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Intensificazione di Processo - iscamapweb.chem.polimi.it · Attenta ottimizzazione di una struttura...

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- Sintesi Parallele - Chimica Combinatoriale - Ottimizzazione di Processo Prof. Attilio Citterio Dipartimento CMIC “Giulio Natta” http://iscamap.chem.polimi.it/citterio/education/course-topics/ School of Industrial and Information Engineering Course 096125 (095857) Introduction to Green and Sustainable Chemistry
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- Sintesi Parallele - Chimica Combinatoriale - Ottimizzazione di Processo Prof. Attilio Citterio Dipartimento CMIC “Giulio Natta” http://iscamap.chem.polimi.it/citterio/education/course-topics/

School of Industrial and Information Engineering Course 096125 (095857)

Introduction to Green and Sustainable Chemistry

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Attilio Citterio

Chimica Combinatoria e Selezione ad Alta Produttività

1. Tecniche in Fase Solida 1.1. Vantaggi 1.2. Requisiti 1.3. Esempi di Supporti Solidi 1.4. Spaziatori e leganti

1.4.1. Resine Merrifield per la sintesi peptidica (gruppo clorometile) 1.4.2. Resine Wang e Rink 1.4.3. Resine diiidropiraniche

2. Sintesi Parallele 2.1. Procedure di Houghton delle Bustine di te 2.2. Sintesi parallela automatizzata 2.3. Tecnica "split and pool"

3. Sintesi Combinatoriale Mista 4. Sintesi in fase soluzione

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Attilio Citterio

Passi Chiave nella Sperimentazione

• Preparazione robotica del campione • Miniaturizzazione dei reattori • Alto livello di automatizzazione dei sensori • Industria farmaceutica:

• creazione e analisi di routine da 1000 a 1000000 composti distinti (librerie)

• Queste tecniche sono ora anche applicate nello sviluppo di materiali

• Nuove aziende: • Symyx (www.symyx.com ) • Avantium (www.avantium.com )

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Attilio Citterio

Analisi ad Alta Produttività

• Ciclo tipico di sperimentazione: – Migliaia di reazioni in poche ore – Poche ore di analisi statistica – Migliaia di reazioni in poche ore – Poche ore di analisi statistica – ---

• Si possono sviluppare nuovi composti chimici in 3 settimane anziché in 3 anni

• Quali tecniche statistiche sono importanti? • Come si confrontano le tecniche classiche degli studi precedenti? • Quali nuove tecniche sono necessarie?

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Chimica Combinatoria - Una Rassegna Storica

1. Sintesi in fase Solida di peptidi

2. Sintesi in fase Solida di oligodeossiribonucleotidi

3. Intesi tradizionale vs. combinatoria :

Mario Geysen: tecnica Multipin

Richard Houghton: tecnica "Tea bag"

Ronald Frank: tecnica SPOT

John Ellman: Prima sintesi combinatoria di piccoli composti eterociclici

4. Concetti base della chimica combinatoria

5. Chimica combinatoria nello sviluppo di farmaci

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1. Sintesi in Fase Solida di Peptidi (SPPS) col Metodo Boc

SPPS: sviluppata da Merrifield, un

premio Nobel.

Sintesi in Fase Solida vs. sintesi tradizionale in soluzione :

1. Facile purificazione del prodotto, specialmente adatta alle sintesi a tanti stadi

2. Reazione eterogenea: le reazioni sono più lente e meno efficienti delle reazioni in soluzione.

Amminoacido1 protetto Resina reattiva

Ancoraggio

Deprotezione con

Accoppiamento Amminoacido2 protetto

+ DCC

Deprotezioni sequenziali e stadi di accoppiamento

Rilascio con HF

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Sintesi in Fase Solida di Peptidi (SPPS) col Metodo Fmoc

AA X R

O

NH2

AA X R

O

AAFmocHN

TFA

FmocNH-AA-COOHDCC, HBTU

X R

ONH

NH

O R1

R2O

FmocHN

Rn

SPPS

20% piperidina

Metodo Fmoc

Deprotezione Fmoc

H

O NH

O

NH

OO

NH + CO2 + RNH2

NH

N

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Sintesi Chimica di Oligos del DNA

Stadio 1: Deprotezione terminale : pochi min. CCl3COOH(TCA) o CHCl2COOH(DCA)

Stadio 2: Accoppiamento: 2-3 min. Stadio 3: Ossidazione: I2, pochi min. Stadio 4: Protezione: per bloccare il 5’-OH Ac2O, lutidina, N-metilimidazolo, THF

Deprotezione: 30% NH4OH, 5h a 50°C Purificazione: HPLC, elettroforesi, Scambio ionico, ecc.

H3CO

OCH3

DMTr

O

O

R1OP

O NHDMTrO

B2

O NH

B1

O

S

O

O

O

OR1

P

O NHDMTrO

B2

O NH

B1

O

S

I2, Lutidina

H2O, THF

O

O

R1OP

O NHDMTrO

B2

O NH

B1

O

S

TetrazoloN

O

R1OP

O NHDMTrO

B2

R2

R2

+N

N

NH

N

OHO NH

B1

O

S

+N

NN

N

O

R1OP

O NHDMTrO

B2

R1= β-cianoetil B = gruppo base S = fase solida

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Ciclo Sintetico

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Attilio Citterio

Tecnica Multipin per la Sintesi Parallela di Peptidi

Geysen, HM; Rodda, HM; Mason, TJ. The delineation of peptides able to mimick assembled epitopes. In Synthetic Peptides as Antigens. Ciba Foundation Symposium 119; Porter, R., Wheelan, J., Eds.; Wiley: New York, 1986; pp131-149

Lavaggio e deprotezione in un grande pentola

Accoppiamento: uso di un Dispositivo a 96 pozzetti Il reagente AA protetto in ciascun pozzetto dipende dalla sequenza del peptide di interesse sulla punta a cui corrisponde.

10-50 nmoli di peptide legato covalentemente

Punte di polipropilene derivatizzato con acido acrilico

Spaziatore Fmoc-b-alanina-esametilendiammina

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Sintesi Classica vs. Approccio a Sintesi Combinatoria

Sintesi "Classica"

+ +

" Approccio a Chimica Combinatoria"

+ +

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Attilio Citterio

Esempio di Diversità Molecolare e Sintesi

Tetra-peptide: H2N-A-B-C-D-CO2H si consideri solo i 20 amino acidi naturali (serie L)

204 = 160,000 differenti tetra-peptidi ! ora si includa i 19 amino acidi D (20 L + 19 D = 39)

394 = 2.3 milioni di tetra-peptidi differenti!! ora si includa 20 amino acidi non naturali

594 = 12 milioni di tetra-peptidi differenti !!!! Chimica Combinatoria: metodologia con cui si può preparare e valutare

una famiglia (libreria) di composti correlati (per struttura e sintesi) Per le sintesi multi-stadio, si deve usare l’approccio sintetico in

esperimenti in parallelo oppure utilizzando una fase solida per velocizzare la purificazione degli intermedi

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Attilio Citterio

Chimica Combinatoriale nella Progettazione di Farmaci

Scoperta Capostipite

Ottimizzazione Struttura

Sviluppo Candidato

Farmaco

Target Terapeutico

La Chimica Combinatoriale opera qui

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Attilio Citterio

Industria Farmaceutica – Scoperta di Farmaci

Identificazione prodotto guida : letteratura (aperta e brevettuale) natura (prodotti naturali)

Attenta ottimizzazione di una struttura guida tramite sintesi chimica “tipico: metile-etile-butile-futile”

N° farmaci commercializzabili per composti sottoposti a test biologico preliminare

1 10,000

Progettazione razionale Chimica combinatoria

Composto Guida (lead)

ottimizzazione

(sintesi) Farmaco

10 anni

400 – 800 milioni di $

$ $ $

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Sintesi Organica in Fase Solida - Catalisi su Supporti Polimerici Prof. Attilio Citterio Dipartimento CMIC “Giulio Natta” http://iscamap.chem.polimi.it/citterio/education/course-topics

School of Industrial and Information Engineering Course 096125 (095857)

Introduction to Green and Sustainable Chemistry

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Attilio Citterio

Sintesi Organica in Fase Solida (SPOS)

La sintesi in fase solida è una metodologia che consente di realizzare trasformazioni chimiche con l'ausilio di un polimero insolubile. Perciò, è anche nota come sintesi assistita da polimeri e, quando si applica alla chimica organica, essa assume l'acronimo di “SPOS” = Solid-Phase Organic Synthesis.

L'approccio fu introdotto da R. B. Merrifield, Premio Nobel per la Chimica nel 1984. R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149

O NH

CH3 CH3

OCBz

ClNO2 NO2

NH

CH3 CH3

CO2NHEt3BzC

O NH2

CH3 CH3

O

NO2

NH CO2HBzC

O NH NHO

CH3 CH3

OCBz OH NH

NH NH NH2

CH3

CH3

OCH3

O

OCH3CH3

O

HeatingDeprotection

Coupling

1) HBr/AcOH

DCC

Deprotection,Neutralizationand Coupling

L-leu-L-ala-gly-L-val

2) Et3NNeutralization

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Tecniche in Fase Solida

• I reagenti sono legati a una superficie polimerica e modificati mentre sono ancora legati. Si rilascia il prodotto finale alla fine della sintesi.

Vantaggi • Si possono legare reagenti specifici a specifici supporti a palline • I supporti si possono mescolare e far reagire nello stesso contenitore • I prodotti formati sono specifici per ogni pallina e fisicamente distinti • Si possono usare reagenti in eccesso per spingere le reazioni a completezza

e questi possono essere facilmente rimossi • Gli intermedi di reazione stanno sulle palline e non si devono isolare/purificare • Si possono separare le singole palline per isolare singoli prodotti • Il supporto polimerico si può rigenerare e ri-usare dopo distacco del prodotto

Requisiti • Una pallina di resina o una superfice funzionalizzata agisce da supporto solido • Uno spaziatore e un legante (gruppi protettivi per i gruppi funz. Non implicati) • Un legame che lega il substrato al legante. Il legame deve essere stabile. • Un mezzo per staccare il prodotto dal legante alla fine. • E' possibile automatizzare il tutto.

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Tecniche in Fase Solida

Esempi di Supporti Solidi

• Palline di polistirene parzialmente reticolato di natura idrofobica causano problemi nella sintesi peptidica per il "folding" dei peptidi

• La resina poliammidica di Sheppard è più polare

• La resina Tentagel ha un intorno simile all'etere o al THF

• Palline, punte e superfici di vetro funzionalizzate

Le palline devono essere in grado di rigonfiarsi nel solvente usato, e rimanere stabili La maggior parte delle reazioni avvengono all'interno delle resine.

Rigonfiamento indotto dal solvente

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Struttura di un Polimero per SPOS

Supporto Solido (nocciolo)

Spaziatore Scaffold

Il materiale si può distinguere in quattro componenti differenziate :

Il nocciolo è normalmente un polimero reticolato all'1% insolubile. Tipici sono i copolimeri del polistirene e divinilbenzene eventualmente con polietielenglicol. Spaziatore: se presente, è comunemente un frammento molecolare (tipico il polietilenglicol) che connette il supporto solido al legante attraverso un legame covalente. Da più reattività tipo soluzione con minor carico di resina Legante, se presente, fornisce un metodo ortogonale al rilascio dello scaffold Scaffold è la parte che si è interessati a far intervenire nella chimica e che rilascia il prodotto alla fine della sintesi. .

Legante

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Scaffolds e Gruppi Terminali Funzionali Reattivi

Polimeri Reattivi per la Sintesi Organica in Fase Solida

+ A + B + C

+ A + B + B A

A, B e D

C

A) Catalizzatore B) Ossidante C) “Bloccante” D) Ausiliario Chirale

N O

O Ph

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Vantaggi della SPOS

C'è una serie di ragioni di base che rendono la SPOS una metodologia vantaggiosa in confronto alla classica sintesi in fase liquida :

1. Procedure di reazioni semplificate: la purificazione dei prodotti di reazione si può fare per semplice filtrazione e lavaggio della resina.

2. Influenza termodinamica e cinetica sul corso della reazione: consente di usare un largo eccesso di reattivo in soluzione (gruppi protettivi polimerici) o su resina (polimerico reattivo), con alta resa di reazione.

3. Rigenerazione della resina: La resina o il reattivo polimerico si possono rigenerare per essere usati in una nuova reazione.

4. Principio dell'alta diluizione: Controllando la capacità equivalente della resina (< 0.8 mmol/g), si possono eliminare reazioni indesiderate di accoppiamento e favorire le reazioni di ciclizzazione intramolecolare.

5. E' possibile automatizzare le procedure: l'automazione si usa tipicamente nelle tecniche di Chimica Combinatoria e nella tecnica di Array in Fase Soluzione.

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Svantaggi della SPOS

I principali svantaggi della chimica assistita da polimeri sono: 1. Sviluppo di un metodo sintetico: Essendo una reazione solido-liquido

(controllata cineticamente dalla diffusione reattiva nei poro del polimero) e avvenendo su un supporto solido (che deve essere stabile), le condizioni di reazione in soluzione non possono essere direttamente applicate, perciò si devono ottimizzare (scegliendo dei gruppi protettivi polimerici).

2. Limiti dei supporti solidi e dei “linkers”: I “linkers” e i supporti solidi, benché sviluppati commercialmente, sono in numero limitato.

3. Monitoraggio delle reazioni: Usando gruppi protettivi polimerici, i tempi reali di monitoraggio delle reazioni sono limitati in quanto il prodotto che si forma rimane legato al polimero.

4. Stadi sintetici aggiuntivi: Lavorando con reazioni di addizione-eliminazione, si devono aggiungere più stadi alla sintesi tradizionale in soluzione. Il processo ha bassa EA e numerosi scarti.

5. Scala: Generalmente il metodo si applica alla sintesi di campioni di prodotto inferiore a 1 g, ma in alcuni casi lo si è applicato in fase di produzione.

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Tipi di Supporto Solido

Si usano supporti polimerici per immobilizzare i substrati, reagenti e catalizzatori. Il supporto polimerico nella maggior parte dei casi è insolubile, ma talvolta si usano polimeri solubili. I polimeri usati nelle sintesi di molecole organiche appartengono a quattro classi :

1) Polimeri organici reticolati: sono insolubili in solventi organici e possono essere micro-porosi o macro-porosi (per es. Polistirene).

2) Polimeri organici lineari: solubili in solventi organici e insolubili in altri da cui si possono precipitare (per es. Polietilenglicol).

3) Dendrimeri: la cui solubilità dipende dalla polarità e forma 4) Supporti inorganici : vetro poroso, silice, allumina, argille, grafite.

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Tipi di Supporto

I supporti costituiti da polimeri organici reticolati sono i più comuni: I due tipi di supporto per lo più usati nelle applicazioni sono:

• poli(stirene-co-divinilbenzene) PS-DVB • 2) poli(etilenglicol-co-stirene-co-divinilbenzene) PEG-PS-DVB

X (CH2) -(OCH2CH2) -OCH2CH2-X

X = Cl (Merrifield), OH, NH2

PS-DVB PEG-PS-DVB

X = Br, OH, NH2, SH, COOH

Dimensione: 100-200 mesh (75-15 µm)200-400 mesh (38-75 µm)

100-200 mesh (75-15 µm)

Capacità Equivalente: 0,5-4 mmol/g 0,2-0,5 mmol/g

CompatibilitàChimica:

DMF, DCM, THF,Toluene.Termicamente stabileIncomplatibile con solventi protici

Solventi protice e non protici

PS PSm n

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Polistirene Reticolato

Il supporto polimerico più usato nella sintesi organica in fase solida è il poli(stirene-co-divinilbenzene).

Il principale problema presentato da questo polimero per il suo impiego in sintesi è la sua disomogeneità.

miscela commerciale

impurezze

+

+

+

+

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Origine della Disomogeneità

1. Differente reattività del m-DVB e del p-DVB: Per quanto riguarda il primo gruppo vinile, l'isomero meta reagisce con lo

stirene più velocemente dell'isomero para. Il p-DVB reagisce meglio con sé stesso (microstruttura densa). Per quanto riguarda il secondo gruppo vinile, il m-DVB reagisce ad una

velocità simile a quella dello stirene, e si inserisce più regolarmente.

2. Modifiche del polimero dopo la sua sintesi: Lavando il polimero con buoni solventi lo si secca con collasso dei pori. Lavando il polimero con cattivi solventi lo si secca con pori più grandi.

Regioni dense ricche in monomero para

Regioni omogenee ma spaziate dal monomero meta

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Sintesi del Polistirene Reticolato

La tecnica preferita per la formazione di resine per sintesi è la polimerizzazione in sospensione. Essa differisce dalle altre tecniche: È un sistema bifasico : fase monomero (costituita dal monomero e dal

solvente organico –”porogeno”-) e la fase acquosa. Utilizza uno stabilizzante come additivo: una miscela di sali inorganici e

specie organiche polari (polivinilalcol), per abbassare la tensione superficiale delle gocce e inibire la loro aggregazione.

Produce delle sfere quasi perfette. formando gocce di monomero in fase acquosa (sotto agitazione meccanica).

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Proprietà del Polistirene Reticolato

Il “Rigonfiamento” di un polimero reticolato è equivalente alla solvatazione di un polimero lineare: Il solvente penetra nel polimero

reticolato e occupa gli interstizi tra le catene di polimero, facendo aumentare il volume.

La reticolazione del polimero crea come una trama che previene il movimento delle catene del polimero necessarie a formare una soluzione.

Il polimero rigonfiato è il reale solvente della reazione in fase solida, ma presenta un'alta viscosità.

• Non c'è relazione diretta tra la quantità e la cinetica della reazione di imbibizione.

• Il grado di reticolazione ha un grande impatto sulla capacità di imbibizione tramite l'entropia configurazionale dissipata. Un'elevata reticolazione rende più rigido il polimero, l'entropia dissipata è inferiore e l'imbibizione è difficile.

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Resine Polistireniche Derivatizzate

L'uso di Resine Polistireniche Derivatizzate è stato introdotto perché lo scheletro alchilico è chimicamente inerte mentre gli anelli benzenici sono reattivi e si possono modificare facilmente (per sostituzione elettrofila aromatica (per es. clorometilazione) o sostituzione nucleofila (litiazioni)). Inoltre, sono disponibili molti monomeri stirenici funzionalizzati poco costosi.

Metodo A: ha il vantaggio di far reagire solo anelli e posizioni di ugual accessibilità. Lo svantaggio è che le reazioni sono lente e difficili da seguire con problemi di resa e sottoprodotti.

Metodo B: Assicura l'esatta posizione della funzionalizzazione e un altro grado di sostituzione, ma richiede la sintesi di appropriati monomeri.

GF

GF

+

+ +

A

B

PS PS CH2ClCH3OCH2Cl

Lewis acid

Lewis acid: SnCl4; ZnCl2; BF3.OEt3costant behavior needs 19%Cl

para-/orto-: 95:5

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Resine Polistireniche Derivatizzate

Ottenibili per funzionalizzazione del clorometilpolistirene:

Cl

N

O

O

NH2

OCH3

O

OH

1)

3)

4)

6)

5)

2)

PS

PS

PS S

CH3

O

CN

SH

COOH

COCl

CHO

PPh2

7) 8)

9) 10)

11)12)

14)

13)

PS

PS

PS

PS

PS

PS

PS

PS

PS

1) Potassio ftalimmide, DMF; 2) NH2NH2, EtOH; 3) NH3, DCM; 4) KOAc, DMA, 85 ºC, 24h; 5) HAL, etere, 4h; 6) KOH, 1-pentanolo, riflusso, 24h; 7) KSAc, DMF; 8) LiBH4, etere; 9) NaCN, DMF, H2O, 120 ºC, 20h; 10) H2SO4, AcOH, H2O, 120 ºC, 10h; 11) SOCl2, toluene, 110 ºC, 24h; 12) DMSO, NaHCO3, 155 ºC, 6h; 13) m-CPBA, DME, 55 ºC, 19h; 14) ClPPh2, Li, THF.

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Linkers nelle Sintesi SPOS

Cl

Altri leganti

Linker Tritile

linker Sieber protetto

linker Rink ammide protetta

ONHFmoc

O

OOH OMe

OMe

O

NHFmocOMe

OMelinker Rink acido

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Linkers nelle Sintesi SPOS

Linker a presa sicura

stabile labile

+ CH2N2 → R = CH3: labile

S O R S O RO O

SO O

base+ R-OH

Linker senza traccia (a presa sicura)

NH

NH

O NH2

NH

O R

Cu(OAc)2 + N2 +

R = H: stabile

NH

O

SNR

O

Product

O O

OH-

HNR1R2

product-COOH

product-CONR1R2

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Sintesi in Fase Solida : Gruppi Protettori

I gruppi protettori usati nella sintesi in fase solida sono pochi. Per ammine.

Boc (t-butossicarbonile) Fmoc (9-fluorenilmetossicarbonile) Tmsec (2-[ trimetilsilil ]etossicarbonile)

Per acidi carbossilici.

Tert-Butil estere (t-butil estere) Fm estere (9-fluorenilmetil estere) Tmse estere (2-[trimetilsilil]etil estere)

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Sintesi in Fase Solida di Peptidi - Stadi Coinvolti

1. L'amminoacido N-protetto (Boc o Fmoc) è attaccato alla resina mediante il terminale C

2. Deproteggere il terminale N 3. Accoppiare: Aggiungere la

soluzione del successivo amminoacido. Lasciare reagire, lavare.

4. Ripetere la deprotezione ed accoppiare con ogni monomero successivo

5. Staccare il peptide dalla resina Nota: sintetizzare da C a N

Schema basato sulla metodologia Merrifield per SPPS basati su Boc

NH CHC OHO

CO

CHNH2

NH CHC O CH2

OCO

CHNHboc

NH2 CHC O CH2

O

NH CH C O CH2

Oboc

Cs+NH CHCO2boc

CH2Cl R

R = polistirene eticolato -

R

Deprotto e neutralizzato condiisopropiletilammina (DIEA)

1) TFA2) DIEA

R

Accoppiamento 1) Boc-NH-CHR2-COOH2) DCC, HOBt

R

Distacco del gruppo protettivo e del dipeptide dalla resina

1) HF2) Purificato via HPLC

dipeptide

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Attilio Citterio

Sintesi in Fase Solida di Peptidi

Accoppiamento

Sblocco finale

Rottura e deprotezione

Peptide sbloccato (prodotto finale)

Sbloccaggio Attivazione

Ripetere gli stadi ad ogni aggiunta di amminoacido

Resina

Amminoacido 1

Amminoacido 2 Gruppo protettore Fmoc

Attivatore

Gruppo protettore in catena (1) Gruppo protettore in catena (2)

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Attilio Citterio

Chimica Organica in Fase Solida (Pro/Con)

I prodotti sono insolubili Più facile la manipolazione fisica Più facile purificarli, si possono lavare abbondantemente Si può usare un eccesso di reagenti per spostare le

reazioni a completamento Nessuna reazione bimolecolare (diluzione infinita) Non si possono usare Reagenti in Fase Solida (SPR) Le cinetiche sono modificate (generalmente più lente, più

ampie distribuzioni di velocità, i siti non sono uguali) Richiede nuove metodologie analitiche Richiede una chimica legata (limita le condizioni di

reazione, impone la struttura del prodotto)

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Attilio Citterio

Chimica Organica in Fase Soluzione (Array)

Più composti significa meno tempo per composto

Ciò richiede: Buone procedure generalizzate Corte sequenze sintetiche Reazioni ad alta resa Aggiunta stechiometrica di reagenti Richiede lo sviluppo di lavorazioni e metodi di purificazioni in parallelo

I prodotti sono solubili I sottoprodotti e i reagenti in eccesso sono anch'essi solubili e si

accumulano ad ogni stadio L'analisi diretta è molto più facile (tlc, nmr, ms, hplc, lc/ms) Le cinetiche sono uniformi e familiari Si possono usare reagenti in fase solida (SPR) Non è richiesto nessun linkers, meno chimica vincolata.

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Attilio Citterio

Chimica Organica in Fase Soluzione (Array)

Reazioni di Condensazione a Componenti Multipli

Armstrong, R.W., Combs, A.P., Tempest, P.A., Brown, S.D., & Keating, T.A. Acc.. Chem. Res., 29, 123-131 (1996).

NH2

O

NH2

O

O

OR3R2 NH

NHO

O

OR2

R1

R3

O

R3 R4

O

NNH

OR1

R2

R3 R4

R5

NH2

R5

R6

R3

R4 NH

R1

R6

R5

R4R3

R1CHO R5NC

R1CHO

R2NH2

R1CHO

Biginelli

Ugi

GriecoKobayashi

+

+

+

+ +

+

+

NR1

R3 R2

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Attilio Citterio

0

1000+

N° di Composti

tempo

tempo per la fase soliida

Sld P Array

Sld P S&M

Solu P Array 2004

Sintesi Organica Classica

Solu P Array 1996

10,000+

Gli Array in Fase Soluzione o Sintesi Parallele ora dominano

Tendenze negli Ultimi Anni

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Apparati Commerciali per la SPOS

FlexChem www.robsci.com

www.scigene.com

Charybdis Technologies www.spike.cc

Polyfiltronics/Whatman www.whatman.com

MiniBlock www.bohdan.com

www.Autochem.com

Argonaut Quest 210 Nautilus 2400 Trident

Bohdan Ram Tecan Combitec Advanced Chemtech 496 Myriad Core

Modelli base

Apparati Completi

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Metodi di Purificazione

Fase Solida Lavare esaustivamente

Distacco dipendente dal Prodotto

Fase Soluzione – Purificazione Parallela Estrazione

• liquido-liquido, acido/base • SPE, resine bloccanti • Sintesi Fluorosa

Cromatografia

MIP (molecular imprinted polymers)

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Resine Bloccanti

S. W. Kaldor, J. E. Fritz, J. Tang, E. R. McKinney, Biorganic & Med. Chem. Lett., 6, 3041-3044 (1996).

NR C O

NH2 R'

NH

C

O

NH

R1 R2NH2

NCH3C

NH

O

R1

H

1.5 eq. +

CHCl3, RT, 3h

1 eq.

NH N

NNH

O

O

O

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Attilio Citterio

Sintesi Fluorosa

Fase Fluorosa (C6F12)

Fase Acquosa

Fase alocarburica (CH2Cl2)

D. P. Curran, M. Hoshino, J. Org. Chem., 1996, 61, 6480-6481. D. P. Curran and Z. Luo, Fluorous Synthesis with Fewer Fluorines (Light Fluorous Synthesis): Separation of Tagged from Untagged Products by Solid-Phase Extraction with Fluorous Reverse Phase Silica Gel, J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 9069. http://fluorous.com

Sostituire le resine con sostituenti fluorurati

O S

N+

O-

O

Br

O

O S

N+

O-

O

Br

O

CF3(CF2) n

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Sintesi Parallele Prof. Attilio Citterio Dipartimento CMIC “Giulio Natta” http://iscamap.chem.polimi.it/citterio/education/course-topics/

School of Industrial and Information Engineering Course 096125 (095857)

Introduction to Green and Sustainable Chemistry

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Attilio Citterio

Sintesi Parallele

Obiettivi • Usare una via sintetica standard per produrre una gamma di analoghi,

con un differente analogo in ogni recipiente di reazione, • L'identità di ogni struttura è nota • Utile per produrre un'ampia gamma di analoghi per SAR o

ottimizzazione di prodotto (farmaco) Sintesi parallela automatizzata Sono disponibili sintetizzatori automatici con 42, 96 o 144 recipienti di reazione o postazioni

• Usano palline o spilli per il supporto in fase solida • Le reazioni e le lavorazioni sono condotte automaticamente • La stessa via sintetica usate per ogni recipiente, ma diversi reagenti • Si ottengono prodotti differenti in ogni recipiente

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Attilio Citterio

Sintesi Combinatoria in Soluzione

Sintesi in Soluzione

+ le condizioni di reazione sono di norma più facilmente adattate ad una ampia varietà di sostituenti

+ niente fasi di aggancio e stacco + nessuna limitazione di scala - stretta limitazione nell'eccesso di

reagenti - Sono spesso necessarie estense

e laboriose purificazioni cromatografiche

- di norma parallelizzazione e automazione richiedono più sforzi iniziali

Sintesi in Fase Solida + procedure di purificazione ottenute

per semplice filtrazione che si può facilmente automatizzare

+ si può usare un eccesso di reagenti per spostare le reazioni a termine

+ sintetizzare miscele (separa e combina)

+ facile da automatizzare - Le condizioni di reazione si devono

stabilire caso per caso - La caratterizzazione dei prodotti sulle

palline sono difficili - La chimica sui polimeri è in parte

costosa: polimeri, solventi - Le resine e i linkers limitano il numero

di possibili reazioni (ortogonalità) Sintesi in soluzione è specialmente adatta a brevi sequenze di reazioni: Sintesi "One-pot", reazioni multi-componenti

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Attilio Citterio

Sintesi Parallele in Soluzione

Procedure di lavorazione: Estrazione liquido-solido usando bloccanti legati al polimero • Basi e acidi ausiliari sono legati covalentemente a supporti insolubili • Vantaggio: l'eccesso di reagenti e sottoprodotti si rimuovono per semplice filtrazione

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Sintesi Parallele in Soluzione

Metodi Speciali: reagenti o catalizzatori supportati su polimeri “sintesi Inversa” su fase solida:

D.H. Drewry, D.M. Coe, S. Poon Med. Res. Rev. 19, 97-148 (1999)

bromurazione epossidazione chetoni

ossidanti riducenti

vari misti

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Attrezzature per la CC

L’apparecchiatura varia molto dalla tradizionale di “sintesi organica”.

‘personal synthesizer’ da 24 posizioni basati sulla chimica per reagenti in soluzione e supportati su solidi (provette da 0.3 - 3 ml) che consentono un veloce trasferimento via robot a 24 piatti per bioassaggi. Stazione di reazione a 6 postazioni che opera con reazioni da 6 100 ml in parallelo con agitazione, riscaldamento elettrico a camicia, sotto vuoto o in pressione, adatta per la sintesi parallela di precursori rilevanti.

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Purificazioni in CC e Sintesi Parallele

Sistema per purificazioni parallele di Stacker. Contenitore a 24 postazioni che consente di effettuare filtrazioni, separazioni di fasi e tecniche di estrazioni in Fase Solida (SPE). Opera in abbinamento con i sintetizzatori paralleli personali.

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Attilio Citterio

Sintesi Parallele

Sintesi simultanea di molti prodotti in differenti recipienti di reazione con l’aiuto dell’automazione. (aumento della produttività di 100-volte o più) Ogni pozzetto contiene un composto, e si può identificare dalla sua posizione sulla griglia Es.: Sintesi parallele di una libreria a 96-membri di dipeptidi in un piatto per micro titolazioni a 8 righe e 12 colonne. (vista parziale)

Fase 1: ogni riga parte con un diverso amminoacido legato ad un supporto

Fase 2: ogni colonna aggiunge un secondo amminoacido diverso. (si hanno 96 differenti dipeptidi)

Fase 3: si rimuovono i dipeptidi dal supporto

Fase 4: si testa ogni scomparto per l’attività biologica.

1 Stadio

2 Stadio

3 Stadio

Ala, A

Val, V

Gly, G

A A A

V V V

G G G

Ala, A

Val, V

Gly, G

A A A

V V V

G G G

I S F

F

F

S

S

I

I

I‒A S‒A F‒A

I‒V S‒V F‒V

I‒G S‒G F‒G

Ala, A

Val, V

Gly, G

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Sintetizzatore per Sintesi Automatizzata in Soluzione 1. Sistema ISRA • Requisiti: Tutte le procedure di

una sintesi di laboratorio devono essere automatizzate:

• pesatura, sintesi, lavorazione, analisi HPLC, diario di lab.

• L'automazione di tale processo completo è estremamente difficile. Nessuna soluzione commerciale.

• Vantaggio: completamente automatico, sintesi parallele laboratorio, operativo 24 h al giorno

1 robot 2 HPLC 3 sostegno iniziale 4 sostegno per filtro 5 stazione di filtrazione 6 stazione di chiusura

7 Asta di trasfer. lid 8 magazzino lid 9 stazione essic. 10 colonne essic. 11 sostegno freddo 12 bilancia

13 separazione di fase 14 rivelatore di fase 15 centrifuga 16 stazione hand over 17 evaporatore 18 blocchi reazione

19 stazione pipet. 20 supporto reagenti 21 supporto reagenti 22 HPLC-transfer 23 stazione vortexer

sintesi Lavorazione Analisi

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Robot per Trattamento Liquidi

Valvola a 6-Vie

Siringhe Puntale

10 mL Loop

X Y Z

Deviatori

Baccio Robotico

Sistema Solvente

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Filtrazione

• Rimozione sali • Cattura di

composti covalenti e Ionici

• Rimozione Resina

Piatto Sorgente Piatto di Destinazione

Teste dei Robot

Piatto filtrante

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Estrazioni

Liquido-Liquido

1. Estrattore posizionale a Solvente Pesante

2. Estrattore posizionale a Solvente Leggero

3. Rivelatore di Liquido nell'estrazione a Solvente Leggero

1

2

1 2

3-1 3-2 3-3

3

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Cromatografia e SPE

• Gel di Silice • Gel di Silice Fluoroso

C18

• Scambio Ionico

1. Scioglie i campioni in un adatto solvente

2. Trasferisce a piccole cromatografiche

3. Eluisce i prodotti puliti e/o raccoglie le frazioni

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Depositore Robotico per Piatti da TLC

Macchie rivelate

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Attilio Citterio

Ottimizzazioni di Reazioni e Chimica Combinatoria

• Combinatorial Methods for High-Throughput Materials Science, MRS Proceedings Volume 1024E, Fall 2007

• "Design, Synthesis, and Evaluation of Small-Molecule Libraries.” Ellman, J. A. Acc. Chem. Res. 1996, 29, 132 -143.

• Combinatorial Chemistry, Nicholas K. Terrett, Oxford University Press, London, 1998

• Combinatorial methods for development of sensing materials, Springer, 2009. ISBN 978-0-387-73712-6

• QSAR and Combinatorial Science, 24, Number 1 (Feb. 2005)

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Attilio Citterio

Migliori Processi – Più Controlli anche in Fase di Sviluppo

INTERFACCIA ELETTRONICA

REATTORI ADIABATICI

REATTORI SU SCALA DA BANCO e PILOTA

SINTESI PARALLELE

PC

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Attilio Citterio

Chimica Semi Batch

Sistemi più comuni.

Alimentazione di liquidi automatizzata, controllo di T, P e agitazione, distillazione liquidi.

Interfaccia utente: flessibile, vari sensori

Utili per analisi termodinamiche e di sicurezza (calorimetria, reazioni fuggitive)

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Controllo in Tempo Reale

Visione Grafica

Quadro

MIMIC + Dati

Tabellare

Controllo

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Attilio Citterio

Unità su Scala Pilota

Reattore per alte pressioni da 0.05-20 L.

Continuo e Semi-batch con varie alimentazioni di:

- liquidi volatili - composti piroforici - gas infiammabili

Prerogative - a prova di esplosione

Interfaccia standard. I sistemi di reattori tubulari sono

modulabili e di varie dimensioni e diametri, ingegnerizzati per varie pressioni e temperature.

PARR

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Attilio Citterio

Progettazione Fattoriale (Disegni Sperimentali) nell'Ottimizzazione di Processi Chimici

-2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

-6

-4-2

-2

0 0

0

0 2

2 2

2

2

2

2

4

4

4

6 6

localminimum

localminimum

Disegni sperimentali:

• Progettazione fattoriale completa con repliche

vs. • ANOVA ad Un-Fattore : • Separa la variazione totale

osservata in una serie di misure in: • Variazione in un sistema

• Dovute a errori random di misura

• Variazione tra i sistemi • Dovute alle reali differenze +

errore random

• La variazione(2) è statisticamente maggiore della variazione(1)?

• Disegno sperimentare a Un-fattore.

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Chimica Sintetica Combinatoria Prof. Attilio Citterio Dipartimento CMIC “Giulio Natta” http://iscamap.chem.polimi.it/citterio/education/course-topics/

School of Industrial and Information Engineering Course 096125 (095857)

Introduction to Green and Sustainable Chemistry

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Attilio Citterio

Chimica Combinatoria: Esplorazione della Diversità Molecolare

Consiste nella progettazione e preparazione di “librerie” (“libraries”) di prodotti a struttura simile, basate su di una molecola modello (“lead”), in modo da poter verificarne le proprietà biologiche e nell'ottimizzazione delle stesse per sviluppare nuovi farmaci nell’industria farmaceutica. Si tratta di una strategia con cui si possono preparare potenzialmente un gran numero di composti in modo rapido e simultaneo (“libraries”), oltre che singoli prodotti (“parallel synthesis”) o come miscele di essi (“combinatorial synthesis”), mediante la combinazione di un gruppo o gruppi di reattivi in solo pochi stadi sintetici consistenti in trattamenti di dissoluzione o adsorbimento in fase solida, che permette una delucidazione strutturale rapida (“deconvolution and tagging”), un riconoscimento accelerato delle relazioni struttura-attività (“SAR”) e la possibilità di automatizzazione. Tecnica inventata nei tardi anni 1980 e inizio anni 1990.

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Attilio Citterio

Approccio alla Sintesi Combinatoriale

+ +

Identificazione di un Target Biologico

Sviluppo di un saggio

Screening ad alto rendimento

Selezione

Struttura capofila

Ottimizzazione capofila

Sviluppo

Librerie Random

Chimica Combinatoriale

Librarie Mirate

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Attilio Citterio

Sintesi Combinatoriali

• Si effettuano reazioni multiple in un unico recipiente, generando un’ampia varietà di diversi prodotti noti come libreria combinatoriale. Normalmente la reazione è la stessa, ma i reagenti sono differenti. Il numero dei composti possibili è: b·x (x = N° degli stadi)

• Progettazione della sintesi combinatoriale: sequenziale (a) o templata (b)

• La generazione sintetica della diversità molecolare era concettualmente e sperimentalmente radicata nella sintesi in fase solida di peptidi: La sua estensione ad altre classi di molecole organiche si è avuta solo dopo il 1990.

A B C

Libraria Lineare Libraria a Templato

A

B

C

templato

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Attilio Citterio

Sintesi Combinatoria

Fonte di Diversità Chimica :

Illimitata !

Nessuna variazione

consentita

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Attilio Citterio

Sintesi Combiatoriale Mista

Obiettivi: • Usare una via sintetica standard per produrre un'ampia gamma di

diversi analoghi dove ciascun recipiente di reazione contiene una miscela di prodotti

• Le identità delle strutture in ogni recipiente non sono note con certezza

• Utile per trovare un composto capostipite ("lead") • Capace di sintetizzare un gran numero di composti velocemente • Ogni miscela è testata per l'attività come miscela • Le miscele inattive sono conservate in librerie combinatoriali • Le miscele attive sono studiate ulteriormente per identificare il/i

componenti attivi.

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Attilio Citterio

Approccio Cambinatoriale

Sintesi combinatoriale

103-104 composti/esperimento

Sintesi tradizionale

1 chimico = 50 composti/l’anno

A + B AB A1 B1 A2 B2

A3 B3

. .

. .

An Bm n m prodotti

B1 B2 Bm

A2

A1

An

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Attilio Citterio

Analisi Multi Stadio

Vaglio di Primo Stadio Test per solo una o due proprietà

Vaglio di Secondo Stadio Test per altre proprietà chiave

Materiali Rapidamente Identificati Campioni con proprietà attese

Candidati per Scale-up I materiali più promettenti si usano in esperimenti su scala pilota

Screening ad Alta Efficienza che Usa Metodi Combinatoriali

Screening Convenzionale che Usa Metodi Consolidati

100-1000 campioni alla set.

10-100 campioni alla settimana

1-10 campioni alla settimana

1-2 campioni al mese

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Attilio Citterio

Strategie Sperimentali: Sintesi Organica Combinatoria

• Si calcolano i descrittori strutturali per ogni composto • Si calcolano i coefficienti di similarità tra coppie di

composti • Si scelgono i composti con l'ausilio di metodi multivariati

(basati su vicinanza, dissimilarità, ecc.)

Possibile perché l'obiettivo è un solo composto

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Attilio Citterio

Sintesi Combinatoria Mista

La procedura del Metodo Combinatoria "Mix and Split" implica cinque sintesi separate usando come strategia quella di mescolare e separare. Esempio – La sintesi di tutti i possibili tripeptidi usa 3 amminoacidi (il metodo Standard avrebbe implicato 25 sintesi separate).

"Ricombinare" RIUNIRE

"Accoppiare"

RIUNIRE

Numero di leganti = Nn dove N=numero di molecole di riferimento & n = numero di cicli; Quando N=100 e n=6: le possibili strutture sono 1,000,000,000,000

“Separare" Lam, K. S.; Lebl, M.; Krchn¡ak, V. The “One-Bead-One-Compound” Combinatorial Library Method. Chem. Rev. 1997, 97, 411-448.

27 tripeptidi

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Attilio Citterio

Metodo "Geysen Pin" (per Sintesi Parallele di Peptidi)

Resine legate a spilli in un formato a batteria 8 × 12

Reagenti o solventi di lavaggio in un piatto da 96 postazioni

Immergere per fare le reazioni o lavare le resine

Kit disponibile www.mimotopes.com

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Attilio Citterio

Tecnica delle Bustine da Te ("Tea bag") per la Sintesi Parallela di Peptidi

Richard A. Houghten, PNAS USA 1985, 82, 5131-5135

Lavaggio e deprotezione: condotte assieme Accoppiamento: separare le bustine raggruppando in base all'AA da accoppiare. Ogni gruppo è accoppiato separatamente

LATO FRONTE

Etichetta

Resina

Chiusura

Apertura a rete

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Attilio Citterio

Tecnica SPOT per la Sintesi Parallela di Oligonucleotidi

Ronald Frank et al. Nucl. Acids Res. 1983, 11, 4365-4377

Metodo del disco a filtro : un oligo per disco. Lavaggio, deprotezione e ossidazione: Tutto assieme

Accoppiamento: Inserire i dischi in quattro contenitori differenti contenenti i precursori dA, dC, dT, dG In base alla sequenza oligo di ogni disco.

Metodo SPOT : un oligo per disco Lavaggio, deprotezione e ossidazione: tutto assieme

Accoppiamento: Pipettare la soluzione di accoppiamento contenente i precursori dA, dC, dT, dG nei dischi in base alla sequenza.

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Attilio Citterio

Pianificazione di Sintesi Combinatoriali: Scaffolds

• Per esplorare lo spazio conformazionale si usano preferibilmente gli ‘Spider’ scaffolds

• Consentono di variare i gruppi funzionali attorno alla molecola per aumentare la probabilità di trovare adatte interazioni di legame a H

Il peso molecolare degli scaffold deve essere abbastanza basso da permettere delle variazioni di funzionalità, senza dare prodotti con PM > 500.

SITO di LEGAME DEL RECETTORE

regioni di legame

Esplorazione della libreria di composti

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Pianificazione di Sintesi Combinatoriali: Scaffolds (2)

"Scaffolds Tadpole" • variazione limitata a una specifica regione attorni alla molecola • Minore probabilità di interazioni favorevoli con un sito di legame

Scaffolds Privilegiati • scaffolds che sono comuni in chimica farmaceutica e che sono

associati con diversi intervalli di attività • benzodiazepine, idantoine, benzenesolfonammidi, ecc..

'Spider' Scaffold con sostituenti 'dispersi'

'Tadpole' scaffold con sostituenti 'addensati'

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Attilio Citterio

Pianificazione di Sintesi Combinatoriali: Esempi di Librerie di Scaffold

Idantoine β-Lattami Piridine

• Buoni scaffolds • Tipo Spider • Basso peso molecolare • Varietà di vie sintetiche disponibili

Dipeptidi

Benzodiazepine

N

Ar

O

R'

R

N

NO

OR4

R3R2

R1 NO

R1R2 R3 R4

R5 NR

O

R2

R3

HOOC

Me

ON

N

O

O

R1

R2

R3 R4

R5

R6

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Attilio Citterio

Glucosio

Tipo Spider e basso MW - buone premesse Ma gruppi OH multipli Difficile variare R1-R5 indipendentemente

Steroide

MW relativamente alto Limitato N° di gruppi funzionali per avere MW < 500 Relativamente poche posizioni su cui legare facilmente i sostituenti

Indolo

Scaffold tipo Tadpole Ristretta regione di variabilità

Pianificazione di Sintesi Combinatoriali: Scaffolds - cattivi esempi

O

O

H

H

O

H

O

O HH

HH

O R1

R2

R3R4

R5

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Attilio Citterio

Chimica Combinatoria

Ricerca bersaglio Ricerca capostipite

Libreria Random

5000 composti

HTS: 1° Bersaglio

EC50 10 µM

Libreria Mirata

500 composti

Struttura Bersaglio

EC50 20 nM

Programma Finale di Ottimizzazione

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Attilio Citterio

Chimica Combinatoria Dinamica: Esempio - Leganti per l'anidrasi carbonica

• Reazione - formazione reversibile di immine

• Reazione condotta in presenza di anidrasi carbonica • Tre aldeidi e quattro ammine presenti come precursori modello • Il sodio cianoboroidruro aggiunto per ‘congelare’ la miscela

• Prodotti quantificati e identificati • Gli esperimenti sono ripetuti in assenza del target per identificare

il/i prodotto(i) amplificati • Il prodotto amplificato non è necessariamente presente in grandi

quantità.

Immina Ammina secondaria

Immina Aimmna primaria

Aldeide H

RO NH2 R'

H

RN

R'+

H

RN

R'NH

R

H R'

NaBH3CN

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Attilio Citterio

Chimica Combinatoria Dinamica: Esempio - Leganti per l'anidrasi carbonica

Substrati modello indagati

prodotto amplificato

Composto Attivo

NaBH3CN

Ammina secondaria Derivata

Aldeidi ammine

O CHOHO3S

S

O

O

NH2 CHOCHO

HOOC

NH2

NH2

O

OO

NHNH2

NH2

NHO

NH2

HOOC

NS

O

O

NH2

NH

S

O

O

NH2

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Attilio Citterio

Screening ad Alta Produttività

Sistemi di screening molecolare • Parametro da misurare: Legame

recettore legante anticorpo antigene DNA proteina che lega il DNA

• Parametro da misurare: funzione enzimatica Turnover del substrato Modifiche di una molecola target

Sistemi di screening subcellulari Interazioni o saggi enzimatici con componenti subcellulari quali preparazioni di membrane o frazioni cellulari

Sistemi di screening cellulari • Parametri da misurare: Eventi Cellulari

Secrezione Attivazione di flussi intracellulari di ioni Generazione di molecole messaggere Stimolo dell'espressione genica

Significativamente più complesso

Riduzionismo: esplorazione di problemi complessi

per riduzione a parti semplici Animali

Organi

Tessuti

Cellule

Organelli

Molecole

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Attilio Citterio

Bibliografia CC

1. Comprehensive survey of combinatorial library synthesis: 1998, 1999, 2000, And 2001, 2002, 2004, 2005, 2006, J. Comb. Chem.

2. Combinatorial Peptide and Nonpeptide Libraries, A Handbook, Ed. Gunther Jung, 1996, VCH, Weinheim, New York, Basel

3. Combinatorial chemistry : synthesis and application / edited by Stephen R. Wilson, Anthony W. Czarnik. New York ; Chichester : Wiley, 1997.

4. Combinatorial Chemistry and Molecular Diversity in Drug Discovery; Gordon, E. M.; Kerwin, J. F., Eds.; Wiley-Liss: New York, NY, 1998.

5. Combinatorial Chemistry-Synthesis, Analysis, Screening, Ed. Gunther Jung, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, 1999.

6. Combinatorial strategies in biology and chemistry / Annette Beck-Sickinger, Peter Weber, translated by Michael Soderman and Allan Wier. New York : Wiley, 2002.

7. Experimental design for combinatorial and high throughput materials development / James N. Cawse. New York, Chichester : Wiley, 2002.

8. Sherrington, D. C. (2001). "Polymer-supported reagents, catalysts, and sorbents: Evolution and exploitation - A personalized view.“ Journal of Polymer Science Part a-Polymer Chemistry 39(14): 2364-2377.

9. D. Hudson. Matrix assisted synthetic transformation: a mosaic of diverse Contributions. II. The pattern is completed. J. Comb. Chem. 1999, 1, 403-457.


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