar cómo los trofozoítos pueden ser capaces de producir necrosis hística se han propuesto dos mecanismos: uno que depende de la atracción y destrucción de leucocitos polimorfonucleares en el sitio donde se está produciendo la invasión, con la liberación p or éstos de sustancias tóxicas para los propios tej idos del hospedero (Seydel y cols, 1997; Yi y Chadee, 1997), y otro, independiente de la desintegración de células inflamatorias, que sería consecuencia de la acción lítica directa de sus productos sobre d ichos tejidos (Reed, 1995; Que y Reed, 1997). En cuanto al primero de dichos mecanismos, experimentos realizados en modelos animales de amebiasis hepática han permitido observar que, durante las primeras horas de la invasión amebiana, ocurre una marcada infiltración del tejido invadido por leucocitos polimorfonucleares y, pocas horas después, también por células mononucleares. Sin embargo, cuando apenas han transcurrido veinticuatro horas del proceso invasivo, se produce un rápido descenso de la presencia de células inflamatorias en las lesiones. Con base en estas observaciones, se ha propuesto que la necrosis hística dependiente de leucocitos sucede en dos etapas: 1) la atracción quimiotáctica de estas células por productos liberados por los trofozoítos y por interleucina 8 (IL-8), quimiotaxina secretada por las células epiteliales ante la presencia del parásito y 2) la destrucción directa de los leucocitos por los mecanismos Uticos extracelulares (dependientes de contacto) e intracelulares (por fagocitosis) de E. histolytica.

7. Inmunobiología de la infección amebianaDeterminados factores del hospedero, al incidir directa o indirectamente sobre sus mecanismos defensivos, pueden hacer variar su susceptibilidad al desarrollo de amebiasis en cualesquiera de sus formas clínicas (Kretschmer, 1989; Kretschmer y López-Osuna, 1994; Kretschmer y López-Osuna, 1999). Los citados con más frecuencia, son los siguientes: Edad\ La disentería amebiana es más frecuente en personas menores de quince años, con una relación de 2:1. Esto se correlaciona con los resultados de estudios en ratones, en los cuales se ha demostrado una mayor susceptibilidad a la infección por E. histolytica en los animales jóvenes. A la inversa, el absceso hepático amebiano es más frecuente en indivi duos mayores de quince años, con una relación de 2:1. Sexo: El absceso hepático amebiano es más frecuente en hombres que en mujeres, con una relación de 2:1. Raza. En el continente africano, las personas de raza negra se infectan por E. histolytica con una frecuencia mayor que los individuos de raza blanca. Estado nutricional: La desnutrición contribuye a incrementar la mortalidad en personas infectadas por E. histolytica, especialmente en niños. Dieta. En modelos animales, dietas ricas en carbohidratos y p obres en proteínas favorecen la colonización del epitelio intestinal por E. histolytica. Embarazo'. Un estudio realizado en Nigeria hace alusión al embarazo como un factor de riesgo en mujeres que padecían de colitis amebiana. Infecciones bacterianas intercurrentes: A pesar de que experiencias más recientes hacen pensar que la coinfección bacteriana no es un requerimiento absoluto para el desarrollo de una amebiasis invasiva, parece existir acuerdo en que las bacterias contribuyen a la invasividad amebiana al promover indirectamente la adherencia de este protozoo al epitelio intestinal, entre otras acciones. Tratamientos Esteroideos'. Existen reportes de complicaciones severas en pacientes de amebiasis que han recibido tratamiento con drogas corticoesteroides.

7.1 Mecanismos defensivos inespecíficos a E. histolytica Muchos aspectos de la inmunobiología de la infección del humano por E. histolytica no son bien conocidos. En relación con los mecanismos defensivos inespecíficos, la información acumulada nos permite referirnos a los siguientes aspectos:

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7.1.1 Funciones defensivas del mucus intestinal El mucus intestinal es una compleja mezcla de glicoproteínas, péptidos, lípidos, electrolitos, moléculas séricas (por ejemplo, IgA), miembros de la flora bacteriana y restos celulares. Su principal componente, las mucinas (glicoproteínas de estructura química no bien definida), son producidas por las células caliciformes del epitelio intestinal (Tse y Chadee, 1991). En el caso de la infección por E. histolytica, el mucus intestinal realiza funciones defensivas por, al menos, dos mecanismos: 1) atenuación de las funciones motrices de los trofozoítos, a consecuencia de su viscosidad y 2) unión de parte de las glicoproteínas que lo componen, por intermedio de sus residuos oligosacarídicos, a la lectina Gal/GalNAc. Esto tiene dos consecuencias: el impedimento de la adherencia de los trofozoítos al epitelio y su atrapamiento en el interior del mucus, con su posterior eliminación peristáltica (Tse y Chadee, 1991).

7.1.2 Reclutamiento de neutrófilos Aunque escasamente presentes en las lesiones bien establecidas, los neutrófilos son las primeras células en responder al contacto de E. histolytica con los tejidos del hospedero. Estudios in vitro han demostrado que la incubación de monocapas de células de diferentes líneas de cultivo (células epiteliales de colon T84, LS174T y Caco -2) con proteínas amebianas, con productos secretados por E. histolytica, o con los propios trofozoítos, resulta en un aumento en la secreción de IL-8 por las primeras. Con base en estos hallazgos, se ha sugerido que IL-8 es secretada por las células epiteliales del colon ante la presencia de E. histolytica, o sus productos, y que esta citoquina actúa como agente quimiotáctico para la infiltración por neutrófilos que caracteriza las primeras etapas de la invasión amebiana (Seydel y cois, 1997; Yi y Chadee, 1997).

7.1.3 Activación de la vía alternativa del complemento E. histolytica, como también E. dispar, activa la vía alternativa del complemento por un mecanismo único, la lisis de C3 (ruptura del enlace peptídico entre los aminoácidos 78 y 79 de la cadena a de esta molécula) por proteinasas extracelulares (Reed, 1995). De este proceso emergen dos fragmentos: C3a (péptido amino-terminal de la cadena a), molécula con actividad de anafílotoxina y, por tanto, promotora de inflamación, y C3b, porción que, dando continuidad a la cascada enzimàtica del complemento, lleva a la formación del complejo de ataque a la membrana (CAM) (C5b-9), que finalmente

produce la lisis del trofozoíto. Como barrera defensiva contra E. dispar, la activación de la vía alternativa del complemento es altamente eficiente. De hecho, éste es uno de los mecanismos que impide la invasión hística por esta especie (Reed, 1995). Sin embargo, E. histolytica ha desarrollado la capacidad de evadir los efectos biológicos que se derivan de la acción de los dos fragmentos antes mencionados (vea más adelante acápite “Mecanismos de evasión de E. histolytica”).

7.1.4 Fagocitosis y eliminación de trofozoítos amebianos por células mononucleares Células mononucleares de humanos y de animales de experimentación son capaces de fagocitar trofozoítos de E. histolytica. En la lisis intracelular de los trofozoítos fagocitados participan mecanismos microbicidas dependientes e independientes de oxígeno. Evidencias recientes demuestran que el óxido nítrico (ON), derivado de L- arginina, es el principal mediador de la muerte amebiana intramacrofágica. Aunque las formas reactivas del oxígeno, como el anión superóxido (O 2) y el peróxido de hidrógeno (H 2O2), no son directamente citotóxicas para las amebas, estas moléculas parecen ser importantes cofactores en la actividad lítica del ON (una inhibición del estallido respiratorio, y con ello una reducción en los niveles de O 2 y de H2O2, conduce a una menor producción de ON). Muy interesante es el reporte de que el factor de necrosis tumoral alfa (FNT), producido por macrófagos activados, actúa de manera autocrina y aumenta la citotoxicidad antiamebiana dependiente de ON, al estimular la expresión del gen que codifica para la sintetasa inducible de óxido nítrico. Este hallazgo, como veremos más adelante, es un argumento en favor de que las respuestas inmunitarias celulares a E. histolytica, entre otros efectos, incrementan la capacidad de las células mononucleares para eliminar a este protozoo (Ortiz-Ortiz y cois., 1994; Kretschmer y López-Osuna, 1994; Kretschmer y López-Osuna, 1999; Sánchez-Guillén, 2002).

7.2 Mecanismos defensivos específicos a E. histolytica La información sobre la adquisición de inmunidad despué s de la infección por E. histolytica es limitada. No obstante, se conoce que la curación de un episodio de colitis amebiana o de un absceso hepático amebiano resulta en el desarrollo de cierto grado de inmunidad. En un estudio de seguimiento de 1 021 indiv iduos que habían sobrevivido a un absceso hepático amebiano, en sólo 5 se presentó nuevamente la enfermedad en los

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cinco años siguientes (Caballero-Salcedo A y cols., 1994). Sobre los mecanismos que median el desarrollo de inmunidad antiamebiana existe menor claridad aún. Al respecto, haremos referencia a las respuestas mejor caracterizadas.

7.2.1 Respuestas inmunitarias mediadas por anticuerpos Un estudio realizado en la década de 1970 demostró que, al momento del diagnóstico, 80 % de los niños con amebiasis intestinal sintomática habían desarrollado coproanticuerpos antiamebianos de las clases IgG e IgA. Tres semanas después, sólo 55 % de los casos se mantuvo positivo a coproanticuerpos. Por el contrario, los anticuerpos antiamebianos séricos se incrementaron durante ese período. Estos datos ilustran el curso de la respuesta inmunitaria humoral a la invasión intestinal amebiana: una respuesta de anticuerpos secretorios de corta duración, seguida de una de anticuerpos séricos más prolongada (Krupp, 1970; Krests chmer, 1989; Pérez-Montfort, 1994; Kretschmer y López-Osuna, 1999). Los individuos con absceso hepático amebiano desarrollan una vigorosa respuesta de anticuerpos séricos a E. histolvtica, que es detectada una semana después de comenzados los síntomas. Estos anticuerpos forman la base de los ensayos serológicos utilizados para el diagnóstico de las formas invasivas de amebiasis, en particular del absceso hepático amebiano (vea acápite “Diagnóstico de la amebiasis”). La aparición de anticuerpos a E. histolytica no tiene efectos sobre el curso de un absceso hepático amebiano, pues esta forma clínica tiene un alto índice de mortalidad si no se emplea el tratamiento adecuado. Sin embargo, estos anticuerpos aparentemente proveen al hospedero de protección contra subsecuentes infecciones por este protozoo. Anticuerpos antiamebianos, obtenidos de pacientes de absceso hepático y suministrados parenteralmente a ratones con inmunodeficiencia combinada severa (ratones sin linfocitos B y T funcionales), fueron capaces de proteger a estos animales del desarrollo de absceso hepático cuando se les realizó un reto intrahepático con trofozoítos de E. histolytica. (Seydel y cois., 1996). Los anticuerpos séricos antiamebianos tienen efectos citotóxicos in vitro e in vivo. En correspondencia con ello, se sabe que activan la vía clásica del complemento. Pero también se conoce, y éste es un elemento en contra de la eficiencia de este mecanismo, que E. histolytica evade, como veremos después, la lisis por los componentes de este sist ema (Kretschmer y López-Osuna, 1999).

Por otro lado, ha sido demostrado in vitro que en presencia de anticuerpos séricos antiamebianos, los trofozoítos de E. histolytica disminuyen su ritmo de crecimiento, pierden movilidad y eritrofagocitan a menor velocidad (Kretschmer y López-Osuna, 1999). Estudios in vitro han demostrado que anticuerpos IgA secretorios antiamebianos pueden bloquear la adherencia de trofozoítos de E. histolytica a células de líneas de cultivo (Carrero y cois., 1994). Estos resultados han sugerido que dichos anticuerpos podrían desempeñar un papel protector in vivo, al impedir la colonización del epitelio intestinal. Sin embargo, al reflexionar sobre la definitiva función protectora de los anticuerpos IgA secretorios anti -f. histolytica, se debe tener en cuenta la ausencia de evidencias en favor de que la amebiasis intestinal es más frecuente o más severa en individuos con déficit de IgA (Kretschmer y López-Osuna, 1999).

7.2.2 Respuestas inmunitarias mediadas por células Desde una perspectiva epidemiológica, los argumentos sobre el papel de las respuestas inmunitarias celulares en la protección contra la invasión amebiana son contradictorios (Gutiérrez y Muñoz, 1994). Las evidencias más fuertes en favor de una participación significativa, provienen de reportes sobre complicaciones severas en pacientes de amebiasis que han recibido tratamiento con drogas corticoesteroides (Kanai, 1969)). La inexistencia de informes sobre un incremento significativo de la incidencia de amebiasis en pacientes de síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) en áreas donde ambas entidades son endémicas es el principal argumento en contra (Kretschmer y López - Osuna, 1999). Sin embargo, estudios in vitro parecen demostrar la existencia de mecanismos protectores mediados por células. Linfocitos T de individuos con absceso hepático amebiano que han rebasado la fase aguda de la enfermedad, desarrollan respuestas proliferativas cuando son estimulados con antígenos de E. histolytica. La capacidad de las células mononucleares de fagocitar y eliminar trofozoítos de E. histolytica se incrementa cuando las mismas son puestas en contacto con sobrenadantes de cultivos linfocitarios estimulados con antígenos amebianos. En línea con lo anterior, las linfoquinas detectadas en dichos sobrenadantes fueron el interferón gamma (INF-5), la interleuquina 2 (1L-2) y el factor de necrosis tumoral beta (FNT-P), que corresponden a un patrón de respuestas Thl (Gandhi y cols. 1986; Salata y cols., 1986; Salata y cols., 1987; Kretschmer y López-Osuna, 1999; Sánchez-Guillén, 2002).

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7.3 Mecanismos de evasión de E. histolytica La relativa ineficiencia de los mecanismos defensivos del hospedero contra la infección por E. histolytica, que es más manifiesta en las primeras fases de ésta, ha conducido a la consideración de que este protozoo desarrolla mecanismos evasivos de las respuesta s inmunitarias. De ellos, y sin que en todos los casos exista aún información concluyente, los mejor caracterizados son los siguientes:

7.3.1 Hipersecreción de glicoproteínas alteradas por las células caliciformes Como fuera detallado anteriormente, las glicoproteínas del mucus intestinal evitan la adherencia de los trofozoítos de E. histolytica al epitelio subyacente. Se ha observado que éstos, por mecanismos no bien definidos, estimulan la síntesis de estas glicop roteínas, también llamadas mucinas, por las células caliciformes. El resultado es la secreción de mucinas “inmaduras”, de bajo peso molecular, incapaces de inhibir la adherencia de los trofozoítos a las células del epitelio y, con ello, de impedir la poste rior invasión amebiana (Tse y Chadee, 1991).

7.3.2 Recambio antigénico de E. histolytica E. histolytica modifica continuamente la expresión de sus antígenos, lo que pudiera hacer inútiles los mecanismos inmunitarios efectores desarrollados por el hospedero (Kret schmer, 1989; Kretschmer y López-Osuna, 1998).

7.3.3 Lisis de células inflamatorias Durante las primeras horas de la invasión amebiana, se observa un intenso flujo de leucocitos polimorfonucleares al sitio donde se desarrolla. Sin embargo, poco tiempo después, l as células inflamatorias en las lesiones son escasas, han sido víctimas de los mecanismos Uticos del parásito antes que pudieran realizar sus funciones defensivas (Seydel y cois, 1997; Yi y Chadee, 1997).

7.3.4 Inmunosupresión del hospedero Se ha observado que, durante las fases más tempranas de la invasión amebiana, algunas variables de la inmunidad mediada por células están deprimidas (linfoproliferación de células T, producción de linfoquinas, actividad linfocitotóxica). Esta anergia celular se produce fundamentalmente ante componentes de E. histolytica, pues, en general, se observan respuestas normales a otros antígenos (estreptoquinasa, estreptodornasa,

derivados proteicos purificados y candidina). Las evidencias experimentales hoy disponibles hacen pensar que la hiporrespuesta es consecuencia de efectos moduladores de los trofozoítos, o sus productos, sobre las funciones defensivas de macrófagos y células T (Betz y Fox, 1991;Wang y Chadee, 1992; Wang y Chadee, 1995; Talamas - Rohana, 1995; Campbel y Chadee, 1997; Kretschmer y López-Osuna, 1999).

7.3.5 Evasión de los efectos derivados de la activación del sistema del complemento Tanto E. dispar como E. histolytica activan la vía alternativa del complemento. In vitro, además, ha sido demostrado que anticuerpos anti~£. histolytica activan la vía clásica de este sistema. Sin embargo, E. histolytica evade los efectos que se derivan de la acción de los fragmentos C3a, C3b y C5a resultantes de la activación del complemento. Veamos:

Degradación de C3a por proteasas cisteíno-dependientes de E. histolytica Las proteasas amebianas dependientes de cisteína rompen el enlace peptídico entre los aminoácidos 78 y 79 de la cadena a de la molécula C3, con la formación de los fragmentos C3a (segmento amino-terminal de la cadena a) y C3b (formado por el resto C3). Varios estudios han demostrado que después de la formación de C3a, estas proteasas continúan rompiendo enlaces peptídicos con la aparición de fragmentos aún más pequeños, que en modelos in vitro de inflamación no conservan su actividad biológica (Reed, 1995; Reed y cois., 1995).

Resistencia a la lisis mediada por el complejo de ataque a la membrana Una vez formado el fragmento C3b, la activación secuencial de los componentes termi nales del complemento (de C5 hasta C9) puede llevar a la integración del CAM (C5b -9) y a la lisis de la célula diana. Esto es lo que parece ocurrir cuando esta cadena de eventos tiene lugar sobre la superficie de la membrana citoplasmática de trofozoítos d e E. dispar. Sin embargo, cuando el proceso de formación del CAM se produce sobre la superficie de trofozoítos de E. histolytica la secuencia de eventos no termina en la lisis amebiana (Gutiérrez -Kobeh y cois., 1997)). Dos explicaciones, ambas, con base ex perimental y no necesariamente excluyentes, han sido adelantadas para contribuir a la comprensión de este fenómeno. . La resistencia de E. histolytica a la lisis mediada por el complemento es una propiedad genética de este protozoo, pues una molécula de su superficie, la lectina Gal/GalNAc,

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media la inhibición de la formación del CAM. Ello está basado en el parecido estructural de la lectina, demostrada mediante análisis secuencial y el uso de anticuerpos monoclonales, con la molécula CD 59, un inhibidor del CAM en células sanguíneas humanas. . La resistencia de E. histolytica a la lisis mediada por el complemento es una propiedad adquirida en su interacción con el hospedero. Este planteamiento encuentra soporte en dos hallazgos: 1) el más alto ritmo de er itrofagocitosis de las cepas más virulentas, resulta en una más amplia incorporación de moléculas regulatorias (por ejemplo, CD 59) a su superficie y 2) cepas de E. histolytica susceptibles a la acción del complemento, se hacen resistentes a este mecanismo lítico cuando son incubadas con una fuente de proteínas reguladoras, por ejemplo, suero humano.

8. Formas Clínicas de la AmebiasisComo consecuencia de las muy diferentes formas de interacción hospedero -parásito que pueden establecerse cuando el humano es infectado por E. histolytica, amplio es el espectro clínico de la amebiasis. Entre los muchos colegas que han publicado sobre el te ma, no existe un modo uniforme de agrupar, e incluso designar, las diferentes formas clínicas de esta parasitosis (Sepulveda y Treviño-García, 1989; Bruckner, 1992; Reed, 1992; Muñoz, 1994; Treviño-García, 1994; Matijasevic; 1995; Ravdin, 1995). Para ser c oherentes con los acápites en que abordamos el diagnóstico y tratamiento de esta parasitosis, hemos decidido hacerlo de la siguiente manera:

8.1 Amebiasis intestinal asintomática En la casi totalidad de los estudios reportados, 90 % o más de los individuos inf ectados por E. histolytica son asintomáticos. Estas personas, también llamadas portadores sanos, en dependencia de la relación hospedero-parásito que se establezca, pueden evolucionar hacia el cese espontáneo de la eliminación de quistes en las heces o al desarrollo de una de las formas de amebiasis sintomática.

8.2 Amebiasis intestinal sintomática La amebiasis intestinal sintomática es consecuencia de la invasión de la pared del colon por trofozoítos de E. histolytica. Su período de incubación es en extremo variable, y su duración depende, entre otros factores, del inoculo infectante, de las oportunidades de reinfección y de las características particulares de la relación hospedero -parásito que se

desarrolle. De manera general, puede ser tan breve como de dos a cinco días, o tan prolongado como de un año. La mayoría de los autores coinciden en que las formas de presentación de la amebiasis intestinal sintomática son dos: 1) colitis amebiana disentérica y 2) colitis amebiana no disentérica. Estas formas clínicas pueden dar lugar a complicaciones de mayor gravedad, a las que nos referiremos posteriormente.

8.2.1 Colitis amebiana disentérica Se puede observar en todos los grupos de edades, pero su incidencia es más alta en ni ños menores de cinco años. Tres son las manifestaciones clínicas que la caracterizan: diarreas muco-sanguinolentas, cólicos intestinales y tenesmo rectal.

8.2.2 Colitis amebiana no disentérica También llamada colitis amebiana crónica, es la forma más común de amebiasis intestinal sintomática. Puede ser el debut de la infección amebiana o, menos frecuentemente, una fase evolutiva de la colitis disentérica. Está caracterizada por la presencia de síntomas de colitis, sin que se desarrolle el cuadro disentérico clási co. Sus manifestaciones más frecuentes son dos: cambios en el ritmo de defecación y dolor abdominal.

8.2.3 Complicaciones de la amebiasis intestinal sintomática La amebiasis intestinal sintomática, en cualquiera de sus dos presentaciones habituales, puede evolucionar hacia formas clínicas más complejas. Estas complicaciones son, entre otras menos frecuentes, la colitis fulminante, las perforaciones intestinales, el ameboma y la apendicitis amebiana.

8.3 Amebiasis extraintestinal El absceso hepático es la más frecuente de las lesiones extraintestinales de la amebiasis invasiva. Otras localizaciones extraintestinales son la pleuropulmonar, la peritoneal, la pericárdica, la cerebral y la cutánea.

8.3.1 Absceso hepático amebiano Aunque puede presentarse a cualquier edad y en ambos sexos, es más frecuente en adultos masculinos. Cuando se presenta en niños, ocurre sobre todo en la edad

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preescolar y con frecuencias parecidas en hembras y varones. Estudios de autopsias han demostrado la localización hepática de la amebiasis invasiva hasta en 30 % de los pacientes de colitis amebiana. Por otro lado, el absceso hepático amebiano puede ocurrir sin historia reciente de infección intestinal y en ausencia del parásito en las heces del paciente. No existe acuerdo en la literatura médica en cuanto al modo de inicio de los síntomas. En general, los autores que viven en países donde el absceso hepático amebiano no es frecuente, aluden a dos formas de presentación de éste: aguda, con la aparición de los síntomas y signos más característicos de la entidad en los primeros diez días, y subaguda, caracterizada por un comienzo más lento, en la que los componentes principales del cuadro pueden tardar semanas y meses para hacerse presentes de conjunto.

Presentación aguda El dolor, de aparición brusca e intensidad variable, y la fiebre son síntomas siempre presentes en esta forma de debut del absceso amebiano del hígado. Otras características semiológicas del dolor dependerán del número (regularmente uno), tamaño y ubicación de los abscesos. La fiebre, que suele acompañarse de escalofríos, alcanza cifras entre 38 y 40 °C, fundamentalmente durante la tarde y la noche. Los pacientes de absceso hepático pueden presentar tos seca, particularmente cuando este se ubica en el lóbulo derecho. Otros síntomas, no siempre presentes, contribuyen a completar el cuadro. Estos son: anorexia, náuseas, vómitos y diarreas. Mención aparte merecen las diarreas. Las deposiciones líquidas, que pueden ser de tipo disentérico, están presentes en aproximadamente 90 y 30 % de los niños y adultos, respectivamente, que padecen de un absceso hepático amebiano. En la mayoría de los casos no se logra demostrar la posible causa amebiana de las mismas.

Presentación subaguda La forma de presentación subaguda del absceso hepático, considerada menos frecuente, se caracteriza por una incorporación gradual, en semanas o meses, de los síntomas y signos que conformarán el cuadro florido de la enfermedad. Al comienzo, cuatro son las manifestaciones clínicas más comunes: pérdida de peso, hepatomegalia, anemia y fiebre (rara vez sobrepasa los 38 °C y, como en el caso de la forma aguda, suele presentarse fundamentalmente durante la tarde y la noche).

Complicaciones del absceso hepático amebiano Sin el tratamiento adecuado y oportuno, la evolución de los pacientes de absceso hepático es generalmente desfavorable, pues suelen progresar hacia complicaciones graves, como la diseminación extrahepática, la más frecuente, la sobreinfección bacteriana del absce so y la insuficiencia hepática. Sin embargo, es válido señalar que la fistulización del absceso hacia los bronquios, el tracto gastrointestinal y la piel, al permitir la evacuación de su contenido, suele producir una mejoría del paciente y, en ocasiones, l a cura espontánea del mismo.

9. Diagnóstico de la AmebiasisNos referiremos primero a los Procedimientos Diagnósticos que, partiendo de una sospecha clínica, son empleados en el diagnóstico de esta parasitosis, y después al Diagnóstico de las Formas Clínicas de Amebiasis, cuando hagamos alusión al conjunto de hallazgos clínicos y complementarios que permiten el diagnóstico de las formas clínicas de esta entidad.

9.1 Procedimientos Diagnósticos Los exámenes complementarios empleados para el diagnóstico de la amebiasis, como los utilizados para el diagnóstico de otras parasitosis, son de dos tipos: directos e indirectos. Con los primeros, entre ellos los microscópicos, se busca la presencia de uno o más estadios de E. histolytica, o sus componentes, en una muestra biológica representativa del proceso infeccioso; con los segundos, procedimientos de muy diferentes tipos (imagenológicos, inmunológicos, etc.), se tiene la intención de obtener resultados que, junto a elemento s clínicos y epidemiológicos, ofrezcan un diagnóstico probable (Sepúlveda y Treviño -García, 1989; Bruckner, 1992; Reed, 1992; Muñoz, 1994; Treviño-García, 1994; Matijasevic; 1995; Ravdin, 1995).

9.1.1 Procedimientos directos De manera general, la identificación de E. histolytica, o sus componentes, se realiza en heces o en los tejidos invadidos del hospedero. Debemos señalar que cuando la identificación se realiza en heces, y sobre todo cuando se encuentran quistes, en realida d lo que se está detectando es una infección por una o ambas especies del complejo E. histolytica/ E. dispar.

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Procedimientos microscópicos para la identificación amebiana en heces Los procedimientos microscópicos que se deben emplear para la identificac ión de amebas en heces son de dos categorías: preparaciones húmedas y técnicas suplementarias. Veamos:

Preparaciones húmedas Las preparaciones húmedas permiten el examen directo de la materia fecal y, por su facilidad y bajo costo de ejecución, pueden ser empleadas en los laboratorios del nivel primario de salud. Entre éstas, las más utilizadas son las realizadas con solución salina fisiológica, con solución de azul de metileno amortiguado y con solución yodada.

-Preparaciones húmedas con solución salina fisiológica En el caso particular del diagnóstico de la amebiasis, este procedimiento es muy utilizado para la identificación, sobre todo por las características de su movimiento y por la presencia de elementos fagocitados, de trofozoítos amebianos en hece s y en otras muestras biológicas. Aunque sin ofrecer muchos detalles de su estructura, también permite la visualización de quistes amebianos en heces. Si un trofozoíto forma seudópodos con rapidez y se mueve en una dirección, puede tratarse de E. histolytica. Si un trofozoíto se mueve en la forma descrita y se observan hematíes en su citoplasma, puede suponerse con más certidumbre que se trata de E. histolytica.

-Preparaciones húmedas con solución de azul de metileno amortiguado Este procedimiento, que de manera particular tiñe los núcleos, se debe emplear cuando se sospecha la presencia de trofozoítos amebianos en las heces o, como herramienta confirmatoria, cada vez que éstos se observen en una preparación húmeda con solución salina fisiológica. Esta prepa ración tiñe los trofozoítos, pero no los quistes amebianos. Además, no colorea ni los trofozoítos ni los quistes de flagelados.

-Preparaciones húmedas con solución yodada Esta preparación permite la observación e identificación de quistes de amebas y flage lados, al teñir los núcleos de éstos. Cuando se emplea para el diagnóstico de amebiasis, resulta un procedimiento de fácil y rápida realización para la diferenciación de quistes en heces.

Técnicas suplementarias Las técnicas suplementarias son de dos tipos: las técnicas de concentración y las técnicas de tinción permanente. Éstas, en general, son de complejidad y costos de ejecución mayores que los exámenes con preparaciones húmedas y se emplean cuando, después de realizado uno o más de aquellos: . No se encuentran amebas en las heces del paciente y existen sospechas clínicas de su presencia en el sistema digestivo de éste. En este caso, se utilizarían las técnicas de concentración. De éstas, las más empleadas son las técnicas de concentración con formo l acetato etílico y formol éter (método de Ritchie) y la que se realiza mediante flotación con sulfato de zinc (método de Faust). . No son suficientes los criterios morfológicos de que se dispone para establecer la identidad de las estructuras encontradas. En estas circunstancias, se haría uso de las técnicas de tinción permanente. De éstas, las más empleadas son la técnica de tinción con hematoxilina férrica y la técnica de tinción tricrómica para protozoos. Estas técnicas permiten, además, la conservación de las preparaciones para su observación posterior con fines múltiples.

Limitaciones de la observación microscópica de heces Por su relativo bajo costo de realización, su disponibilidad en prácticamente todas las unidades de la mayoría de los sistemas de salud y porque permite la detección de otras infecciones parasitarias en el mismo ensayo, la observación microscópica de heces es el examen más utilizado para el diagnóstico de la amebiasis intestinal. Sin embargo, este procedimiento tiene limitaciones que debemos comentar: . Debido a que la excreción fecal de las amebas es intermitente y éstas no están distribuidas de forma homogénea en las heces, la observación microscópica de una sola muestra por paciente se asocia a más de 40 % de resultados falsos nega tivos. Ello hace necesario, para lograr una sensibilidad superior a 90 %, el examen de al menos tres muestras por individuo (Walsh, 1986). . Si quien realiza el procedimiento no conoce adecuadamente las características morfológicas de los elementos a ser observados, confunde con mucha frecuencia trofozoítos amebianos con leucocitos y quistes de unas amebas con los de otras. Esta incapacidad para realizar una adecuada discriminación microscópica, conduce, en no pocas ocasiones, a resultados falsos positivos (Bruckner, 1992).

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. La insuficiencia del examen microscópico para diferenciar entre quistes de E. histolytica y de E. dispar, a cuyas implicaciones nos referimos más adelante, es otra fuente de sobrediagnóstico de amebiasis intestinal (WHO/PAHO/UNESCO, 1997).

Identificación amebiana en lesiones intestinales La realización de exámenes endoscópicos de colon y recto permite la observación de lesiones sugestivas de alguna de las formas de amebiasis intestinal (en tales casos, además, si el riesgo de perforación intestinal no es alto, es recomendable la toma de tejidos de una o más de las lesiones encontradas) (Sepúlveda y Treviño-García, 1989; Bruckner, 1992; Reed, 1992; Muñoz, 1994; Treviño-García, 1994; Matijasevic; 1995; Ravdin, 1995). El examen microscópico de cortes de tejido invadido hace posible la identificación de E. histolytica en las lesiones intestinales. Generalmente, la utilización de la clásica coloración con hematoxilina-eosina permite la observación de los trofozoítos amebianos. Sin embargo, dado que esta tinción no permite detallar las estructuras nucleares, en ocasiones es necesario el empleo de coloraciones especiales, tales como la tinción tricrómica, que posibilitan una mejor diferenciación de las amebas respecto a macrófagos e histiocitos.

Identificación amebiana en lesiones extraintestinales En determinadas circunstancias, puede ser necesaria la identificación de Entamoeba histolytica en el tejido aspirado de un absceso hepático (Sepúlveda y Treviño-García, 1989; Muñoz, 1994; Treviño-García, 1994). Los trofozoítos son escasos en el líquido necròtico del centro de la lesión y más abundantes en los tejidos en las márgenes de la misma. En otras situaciones la identificación amebiana en el material de un absceso hepático también es posible y recomendable (Sepúlveda y Treviño -García, 1989; Muñoz, 1994; Treviño-García, 1994). Todas están relacionadas con la apertura del absceso hacia estructuras vecinas: hacia un bronquio, en cuyo caso su contenido es expectorado; hacia el peritoneo, de donde puede ser tomado de tener lugar el abordaje quirúrgico del paciente; y hacia la piel, cuando es posible la toma de la muestra de la fístula correspondiente. Debido a que no es posible el hallazgo de quistes en los tejidos invadidos por Entamoeba histolytica, para la identificación de este protozoo en los mismos, se deben

emplear preparaciones húmedas y tinciones permanentes que faciliten la identificación de trofozoítos. Con ese fin, excepto en la preparación húmeda con solución yodada, se suelen utilizar las preparaciones húmedas y las tinciones permanentes antes descritas.

Detección de Entamoeba histolytica por cultivo in vitro El cultivo in vitro de E. histolytica a partir de muestras representativas del proceso infeccioso (heces, tejido de úlcera intestinal, material de abscesos, etc.), es un procedimiento diagnóstico mucho más sensible que la observación microscópica de tales muestras (Sepúlveda y Treviño -García, 1989; Muñoz, 1994; Treviño-García, 1994. Sin embargo, varios inconvenientes impiden su más amplio uso para tal fin: . La imposibilidad de realizar cultivos en la mayoría de los laboratorios donde se diagnóstica esta parasitosis. . Los resultados del cultivo no están disponibles hasta pas ados cuatro o más días de recogida la muestra. . En los casos de muestras en que ocurre crecimiento amebiano, la identificación de especie nunca excluye la presencia de E. histolytica. Varios medios de cultivo han sido utilizados para el crecimiento in vitro de E. histolytica con fines diagnósticos. De ellos, en los últimos años ganó popularidad el empleo del medio bifásico de Robinson, que permite la obtención de amebas para su caracterización isoenzimática y, con ello, la diferenciación entre E. histolytica y E. dispar.

Detección de Entamoeba histolytica por análisis isoenzimático Como expresáramos antes, sobre la base de la migración electroforética de determinadas enzimas es posible discriminar entre E. histolytica y E. dispar. Hasta muy recientemente, este fue el procedimiento de referencia para validar ensayos que permitieran la identificación de estas especies. En la práctica, sin embargo, el análisis de isoenzimas tiene los inconvenientes del cultivo in vitro que debe precederlo, incluido el hecho de que éste no siempre es exitoso (Sehgal y cols., 1995). Por ese motivo, su uso con fines de diagnóstico clínico es raro (Ackers, 2002).

Detección de componentes de Entamoeba histolytica Las limitaciones del examen microscópico, de manera particular los falsos diagnósticos de amebiasis asociado al mismo y su insuficiencia para discriminar entre infección por

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E. histolytica e infección por E. dispar, han conducido al desarrollo de procedimientos que permitan la detección de componentes de la especie presente.

Detección de componentes antigénicos Las primeras aproximaciones al desarrollo de procedimientos para la detección de componentes antigénicos de E. histolytica, la mayoría de ellas de principios de la década de 1990, fueron realizadas con el empleo de anticuerpos policlonales. Estos ensayos, aunque mostraron una sensibilidad adecuada, exhibían una especificidad insatisfactoria, debido fundamentalmente al compartimiento de epitopes especies amebianas. En 1992, Luaces y cois, reportaron el desarrollo de un inmunoensayo para la detección en heces de histolisaína (EhCP2), cisteíno-proteinasa excretada por E. histolytica (Luaces y cois., 1992). Este ensayo, denominado ENZYMEBA, tiene la particularidad de que el propio parásito aporta la enzima que detecta su presencia (a diferencia de los sistemas ELISA clásicos, no se requiere de un segundo anticuerpo conjugado a una enzima reveladora). ENZYMEBA, aunque permite demostrar la infección amebiana con el examen de una sola muestra por paciente en estudio, adolece del problema de los sistemas antes mencionados: no distingue entre infección por E. histolytica e infección por E. dispar. Una cisteíno-proteinasa homologa a EhCP2 es expresada por E. dispar (EdCP2, 96 % de identidad aminoacídica) (Bruchhaus y cois., 1996; Que y Reed, 2000). Más recientemente, la obtención y caracterización de anticuerpos monoclonales contra antígenos de E. histolytica, de manera particular contra epitopes no compartidos con E. dispar en la subunidad de 170 kDa de la lectina Gal/GalNAc (Haque y cois, 1998; Haque y cois., 2000; Abd-Alla y cols., 2000a, Abd-Alla y Ravdin, 2002; Ackers, 2002) y contra la proteína rica en serina (PRSEH) (Pillai y cois., 1999), ha permitido el desarrollo de inmunoensayos sensibles y específicos para la detección de la especie amebiana invasiva en heces e, incluso, en suero (Haque y cois, 2000; Ackers, 2002).

Detección de componentes genómicos Desde que fueron reportadas las primeras evidencias genómicas de la existencia de E. histolytica y E. dispar, varias aproximaciones se han empleado en el desarrollo de procedimientos de biología molecular para la detección específica de estas especies. De ellas, las más utilizadas han sido las siguientes: 1. La hibridación de sondas de ADN de una u otra especie amebiana, o de ambas, al ADNpresente en las muestras en estudio. Esta fue una variante muy utilizada a finales

de la década de 1980, cuando aún la discusión taxonómica transcurría en términos de cepas patógenas y no patógenas de E. histolytica (Garfinkel y cols., 1989; Samuelson y col s., 1989; Tannich y cois., 1989; Agarwal y cols., 1998). La falta de certeza acerca de su sensibilidad, le ha restado seguidores a este acercamiento durante los últimos años (Ackers, 2002). 2. La amplificación, mediante el empleo de la reacción en cadena de la polimerasa (RCP), defragmentos nucleotídicos de una o ambas especies amebianas. Genéricamente, utilizando trofozoítos obtenidos de cultivo in vitro, la detección y diferenciación amebiana por procedimientos de RCP parece ser más sensible que la realizada mediante ensayos de búsqueda de antígenos (Mirelman y cois., 1997). Las secuencias nucleotídicas más utilizadas para la detección y diferenciación amebiana por procedimientos de RCP en muestras de heces están situadas en el ADN circular extracromosomal de ambas especies (Troll y cois., 1997; Ackers, 2002). La detección de E. histolytica por procedimiento de RCP en muestras de pus de absceso hepático parece ser más sensible y específica con el empleo de cebadores basados en la secuencia nucleotídica del gen que codifica para la proteína de 30 kDa de esta especie (Zengzhu y cois., 1999).

9.1.2 Procedimientos indirectos Detección de anticuerpos anti-f. histolytica Como en el caso de otras parasitosis, la detección sérica de anticuerpos contra el microorganismo supuestamente implicado en el proceso infeccioso, fue el primer abordaje inmunológico empleado para el diagnóstico de la amebiasis (Bruckner, 1992; Reed, 1 992; Muñoz, 1994; Treviño-García, 1994; Pérez-Montfort y Kretschmer, 1994; Ravdin, 1995; Ackers, 2002). Posteriormente, dando continuidad a este paralelismo, la búsqueda de anticuerpos anti-Zi. histolytica se extendió a la saliva y a las heces (Urdaneta y cois., 1996).

Detección de anticuerpos antiamebianos en suero La detección de anticuerpos séricos es una herramienta muy útil para el diagnóstico de la amebiasis, sobre todo de sus formas invasivas, si se realiza con un adecuado conocimiento de la cronología de las respuestas humorales del hospedero a E. histolytica. (Ackers, 2002).

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Anticuerpos séricos antiamebianos pueden ser encontrados en más de 85 % de los pacientes de alguna forma de amebiasis invasiva y, con mucha menor probabilidad, en individuos con la infección asintomática (Reed, 1992). En los casos en que se produce la invasión amebiana, estos anticuerpos son detectados después de transcurridos siete a diez días del comienzo de los síntomas (Pérez-Montfort y Kretschmer, 1994). Este hecho tiene dos implicaciones importantes: . La ausencia de anticuerpos antiamebianos durante los primeros diez días de evolución de los síntomas, no debe descartar el diagnóstico de amebiasis invasiva. Transcurrido ese período, debe realizarse una segunda prueba. . La ausencia de anticuerpos después de diez días de evolución de los síntomas, aunque tampoco lo descarta, es una evidencia en contra del diagnóstico de amebiasis invasiva. Después de la invasión amebiana, los anticuerpos séricos anti -£. histolytica pueden persistir durante años (Reed, 1992; Pérez-Montfort y Kretschmer, 1994; Ackers, 2002. Este hecho parece estar relacionado con la retención de antígenos amebianos en el sistema reticuloendotelial del hospedero. La extensión temporal de la presencia sérica de anticuerpos antiamebianos tiene dos aristas significativas: . Por un lado, ha permitido la realización de estudios seroepidemiológicos en áreas endémicas de amebiasis, donde entre 6 y 20 % de la población sana resulta positiva a los ensayos serológicos correspondientes. . Por el otro, ha limitado la utilidad de los procedimientos serológicos para detectar un episodio invasivo actual; sobre todo en áreas endémicas, don de, ante el hallazgo de anticuerpos antiamebianos, siempre existe la posibilidad de que los mismos sean consecuencia de una infección pasada. Para la detección sérica de anticuerpos antiamebianos se ha utilizado la casi totalidad de los procedimientos serológicos conocidos. De ellos, los más emple ados han sido la doble inmunodifusión, la contrainmunoelectroforesis, la hemaglutinación e inmunofluorescenci a indirectas y los ensayos inmunoenzimáticos (ELISA). Hasta muy reciente, estos métodos utilizaban casi exclusivamente extractos antigénicos provenientes de cultivo in vitro de E. histolytica. Una aproximación al aumento del valor diagnóstico de las prueba s serológicas ha sido la identificación de antígenos amebianos que puedan estar asociados a respuestas de más corta duración. En ese sentido, las mejor estudiadas son las que se producen a la subunidad de 170 kDa de la lectina Gal/GalNAc y a la proteína ri ca en serina de E. histolytica (PRSEH). Tres estudios retrospectivos utilizando procedimientos

desarrollados para la detección de anticuerpos séricos a las formas recombinantes de estos antígenos, demostraron que los valores predictivos positivos de estas pruebas para el diagnóstico de formas agudas de amebiasis invasiva eran mejores que el del método convencional empleado (Lotter y cols., 1995; Stanley y cois., 1998; Haque y cois., 1999). Con la misma intención, la detección de anticuerpos IgM a la subuni dad de 170 kDa de la lectina Gal/GalNAc tuvo mejores resultados (Abb-Alla y cols, 1998).

Detección de anticuerpos antiamebianos en saliva y en heces Varios procedimientos para la detección de anticuerpos secretorios en saliva y en heces han sido desarrollados (Pérez-Montfort y Kretschmer, 1994; Urdaneta y cois, 1996; Abd -Alla y cois., 2000b). Sin embargo, el uso diagnóstico de los mismos no ha tenido la extensión esperada. En nuestra opinión, a ello ha contribuido la insuficiente reproducibilidad que generalmente caracteriza a los métodos para la detección de anticuerpos en este tipo de secreciones y el hecho de que, en el caso de la búsqueda de coproanticuerpos, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre infectados y contr oles.

Estudios endoscópicos Determinadas circunstancias del diagnóstico de la amebiasis intestinal sintomática hacen necesaria la realización de estudios endoscópicos de colon y recto (Sepulveda, 1989; Reed, 1992; Muñoz, 1994; Treviño-García, 1994; Ravdin, 1995). Éstos permiten: . La toma de muestras de heces en la luz intestinal. En éstas, comparadas con las obtenidas por defecación, se observan con más frecuencia trofozoítos móviles y eritofagocíticos. . La observación de la mucosa de ese órgano en busca de lesiones características de la invasión amebiana y la toma de tejido de las mismas, mediante raspado o biopsia, para posterior análisis anatomopatológico.

Estudios imagenológicos Los estudios imagenológicos hoy disponibles son poco útiles para diagnóstico de amebiasis intestinal. Esto obedece a que las anomalías que podrían ser detectadas por estos exámenes, en general, no son exclusivas de las formas intestinales de esta parasitos is. La radiografía de colon contrastada con bario, en los casos de amebomas, es la que mayor información ofrece.

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Sin embargo, el desarrollo de los exámenes imagenológicos ha incrementado en alto grado la capacidad de los médicos asistenciales para diagnosticar algunas de las formas extraintestinales de la amebiasis (Sepulveda, 1989; Bruckner, 1992; Reed, 1992; Muñoz, 1994; Treviño-García, 1994; Ravdin, 1995). De éstos, la ultrasonografía, por su eficacia diagnóstica superior al 90 %, no invasividad, rapidez de ejecución y accesibilidad, y la tomografía axial computarizada, por su eficacia diagnóstica superior al 95 % y su precisión en la detección y localización de lesiones muy pequeñas, son las más utilizadas en el diagnóstico del absceso hepático amebiano.

9.2 Diagnóstico de las diferentes formas clínicas de amebiasis

9.2.1 Diagnóstico de la amebiasis intestinal asintomática Desde principios del siglo XX, la amebiasis intestinal asintomática se ha diagnosticado por la presencia de quistes de E. histolytica al examen microscópico de heces en un individuo sin síntomas y signos atribuibles a esta parasitosis. A la luz de los conocimientos actuales, que demuestran que los quistes de E. histolytica y E. dispar son microscópicamente indistinguibles, el diagnóstico de esta forma de amebiasis sólo se puede hacer si se dispone de uno o más procedimientos complementarios que permitan identificar la especie presente. Si esto no fuera posible, el hallazgo microscópico de los quistes sólo permite suponer la presencia de una o ambas especies del complejo E. histolytica/ E. dispar y de ninguna manera permite establecer el diagnóstico de amebiasis intestinal asintoniática (Diamond y Clark, 1993; WHO/PAHO/UNESCO, 1997).

9.2.2 Diagnóstico de la amebiasis intestinal sintomática La amebiasis intestinal sintomática se sospecha por la presencia de síntomas y signos relacionados con alguna de sus formas de presentación y el diagnóstico se confirma mediante la realización de los exámenes complementarios que directa o indirectamente demue stran la presencia del parásito (Sepulveda, 1989; Bruckner, 1992; Reed, 1992; Muñoz, 1994; Treviño-García, 1994; Ravdin, 1995). La observación microscópica de muestras seriadas de heces es el examen complementario más utilizado para el diagnóstico de la amebiasis intestinal. La presencia de trofozoítos móviles con las características morfológicas de E. histolytica y con eritrocitos fagocitados permite establecer el diagnóstico de amebiasis. Por otro lado,

el hallazgo de trofozoítos no hematófagos y de qui stes con las características microscópicas de E. histolytica no confirma dicho diagnóstico. La observación de estas estructuras sólo permite suponer la presencia de una o ambas especies del complejo E. histolytica E. dispar. En estos casos, se debe emplear alguno de los procedimientos que permiten la identificación precisa de la especie presente. Si no se dispone de una de estas pruebas, se deben tener en cuenta otros exámenes complementarios y elementos epidemiológicos (Diamond, 1993; WHO/PAHO/UNESCO, 1997). Cuando las características del paciente hacen pensar en una de las formas de amebiasis intestinal y el estudio de muestras fecales no ha permitido arribar a un diagnóstico definitivo, la realización de estudios endoscópicos de colon y recto puede aporta r, como comentáramos anteriormente, nuevos elementos. El cultivo in vitro de E. histolytica a partir de muestras fecales, puede ser empleado en el estudio de un paciente en el que se sospeche una forma de amebiasis intestinal. Sin embargo, los inconvenientes de esta prueba, de manera particular el hecho de que sus resultados tardan cuatro o más días, le restan utilidad diagnóstica. La presencia de anticuerpos antiamebianos en suero, en saliva o en heces sólo es indicativa de infección actual o pasada por E. histolytica. Sin embargo, la detección de éstos, sobre todo en individuos que no viven en áreas endémicas de amebiasis, es una herramienta de mucha utilidad para el diagnóstico de las formas invasivas de esta parasitosis. Excepto la radiografía de colon contrastada con bario, de utilidad en los casos de amebomas, los estudios imagenológicos son poco empleados en el diagnóstico de la amebiasis intestinal. Cuando se sospecha un cuadro de amebiasis intestinal sintomática, y la realización de uno o más procedimientos complementarios no ha permitido demostrar la infección por E. histolytica, o cuando dichos exámenes no están disponibles, algunos elementos epidemiológicos puedenser de utilidad diagnóstica. En ese sentido, una historia de contacto est recho del paciente-problema con un caso de amebiasis invasiva o la estadía de éste en un área geográfica endémica o en una institución cerrada donde existan evidencias del desarrollo de una epidemia de amebiasis, son datos de mucho interés.

Diagnóstico diferencial Lesiones de colon y recto de muy variada naturaleza pueden manifestarse por un síndrome disentérico y, en consecuencia, deben ser tenidas en cuenta cuando se estudia

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un posible caso de colitis disentérica de causa amebiana (Sepùlveda, 1989; Bruckner, 1992; Reed, 1992; Muñoz, 1994; Treviño-García, 1994; Ravdin, 1995). La colitis amebiana debe ser diferenciada de las colitis bacterianas causadas por Shiguella, Salmonella, Campilobacter, Vibrio, Escherichia coli enteroinvasiva y Yersinia enterocolitica. En general, la diferenciación se debe realizar mediante la indicación de coprocultivos bacterianos y de los exámenes complementarios que permiten el diagnóstico positivo de amebiasis intestinal. Por su frecuencia, sobre todo en países en desarroll o, la disentería bacilar o shiguelosis merece mención aparte. Esta colitis bacteriana cursa casi siempre con fiebre, es de aparición brusca y, en relación con la colitis amebiana, lleva más rápidamente a la deshidratación. La simple observación microscópica de muestras fecales aporta un importante detalle diferenciante: la presencia de numerosos leucocitos, en los casos de shiguelosis, y la relativa ausencia de éstos, en las heces de los individuos infectados por E. histolytica. La diferenciación se completará con la indicación de los exámenes mencionados en el párrafo anterior. En raras ocasiones es necesario hacer diagnóstico diferencial entre amebiasis y linfogranuloma venéreo. En tales casos, al diagnóstico de la enfermedad producida por Clamydia trachomatis se llega mediante la constatación de adenopatías inguinales, la presencia de pruebas serológicas positivas, el aislamiento del germen y estudios histopatológicos. Otro grupo de enfermedades infecciosas que se deben diferenciar de la disentería amebiana son las parasitarias. Al menos tres de éstas pueden causar síndrome disentérico: tricocefaliasis, balantidiasis y esquistosomiasis. En estos casos, los exámenes coproparasitológicos resuelven regularmente el problema diagnóstico. Entre las enfermedades no infecciosas que cursan con colitis y diarreas, se debe hacer diferenciación con la colitis ulcerativa idiopàtica, los adenocarcinomas de colon sigmoides y recto, y la polipolisis colorectal, entre otras. En estos casos, los exámenes endoscópicos, con toma de muestras para estudios histopatológicos de las lesiones, permiten llegar al diagnóstico sin muchas dificultades. Los amebomas deben ser diferenciados de otras enfe rmedades de colon y recto, como adenocarcinomas de esos segmentos intestinales, granulomas tuberculosos y linfogranulomas venéreos. La realización de una radiografía de colon contrastada con bario puede demostrar la lesión principal y la coexistencia de úlceras en las proximidades de la misma. El examen endoscópico correspondiente, con toma de

muestras para estudios parasitológicos e histopatológicos de las lesiones, permite llegar al diagnóstico definitivo. Por las manifestaciones clínicas que le son comunes, la apendicitis amebiana debe ser diferenciada de la de causa bacteriana. El hallazgo de trofozoítos hematófagos en las heces de estos pacientes, puede establecer el diagnóstico etiológico de la apendicitis.

9.2.3 Diagnóstico de la amebiasis extraintestinal Diagnóstico del absceso hepático amebiano El absceso hepático amebiano se sospecha por la presencia de los síntomas y signos que caracterizan a una de sus formas de presentación, y el diagnóstico se confirma mediante la realización de los exámenes complementarios que directa o indirectamente demuestran la presencia del absceso y la causa amebiana de éste (Sepúlveda, 1989; Bruckner, 1992; Reed, 1992; Muñoz, 1994; Treviño-García, 1994; Ravdin, 1995). De éstos, los más utilizados son los estudios imagenológic os y la detección sérica de anticuerpos antiamebianos, procedimientos éstos a los que ya nos referimos con anterioridad. Recientemente, el perfeccionamiento de los ensayos para la detección de antígenos de E. histolytica, en particular uno que emplea un anticuerpo monoclonal contra la lectina Gal/GalNAc, ha hecho de los mismas herramientas prometedoras para el diagnóstico directo de esta forma de amebiasis extraintestinal (Haque y cois, 2000; Ackers, 2002). Las pruebas ELISA, por su eficacia y por ser las p rimeras que ofrecen resultados positivos (antes de haber transcurrido diez días de comenzados los síntomas), son los procedimientos serológicos para la detección de anticuerpos más útiles para el diagnóstico de las formas extraintestinales, entre ellas, el absceso hepático. Estas pruebas suelen ser positivas en más del 95 % de los casos. Con más frecuencia, el absceso hepático amebiano se debe diferenciar de otras enfermedades que produzcan hepatomegalia dolorosa, como abscesos piógenos, quistes congénitos infectados, quistes hidatídicos, hepatitis virales y tumores, y de otras parasitosis que afectan al hígado y cursan con fiebre, como la malaria y la fasciolasis.

Diagnóstico de la amebiasis en otras localizaciones extraintestinales Excepto en algunos casos de amebiasis cutánea, la diseminación de la infección por E. histolytica a localizaciones extraintestinales y extrahepáticas es casi siempre complicación de un absceso hepático (Sepúlveda, 1989; Bruckner, 1992; Muñoz, 1994;

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Treviño-García, 1994). Por este motivo, con la excepción mencionada, la conducta diagnóstica ante posibles casos de amebiasis en dichas localizaciones debe incluir la detección de un absceso hepático de base.

10. Tratamiento de la amebiasis10.1 Drogas con actividad antiamebiana El número de drogas a las que se le ha demostrado actividad antiamebiana es amplio y los esquemas en que éstas han sido utilizadas son variados (Bruckner, 1992; Guamer, 1994; Matijasevic, 1995; Ravdin, 1995). El elemento común a la mayoría de éstas, con independencia del esquema empleado, es su alta eficacia. Fallas terapéuticas aisladas, sobre todo en el caso del metronidazol, han sido reportadas (Griffin, 1973; Koutsaimanis y cols., 1979; Orozco y cois, 1995). Los fármacos antiamebianos actúan sobre los trofozoítos y son incapaces de penetrar la pared de los quistes. La desaparición de los quistes de las heces después de un tratamiento se debe a la acción de la droga empleada sobre las formas trofozoíticas que los originan y no a un efecto directo sobre ellos. En dependencia de los sitios donde ejercen su acción, los fármacos antiamebianos se clasifican en tres grupos: amebicidas de acción luminal, amebicidas de acción principalmente hística y parcialmente luminal, y amebicidas de acción exclusivamente hística. Aquí abordaremos los compuestos del segundo grupo, con énfasis en el metronidazol, por ser éstos los más utilizados en el tratamiento de la amebiasis intestinal invasiva. Todos los amebicidas de acción principalmente hística y parcialmente luminal derivan de un compuesto básico: el 5 nitroimidazol. El mecanismo de acción común está relacionado con una interferencia de estas drogas en la síntesis de ácidos nucleicos de E. histolytica. Además de su uso en la terapia antiamebiana, han sido utilizadas e n el tratamiento de otras parasitosis, como giardiasis y trichomoniasis, y de infecciones por bacterias anaerobias, como Clostridium tetani, Clostridium septicum y Bacteroides fragilis (Guarner, 1994). Los derivados 5 nitroimidazólicos se absorben con rapi dez en el intestino delgado, razón por la que están indicados en los casos de amebiasis intestinal sintomática, en los cuales los trofozoítos han invadido la pared del colon, y en todos los pacientes de amebiasis extraintestinal (Guarner, 1994). Sin embargo, una pequeña parte de la droga, que no es absorbida, o sus metabolitos eliminados con la bilis, tienen una acción parcial contra las

amebas en la luz intestinal intestinal. Estos fármacos difunden ampliamente en los tejidos y algunos, como el omidazol y el secnidazol, permanecen en ellos por mayor tiempo. Todos se eliminan por la orina y, en menor medida, por otros fluidos, como la saliva y la leche materna (Guamer, 1994). Los medicamentos nitroimidazólicos producen efectos colaterales frecuentes y, en general, no graves. Éstos son fundamentalmente manifestaciones del aparato digestivo, como sabor metálico, náuseas, vómitos, dolor epigástrico y anorexia (Ravdin, 1995). Durante la administración de estos compuestos se debe proscribir el consumo de bebida s alcohólicas. Ello es así porque estas drogas inhiben enzimas implicadas en el metabolismo de los alcoholes, lo que puede tener una acción potencializadora sobre los efectos de éstos (Ravdin, 1995). Aunque las drogas nitroimidazólicas no parecen ser terat ogénicas (Beard y cols., 1979), no existen criterios definitivos acerca de sus posibles efectos sobre el desarrollo fetal. Por este motivo, y teniendo en cuenta que estos compuestos atraviesan la barrera placentaria y alcanzan con rapidez la circulación fe tal, se recomienda que no se empleen durante el primer trimestre del embarazo (Ravdin, 1995). Por otro lado, y como consecuencia de su eliminación en la leche materna, tampoco se deben administrar a madres que se encuentren lactando. De los derivados 5 nitroimidazólicos, el metronidazol es el más utilizado con fines antiamebianos. Esto es así, ante todo, porque es al que más fehacientemente se le han demostrado sus actividades amebicidas (Powell y cois., 1966). Sin embargo, otros introducidos con posterioridad, como el tinidazol, el secnidazol y el omidazol, tienen lina vida plasmática más prolongada, lo que hace posible su empleo en esquemas de menor duración e, incluso, en dosis únicas. La administración de éstos, además, da lugar con menor frecuencia a reacciones colaterales (Ravdin, 1995). El metronidazol se administra en todas las formas de amebiasis invasiva, de preferencia por vía oral, en dosis de 250 mg, tres veces al día, durante siete a diez días. En niños, se debe emplear a razón de 30 mg/kg/día, repartidos en tres dosis, también durante siete a diez días. La administración endovenosa es muy efectiva en el tratamiento de las formas más graves, como la colitis fulminante, amebomas y abscesos hepáticos múltiples. En estos pacientes, la dosis recomendada es de 500 mg cada seis horas, durante cinco a diez días (Ravdin, 1995).

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10.1.1 Drogas antiamebianas en perspectivas En el tratamiento de muchas enfermedades infecciosas, el ensayo de nuevas drogas obedece en primer lugar al desarrollo de resistencia a los fármacos en uso. No ocurre así en el caso de la amebiasis. A pesar de ello, no pocos laboratorios trabajan en la obtención de nuevos medicamentos antiamebianos (Sohni y cols., 1995; Khaw y Panosian, 1995; Di Staci. 1995; Ghoshal y cols, 1996). Se busca disponer de drogas que, siendo tan o más eficientes que las actuales, su uso dé lugar a menos reacciones colaterales y sean aplicables en dosis única. En los últimos años, se han introducido nuevos fármacos, los cuales aún no han sido evaluado s suficientemente (Bhopale y cols., 1995). Entre éstos, algunos derivados oxadiazoles; moléculas nuevas como la nitazoxanida; y antibióticos del grupo de los macrólidos, como la azitromicina.

10.2 Empleo de procederes quirúrgicos La rápida acumulación de conocimientos que sobre la amebiasis y su agente causal tuvo lugar en las últimas décadas; el desarrollo de procedimientos diagnósticos más precisos y oportunos; y, sobre todo, la utilización de medicamentos amebicidas cada vez más eficaces, son factores que han reducido considerablemente el empleo de procederes quirúrgicos en el tratamiento de esta parasitosis (Guamer, 1994). Sin embargo, en determinadas circunstancias el abordaje quirúrgico de un caso de amebiasis puede ser necesario. Estas son: 1) el desarrollo de alguna de las formas clínicas más graves, y 2) el diagnóstico tardío de la infección. La apendicitis, el amebonia, el absceso hepático, la amebiasis peritoneal y la pericarditis amebiana son las formas clínicas de amebiasis invasiva que con más frecuencia requieren de procederes quirúrgicos con fines terapéuticos.

10.3 Tratamiento de las formas clínicas más frecuentes de amebiasis intestinal No existe unanimidad en cuanto a los criterios de selección de las modalidades t erapéuticas a emplear en los individuos infectados por E. histolytica. Teniendo en cuenta los estudios que forman parte de esta tesis, en esta revisión bibliográfica sólo nos referiremos al tratamiento de las formas intestinales más frecuentes.

10.3.1 Tratamiento de la amebiasis intestinal asintomática Los individuos con amebiasis intestinal asintomática, también denominados portadores sanos, representan la principal fuente de diseminación de la infección y, en dependencia

de la relación hospedero-parásito que se establezca, pueden evolucionar hacia el desarrollo de una de las formas de amebiasis sintomática. Por estos motivos, aplicar tratamientos antiamebianos en estos casos es una conducta bastante generalizada. Este modo de proceder, si se tiene la certeza de que se trata de casos de infección por E. histolytica, no es incorrecto. Sin embargo, en la mayoría de las ocasiones se indican tratamientos antiamebianos por el simple hallazgo de quistes, supuestamente de E. histolytica, al examen microscópico de heces. Esta práctica conduce, cuando menos, al uso indiscriminado e injustificado de drogas antiamebianas. En enero de 1997, un Grupo de Expertos en Amebiasis de la OMS evaluó las implicaciones que para la práctica médica t iene la existencia de las dos especies (WHO/PAHO/UNESCO, 1997). El texto de algunas de las recomendaciones emitidas al término de aquella reunión lo adecuamos a continuación a las características de este documento: 1. E. histolytica, o sus componentes, debe ser identificada específicamente para el diagnóstico

de certeza de amebiasis intestinal asintomática. Si el diagnóstico se realiza, el individuoinfectado debe ser tratado.

2. Si solamente se identifica a E. dispar en las heces de un individuo asintomático, no se tratade un caso de amebiasis y, por tanto, el tratamiento antiamebiano es innecesario.

3. Cuando se ha detectado la infección por el complejo E. histolytica/E. dispar en individuosasintomáticos, y no existe la posibilidad de identificar específicamente a E. histolytica, nose debe asumir a priori que esta última es la especie presente. En tales casos, eltratamiento sólo estaría indicado si existieran razones para sospechar la infección por E.histolytica (una historia de contacto estrecho con un caso de amebiasis invasiva, la estadíade la persona en cuestión en un área geográfica o en una institución cerrada donde existanevidencias del desarrollo de una epidemia de amebiasis).

4. Sólo se deben emplear amebicidas de acción luminal en el tratamiento de la amebiasisintestinal asintomática

Las drogas recomendadas para el tratamiento de la amebiasis intestinal asintomática son el furoato de diloxanida y, en menor medida, la quinfamida y la paramomicina. El primero se emplea por vía oral en dosis de 500 mg, tre s veces al día, durante diez días. En niños se recomiendan 20 mg/kg/día, repartidos en tres dosis, también durante diez días.

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10.3.2 Tratamiento de la amebiasis intestinal sintomática A continuación citamos, adecuadas a las características de este documento, las recomendaciones del informe de la reunión de expertos en amebiasis de la OMS para el tratamiento de las formas habituales de amebiasis intestinal sintomática: 1. Para el diagnóstico de certeza de amebiasis intestinal sintomática, E. histolytica, o sus

componentes, debe ser identificada específicamente. Si el diagnóstico se realiza, elpaciente debe recibir el tratamiento correspondiente.

2. Si en las heces de un individuo sintomático se identifica a E. dispar, no se trata de un casode amebiasis y, por tanto, todo tratamiento antiamebiano es innecesario. En esteindividuo, dado que existen síntomas, se debe buscar la causa de los mismos.

3. En personas sintomáticas, cuando se ha detectado la infección por el complejo E.histolytical E. dispar y no existe la posibilidad de identificar a E. histolytica, no se debeasumir a priori que esta última especie es el agente etiológico de los síntomas. En talescasos, se indicaría tratamiento antiamebiano si existieran razonbs para sospechar que E.histolytica es la especie presente (títulos altos de anticuerpos antiamebianos, una historiade contacto estrecho con un caso de amebiasis invasiva o la estadía de la persona encuestión en un área geográfica o en una institución cerrada donde existan evidencias deldesarrollo de una epidemia de amebiasis).

4. En el tratamiento de la amebiasis intestinal sintomática se deben emplear uno o másamebicidas de acción hística (el metronidazol, el más utilizado), con la intención decombatir los trofozoítos que ya han invadido los tejidos, y, a continuación, un amebicidade acción luminal (el furoato de diloxanida, el más empleado) con el objetivo de actuarsobre los trofozoítos remanentes en la luz del intestino.

En algunos casos, el tratamiento de un cuadro de amebiasis disentérica pudiera incluir la adopción de medidas para el mejoramiento del estad o general del paciente, entre ellas, la rehidratación del mismo.

11. Epidemiología de la AmebiasisVarias autoras estiman que alrededor del 10 % de la población mundial está parasitada por E. histolytica y que unas cuarenta mil personas fallecerían anualmente por la infección (Walsh, 1986; WHO/PAHO/UNESCO, 1997; Sánchez-Guillén y cois., 2002). Al menos, dos limitaciones de los estudios precedentes hacen complejo el abordaje de las características epidemiológicas de la infección amebiana:

La realización, en el caso de los exámenes coprológicos, de un número diferente de ensayos por individuos incluidos en el pesquisaje. Ello, a su vez, tiene dos posibles consecuencias adversas: 1) el riesgo de subdiagnóstico en aquellos estudios que emplean un solo ensayo por persona, y 2) la posibilidad de incrementar el sobrediagnóstico de amebiasis asociado al examen microscópico de heces cuando se realizan pruebas seriadas. . La imposibilidad, para la mayoría de los laboratorios, de disponer de las tecnologías necesarias para distinguir entre E. histolytica y E. dispar. Dado que los reportes más recientes indican que, de manera general, la infección por E. dispar es diez veces más frecuente, todos los estudios de prevalencia de infección por E. histolytica basados en la observación microscópica de heces realizados con anterioridad deben ser reconsiderados, a fin de evitar una sobredimensión del problema. Estas limitaciones en muchos de los estudios epidemiológicos sobre amebiasis realizados hasta el presente, que en el menos desfavorable de los casos introducen inexactitudes en sus resultados de los mismos, deben ser tenidas en cuenta por el lector al transitar por algunos aspectos contenidos en los acápites que siguen.

11.1 Distribución geográfica Informes de infección por E. histolytica han emergido de pesquisas realizadas en regiones de muy diferente ubicación geográfica (Matijasevic, 1992). Así, la presencia de este protozoo ha sido reportada desde Alaska (61° de latitud norte) hasta el estrecho de Magallanes (52° de latitud sur), al oeste del meridiano de Greenwich, y desde Finlandia (60° de latitud norte) hasta Australia y África del Sur (30° de latitud sur), al este del citado meridiano. A pesar de la distribución aparentemente cosmopolita de la infección, existen marcadas variaciones geográficas en su incidencia, que dependen de factores climáticos (más frecuente en el trópico), socioeconómicos (más frecuente en áreas en las que condiciones higiénico -sanitarias inadecuadas facilitan la transmisión fecal -oral) y otros, no bien conocidos, más relacionados con aspectos biológicos del parásito y su hospedero (Walsh, 1986; Matijasevic, 1992; Gutiérrez y Muñoz, 1994). El patrón de la infección por E. histolytica es endémico, con núcleos hiperendémicos en comunidades con condiciones sanitarias inadecuadas y en grupos poblacionales con características especiales en lo que respecta a costumbres alimentarias, sexuales y de disposición de excretas (Gutiérrez y Muñoz, 1994).

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Las epidemias de amebiasis son extremadamente raras y, en la mayoría de las ocasiones, pasan inadvertidas debido a sus índices relativamente bajos de morbilidad y a la variabilidad del período de incubación de esta infección. La casi totalidad de las epidemias de amebiasis han tenido lugar en comunidades cerradas, en las que hábitos higiénicos inadecuados de sus miembros facilitan la transmisión de la infección de persona a persona (Gutiérrez y Muñoz, 1994).

11.2 Índices epidemiológicos En relación con la infección por E. histolytica, los índices epidemiológicos más reiteradamente utilizados son tres: frecuencia y distribución de portadores, de individuos con anticuerpos antiamebianos, y de enfermos.

11.2.1 Portadores Los portadores, en sentido estricto, son individuos sin síntomas ni signos de enfermedad amebiana, que eliminan quistes de E. histolytica en las heces. La correcta detección de los mismos, que en la actualidad no está al alcance de la mayoría de los laboratorios, tiene una doble importancia epidemiológica: 1) puede ser un indicador de la magnitud de la infección en una población determinada, y 2) dado que los quistes son la forma infectante, permite la identificación de los individuos que estarían transmitiendo la infección en dicha población.

11.2.2 Seroepidemiología La respuesta de anticuerpos a E. histolytica es intensa y prolongada en individuos con alguna forma de amebiasis invasiva y es menor, o está ausente, en personas con infecciones asintomáticas. Por este motivo, se considera que los estudios serológicos son mejores indicadores de amebiasis invasiva que de infección amebiana. Si bien la presencia de anticuerpos antiamebianos es la huella de una infección y no ésta propiamente, la detección sérica de los mismos se ha utilizado para estimar indirectamente la prevalencia de esta parasitosis (Caballero-Salcedo y cols., 1994). Los resultados de cada una de las encuestas seroepidemiológicas realizadas, pocas veces son factibles de ser comparadas con los de las demás. Ello es consecuencia de la utilización de inmunoensayos diferentes y de diseños muéstrales muchas veces inadecuados. En general, los resultados fluctúan entre el 6 y el 20% de seropositividad en los estudios realizados en áreas endémicas de amebiasis.

11.2.3 Frecuencia de enfermos Excepto en los casos de amebiasis extraintestinal, en los que regularmente se realiza un diagnóstico correcto, por las limitaciones antes referidas la frecuencia real de enfermedad amebiana ha sido difícil de precisar.

11.3 Transmisión 11.3.1 La forma infectante Aunque existen reportes de transmisión de trofozoítos de E. histolytica por contacto sexual, la forma infectante de este protozoo es, casi exclusivamente, el quiste cuadrinucleado (Walsh, 1986; Matijasevic, 1992; Gutiérrez y Muñoz, 1994). En lo fundamental, es así porque los quistes, a diferencia de los trofozoítos: . Conservan su capacidad infectante en las heces, aguas y suelo hasta ocho días, cuando la temperatura oscila entre 28 y 34 °C, y hasta un mes, cuando desciende a 10 °C. . Preservan su viabilidad debajo de las uñas por periodos de hasta cuarenta y cinco minutos. . Resisten condiciones adversas, como la acción del cloro a las concentraciones que regularmente son utilizadas para el tratamiento de las aguas de uso humano. . Sobreviven a la exposición al ácido clorhídrico y a las enzimas digestivas presentes en el tracto gastrointestinal. A pesar de que no se conoce con precisión el inoculo mínimo infectante, estudios en voluntarios sanos parecen demostrar que la ingestión de 2 000 o más quistes produce infección en 100 % de los casos.

11.3.2 Los reservorios Si bien se ha encontrado a E. histolytica en ratas, perros, cerdos y algunos primates, y experimentalmente se ha transmitido la infección a diferentes especies de mamíferos, el hombre es el principal reservorio de este parásito y el único epidemiológicamente importante (Gutiérrez y Muñoz, 1994). Los principales emisores de la forma infectante son los portadores asintomáticos, sobre todo los convalecientes de alguna de las formas clínicas. Durante las fases iniciales del padecimiento los enfermos eliminan trofozoítos casi exclusivamen te.

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11.3.3 Modos de Transmisión Diseminación fecal-oral de quistes La amebiasis se transmite en todas las formas de diseminación fecal -oral, especialmente a partir de heces de portadores evacuadores de quistes maduros (éste es el principal mecanismo de transmisión).

Transmisión sexual de trofozoítos La transmisión sexual de trofozoítos es un mecanismo de transmisión de las amebiasis bastante poco frecuente. Este mecanismo es responsable de casos de amebiasis cutánea primaria, observados casi siempre en la región genital.

Inoculación directa de quistes en el colon La transmisión directa de la infección por E. histolytica por el empleo de terapias de irrigación del colon, es un hecho extremadamente raro y de consecuencias muy graves, pues la colitis a que da lugar tiene una elevada mortalidad.

12. Prevención y control de la amebiasisA pesar de los enormes esfuerzos realizados en favor de su control, la amebiasis continúa siendo un importante problema de salud pública. Ello es así, en lo fundamental, por tres motivos: 1) el marcado retraso socioeconómico de la casi totalidad de las regiones donde la amebiasis es endémica, situación que crea las condiciones de insalubridad necesarias para la transmisión fecal-oral de la infección, 2) las limitaciones cognoscitivas sobre esta parasitosis y su agente causal, E. histolytica, que condujeron a la implementación de medidas que la práctica demostró posteriormente eran incorrectas, y 3) la aplicación de programas de control, en su mayoría, con estructuras, recursos y duració n inadecuados. En el esfuerzo por controlar y prevenir la amebiasis, medidas de muy diferente tipo se han aplicado (Walsh y Martínez-Palomo, 1989). Estas se pueden agrupar de la forma siguiente:

12.1 Prevención de la transmisión fecal-oral El principal modo de transmisión de la amebiasis es la ingestión de aguas o alimentos contaminados con quistes de E. histolytica; por tanto, el primer grupo de medidas para su control tiene el objetivo de eliminar la transmisión fecal -oral de este parásito:

12.1.1 Saneamiento ambiental Una de las vías más eficaces para prevenir la amebiasis es dotar a la población que vive en áreas endémicas de mecanismos seguros para la eliminación de sus desechos, de manera particular proveerla de instalaciones sanitarias que impidan la contaminación de aguas y alimentos. Lamentablemente, la mayoría de los estudios realizados para evaluar la eficacia de la aplicación de medidas de saneamiento ambiental adolecen de importantes deficiencias metodológicas y, en consecuencia, ofrecen resultados contradictorios. A las limitaciones de las pesquisas epidemiológicas, ya referidas anteriormente, se suma en estas investigaciones la observación no rigurosa, o simplemente la no observación, de variables tales como escolaridad, ingresos, hacinamiento y fuentes de agua. Por otro lado, en muchas ocasiones las medidas de saneamiento ambiental sólo logran beneficios limitados. En lo fundamental, ello es consecuencia de que en su aplicación no se tiene en cuenta la multifactorialidad del problema. Así, por ejemplo, de nada serviría dotar a una comunidad de un nuevo sistema de eliminación de excretas si los miembros de ésta, por factores socioculturales que son desatendidos, no hacen un uso adecuado del mismo.

12.1.2 Fuentes de abasto de agua Medios de muy diversos tipos se han utilizado para la esterilización del agua. Estos van desde procedimientos físicos como la filtración, que es muy segura, pero que tiene el inconveniente de que no siempre se dispone del equipamiento necesario para ello, hasta los pro cedimientos químicos, como la cloración, que debido a la resistencia de los quistes obliga al uso de dosis de cloro muy superiores a las empleadas para la esterilización bacteriana, lo que la hace no recomendable en la profilaxis de la infección amebiana. De todos los procedimientos empleados para la potabilización del agua, sobre todo como medida individual, su exposición a temperaturas de ebullición durante al menos diez minutos es el que mejor combina seguridad y factibilidad. Tan importante como la calidad del agua es la cantidad de ésta disponible para las muy diversas necesidades humanas. Las infecciones intestinales, en general, y la amebiasis, en particular, se diseminan fácilmente de persona a persona a través de manos, alimentos y utensilios contaminados. Cuando no se dispone de agua en cantidades

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suficientes, se hace imposible mantener niveles adecuados de higiene personal y de los alimentos.

12.1.3 Higiene personal y de los alimentos Para la prevención de la amebiasis son útiles medidas de higiene personal y de los alimentos como recorte y cepillado periódico de las uñas, lavado de las manos (después de la defecación, antes de tocar o ingerir cualquier tipo de alimento, antes y después de la manipulación de niños pequeños), hervir el agua (de beber, de lavar utensilios que se llevan a la boca, de preparar alimentos que se ingerirán sin ser cocidos), evitar el empleo de heces humanas como fertilizantes de árboles frutales y legumbres, evitar el empleo de aguas negras no tratadas en operaciones de riego agrícola. Estos hábitos deben ser introducidos y reforzados constantemente en el hogar, la escuela y en las unidades del sistema de salud, sobre todo las del nivel primario, mediante campañas periódicas de educación en las que se empleen todos los medios de difusión posibles.

12.1.4 Control de vectores A partir de elementos muchas veces anecdóticos, se ha especulado con que algunos vectores, como moscas y cucarachas, podrían transmitir la infección amebiana al contaminar alimentos con quistes transportados en sus superficies externas o eliminados en sus deyecciones después de alimentarse de heces humanas. Con independencia de que la transmisión de la amebiasis por estos vectores sea posible, la importancia epidemiológica de esta forma de transmisión es desconocida y probablemente de poca significación.

12.2 Tratamiento médico de pacientes y portadores Durante mucho tiempo no ha existido unanimidad en cuanto a los criterios para la indicación de un tratamiento antiamebiano, sobre todo en portadores asintomáticos, y para la elección del medicamento, o de los medicamentos, con ese fin. A esta diversidad de opiniones ha contribuido la no disponibilidad de herramientas confiables y fácilmente aplicables para la evaluación de los diferentes esquemas terapéuticos, al punto que hasta la desaparición de los síntomas ha sido asumida como criterio de eficacia antiamebiana. La reciente redescripción de E. histolytica como un complejo de dos especies, ha llevado a reconsiderar los criterios de tratamiento de la amebiasis. Tomando como

núcleo las recomendaciones en relación con el tema recientemente emitidas por un grupo de expertos de la OMS, en el acápite “Tratamiento de la amebiasis” hemos detallado los criterios que se deben tener en cuenta para la indicación de tratamientos antiamebianos.

12.3 Inmunoprofilaxis Como otras enfermedades infecciosas, la amebiasis es más frecuente en lugares donde las condiciones higiénico-sanitarias son inadecuadas. La vía ideal para su control sería el mejoramiento de dichas condiciones. Ello incluiría, desde luego, el desarrollo s ocioeconómico de las regiones y países donde esta parasitosis es endémica, lo que no parece que ocurrirá a corto o mediano plazo. En consecuencia, la inmunoprofi laxis ha devenido una alternativa razonable para el control de esta parasitosis en el futuro inmediato. Un aspecto importante a tener en cuenta cuando se valora la factibilidad de obtención de una vacuna contra un agente infeccioso, es conocer si la primoinfección desarrolla algún grado de inmunidad. Así, enfermedades como el sarampión y la viruela, cuyos agentes etiológicos estimulan inmunidad protectora al primer contacto con el hospedero, son eficazmente prevenibles mediante vacunas. No es ese el caso de enfermedades como la malaria, en las cuales las respuestas inmunitarias a la infección inicial son insuficientes para controlar la multiplicación del parásito (Stanley, 1997). La información disponible sobre la adquisición de inmunidad después de la infección con E. histolytica es limitada. Aunque se conoce que la curación de un episodio de colitis o de un absceso hepático resulta en el desarrollo de cierto grado de inmunidad (de León, 1970), lo cierto es que no existen estudios prospectivos rigurosamente controlados al respecto. Se han emprendido varios caminos para el desarrollo de una vacuna anti amebiana. Todos tienen un elemento común, el empleo de antígenos de trofozoítos de E. histolytica. Ello es así, porque ésta es la única fase del parásito que ha podido ser cultivada in vitro. El empleo de microorganismos muertos o inactivados, estrategia e xitosa en el logro de inmunidad a algunos virus y bacterias, tuvo resultados favorables cuando se probaron esquemas de inmunización con trofozoítos de E. histolytica en modelos animales. Sin embargo, dos elementos impiden su empleo en humanos: el alto cost o de la obtención

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de trofozoítos a la escala necesaria para producir vacunas, y la reactogenicidad asociada a la utilización de microorganismos enteros en preparados vacunales (Stanley, 1997). Los progresos más recientes en la inmunoprofilaxis de la amebiasis, todavía en modelos animales, vienen de la inmunización parenteral con antígenos recombinantes y del desarrollo de promisorias vacunas orales, avances en los que se han empleado novedosos procedimientos de la biología molecular y, desde luego, el mejor conocimiento que se ha ido adquiriendo acerca de la inmunobiología de esta parasitosis (Stanley, 1997).

12.3.1 Inmunización parenteral con antígenos recombinantes Entre otras ventajas, las técnicas de obtención de antígenos recombinantes permiten la producción a gran escala de inmunógenos estructuralmente definidos, mediante su expresión en células procariotas o en levaduras, la manipulación de genes para el logro de preparados vacunales multivalentes, y la utilización de vectores virales o bacterianos aten uados como transportadores de los epitopes a los que se desea inducir respuesta. Utilizando moléculas obtenidas en forma recombinante, tres proteínas de E. histolytica, entre otros candidatos vacunales, han sido las más empleadas en estudios de inmunizació n parenteral: la proteína rica en serina (PRSEH) (Zhang y cois., 1994), la lectina Gal/GalNAc (Petri y Ravdin, 1990) y un antígeno de 29 kD rico en cisteína (Soong y cols., 1995). La inmunización parenteral con estas moléculas posiblemente no impida la colonización de la superficie intestinal, pero podría disminuir la invasividad de este protozoo y, al menos, proteger contra las formas extraintestinales de esta parasitosis. Otros candidatos vacunales transitan por fases más tempranas de estudio. De éstos, una proteasa neutra dependiente de cisteína (Keene y cois., 1990) y un péptido de 77 aminoácidos, denominado amebaporo (Leippe y Muller-Eberhard, 1994), moléculas a cuyas actividades biológicas ya nos referimos, parecen ser los más promisorios.

12.3.2 Inmunización oral La capacidad de E. histolytica para adherirse al epitelio intestinal es crucial para el mantenimiento de la colonización y para el comienzo de la invasión. Anticuerpo s IgA secretorios antiamebianos pueden bloquear la adherencia de trofozoítos de E. histolytica a células de líneas de cultivo. Estos resultados han sugerido que dichos anticuerpos podrían desempeñan un papel protector in vivo al impedir la colonización del epitelio

intestinal. Una vacuna oral capaz de estimular la síntesis de anticuerpos IgA secretorios antiamebianos tendría, además, otra ventaja: una administración más fácil y menos costosa. En varias aproximaciones a una vacuna antiamebiana oral se registran importantes progresos. En dos de ellas se reportan los avances más prometedores: 1) la administración oral de una proteína de fusión que contiene la subunidad B de la toxina colérica y un dodecapéptido repetido de la PRSEH (Zhang y Stanley, 1995) y 2) la administración oral de una cepa atenuada de Salmonella typhimurium que expresa y libera la molécula PRSEH recombinante (Zhang y Stanley, 1996).

12.3.3 Obstáculos al desarrollo de vacunas antiamebianas A pesar de los progresos obtenidos en el logro de una inmunoprofilaxis eficaz de la amebiasis, el desarrollo de vacunas antiamebianas enfrenta aún importantes obstáculos (Stanley, 1997). Ellos son, entre otros, los siguientes: . No existe un modelo animal adecuado para estudios de inmunoprotección. Todos los trabajos han sido realizados en el modelo del gerbo y con el uso de una forma artificial de absceso hepático, la inoculación intrahepática directa de trofozoítos de E. histolytica. . Las secuencias nucleotídicas que codifican para los inmunógenos estudiados derivan de la cepa HM1: IMSS de E. histolytica y ésta fue la utilizada en los estudios de reto. Aunque las secuencias correspondientes a los antígenos más promisorios parecen ser muy conservadas, no existen estudios que demuestren que la inmunización con alguno de ellos produce inmunidad protectora contra todos los aislamientos. . En el caso de preparados vacunales que en modelos animales generan protección, no existen estudios que demuestren la duración de ésta. . Algunos vectores bacterianos ya utilizados en la inmunización oral contra otros microorganismos en modelos animales, no fueron igualmente eficaces cuando se emplearon en humanos.

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III- Materiales y Métodos Para la redacción de esta tesis de doctorado seleccionamos una modalidad de documento que incluye una compilación de las publicaciones del autor cuyos contenidos, de conjunto, permitirían refutar (o aceptar) la hipótesis planteada. La modalidad de documento seleccionada nos libra de la necesidad de hacer detalladas descripciones de los materiales y métodos empleados en la ejecución de cada uno de los estudios que incluye. Esas descripciones están contenidas en las publicaciones, presentadas en forma secuenciada, que forman parte de este documento. Sin embargo, haremos a continuación algunos comentarios que, unas veces como complemento y otra s como hilo conductor, pueden facilitar la mejor comprensión de lo relacionado con los materiales y métodos utilizados.

1- Examen microscópico de heces en hospitales y policlínicos de las provincias Ciudad de La Habana y Cienfuegos.

Dos de los artículos incluidos en este documento (artículos Iy II) describen estudios de control de calidad del diagnóstico de amebiasis intestinal por observación microscópica de heces en hospitales y policlínicos de las provincias Ciudad de La Habana y Cienfuegos. Al momento de llevarse a cabo esas investigaciones, en los centros asistenciales sometidos al control, el diagnóstico microscópico se realizaba mediante examen directo de las heces con solución salina y, con mucha menor frecuencia, con coloración de Lugol. En ninguna de estas unidades se empleaban tinciones permanentes.

2- Inmunoensayo ENZYMEBA ENZYMEBA, inmunoensayo que permite detectar la presencia de infección por una o ambas especies del complejo E. histolytica/ E. dispar, fue empleado como prueba comparativa en los estudios de control de calidad del diagnóstico de amebiasis intestinal por observación microscópica de heces a que hacíamos referencia en el acápite ante rior (artículos I y II). ENZYMEBA también fue utilizado, junto al procedimiento de RCP que describimos más adelante, en los estudios de diferenciación de especies amebianas (artículo III) y de eficacia terapéutica (artículo IV). Referencias a este ensayo, como herramienta con la que se demostró el sobrediagnóstico microscópico, también aparecen en los artículos que reportan los resultados de las encuestas aplicadas a Técnicos (artículo VI) y Responsables de Laboratorio (artículo VII).

ENZYMEBA se realizó según reportaron Luaces y colaboradores (Luaces y cois., 1992), con algunas modificaciones introducidas en el proceso de validación del procedimiento (Fonte y cois., 1998). Descripciones detalladas del modo en que empleamos este inmunoensayo aparecen en varios de los artículos que forman parte de este documento ( artículos II, III y VI).

3- Reacción en Cadena de la Polimerasa Múltiple (RCP Múltiple) En la identificación de la especie (o las especies) amebiana presente en las muestras positivas a ENZYMEBA se aplicó un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa. Como expresáramos antes, éste se diseñó y estandarizó especialmente para este estudio y presenta, respecto a los reportados en la literatura internacional al momento de su desarrollo (Cruz -Reyes y cois., 1992; Romero y cois., 1992; Tachibana y cois., 1992; Acuna-Soto y cols, 1993; Katzwinkel-Wladarseh y cois., 1994; Aguirre y cois., 1995; Guo y cois., 1995; Mackenstedt y cois., 1995; Britten y cois., 1997; Mirelman y cois., 1997; Newton y cois., 1997; Troll y cols., 1997; Haque y cols., 1998; Haque y cois., 1999; Pillai y cois, 1999; Zengzhu y cois., 1999), dos novedades metodológicas que lo podrían hacer más eficiente: 1) el bombardeo de las muestras, durante el proceso de extracción de ADN, con partículas de circonio y 2) la realización simultánea, en una misma reacción, de dos ensayos de RCP, uno par a detectar E. histolytica y otro para detectar E. dispar. La descripción detallada de este procedimiento, que también utilizamos en el estudio de eficacia terapéutica a que hacemos referencia más adelante ( Artículo IV), aparece en el artículo que reporta el estudio de diferenciación de especies amebianas antes mencionado ( Artículo III).

4- Tratamiento antiamebiano A individuos con infección confirmada por una o ambas especies del complejo E. histolytica/ E. dispar en el estudio descrito en el acápite anterior, a los que sus respectivos médicos de asistencia les habían indicado tratamiento con metronidazol (250 mg, 3 veces al día, durante 10 días), se les tomó una segunda muestra de heces inmediatamente después de finalizado el mismo. A estas muestras postratamiento se le aplicaron los procedimientos ENZYMEBA, para detectar la presencia de una o ambas especies del complejo E. histolytica/ E. dispar, y RCP Múltiple, para precisar la especie

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(o especies) presente (Artículo IV). Estas segundas aplicaciones de los procedimientos citados tenían la intención de conocer de la eficacia del tratamiento antiamebiano empleado.

5- Encuestas a médicos, técnicos y responsables de laboratorios Para incursionar en las posibles causas de la sobredimensión de la amebiasis como problema de salud, aplicamos encuestas sobre conocimientos, percepciones y prácticas a Médicos, Técnicos y Responsables de Laboratorio relacionados con el diagnóstico, tratamiento y control de esta parasitosis en la provincia de Cienfuegos (Artículos V, Vi y Vil). Para evaluar los resultados de un grupo de acciones realizadas en la provincia de Cienfuegos con la intención de atenuar las deficiencias cognoscitivas y técnico - organizativas detectadas por las encuestas, un año después de completada la puesta en práctica de esa intervención se realizó una segunda aplicación de los cuestionarios {Artículos VIII YIX).

6- Medidas tomadas para atenuar las deficiencias cognoscitivas y técnico- organizativas detectadas por las encuestas.

Para contribuir a la atenuación del problema de la sobredimensión de la amebiasis, y de sus consecuencias, se ejecutó un grupo de acciones que podrían incidir sobre la eficiencia del trabajo de los Médicos, Técnicos y Responsables de Laboratorio de la provin cia de Cienfuegos (Tabla 2). La cuantía y formas de aplicación de este grupo de acciones, a las que en lo adelante también llamaremos intervención, fueron las disponibles en la citada provincia al momento de su ejecución (Artículos VIII y IX).

7- Libro ‘‘Amebiasis: enfoques actuales sobre su diagnóstico, tratamiento y control”. Lugar importante entre las medidas tomadas como parte de la intervención descrita en el acápite anterior tuvo la redacción, publicación y posterior distribución gratuita en todo e l país, de una monografía que contiene una reestructuración y actualización de los conocimientos sobre amebiasis de los profesionales encarados al diagnóstico, tratamiento y control de esta parasitosis. Para la preparación de este libro (Reseña de libro), además de realizar una exhaustiva revisión de lo publicado sobre los temas en él abordado, tuvimos en cuenta, y así está expresado en sus textos, parte de los resultados

de las investigaciones descritas en este documento (aquellos que condujeron a la intervención).

Tabla 2. Componentes de la intervención realizada en la provincia de Cienfuegos.

*En la red de Hospitales, Policlínicos y Centros Municipales de Higiene y Epidemiologíade la Provincia mediante un Proyecto financiado por la ONG Cáritas - Cuba (Proyecto3400 IPK-Amebiasis) **Editorial Elfos Scientiae (ISBN 959-235-018-3)

En relación con los Médicos En relación con Técnicos y Responsables de Laboratorio

1- 1- Preparación, publicación y distribución gratuita* de un libro sobre el tema que titulamos Amebiasis: enfoques actuales sobre su diagnóstico tratamiento y control**

2- 2- Impartición de conferencias sobre el tema a los médicos de la provincia relacionados con el problema

3- 3- Inclusión de conferencias sobre el tema en las actividades docentes (Cursos sobre Diagnóstico, Módulos de Maestrías) que de manera sistemática organiza e imparte el Laboratorio Nacional de Referencia en Parasitología del Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”

1- 1- Preparación y publicación de un libro sobre el tema que titulamos Amebiasis: enfoques actuales sobre su diagnóstico tratamiento y control

2- 2- Cursos teórico-prácticos de actualización y readiestramiento en el diagnóstico microscópico del parasitismo intestinal

3- 3- Medidas tendientes a prestigiar la actividad del diagnóstico microscópico del parasitismo intestinal

4- 3- Promover el incremento de los controles internos y externos a la actividad del diagnóstico microscópico del parasitismo intestinal

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IV- Resultados Todos los resultados de este trabajo están descritos en las publicaciones que lo componen.

V- Compilación de publicaciones del autor que forman parte del documento Copias de las publicaciones del autor que forman parte del documento, ordenadas según cronología de los estudios que describen, se compilan a continuación. Esta compilación incluye, además, una reseña del libro preparado, publicado y distribuido con la int ención de, partiendo de los primeros resultados aquí abordados, aportar herramientas necesarias para un mejor diagnóstico, tratamiento y control de la amebiasis intestinal en nuestro país.

Artículo 1

RESEARCH NOTE

Overdiagnosis of Intestinal Amoebiasis Associated to

Serial Microscopical Examination of Faeces. Some

Precisions on a Problem

Luis Fonte+, Ana M Montalvo, Esteban Alberti, Fidel Núñez, Lazara Rojas

Institute de Medicina Tropical “Pedro Kouri”,

Autopista Novia del Mediodía, km 6 1/2, Apartado

Postal 601, Marianao 13, Ciudad de la Habana,

Cuba

Key words: Entamoeba histolytica - intestinal

amoebiasis - overdiagnosis - microscopical

examination - ENZYMEBA

In spite of the accumulated evidences favoring the existence of Entamoeba histolytica as a complex of two species morphologically identical, but with different pathogenecity, Entamoeba histolytica, Schaudinn, 1903, and Entamoeba dispar, Brumpt, 1925 (LS Diamond & CG Clark 1993 J Euk Microbiol 40: 340-344), the microscopical examination of faeces continuous to be the most widely used laboratory method for the diagnosis of intestinal amoebiasis.

This procedure has two additional limitations: since the excretion of the cyst of E. histolytica is intermittent, it requires the examination of at least three specimens on separate days to minimize the presence of false negatives (JA Walsh 1986 Rev Infect Dis 8: 228-238). The differentiation of E. histolytica from other cells in faeces is tedious an d frequently leukocytes in the stool are mistakenly identified as E. histolytica (F Anaya & G Sabanero 1989 Trans R Soc Trop Med Hyg 83: 210-213, DA Bruckner 1992 Clin Microbiol Rev 5: 356-369). These difficulties have been frequently mentioned but not rigorously estimated.

Recently, AL Luaces et al. (1992 Parasitology 105: 203-205, 1993 Parasitol Today 9: 69-71) de-veloped a highly effective method for the detec tion of E. histolytica in faeces. The technique,

Corresponding author. Fax: +53-7-246051. E-mail:

fonte@ipk.sld.cu Received 4 February 1998 Accepted 22 June 1998

which they named ENZYMEBA, is based on immuno-enzymatic capture of histolysaine, a cys -teine proteinase of E. histolytica first described by AL Luaces and AJ Barret (1988 Biochem J 250: 903-907). Taking into account the advantages of ENZYMEBA method, included its ability to per -form effective diagnosis using frozen samples, we decided to determine with more precision the mis -diagnosis of intestinal amoebiasis associated to the microscopical examination of faeces.

Three stool samples were collected from 288 individuals who visited the parasitology services of three hospitals of Havana City by different rea -sons, more frequently diarrhoeal diseases. All the specimens were studied by the routine procedures used for microscopical examination of faeces in the corresponding hospital.

To be assayed by ENZYMEBA, a portion of each sample was frozen at -20°C and sent to the Parasitology Laboratory of the Tropical Medicine Institute “Pedro Kouri” (IPK) of Cuba. The ENZYMEBA test, a commercial enzyme immu -noassay kit produced at IPK, was used according to the manufacturer’s instructions, based on the procedure described by Luaces et al. (loc. cit.).

The results are shown in the Table. The three samples of 151 individuals were negative to E. histolytica by morphological observation. Of these persons, only the specimens of three (1.9%) were positive by ENZYMEBA (as this technique is based on the detection of enzymatic activity of histolysaine, a positive result is possible in the absence of the intact parasite in the sample). This result, by using a different procedure, confirms with precision that the serial microscopical examination of at least three stool samples per individual satisfactorily reduces the risk of false negative diagnosis of intestinal amoebiasis.

However, as we can see in the Table, of the 137 persons whose three samples were at least once positive by microscopical observa tion, only the specimens of 28 (21.9%) were positive by ENZYMEBA. The number of microscopical false positives was superior when the number of samples analyzed per individual was higher (55, 88 and 109 false positives after the first, second and third samples, respectively). The ENZYMEBA test has the advantage of not being dependent of the skill of a microscopist. The report of cases found posi tive by microscopical examination and negative by ENZYMEBA was first done by Luaces et al. (loc. cit.). Faeces of those individuals were cultivated in Robinson’s medium in order to try to isolate E. histolytica, but from none of them was growth of parasites observed.

Taken these results together, we have objec -

Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 93(6): 799-800, Nov./Dec. 1998

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tively demonstrated that the current solution of the microscopical subdiagnosis of amoebiasis, the ex-

TABLE

animation of serial samples of faeces, leads to an increase of the occurrence of microscopical overdiagnosis of this infection. Thus, it is clear that there is an urgent need of complementary tests for an efficient diagnosis of amoebiasis. The new methods must be based on appropriate technologies for use in a broad range of logistic conditions, included those more frequently present at the health services of developing countries, and must differentiate between E. histolytica and E. dispar infections.

Stool microscopy, due to its low cost and ca -pacity for detecting different parasitic protozoa and helminths in the same assay, will continue to play an essential role in supporting the physicians in the diagnosis of intestinal parasitism. Accordingly, the improvement of the technician’s competence to execute the microscopical examination of faeces remains a necessary approach to the reduction of the overdiagnosis of intestinal amoebiasis.

Results of microscopical examination and the ENZYMEBA test on faecal samples of 288 individuals (three per each)

ENZYMEBA Positive °

Negative Total

Positive b 28 109 137 Microscopy

Negative 3 148 151 Total 31 257 288

a: ENZYMEBA test was positive in the three samples of 31 persons; b: microscopical examination was considered positive when cysts and/or trophozoites of Entamoeba hisiolytica/E. dispar were observed in at least one sample per individual.

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Artículo II

DEMOSTRACIÓN, MEDIANTE ENZYMEBA, DEL SOBREDI AGNÓSTICO DE AMEBIASIS INTESTINAL A SÓCIA DO AL EXAMEN MICROSCÓPICO DE HECES. REPÓRTE DE UN ESTUDIO EN (TENFLEGOS, CUBA

Luis Funle. María A Fernández.' Lizet Sánchez. Humberto Marín. ' Yury O Vúñez y Ivon Montano'

RESUME N

1 I sohrcdiagníSstico microscópico de amebiasis intestinal ha sido ampliamente reportado, peo pocas \eces objetivamente demostrado I n el presente trabajo, empleando l'nzymeba. un procedimiento diagnóstico de amebiasis intestina! desarrollado en el Instituto de Medicina 1 ropical Pedro kouri. C ludad de La Habana, abordamos este problema Durante seis meses se colectaron en los servicios de parasitología de la casi totalidad de los po'.iclimcos (13 de 14), y de los dos mayores hospitales (2 de 3) de la provincia de Cienluegos, todas lasmuestras de heces en las que el personal técnico correspondiente habla informado la detección por observación microscópica de uno o más estadios de Emamoeba histolytica En sólo 61 (14 4%) de 424 muestras colectadas l-.nzvmebaconfirmó el hallazgo microscópico previo No encontramos diferencia estadísticamente significativa (p>0 05) en'.rc la eficiencia del diagnóstico microscópico en los hospitales y en los policlímcos de aquella provincia

PAL ABR AS CL AVES : Ame bias i s . S obred iagnó s t ico mi c roscóp ico . Enzy - meba

INTR ODUCCI ON

El exa men micro scóp ico de heces con t inúa s ie ndo e l p roced i mien to de l abora to r io más a mpl ia mente u t i l i zado para e l d i agn os t ico de a mebias i s

1 Instituto de Medicina Tropical "Pedro kouri. Autopista Movía del Mediodía km 6'/>. Apartado Postal 601. Marianao 13. C iudad de la Habana. Cuba I ax >1-7 215957 e-mail lome a ipk sld cu

2 Cer.iro ¿- Investigaciones Médico-Quirurgicas. c mdad de la Habana. Cuba3 (. entro Provincial de Higiene. Epidemiología y Microbiología de Cienfuegos. Cienluegos. Cuba Enderezo para correspondencia Insntuto de Medicina tropical Pedro Kouri". Autopista Novia del Mediodía km 6'/j, Apartado Postal 601, Marianao 13. Ciudad de la Habana. Cuba Fax 53-7-215957 e-mail fonte(5) ipk sld cu

Recebido para publicado em 15/05/98 Revisto em !0*09/98 Aceito em 19/09/98

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196 Vol 27(2) 195-201 jul –dec. 1998

intestinal (Bruckner. 1992; Ravdin, 1995). Sin embargo, este método tiene importantes limitaciones en primer lugar, la excreción intermitente de quistes de Entamoeba histolytica obliga a la realización de al menos tres exámenes por paciente para solo detectar 80% de las infecciones (Walsh, 1986); en segundo lugar, sobre todo cuando la prueba es realizada por personal insuficientemente entrenado, el parecido de los diferentes estadios de E histolytica con otras estructuras que pueden estar presentes en las heces frecuentemente conduce a falsos diagnósticos de amebiasis (Anaya & Sabanero, 1989). A estas limitaciones se suma que la observación microscópica de heces, sobre todo cuando se visualizan quistes, no permite distinguir entre E histolytica y E dispar (Diamond & Clark. 1993; WHO, 1997) .

Algunas pruebas serológicas han sido utiles en el diagnóstico indirecto de las formas extraintestinales de amebiasis, en particular del absceso hepático (Madison. 1991). Sin embargo, para las formas intestinales estos exámenes no han representado una solución eficiente al problema de su diagnósti co (Ravdini, 1995). Sistemas para la detección de antígenos en heces han sido recientemente desarrollados (Haque et al., 1993; Abd-Alla et al.,1993; González-Ruíz et al., 1994; Haque et al., 1995; Urdaneta et al., 1996; Jackson & Ravdin. 1996). Al menos uno de ellos, que permite la diferenciación entTe E histolytica y E dispar, ya se comercializa; pero por su relativo alto costo aún no está disponible para su uso regular en la mayoría de los servicios parasitológicos.

En 1988, Luaces y colaboradores (Luaces et al., 1988) describieron una proteasa de E histolytica a la que nombraron histolisaina Posteriormente, Luaces y cois. (Luaces et al., 1992a; Luaces et al., 1992b) desarrollaron un ensayo inmunoenzimático (Enzymeba) para la detección de histolisaina en h eces, siendo éste el primer procedimiento diagnóstico en que el propio parásito aporta la enzima (histolisaina) que revela su presencia La eficacia de este procedimiento fue probada en sendos estudios realizados en Mérida, México (Comisión de Expertos de l a Universidad Autónoma de Yucatán, Mérida, México, 1992) y en Ciudad de La Habana, Cuba (Fonte et al., 1998).

El sobrediagnóstico de amebiasis intestinal, en particular la cuantía de éste, ha sido hasta el presente un problema ampliamente reportado pero pocas veces objetivamente demostrado. Teniendo en cuenta las bondades de Enzymeba, en especial el hecho de que sus altos indices de sensibilidad y especificidad no dependen de la subjetividad asociada a un observador (Luaces et al., 1992a; Luaces et al., 1992b; Comisión de Expertos de la Universidad Autónoma de Yucatán, M énda, México, 1992; Fonte et al, 1998) , decidimos demostrar con precisión la presencia, y cuantía, del sobrediagnóstíco de amebiasis asociado al examen microscópico de heces en la provincia de Cienfuegos, Cuba

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MATERIALES Y METODOS

1 Muestras de heces

La provincia de Cienfuegos es una de las catorce en que esta dividid a el territorio cubano. Esta, a su vez, esta constituida por ocho municipios: Cienfuegos. el municipio capital de la provincia y siete municipios periféricos, fundamentalmente rurales.

Durante los meses de mayo a octubre de 1996 se colectaron en los Hospit ales Clinico-Quirúrgicos "Gustavo Aldereguía" y Pediátrico “Paquito González" de Cienfuegos y en prácticamente todos los policlinicos (13 de 14) de aquella provincia, muestras fecales en las que los técnicos de laboratorio de los citados centros asistenciales habían detectado por observación microscópica uno o mas estadios de Entamucbu histulylica En todos los casos, el diagnostico coproparasitologico había sido realizado mediante examen directo con coloración de Lugol: en algunas muestras sobre las que existieron dudas diagnosticas emplearon, además, la observación con tinción tricrómica. Se consideró a un individuo positivo por observación microscópica cuando en uno de tres exámenes realizados los técnicos informaron, según sus criterios, la presencia de uno o más estadios de E histolytica. Durante el período en que se colectaron las muestras supuestamente positivas, los técnicos de laboratorio no conocían que con las mismas se haría un estudio de la calidad del diagnóstico microscópico que realizaban.

Todas las muestras fueron conservadas, congeladas (debido a que después se emplearía Enzymeba, no era posible la utilización de preservantes), en las respectivas instituciones en que se realizó el diagnóstico primario. De estas fueron transportadas, también congeladas, al Centro Provincial de Higiene y Epidemiologia de la provincia Cienfuegos y de allí en iguales condiciones, al Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kouri" (IPK).

Con la intención de confirmar con una herramienta más objetiva el diagnóstico microscópico previo, una vez las muestras de heces en el IPK. a las mismas se les realizó Enzymeba

2 Obtención de anticuerpos antihistolisaina

La histolisaina se purificó según describieran Luaces \ Barret en 1988 (Luaces y Barret, 1988). Para la obtención d e anticuerpos contra esta enzima se procedió de la siguiente manera: dos conejos Chinchilla de 2 -3 kg de peso fueron inmunizados subcutáneamente con 500 ng de la proteína diluida en 0.5 mi de solución salina tamponada (PBS) (0 1 M, pH 7.2) > emulsificada e n igual volumen de adyuvante completo de Freund. A

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intervalos de dos semanas, ambos conejos fueron inmunizados en otras nueve ocasiones con cantidades decrecientes de la enzima (50 pg menos de por vez, hasta inocular sólo 50 jag en la última de ellas) emulsificada en igual volumen de adyuvante incompleto de Freund. Una semana después de la décima inmunización los conejos fueron sangrados. De la sangre colectada fue separado el suero y de este se obtuvo una preparación cruda de mmunoglobulinas mediante p recipitación en sulfato de amonio, siguiendo una metodología similar a la empleada por Luaces y cois, en 1992 (Luaces).

3. Enzymeba

Enzymeba se realizó según reporto Luaces y cois, en 1992, con algunas modificaciones. Placas de poliestireno de fondo plano y d e 96 pocilios (Marxisorp, NUNC) fueron sensibilizadas durante 16 horas a 4°C con 125 n 1/pociIlo de una solución 0.1 M de carbonato de sodio pH 9.6, contentiva de anticuerpos antihistolisama obtenidos en conejo (5 |ug/ml). Los sitios no recubiertos por los anticuerpos fueron bloqueados durante 2 horas a 37°C con 150 |il/pocillo de seroalbúmina bovina al 0.1% en PBS (0.1 M, pH 7.2). Transcurrida esta incubación, se eliminó el agente bloqueante en exceso y se añadieron 100 jaI del sobrenadante de las muestras de heces previamente diluidas (lg de heces diluido en 3 mi de agua destilada y dejado reposar durante 15 minutos).

Después de 4 horas en contacto con la placa a 4°C el material no “capturado" fue desechado y tras cuatro lavados con Tween -20 al 0.05% en PBS (PBS-T) en ios pocilios fueron colocados 100 |il de 100 mM Benziloxicarbonil -L Arginil-L Arginine 2-(4-metoxi) naphthylamida (z-arg- arg Mna), Bachen, Suiza, en solución 50 mM glicina -EDTA pH 9.5 que contenía, además, L -cysteina 2 mM.

Luego de 16 horas de incubación a 37°C, la acción de la enzima capturada fue revelada mediante la adición de 100 |jl de una solución que contenía p -cloro mercuribenzoato 5 mM, Fast gamet 22.5ng/pl, EDTA 25 mM y Tween 20 al 1% pH 6 0 La aparición inmediata de color rosado (de diferente intensidad) fue considerada como un resultado positivo, y negativo en aquellos pocilios cuyo contenido continuo amarillo. En cada ensayo se utilizaron dos controles (positivo y negativo).

4. Análisis Estadístico

Se empleó una prueba de comparación de proporciones para analizar la diferencia entre grupos (hospitales y policlinicos). Se consideró como nivel de significación un valor de p<0.05.

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RESULTADOS Y DISCUSION

Se colectaron en los ocho municipios de la provincia Cienfuegos un total de 448 muestras de heces en las que el personal técnico de los centras asistenciales incluidos en el estudio habia informado la detección por examen microscópico de uno o mas estadios de E hislolytica. Veinticuatro de ellas fueron descartadas por no haber sido transportadas al IPK en condiciones de congelación. En relación con las 424 muestras restantes, fue informada la presencia de quistes en 412 (97.2%), trofozoitos, ninguno hematófago, en I I (2.6%) y quistes y trofozoitos en 1 (0.2%).

La tabla I muestra los resultados del estudio de la eficacia del diagnóstico morfológico en la provincia Cienfuegos Como puede observarse, de las 424 muestras finalmente incluidas en el estudio, sólo 61 (14 4%) fueron positivas a Enzymeba. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre la calidad del diagnóstico en los hospitales (18.2% de eficacia) y la de los policlinicos (13.8%) (p -0.051

Tabla I Resultados de la aplicación de Enzymeba a muestras de heces informadas positivas a E histolytica por examen microscópico en hospitales y policlinicos de la provincia Cienfuegos

Tres estudios anteriores (Luaces et al., 1992; Comisión de Expertos de la Universidad Autónoma de Yucatán, Mérida, México, 1992; Fonte et al., 1998) demostraron que el procedimiento Enzymeba para el diagnóstico de amebiasis es altamente eficiente y sólo requiere la realización del ensayo en una muestra por paciente para la obtención de un diagnóstico acertado (Enzymeba detecta una proteasa excretada por las amebas en el lumen intestinal y, por tanto, son posibles resultados positivos aún en ausencia de quistes y trofozoitos en las heces) Este procedimiento, a diferencia de los demás ensayos inmunoenzimáticos, no requiere de enzimas conjugadas, pues el propio parásito aporta la enzima que detecta su presencia. En este hecho radica su doble fuente de especificidad, la del anticuerpo por el antígeno (la enzima) y la de la enzima por su sustrato colonmétrico

Los resultados arriba mencionados nos demuestran, por tanto, que existe un marcado sobrediagnóstico microscópico de amebiasis intestinal en los centros de salud de la provincia Cienfuegos.

El sobrediagnóstico de amebiasis intestinal asociado al examen microscópico de heces se reporta cada vez con más frecuencia (Krogstad et al., 1978; Walsh, 1986; Anaya & Sabanero, 1989; Matijasevic, 1995). Nuestro trabajo, a diferencia de los estudios precedentes, emplea para demostrar y cuantificar los falsos diagnósticos de amebiasis una herramientE diferente (y más objetiva) a la propia observación microscópica de heces.

Este problema del sobrediagnóstico de amebiasis intestinal conduce al uso innecesario, cuando no yatrógeno, de drogas amebicidas. Su solución debe ser abordada de forma multidisciplinaria. Una alternativa al empleo dei examen microscópico de heces podría ser el uso de procedimientos má s:. sensibles y específicos para la detección de infección intestinal por E histolytica (Jackson & Ravdin, 1996; WHO, 1997). Pero estos, por sj relativo alto costo, aún no están disponibles para un uso regular en la mayoría de los servicios parasitológicos. Por este motivo, y por el hecho de que la

N.° de muestras Enzvmeba positivas

Porciento

Hospitales 55 10 18.2 Policlinicos 369 51 13 8 Totales 424 61 14.4

p > 0.05

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observación microscópica de heces permite la detección de una amplia gama de parasitos en una misma prueba, el diagnóstico morfológico debe ser perfeccionado. Para incursionar en los factores que condicionan los falsos diagnósticos microscópicos de amebiasis, y posiblemente de otras parasitosis, actualmente aplicamos encuestas sobre percepciones, conocimientos y prácticas relacionadas con este problema, a técnicos de laboratorio, a responsables de éstos y a médicos de la provincia de Cienfuegos.

SUMMARY

Demonstration, using Enzymeba test, of the overdiagnosis of intestinal amebiasis associated to the microscopical examination of faeces. Report of a study in Cienfuegos, Cuba.

The overdiagnosis of amebiasis has been widely reported, but not rigorously demonstrated. We confronted this issue utilizing Enzymeba, a diagnostic method for intestinal amebiasis developed at the Tropical Medicine Institute “Pedro Kouri”, Havana City. From 424 faccal samples collected at the parasitology division of almost all local polyclinics (13 of 14), and two of the. largest hospitals (2 of 3) belonging to the province of Cienfuegos, in only 61 (14.4%) Enzymeba confirmed the microscopic diagnosis. We did not find statistically significant differences (p>0.05) between the microscopic diagnosis at the hospitals and at the local polyclinics.

KEYWORDS: Amebiasis. Microscopical overdiagnosis. Enzymeba.

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