- Sintesi Parallele - Chimica Combinatoriale - Ottimizzazione di Processo Prof. Attilio Citterio Dipartimento CMIC “Giulio Natta” http://iscamap.chem.polimi.it/citterio/education/course-topics/
School of Industrial and Information Engineering Course 096125 (095857)
Introduction to Green and Sustainable Chemistry
Attilio Citterio
Chimica Combinatoria e Selezione ad Alta Produttività
1. Tecniche in Fase Solida 1.1. Vantaggi 1.2. Requisiti 1.3. Esempi di Supporti Solidi 1.4. Spaziatori e leganti
1.4.1. Resine Merrifield per la sintesi peptidica (gruppo clorometile) 1.4.2. Resine Wang e Rink 1.4.3. Resine diiidropiraniche
2. Sintesi Parallele 2.1. Procedure di Houghton delle Bustine di te 2.2. Sintesi parallela automatizzata 2.3. Tecnica "split and pool"
3. Sintesi Combinatoriale Mista 4. Sintesi in fase soluzione
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Passi Chiave nella Sperimentazione
• Preparazione robotica del campione • Miniaturizzazione dei reattori • Alto livello di automatizzazione dei sensori • Industria farmaceutica:
• creazione e analisi di routine da 1000 a 1000000 composti distinti (librerie)
• Queste tecniche sono ora anche applicate nello sviluppo di materiali
• Nuove aziende: • Symyx (www.symyx.com ) • Avantium (www.avantium.com )
Attilio Citterio
Analisi ad Alta Produttività
• Ciclo tipico di sperimentazione: – Migliaia di reazioni in poche ore – Poche ore di analisi statistica – Migliaia di reazioni in poche ore – Poche ore di analisi statistica – ---
• Si possono sviluppare nuovi composti chimici in 3 settimane anziché in 3 anni
• Quali tecniche statistiche sono importanti? • Come si confrontano le tecniche classiche degli studi precedenti? • Quali nuove tecniche sono necessarie?
Attilio Citterio
Chimica Combinatoria - Una Rassegna Storica
1. Sintesi in fase Solida di peptidi
2. Sintesi in fase Solida di oligodeossiribonucleotidi
3. Intesi tradizionale vs. combinatoria :
Mario Geysen: tecnica Multipin
Richard Houghton: tecnica "Tea bag"
Ronald Frank: tecnica SPOT
John Ellman: Prima sintesi combinatoria di piccoli composti eterociclici
4. Concetti base della chimica combinatoria
5. Chimica combinatoria nello sviluppo di farmaci
Attilio Citterio
1. Sintesi in Fase Solida di Peptidi (SPPS) col Metodo Boc
SPPS: sviluppata da Merrifield, un
premio Nobel.
Sintesi in Fase Solida vs. sintesi tradizionale in soluzione :
1. Facile purificazione del prodotto, specialmente adatta alle sintesi a tanti stadi
2. Reazione eterogenea: le reazioni sono più lente e meno efficienti delle reazioni in soluzione.
Amminoacido1 protetto Resina reattiva
Ancoraggio
Deprotezione con
Accoppiamento Amminoacido2 protetto
+ DCC
Deprotezioni sequenziali e stadi di accoppiamento
Rilascio con HF
Attilio Citterio
Sintesi in Fase Solida di Peptidi (SPPS) col Metodo Fmoc
AA X R
O
NH2
AA X R
O
AAFmocHN
TFA
FmocNH-AA-COOHDCC, HBTU
X R
ONH
NH
O R1
R2O
FmocHN
Rn
SPPS
20% piperidina
Metodo Fmoc
Deprotezione Fmoc
H
O NH
O
NH
OO
NH + CO2 + RNH2
NH
N
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Sintesi Chimica di Oligos del DNA
Stadio 1: Deprotezione terminale : pochi min. CCl3COOH(TCA) o CHCl2COOH(DCA)
Stadio 2: Accoppiamento: 2-3 min. Stadio 3: Ossidazione: I2, pochi min. Stadio 4: Protezione: per bloccare il 5’-OH Ac2O, lutidina, N-metilimidazolo, THF
Deprotezione: 30% NH4OH, 5h a 50°C Purificazione: HPLC, elettroforesi, Scambio ionico, ecc.
H3CO
OCH3
DMTr
O
O
R1OP
O NHDMTrO
B2
O NH
B1
O
S
O
O
O
OR1
P
O NHDMTrO
B2
O NH
B1
O
S
I2, Lutidina
H2O, THF
O
O
R1OP
O NHDMTrO
B2
O NH
B1
O
S
TetrazoloN
O
R1OP
O NHDMTrO
B2
R2
R2
+N
N
NH
N
OHO NH
B1
O
S
+N
NN
N
O
R1OP
O NHDMTrO
B2
R1= β-cianoetil B = gruppo base S = fase solida
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Ciclo Sintetico
Attilio Citterio
Tecnica Multipin per la Sintesi Parallela di Peptidi
Geysen, HM; Rodda, HM; Mason, TJ. The delineation of peptides able to mimick assembled epitopes. In Synthetic Peptides as Antigens. Ciba Foundation Symposium 119; Porter, R., Wheelan, J., Eds.; Wiley: New York, 1986; pp131-149
Lavaggio e deprotezione in un grande pentola
Accoppiamento: uso di un Dispositivo a 96 pozzetti Il reagente AA protetto in ciascun pozzetto dipende dalla sequenza del peptide di interesse sulla punta a cui corrisponde.
10-50 nmoli di peptide legato covalentemente
Punte di polipropilene derivatizzato con acido acrilico
Spaziatore Fmoc-b-alanina-esametilendiammina
Attilio Citterio
Sintesi Classica vs. Approccio a Sintesi Combinatoria
Sintesi "Classica"
+ +
" Approccio a Chimica Combinatoria"
+ +
Attilio Citterio
Esempio di Diversità Molecolare e Sintesi
Tetra-peptide: H2N-A-B-C-D-CO2H si consideri solo i 20 amino acidi naturali (serie L)
204 = 160,000 differenti tetra-peptidi ! ora si includa i 19 amino acidi D (20 L + 19 D = 39)
394 = 2.3 milioni di tetra-peptidi differenti!! ora si includa 20 amino acidi non naturali
594 = 12 milioni di tetra-peptidi differenti !!!! Chimica Combinatoria: metodologia con cui si può preparare e valutare
una famiglia (libreria) di composti correlati (per struttura e sintesi) Per le sintesi multi-stadio, si deve usare l’approccio sintetico in
esperimenti in parallelo oppure utilizzando una fase solida per velocizzare la purificazione degli intermedi
Attilio Citterio
Chimica Combinatoriale nella Progettazione di Farmaci
Scoperta Capostipite
Ottimizzazione Struttura
Sviluppo Candidato
Farmaco
Target Terapeutico
La Chimica Combinatoriale opera qui
Attilio Citterio
Industria Farmaceutica – Scoperta di Farmaci
Identificazione prodotto guida : letteratura (aperta e brevettuale) natura (prodotti naturali)
Attenta ottimizzazione di una struttura guida tramite sintesi chimica “tipico: metile-etile-butile-futile”
N° farmaci commercializzabili per composti sottoposti a test biologico preliminare
1 10,000
Progettazione razionale Chimica combinatoria
Composto Guida (lead)
ottimizzazione
(sintesi) Farmaco
10 anni
400 – 800 milioni di $
$ $ $
Sintesi Organica in Fase Solida - Catalisi su Supporti Polimerici Prof. Attilio Citterio Dipartimento CMIC “Giulio Natta” http://iscamap.chem.polimi.it/citterio/education/course-topics
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Introduction to Green and Sustainable Chemistry
Attilio Citterio
Sintesi Organica in Fase Solida (SPOS)
La sintesi in fase solida è una metodologia che consente di realizzare trasformazioni chimiche con l'ausilio di un polimero insolubile. Perciò, è anche nota come sintesi assistita da polimeri e, quando si applica alla chimica organica, essa assume l'acronimo di “SPOS” = Solid-Phase Organic Synthesis.
L'approccio fu introdotto da R. B. Merrifield, Premio Nobel per la Chimica nel 1984. R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149
O NH
CH3 CH3
OCBz
ClNO2 NO2
NH
CH3 CH3
CO2NHEt3BzC
O NH2
CH3 CH3
O
NO2
NH CO2HBzC
O NH NHO
CH3 CH3
OCBz OH NH
NH NH NH2
CH3
CH3
OCH3
O
OCH3CH3
O
HeatingDeprotection
Coupling
1) HBr/AcOH
DCC
Deprotection,Neutralizationand Coupling
L-leu-L-ala-gly-L-val
2) Et3NNeutralization
Attilio Citterio
Tecniche in Fase Solida
• I reagenti sono legati a una superficie polimerica e modificati mentre sono ancora legati. Si rilascia il prodotto finale alla fine della sintesi.
Vantaggi • Si possono legare reagenti specifici a specifici supporti a palline • I supporti si possono mescolare e far reagire nello stesso contenitore • I prodotti formati sono specifici per ogni pallina e fisicamente distinti • Si possono usare reagenti in eccesso per spingere le reazioni a completezza
e questi possono essere facilmente rimossi • Gli intermedi di reazione stanno sulle palline e non si devono isolare/purificare • Si possono separare le singole palline per isolare singoli prodotti • Il supporto polimerico si può rigenerare e ri-usare dopo distacco del prodotto
Requisiti • Una pallina di resina o una superfice funzionalizzata agisce da supporto solido • Uno spaziatore e un legante (gruppi protettivi per i gruppi funz. Non implicati) • Un legame che lega il substrato al legante. Il legame deve essere stabile. • Un mezzo per staccare il prodotto dal legante alla fine. • E' possibile automatizzare il tutto.
Attilio Citterio
Tecniche in Fase Solida
Esempi di Supporti Solidi
• Palline di polistirene parzialmente reticolato di natura idrofobica causano problemi nella sintesi peptidica per il "folding" dei peptidi
• La resina poliammidica di Sheppard è più polare
• La resina Tentagel ha un intorno simile all'etere o al THF
• Palline, punte e superfici di vetro funzionalizzate
Le palline devono essere in grado di rigonfiarsi nel solvente usato, e rimanere stabili La maggior parte delle reazioni avvengono all'interno delle resine.
Rigonfiamento indotto dal solvente
Attilio Citterio
Struttura di un Polimero per SPOS
Supporto Solido (nocciolo)
Spaziatore Scaffold
Il materiale si può distinguere in quattro componenti differenziate :
Il nocciolo è normalmente un polimero reticolato all'1% insolubile. Tipici sono i copolimeri del polistirene e divinilbenzene eventualmente con polietielenglicol. Spaziatore: se presente, è comunemente un frammento molecolare (tipico il polietilenglicol) che connette il supporto solido al legante attraverso un legame covalente. Da più reattività tipo soluzione con minor carico di resina Legante, se presente, fornisce un metodo ortogonale al rilascio dello scaffold Scaffold è la parte che si è interessati a far intervenire nella chimica e che rilascia il prodotto alla fine della sintesi. .
Legante
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Scaffolds e Gruppi Terminali Funzionali Reattivi
Polimeri Reattivi per la Sintesi Organica in Fase Solida
+ A + B + C
+ A + B + B A
A, B e D
C
A) Catalizzatore B) Ossidante C) “Bloccante” D) Ausiliario Chirale
N O
O Ph
Attilio Citterio
Vantaggi della SPOS
C'è una serie di ragioni di base che rendono la SPOS una metodologia vantaggiosa in confronto alla classica sintesi in fase liquida :
1. Procedure di reazioni semplificate: la purificazione dei prodotti di reazione si può fare per semplice filtrazione e lavaggio della resina.
2. Influenza termodinamica e cinetica sul corso della reazione: consente di usare un largo eccesso di reattivo in soluzione (gruppi protettivi polimerici) o su resina (polimerico reattivo), con alta resa di reazione.
3. Rigenerazione della resina: La resina o il reattivo polimerico si possono rigenerare per essere usati in una nuova reazione.
4. Principio dell'alta diluizione: Controllando la capacità equivalente della resina (< 0.8 mmol/g), si possono eliminare reazioni indesiderate di accoppiamento e favorire le reazioni di ciclizzazione intramolecolare.
5. E' possibile automatizzare le procedure: l'automazione si usa tipicamente nelle tecniche di Chimica Combinatoria e nella tecnica di Array in Fase Soluzione.
Attilio Citterio
Svantaggi della SPOS
I principali svantaggi della chimica assistita da polimeri sono: 1. Sviluppo di un metodo sintetico: Essendo una reazione solido-liquido
(controllata cineticamente dalla diffusione reattiva nei poro del polimero) e avvenendo su un supporto solido (che deve essere stabile), le condizioni di reazione in soluzione non possono essere direttamente applicate, perciò si devono ottimizzare (scegliendo dei gruppi protettivi polimerici).
2. Limiti dei supporti solidi e dei “linkers”: I “linkers” e i supporti solidi, benché sviluppati commercialmente, sono in numero limitato.
3. Monitoraggio delle reazioni: Usando gruppi protettivi polimerici, i tempi reali di monitoraggio delle reazioni sono limitati in quanto il prodotto che si forma rimane legato al polimero.
4. Stadi sintetici aggiuntivi: Lavorando con reazioni di addizione-eliminazione, si devono aggiungere più stadi alla sintesi tradizionale in soluzione. Il processo ha bassa EA e numerosi scarti.
5. Scala: Generalmente il metodo si applica alla sintesi di campioni di prodotto inferiore a 1 g, ma in alcuni casi lo si è applicato in fase di produzione.
Attilio Citterio
Tipi di Supporto Solido
Si usano supporti polimerici per immobilizzare i substrati, reagenti e catalizzatori. Il supporto polimerico nella maggior parte dei casi è insolubile, ma talvolta si usano polimeri solubili. I polimeri usati nelle sintesi di molecole organiche appartengono a quattro classi :
1) Polimeri organici reticolati: sono insolubili in solventi organici e possono essere micro-porosi o macro-porosi (per es. Polistirene).
2) Polimeri organici lineari: solubili in solventi organici e insolubili in altri da cui si possono precipitare (per es. Polietilenglicol).
3) Dendrimeri: la cui solubilità dipende dalla polarità e forma 4) Supporti inorganici : vetro poroso, silice, allumina, argille, grafite.
Attilio Citterio
Tipi di Supporto
I supporti costituiti da polimeri organici reticolati sono i più comuni: I due tipi di supporto per lo più usati nelle applicazioni sono:
• poli(stirene-co-divinilbenzene) PS-DVB • 2) poli(etilenglicol-co-stirene-co-divinilbenzene) PEG-PS-DVB
X (CH2) -(OCH2CH2) -OCH2CH2-X
X = Cl (Merrifield), OH, NH2
PS-DVB PEG-PS-DVB
X = Br, OH, NH2, SH, COOH
Dimensione: 100-200 mesh (75-15 µm)200-400 mesh (38-75 µm)
100-200 mesh (75-15 µm)
Capacità Equivalente: 0,5-4 mmol/g 0,2-0,5 mmol/g
CompatibilitàChimica:
DMF, DCM, THF,Toluene.Termicamente stabileIncomplatibile con solventi protici
Solventi protice e non protici
PS PSm n
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Polistirene Reticolato
Il supporto polimerico più usato nella sintesi organica in fase solida è il poli(stirene-co-divinilbenzene).
Il principale problema presentato da questo polimero per il suo impiego in sintesi è la sua disomogeneità.
miscela commerciale
impurezze
+
+
+
+
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Origine della Disomogeneità
1. Differente reattività del m-DVB e del p-DVB: Per quanto riguarda il primo gruppo vinile, l'isomero meta reagisce con lo
stirene più velocemente dell'isomero para. Il p-DVB reagisce meglio con sé stesso (microstruttura densa). Per quanto riguarda il secondo gruppo vinile, il m-DVB reagisce ad una
velocità simile a quella dello stirene, e si inserisce più regolarmente.
2. Modifiche del polimero dopo la sua sintesi: Lavando il polimero con buoni solventi lo si secca con collasso dei pori. Lavando il polimero con cattivi solventi lo si secca con pori più grandi.
Regioni dense ricche in monomero para
Regioni omogenee ma spaziate dal monomero meta
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Sintesi del Polistirene Reticolato
La tecnica preferita per la formazione di resine per sintesi è la polimerizzazione in sospensione. Essa differisce dalle altre tecniche: È un sistema bifasico : fase monomero (costituita dal monomero e dal
solvente organico –”porogeno”-) e la fase acquosa. Utilizza uno stabilizzante come additivo: una miscela di sali inorganici e
specie organiche polari (polivinilalcol), per abbassare la tensione superficiale delle gocce e inibire la loro aggregazione.
Produce delle sfere quasi perfette. formando gocce di monomero in fase acquosa (sotto agitazione meccanica).
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Proprietà del Polistirene Reticolato
Il “Rigonfiamento” di un polimero reticolato è equivalente alla solvatazione di un polimero lineare: Il solvente penetra nel polimero
reticolato e occupa gli interstizi tra le catene di polimero, facendo aumentare il volume.
La reticolazione del polimero crea come una trama che previene il movimento delle catene del polimero necessarie a formare una soluzione.
Il polimero rigonfiato è il reale solvente della reazione in fase solida, ma presenta un'alta viscosità.
• Non c'è relazione diretta tra la quantità e la cinetica della reazione di imbibizione.
• Il grado di reticolazione ha un grande impatto sulla capacità di imbibizione tramite l'entropia configurazionale dissipata. Un'elevata reticolazione rende più rigido il polimero, l'entropia dissipata è inferiore e l'imbibizione è difficile.
Attilio Citterio
Resine Polistireniche Derivatizzate
L'uso di Resine Polistireniche Derivatizzate è stato introdotto perché lo scheletro alchilico è chimicamente inerte mentre gli anelli benzenici sono reattivi e si possono modificare facilmente (per sostituzione elettrofila aromatica (per es. clorometilazione) o sostituzione nucleofila (litiazioni)). Inoltre, sono disponibili molti monomeri stirenici funzionalizzati poco costosi.
Metodo A: ha il vantaggio di far reagire solo anelli e posizioni di ugual accessibilità. Lo svantaggio è che le reazioni sono lente e difficili da seguire con problemi di resa e sottoprodotti.
Metodo B: Assicura l'esatta posizione della funzionalizzazione e un altro grado di sostituzione, ma richiede la sintesi di appropriati monomeri.
GF
GF
+
+ +
A
B
PS PS CH2ClCH3OCH2Cl
Lewis acid
Lewis acid: SnCl4; ZnCl2; BF3.OEt3costant behavior needs 19%Cl
para-/orto-: 95:5
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Resine Polistireniche Derivatizzate
Ottenibili per funzionalizzazione del clorometilpolistirene:
Cl
N
O
O
NH2
OCH3
O
OH
1)
3)
4)
6)
5)
2)
PS
PS
PS S
CH3
O
CN
SH
COOH
COCl
CHO
PPh2
7) 8)
9) 10)
11)12)
14)
13)
PS
PS
PS
PS
PS
PS
PS
PS
PS
1) Potassio ftalimmide, DMF; 2) NH2NH2, EtOH; 3) NH3, DCM; 4) KOAc, DMA, 85 ºC, 24h; 5) HAL, etere, 4h; 6) KOH, 1-pentanolo, riflusso, 24h; 7) KSAc, DMF; 8) LiBH4, etere; 9) NaCN, DMF, H2O, 120 ºC, 20h; 10) H2SO4, AcOH, H2O, 120 ºC, 10h; 11) SOCl2, toluene, 110 ºC, 24h; 12) DMSO, NaHCO3, 155 ºC, 6h; 13) m-CPBA, DME, 55 ºC, 19h; 14) ClPPh2, Li, THF.
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Linkers nelle Sintesi SPOS
Cl
Altri leganti
Linker Tritile
linker Sieber protetto
linker Rink ammide protetta
ONHFmoc
O
OOH OMe
OMe
O
NHFmocOMe
OMelinker Rink acido
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Linkers nelle Sintesi SPOS
Linker a presa sicura
stabile labile
+ CH2N2 → R = CH3: labile
S O R S O RO O
SO O
base+ R-OH
Linker senza traccia (a presa sicura)
NH
NH
O NH2
NH
O R
Cu(OAc)2 + N2 +
R = H: stabile
NH
O
SNR
O
Product
O O
OH-
HNR1R2
product-COOH
product-CONR1R2
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Sintesi in Fase Solida : Gruppi Protettori
I gruppi protettori usati nella sintesi in fase solida sono pochi. Per ammine.
Boc (t-butossicarbonile) Fmoc (9-fluorenilmetossicarbonile) Tmsec (2-[ trimetilsilil ]etossicarbonile)
Per acidi carbossilici.
Tert-Butil estere (t-butil estere) Fm estere (9-fluorenilmetil estere) Tmse estere (2-[trimetilsilil]etil estere)
Attilio Citterio
Sintesi in Fase Solida di Peptidi - Stadi Coinvolti
1. L'amminoacido N-protetto (Boc o Fmoc) è attaccato alla resina mediante il terminale C
2. Deproteggere il terminale N 3. Accoppiare: Aggiungere la
soluzione del successivo amminoacido. Lasciare reagire, lavare.
4. Ripetere la deprotezione ed accoppiare con ogni monomero successivo
5. Staccare il peptide dalla resina Nota: sintetizzare da C a N
Schema basato sulla metodologia Merrifield per SPPS basati su Boc
NH CHC OHO
CO
CHNH2
NH CHC O CH2
OCO
CHNHboc
NH2 CHC O CH2
O
NH CH C O CH2
Oboc
Cs+NH CHCO2boc
CH2Cl R
R = polistirene eticolato -
R
Deprotto e neutralizzato condiisopropiletilammina (DIEA)
1) TFA2) DIEA
R
Accoppiamento 1) Boc-NH-CHR2-COOH2) DCC, HOBt
R
Distacco del gruppo protettivo e del dipeptide dalla resina
1) HF2) Purificato via HPLC
dipeptide
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Sintesi in Fase Solida di Peptidi
Accoppiamento
Sblocco finale
Rottura e deprotezione
Peptide sbloccato (prodotto finale)
Sbloccaggio Attivazione
Ripetere gli stadi ad ogni aggiunta di amminoacido
Resina
Amminoacido 1
Amminoacido 2 Gruppo protettore Fmoc
Attivatore
Gruppo protettore in catena (1) Gruppo protettore in catena (2)
Attilio Citterio
Chimica Organica in Fase Solida (Pro/Con)
I prodotti sono insolubili Più facile la manipolazione fisica Più facile purificarli, si possono lavare abbondantemente Si può usare un eccesso di reagenti per spostare le
reazioni a completamento Nessuna reazione bimolecolare (diluzione infinita) Non si possono usare Reagenti in Fase Solida (SPR) Le cinetiche sono modificate (generalmente più lente, più
ampie distribuzioni di velocità, i siti non sono uguali) Richiede nuove metodologie analitiche Richiede una chimica legata (limita le condizioni di
reazione, impone la struttura del prodotto)
Attilio Citterio
Chimica Organica in Fase Soluzione (Array)
Più composti significa meno tempo per composto
Ciò richiede: Buone procedure generalizzate Corte sequenze sintetiche Reazioni ad alta resa Aggiunta stechiometrica di reagenti Richiede lo sviluppo di lavorazioni e metodi di purificazioni in parallelo
I prodotti sono solubili I sottoprodotti e i reagenti in eccesso sono anch'essi solubili e si
accumulano ad ogni stadio L'analisi diretta è molto più facile (tlc, nmr, ms, hplc, lc/ms) Le cinetiche sono uniformi e familiari Si possono usare reagenti in fase solida (SPR) Non è richiesto nessun linkers, meno chimica vincolata.
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Chimica Organica in Fase Soluzione (Array)
Reazioni di Condensazione a Componenti Multipli
Armstrong, R.W., Combs, A.P., Tempest, P.A., Brown, S.D., & Keating, T.A. Acc.. Chem. Res., 29, 123-131 (1996).
NH2
O
NH2
O
O
OR3R2 NH
NHO
O
OR2
R1
R3
O
R3 R4
O
NNH
OR1
R2
R3 R4
R5
NH2
R5
R6
R3
R4 NH
R1
R6
R5
R4R3
R1CHO R5NC
R1CHO
R2NH2
R1CHO
Biginelli
Ugi
GriecoKobayashi
+
+
+
+ +
+
+
NR1
R3 R2
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0
1000+
N° di Composti
tempo
tempo per la fase soliida
Sld P Array
Sld P S&M
Solu P Array 2004
Sintesi Organica Classica
Solu P Array 1996
10,000+
Gli Array in Fase Soluzione o Sintesi Parallele ora dominano
Tendenze negli Ultimi Anni
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Apparati Commerciali per la SPOS
FlexChem www.robsci.com
www.scigene.com
Charybdis Technologies www.spike.cc
Polyfiltronics/Whatman www.whatman.com
MiniBlock www.bohdan.com
www.Autochem.com
Argonaut Quest 210 Nautilus 2400 Trident
Bohdan Ram Tecan Combitec Advanced Chemtech 496 Myriad Core
Modelli base
Apparati Completi
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Metodi di Purificazione
Fase Solida Lavare esaustivamente
Distacco dipendente dal Prodotto
Fase Soluzione – Purificazione Parallela Estrazione
• liquido-liquido, acido/base • SPE, resine bloccanti • Sintesi Fluorosa
Cromatografia
MIP (molecular imprinted polymers)
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Resine Bloccanti
S. W. Kaldor, J. E. Fritz, J. Tang, E. R. McKinney, Biorganic & Med. Chem. Lett., 6, 3041-3044 (1996).
NR C O
NH2 R'
NH
C
O
NH
R1 R2NH2
NCH3C
NH
O
R1
H
1.5 eq. +
CHCl3, RT, 3h
1 eq.
NH N
NNH
O
O
O
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Sintesi Fluorosa
Fase Fluorosa (C6F12)
Fase Acquosa
Fase alocarburica (CH2Cl2)
D. P. Curran, M. Hoshino, J. Org. Chem., 1996, 61, 6480-6481. D. P. Curran and Z. Luo, Fluorous Synthesis with Fewer Fluorines (Light Fluorous Synthesis): Separation of Tagged from Untagged Products by Solid-Phase Extraction with Fluorous Reverse Phase Silica Gel, J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 9069. http://fluorous.com
Sostituire le resine con sostituenti fluorurati
O S
N+
O-
O
Br
O
O S
N+
O-
O
Br
O
CF3(CF2) n
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Sintesi Parallele
Obiettivi • Usare una via sintetica standard per produrre una gamma di analoghi,
con un differente analogo in ogni recipiente di reazione, • L'identità di ogni struttura è nota • Utile per produrre un'ampia gamma di analoghi per SAR o
ottimizzazione di prodotto (farmaco) Sintesi parallela automatizzata Sono disponibili sintetizzatori automatici con 42, 96 o 144 recipienti di reazione o postazioni
• Usano palline o spilli per il supporto in fase solida • Le reazioni e le lavorazioni sono condotte automaticamente • La stessa via sintetica usate per ogni recipiente, ma diversi reagenti • Si ottengono prodotti differenti in ogni recipiente
Attilio Citterio
Sintesi Combinatoria in Soluzione
Sintesi in Soluzione
+ le condizioni di reazione sono di norma più facilmente adattate ad una ampia varietà di sostituenti
+ niente fasi di aggancio e stacco + nessuna limitazione di scala - stretta limitazione nell'eccesso di
reagenti - Sono spesso necessarie estense
e laboriose purificazioni cromatografiche
- di norma parallelizzazione e automazione richiedono più sforzi iniziali
Sintesi in Fase Solida + procedure di purificazione ottenute
per semplice filtrazione che si può facilmente automatizzare
+ si può usare un eccesso di reagenti per spostare le reazioni a termine
+ sintetizzare miscele (separa e combina)
+ facile da automatizzare - Le condizioni di reazione si devono
stabilire caso per caso - La caratterizzazione dei prodotti sulle
palline sono difficili - La chimica sui polimeri è in parte
costosa: polimeri, solventi - Le resine e i linkers limitano il numero
di possibili reazioni (ortogonalità) Sintesi in soluzione è specialmente adatta a brevi sequenze di reazioni: Sintesi "One-pot", reazioni multi-componenti
Attilio Citterio
Sintesi Parallele in Soluzione
Procedure di lavorazione: Estrazione liquido-solido usando bloccanti legati al polimero • Basi e acidi ausiliari sono legati covalentemente a supporti insolubili • Vantaggio: l'eccesso di reagenti e sottoprodotti si rimuovono per semplice filtrazione
Attilio Citterio
Sintesi Parallele in Soluzione
Metodi Speciali: reagenti o catalizzatori supportati su polimeri “sintesi Inversa” su fase solida:
D.H. Drewry, D.M. Coe, S. Poon Med. Res. Rev. 19, 97-148 (1999)
bromurazione epossidazione chetoni
ossidanti riducenti
vari misti
Attilio Citterio
Attrezzature per la CC
L’apparecchiatura varia molto dalla tradizionale di “sintesi organica”.
‘personal synthesizer’ da 24 posizioni basati sulla chimica per reagenti in soluzione e supportati su solidi (provette da 0.3 - 3 ml) che consentono un veloce trasferimento via robot a 24 piatti per bioassaggi. Stazione di reazione a 6 postazioni che opera con reazioni da 6 100 ml in parallelo con agitazione, riscaldamento elettrico a camicia, sotto vuoto o in pressione, adatta per la sintesi parallela di precursori rilevanti.
Attilio Citterio
Purificazioni in CC e Sintesi Parallele
Sistema per purificazioni parallele di Stacker. Contenitore a 24 postazioni che consente di effettuare filtrazioni, separazioni di fasi e tecniche di estrazioni in Fase Solida (SPE). Opera in abbinamento con i sintetizzatori paralleli personali.
Attilio Citterio
Sintesi Parallele
Sintesi simultanea di molti prodotti in differenti recipienti di reazione con l’aiuto dell’automazione. (aumento della produttività di 100-volte o più) Ogni pozzetto contiene un composto, e si può identificare dalla sua posizione sulla griglia Es.: Sintesi parallele di una libreria a 96-membri di dipeptidi in un piatto per micro titolazioni a 8 righe e 12 colonne. (vista parziale)
Fase 1: ogni riga parte con un diverso amminoacido legato ad un supporto
Fase 2: ogni colonna aggiunge un secondo amminoacido diverso. (si hanno 96 differenti dipeptidi)
Fase 3: si rimuovono i dipeptidi dal supporto
Fase 4: si testa ogni scomparto per l’attività biologica.
1 Stadio
2 Stadio
3 Stadio
Ala, A
Val, V
Gly, G
A A A
V V V
G G G
Ala, A
Val, V
Gly, G
A A A
V V V
G G G
I S F
F
F
S
S
I
I
I‒A S‒A F‒A
I‒V S‒V F‒V
I‒G S‒G F‒G
Ala, A
Val, V
Gly, G
Attilio Citterio
Sintetizzatore per Sintesi Automatizzata in Soluzione 1. Sistema ISRA • Requisiti: Tutte le procedure di
una sintesi di laboratorio devono essere automatizzate:
• pesatura, sintesi, lavorazione, analisi HPLC, diario di lab.
• L'automazione di tale processo completo è estremamente difficile. Nessuna soluzione commerciale.
• Vantaggio: completamente automatico, sintesi parallele laboratorio, operativo 24 h al giorno
1 robot 2 HPLC 3 sostegno iniziale 4 sostegno per filtro 5 stazione di filtrazione 6 stazione di chiusura
7 Asta di trasfer. lid 8 magazzino lid 9 stazione essic. 10 colonne essic. 11 sostegno freddo 12 bilancia
13 separazione di fase 14 rivelatore di fase 15 centrifuga 16 stazione hand over 17 evaporatore 18 blocchi reazione
19 stazione pipet. 20 supporto reagenti 21 supporto reagenti 22 HPLC-transfer 23 stazione vortexer
sintesi Lavorazione Analisi
Attilio Citterio
Robot per Trattamento Liquidi
Valvola a 6-Vie
Siringhe Puntale
10 mL Loop
X Y Z
Deviatori
Baccio Robotico
Sistema Solvente
Attilio Citterio
Filtrazione
• Rimozione sali • Cattura di
composti covalenti e Ionici
• Rimozione Resina
Piatto Sorgente Piatto di Destinazione
Teste dei Robot
Piatto filtrante
Attilio Citterio
Estrazioni
Liquido-Liquido
1. Estrattore posizionale a Solvente Pesante
2. Estrattore posizionale a Solvente Leggero
3. Rivelatore di Liquido nell'estrazione a Solvente Leggero
1
2
1 2
3-1 3-2 3-3
3
Attilio Citterio
Cromatografia e SPE
• Gel di Silice • Gel di Silice Fluoroso
C18
• Scambio Ionico
1. Scioglie i campioni in un adatto solvente
2. Trasferisce a piccole cromatografiche
3. Eluisce i prodotti puliti e/o raccoglie le frazioni
Attilio Citterio
Depositore Robotico per Piatti da TLC
Macchie rivelate
Attilio Citterio
Ottimizzazioni di Reazioni e Chimica Combinatoria
• Combinatorial Methods for High-Throughput Materials Science, MRS Proceedings Volume 1024E, Fall 2007
• "Design, Synthesis, and Evaluation of Small-Molecule Libraries.” Ellman, J. A. Acc. Chem. Res. 1996, 29, 132 -143.
• Combinatorial Chemistry, Nicholas K. Terrett, Oxford University Press, London, 1998
• Combinatorial methods for development of sensing materials, Springer, 2009. ISBN 978-0-387-73712-6
• QSAR and Combinatorial Science, 24, Number 1 (Feb. 2005)
Attilio Citterio
Migliori Processi – Più Controlli anche in Fase di Sviluppo
INTERFACCIA ELETTRONICA
REATTORI ADIABATICI
REATTORI SU SCALA DA BANCO e PILOTA
SINTESI PARALLELE
PC
Attilio Citterio
Chimica Semi Batch
Sistemi più comuni.
Alimentazione di liquidi automatizzata, controllo di T, P e agitazione, distillazione liquidi.
Interfaccia utente: flessibile, vari sensori
Utili per analisi termodinamiche e di sicurezza (calorimetria, reazioni fuggitive)
Attilio Citterio
Controllo in Tempo Reale
Visione Grafica
Quadro
MIMIC + Dati
Tabellare
Controllo
Attilio Citterio
Unità su Scala Pilota
Reattore per alte pressioni da 0.05-20 L.
Continuo e Semi-batch con varie alimentazioni di:
- liquidi volatili - composti piroforici - gas infiammabili
Prerogative - a prova di esplosione
Interfaccia standard. I sistemi di reattori tubulari sono
modulabili e di varie dimensioni e diametri, ingegnerizzati per varie pressioni e temperature.
PARR
Attilio Citterio
Progettazione Fattoriale (Disegni Sperimentali) nell'Ottimizzazione di Processi Chimici
-2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2-2
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
-6
-4-2
-2
0 0
0
0 2
2 2
2
2
2
2
4
4
4
6 6
localminimum
localminimum
Disegni sperimentali:
• Progettazione fattoriale completa con repliche
vs. • ANOVA ad Un-Fattore : • Separa la variazione totale
osservata in una serie di misure in: • Variazione in un sistema
• Dovute a errori random di misura
• Variazione tra i sistemi • Dovute alle reali differenze +
errore random
• La variazione(2) è statisticamente maggiore della variazione(1)?
• Disegno sperimentare a Un-fattore.
Chimica Sintetica Combinatoria Prof. Attilio Citterio Dipartimento CMIC “Giulio Natta” http://iscamap.chem.polimi.it/citterio/education/course-topics/
School of Industrial and Information Engineering Course 096125 (095857)
Introduction to Green and Sustainable Chemistry
Attilio Citterio
Chimica Combinatoria: Esplorazione della Diversità Molecolare
Consiste nella progettazione e preparazione di “librerie” (“libraries”) di prodotti a struttura simile, basate su di una molecola modello (“lead”), in modo da poter verificarne le proprietà biologiche e nell'ottimizzazione delle stesse per sviluppare nuovi farmaci nell’industria farmaceutica. Si tratta di una strategia con cui si possono preparare potenzialmente un gran numero di composti in modo rapido e simultaneo (“libraries”), oltre che singoli prodotti (“parallel synthesis”) o come miscele di essi (“combinatorial synthesis”), mediante la combinazione di un gruppo o gruppi di reattivi in solo pochi stadi sintetici consistenti in trattamenti di dissoluzione o adsorbimento in fase solida, che permette una delucidazione strutturale rapida (“deconvolution and tagging”), un riconoscimento accelerato delle relazioni struttura-attività (“SAR”) e la possibilità di automatizzazione. Tecnica inventata nei tardi anni 1980 e inizio anni 1990.
Attilio Citterio
Approccio alla Sintesi Combinatoriale
+ +
Identificazione di un Target Biologico
Sviluppo di un saggio
Screening ad alto rendimento
Selezione
Struttura capofila
Ottimizzazione capofila
Sviluppo
Librerie Random
Chimica Combinatoriale
Librarie Mirate
Attilio Citterio
Sintesi Combinatoriali
• Si effettuano reazioni multiple in un unico recipiente, generando un’ampia varietà di diversi prodotti noti come libreria combinatoriale. Normalmente la reazione è la stessa, ma i reagenti sono differenti. Il numero dei composti possibili è: b·x (x = N° degli stadi)
• Progettazione della sintesi combinatoriale: sequenziale (a) o templata (b)
• La generazione sintetica della diversità molecolare era concettualmente e sperimentalmente radicata nella sintesi in fase solida di peptidi: La sua estensione ad altre classi di molecole organiche si è avuta solo dopo il 1990.
A B C
Libraria Lineare Libraria a Templato
A
B
C
templato
Attilio Citterio
Sintesi Combinatoria
Fonte di Diversità Chimica :
Illimitata !
Nessuna variazione
consentita
Attilio Citterio
Sintesi Combiatoriale Mista
Obiettivi: • Usare una via sintetica standard per produrre un'ampia gamma di
diversi analoghi dove ciascun recipiente di reazione contiene una miscela di prodotti
• Le identità delle strutture in ogni recipiente non sono note con certezza
• Utile per trovare un composto capostipite ("lead") • Capace di sintetizzare un gran numero di composti velocemente • Ogni miscela è testata per l'attività come miscela • Le miscele inattive sono conservate in librerie combinatoriali • Le miscele attive sono studiate ulteriormente per identificare il/i
componenti attivi.
Attilio Citterio
Approccio Cambinatoriale
Sintesi combinatoriale
103-104 composti/esperimento
Sintesi tradizionale
1 chimico = 50 composti/l’anno
A + B AB A1 B1 A2 B2
A3 B3
. .
. .
An Bm n m prodotti
B1 B2 Bm
A2
A1
An
Attilio Citterio
Analisi Multi Stadio
Vaglio di Primo Stadio Test per solo una o due proprietà
Vaglio di Secondo Stadio Test per altre proprietà chiave
Materiali Rapidamente Identificati Campioni con proprietà attese
Candidati per Scale-up I materiali più promettenti si usano in esperimenti su scala pilota
Screening ad Alta Efficienza che Usa Metodi Combinatoriali
Screening Convenzionale che Usa Metodi Consolidati
100-1000 campioni alla set.
10-100 campioni alla settimana
1-10 campioni alla settimana
1-2 campioni al mese
Attilio Citterio
Strategie Sperimentali: Sintesi Organica Combinatoria
• Si calcolano i descrittori strutturali per ogni composto • Si calcolano i coefficienti di similarità tra coppie di
composti • Si scelgono i composti con l'ausilio di metodi multivariati
(basati su vicinanza, dissimilarità, ecc.)
Possibile perché l'obiettivo è un solo composto
Attilio Citterio
Sintesi Combinatoria Mista
La procedura del Metodo Combinatoria "Mix and Split" implica cinque sintesi separate usando come strategia quella di mescolare e separare. Esempio – La sintesi di tutti i possibili tripeptidi usa 3 amminoacidi (il metodo Standard avrebbe implicato 25 sintesi separate).
"Ricombinare" RIUNIRE
"Accoppiare"
RIUNIRE
Numero di leganti = Nn dove N=numero di molecole di riferimento & n = numero di cicli; Quando N=100 e n=6: le possibili strutture sono 1,000,000,000,000
“Separare" Lam, K. S.; Lebl, M.; Krchn¡ak, V. The “One-Bead-One-Compound” Combinatorial Library Method. Chem. Rev. 1997, 97, 411-448.
27 tripeptidi
Attilio Citterio
Metodo "Geysen Pin" (per Sintesi Parallele di Peptidi)
Resine legate a spilli in un formato a batteria 8 × 12
Reagenti o solventi di lavaggio in un piatto da 96 postazioni
Immergere per fare le reazioni o lavare le resine
Kit disponibile www.mimotopes.com
Attilio Citterio
Tecnica delle Bustine da Te ("Tea bag") per la Sintesi Parallela di Peptidi
Richard A. Houghten, PNAS USA 1985, 82, 5131-5135
Lavaggio e deprotezione: condotte assieme Accoppiamento: separare le bustine raggruppando in base all'AA da accoppiare. Ogni gruppo è accoppiato separatamente
LATO FRONTE
Etichetta
Resina
Chiusura
Apertura a rete
Attilio Citterio
Tecnica SPOT per la Sintesi Parallela di Oligonucleotidi
Ronald Frank et al. Nucl. Acids Res. 1983, 11, 4365-4377
Metodo del disco a filtro : un oligo per disco. Lavaggio, deprotezione e ossidazione: Tutto assieme
Accoppiamento: Inserire i dischi in quattro contenitori differenti contenenti i precursori dA, dC, dT, dG In base alla sequenza oligo di ogni disco.
Metodo SPOT : un oligo per disco Lavaggio, deprotezione e ossidazione: tutto assieme
Accoppiamento: Pipettare la soluzione di accoppiamento contenente i precursori dA, dC, dT, dG nei dischi in base alla sequenza.
Attilio Citterio
Pianificazione di Sintesi Combinatoriali: Scaffolds
• Per esplorare lo spazio conformazionale si usano preferibilmente gli ‘Spider’ scaffolds
• Consentono di variare i gruppi funzionali attorno alla molecola per aumentare la probabilità di trovare adatte interazioni di legame a H
Il peso molecolare degli scaffold deve essere abbastanza basso da permettere delle variazioni di funzionalità, senza dare prodotti con PM > 500.
SITO di LEGAME DEL RECETTORE
regioni di legame
Esplorazione della libreria di composti
Attilio Citterio
Pianificazione di Sintesi Combinatoriali: Scaffolds (2)
"Scaffolds Tadpole" • variazione limitata a una specifica regione attorni alla molecola • Minore probabilità di interazioni favorevoli con un sito di legame
Scaffolds Privilegiati • scaffolds che sono comuni in chimica farmaceutica e che sono
associati con diversi intervalli di attività • benzodiazepine, idantoine, benzenesolfonammidi, ecc..
'Spider' Scaffold con sostituenti 'dispersi'
'Tadpole' scaffold con sostituenti 'addensati'
Attilio Citterio
Pianificazione di Sintesi Combinatoriali: Esempi di Librerie di Scaffold
Idantoine β-Lattami Piridine
• Buoni scaffolds • Tipo Spider • Basso peso molecolare • Varietà di vie sintetiche disponibili
Dipeptidi
Benzodiazepine
N
Ar
O
R'
R
N
NO
OR4
R3R2
R1 NO
R1R2 R3 R4
R5 NR
O
R2
R3
HOOC
Me
ON
N
O
O
R1
R2
R3 R4
R5
R6
Attilio Citterio
Glucosio
Tipo Spider e basso MW - buone premesse Ma gruppi OH multipli Difficile variare R1-R5 indipendentemente
Steroide
MW relativamente alto Limitato N° di gruppi funzionali per avere MW < 500 Relativamente poche posizioni su cui legare facilmente i sostituenti
Indolo
Scaffold tipo Tadpole Ristretta regione di variabilità
Pianificazione di Sintesi Combinatoriali: Scaffolds - cattivi esempi
O
O
H
H
O
H
O
O HH
HH
O R1
R2
R3R4
R5
Attilio Citterio
Chimica Combinatoria
Ricerca bersaglio Ricerca capostipite
Libreria Random
5000 composti
HTS: 1° Bersaglio
EC50 10 µM
Libreria Mirata
500 composti
Struttura Bersaglio
EC50 20 nM
Programma Finale di Ottimizzazione
Attilio Citterio
Chimica Combinatoria Dinamica: Esempio - Leganti per l'anidrasi carbonica
• Reazione - formazione reversibile di immine
• Reazione condotta in presenza di anidrasi carbonica • Tre aldeidi e quattro ammine presenti come precursori modello • Il sodio cianoboroidruro aggiunto per ‘congelare’ la miscela
• Prodotti quantificati e identificati • Gli esperimenti sono ripetuti in assenza del target per identificare
il/i prodotto(i) amplificati • Il prodotto amplificato non è necessariamente presente in grandi
quantità.
Immina Ammina secondaria
Immina Aimmna primaria
Aldeide H
RO NH2 R'
H
RN
R'+
H
RN
R'NH
R
H R'
NaBH3CN
Attilio Citterio
Chimica Combinatoria Dinamica: Esempio - Leganti per l'anidrasi carbonica
Substrati modello indagati
prodotto amplificato
Composto Attivo
NaBH3CN
Ammina secondaria Derivata
Aldeidi ammine
O CHOHO3S
S
O
O
NH2 CHOCHO
HOOC
NH2
NH2
O
OO
NHNH2
NH2
NHO
NH2
HOOC
NS
O
O
NH2
NH
S
O
O
NH2
Attilio Citterio
Screening ad Alta Produttività
Sistemi di screening molecolare • Parametro da misurare: Legame
recettore legante anticorpo antigene DNA proteina che lega il DNA
• Parametro da misurare: funzione enzimatica Turnover del substrato Modifiche di una molecola target
Sistemi di screening subcellulari Interazioni o saggi enzimatici con componenti subcellulari quali preparazioni di membrane o frazioni cellulari
Sistemi di screening cellulari • Parametri da misurare: Eventi Cellulari
Secrezione Attivazione di flussi intracellulari di ioni Generazione di molecole messaggere Stimolo dell'espressione genica
Significativamente più complesso
Riduzionismo: esplorazione di problemi complessi
per riduzione a parti semplici Animali
Organi
Tessuti
Cellule
Organelli
Molecole
Attilio Citterio
Bibliografia CC
1. Comprehensive survey of combinatorial library synthesis: 1998, 1999, 2000, And 2001, 2002, 2004, 2005, 2006, J. Comb. Chem.
2. Combinatorial Peptide and Nonpeptide Libraries, A Handbook, Ed. Gunther Jung, 1996, VCH, Weinheim, New York, Basel
3. Combinatorial chemistry : synthesis and application / edited by Stephen R. Wilson, Anthony W. Czarnik. New York ; Chichester : Wiley, 1997.
4. Combinatorial Chemistry and Molecular Diversity in Drug Discovery; Gordon, E. M.; Kerwin, J. F., Eds.; Wiley-Liss: New York, NY, 1998.
5. Combinatorial Chemistry-Synthesis, Analysis, Screening, Ed. Gunther Jung, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, 1999.
6. Combinatorial strategies in biology and chemistry / Annette Beck-Sickinger, Peter Weber, translated by Michael Soderman and Allan Wier. New York : Wiley, 2002.
7. Experimental design for combinatorial and high throughput materials development / James N. Cawse. New York, Chichester : Wiley, 2002.
8. Sherrington, D. C. (2001). "Polymer-supported reagents, catalysts, and sorbents: Evolution and exploitation - A personalized view.“ Journal of Polymer Science Part a-Polymer Chemistry 39(14): 2364-2377.
9. D. Hudson. Matrix assisted synthetic transformation: a mosaic of diverse Contributions. II. The pattern is completed. J. Comb. Chem. 1999, 1, 403-457.
