7/27/2019 Introduction to Enzyme Kinetics.pdf

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From Molecular D i v e r s i t y to C a t a l y s i s :Lessons from the Immune SystemP e t e r G . S c h u l t z and R i c h a r d A . L e r n e r

B y c o m b i n i n g t h e e n o r m o u s m o l e c u l a r d i v e r s i t y o f t h e immune s y s t e m w i t h b a s i c m e c h -a n i s t i c p r i n c i p l e s o f c h e m i s t r y , o n e c a n p r o d u c e c a t a l y t i c a n t i b o d i e s t h a t a l l o w c o n t r o l o fr e a c t i o n s i n w a y s h e r e t o f o r e n o t p o s s i b l e . M e c h a n i s t i c a n d s t r u c t u r a l s t u d i e s o f t h e s ea n t i b o d i e s a r e a l s o p r o v i d i n g i n s i g h t s i n t o i m p o r t a n t a s p e c t s o f e n z y m a t i c c a t a l y s i s a n dt h e e v o l u t i o n o f c a t a l y t i c f u n c t i o n . M o r e o v e r , t h e a b i l i t y t o r a t i o n a l l y d i r e c t t h e immuner e s p o n s e t o g e n e r a t e s e l e c t i v e c a t a l y s t s f o r r e a c t i o n s r a n g i n g f r o m p e r i c y c l i c a n d r e d o xr e a c t i o n s t o c a t i o n i c r e a r r a n g e m e n t r e a c t i o n s u n d e r s c o r e s t h e c h e m i c a l p o t e n t i a l o f t h i sa n d o t h e r l a r g e c o m b i n a t o r i a l l i b r a r i e s .

The r a t i o n a l d e s i g n o f s e l e c t i v e r e c e p t o r sa n d c a t a l y s t s r e m a i n s a c h a l l e n g e f o r c h e m -i s t s a n d b i o c h e m i s t s a l i k e . I n c o n t r a s t , n a -t u r e h a s p r o d u c e d e n z y m e s t h a t c a t a l y z e ah u g e a r r a y o f r e a c t i o n s w i t h e x q u i s i t e s e l e c -t i v i t y a n d a n t i b o d i e s t h a t b i n d v i r t u a l l y a n ym o l e c u l e w i t h h i g h a f f i n i t y . N a t u r e h a ss o l v e d m a n y o f t h e c o m p l e x p r o b l e m s a s s o -c i a t e d w i t h m o l e c u l a r r e c o g n i t i o n a n d c a -t a l y s i s b y g e n e r a t i n g a n d s c r e e n i n g l a r g el i b r a r i e s o f p r o t e i n s , e i t h e r o n a n e v o l u t i o n -a r y t i m e s c a l e o r o v e r t h e c o u r s e o f a f e ww e e k s d u r i n g t h e i m m u n e r e s p o n s e . C a nt h e p r i n c i p l e s a n d t o o l s o f c h e m i s t r y b eu s e d t o g u i d e t h e s e c o m p l e x b i o l o g i c a l p r o -c e s s e s t o g e n e r a t e n e w m o l e c u l e s w i t h n o v -e l f u n c t i o n s ?O n e o f t h e f i r s t e x a m p l e s i n w h i c h t h ec h e m i c a l p o t e n t i a l o f l a r g e l i b r a r i e s w a se x p l o i t e d w a s t h e u s e o f t r a n s i t i o n - s t a t et h e o r y t o s e l e c t c a t a l y s t s f r o m a m o n g t h el a r g e p o p u l a t i o n o f a n t i b o d y m o l e c u l e s( 1 ) . S i n c e t h e s e e a r l y e x p e r i m e n t s , w h i c hi n v o l v e d r e l a t i v e l y s i m p l e t r a n s f o r m a -t i o n s , t h e r e a c t i o n s c a t a l y s e d b y a n t i b o d -i e s h a v e i n c r e a s e d i n c o m p l e x i t y a n d d e -g r e e o f d i f f i c u l t y ( 2 ) . A t t h e s a m e t i m e ,t h e s t r a t e g i e s f o r g e n e r a t i n g a n t i b o d y c a t -a l y s t s h a v e b e c o m e i n c r e a s i n g l y s o p h i s t i -c a t e d . R e c e n t s t r u c t u r a l a n d m e c h a n i s t i cs t u d i e s a r e s h o w i n g t h a t t h e c h e m i c a l n o -t i o n s u s e d t o g e n e r a t e c a t a l y t i c a n t i b o d i e sa r e i n d e e d r e f l e c t e d i n t h e i r a c t i v e s i t es t r u c t u r e s ( 3 - 5 ) . T o d a y , t h e r e i s i n t e r e s ti n s c r e e n i n g l i b r a r i e s n o t o n l y o f a n t i b o d -i e s b u t a l s o o f F a b f r a g m e n t s ( 6 ) , RNAs( 7 ) , p e p t i d e s ( 8 ) , s y n t h e t i c o r g a n i c m o l e -c u l e s ( 9 ) , a n d e v e n s o l i d - s t a t e m a t e r i a l s( 1 0 ) f o r i n t e r e s t i n g p r o p e r t i e s a n d f u n c -t i o n s . T h i s r e v i e w s e t s o u t t o i l l u s t r a t e t h eP . G . S c h u l t z i s a t H o w a r d H u g h es M e d i c a l I n s t i t u t e ,D e p a r t m e n t o f C h e m i s t r y , U n i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a , B e r k e -l e y , CA 9 4 7 2 0 , U S A . R . A . L e r n e r i s a t T h e S c r i p p s R e -s e a r c h I n s t i t u t e , L a J o l l a , CA 9 2 0 3 7 , U S A . T h i s a r t i c l e i sb a s e d o n l e c t u r e s d e l i v e r e d b y b o t h a u t h o r s a t u n i v e r s i -t i e s t h r o u g h o u t I s r a e l i n M a r c h 1 9 9 5 a f t e r t h e y j o i n t l yr e c e i v e d t h e 1 9 9 5 W o l f P r i z e i n C h e m i s t r y .

p r o d u c t i v e i n t e r p l a y o f c h e m i s t r y a n d b i -o l o g y i n g e n e r a t i n g n e w c h e m i c a l f u n c -t i o n f r o m t h e i m m u n e s y s t e m .I m m u n o l o g i c a l V e r s u sN a t u r a l S e l e c t i o n

E v o l v i n g c a t a l y t i c a c t i v i t i e s . T h e i m m u n e s y s -t e m i s c a p a b l e o f b o t h g e n e r a t i n g t r e m e n -d o u s m o l e c u l a r d i v e r s i t y , t h r o u g h t h e c o m -b i n a t o r i a l a s s o c i a t i o n o f v a r i a b l e ( V ) , j o i n -i n g ( J ) , a n d d i v e r s i t y ( D ) g e n e s w i t h s u b s e -q u e n t a f f i n i t y m a t u r a t i o n , a n d r a p i d l ys c r e e n i n g t h i s d i v e r s i t y f o r a d e s i r e d s p e c i -f i c i t y ( 1 1 ) . T h e r e a r e m a n y p a r a l l e l s b e -t w e e n t h e s e p r o c e s s e s a n d t h e n a t u r a l e v o -l u t i o n o f e n z y m e s . H o w e v e r , w h e r e a s a n t i -b o d i e s a r e s e l e c t e d o n t h e b a s i s o f a f f i n i t yf o r s t a b l e a n t i g e n s , e n z y m e s g e n e r a l l ye v o l v e maximum a f f i n i t y f o r h i g h - e n e r g y ,t r a n s i e n t t r a n s i t i o n s t a t e s ( 1 2 ) . C o n s e -q u e n t l y , i n o r d e r t o t a p t h e c a t a l y t i c p o t e n -t i a l o f a n t i b o d i e s , t h e i m m u n e s y s t e m m u s tb e p r o v i d e d w i t h i n f o r m a t i o n r e l a t i n g t ot h e r a t e - l i m i t i n g t r a n s i t i o n s t a t e o f a p a r t i c -u l a r r e a c t i o n . O n e s t r a t e g y f o r a c c o m p l i s h -i n g t h i s i n v o l v e s t h e u s e o f a s t a b l e a n a l o go f t h e t r a n s i t i o n s t a t e ( T S t ) a s t h e i m m u n o -g e n ( 1 ) . T h i s e f f e c t i v e l y d i r e c t s i m m u n o -l o g i c a l e v o l u t i o n a l o n g t h e s a m e p a t h w a y a se n z y m i c e v o l u t i o n ; t h e e n d r e s u l t i s a n a n -t i b o d y w i t h c a t a l y t i c a c t i v i t y .

C o n s i d e r , f o r e x a m p l e , t h e e n z y m e f e r -

r o c h e l a t a s e , w h i c h c a t a l y z e s t h e i n s e r t i o n o fF e 2 + i n t o p r o t o p o r p h y r i n a s p a r t o f t h eh e m e b i o s y n t h e t i c p a t h w a y ( 1 3 ) . A p o t e n ti n h i b i t o r o f t h i s e n z y m e i s t h e b e n t p o r p h y -r i n N - m e t h y l p r o t o p o r p h y r i n ( 1 ) ( 1 4 ) ,w h i c h i s t h o u g h t t o r e s e m b l e t h e t r a n s i t i o ns t a t e f o r p o r p h y r i n m e t a l l a t i o n i n w h i c hd i s t o r t i o n o f t h e m a c r o c y c l i c r i n g s y s t e mf a c i l i t a t e s b i n d i n g o f m e t a l i o n s . C o n s e -q u e n t l y , a n t i b o d i e s g e n e r a t e d a g a i n s t a b e n tN - a l k y l m e s o p o r p h y r i n s h o u l d a c t a s a f e r -r o c h e l a t a s e . T o t e s t t h i s n o t i o n , C o c h r a na n d S c h u l t z g e n e r a t e d m o n o c l o n a l a n t i b o d -i e s a g a i n s t t h e m e s o p o r p h y r i n d e r i v a t i v e 1( F i g . 1 ) ( 1 5 ) , r e s u l t i n g i n t h e i s o l a t i o n o ft h e c a t a l y t i c a n t i b o d y G 1 - A 1 2 . B o t h e n -z y m e a n d a n t i b o d y c a n i n s e r t a v a r i e t y o fd i v a l e n t t r a n s i t i o n m e t a l s [ f o r e x a m p l e ,Z n ( I l ) , C o ( I I ) , C u ( I I ) , a n d M n ( I I ) ] i n t op o r p h y r i n s w i t h s i m i l a r t u r n o v e r n u m b e r s( k r t ) . T h e c a l c u l a t e d v a l u e o f k i l t f o r f e r r o -c h e l a t a s e w i t h Z n ( I I ) i s 8 0 0 h o u r - l , c o m -p a r e d w i t h t h e e x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e dk c l t v a l u e o f 8 0 h o u r - 1 f o r t h e a n t i b o d y( 1 5 ) . T h e r e p o r t e d M i c h a e l i s c o n s t a n t s( K m ) f o r t h e e n z y m e r a n g e f r o m 1 0 t o 7 0F i M , c o m p a r e d w i t h 5 0 F i M d e t e r m i n e d f o rt h e a n t i b o d y ( C u 2 + ) , a n d b o t h t h e e n z y m ea n d a n t i b o d y h a v e c o m p a r a b l e a f f i n i t i e s f o rN - m e t h y l p o r p h y r i n ( 1 3 - 1 5 ) . T h e s e s i m i l a r -i t i e s b e t w e e n a n t i b o d y a n d e n z y m e b o t hs u p p o r t t h e h y p o t h e s i s t h a t t h e e n z y m e h a se v o l v e d t h r o u g h n a t u r a l s e l e c t i o n t o b i n d ad i s t o r t e d h e m e s t r u c t u r e a n d p r o v i d e e v i -d e n c e t h a t t h e i m m u n e r e s p o n s e c a n b es i m i l a r l y d i r e c t e d .P e r h a p s t h e m o s t u b i q u i t o u s a n d w e l l -c h a r a c t e r i z e d c l a s s o f e n z y m e - c a t a l y z e d r e a c -t i o n s a r e t h e a c y l t r a n s f e r r e a c t i o n s . T h e s er e a c t i o n s h av e b ee n a n a t t r a c t i v e t a r g e t f o ra n t i b o d y c a t a l y s i s ( 1 6 , 1 7 ) a n d a g a i n a l l o wu s t o a s s e s s t h e d e g r e e t o w h i c h a n t i b o d i e sc a n r e c a p i t u l a t e t h e p r o p e r t i e s o f e n z y m e s .C o n s i d e r , f o r e x a m p l e , t w o d i f f e r e n t a n t i -

RRCN H Nm2+

N H N - 2 H +

0 OH OH

RR- E N \ \ N R

\ /M\ /N N

0 OH OH

F i g . 1 . A n t i b o d y - c a t a l y z e d p o r p h y r i n m e t a l l a t i o n r e a c t i o n .SCIENCE * V O L . 2 6 9 * 2 9 SEPTEMBER 1 9 9 5 1 8 3 5

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b o d i e s t h a t c a t a l y : e r e l a t e d t r a n s e s t e r i f i - c a -t i o n r e a c t i o n s i n v x l i n g secondaNachl( 1 ( 8 , 1 9 ) . O n e a n t n b o d y w a s r a i s e d a g a i n s tt h e c o r r e s p o n d i n g p h o s p h o n a t e d i e s t e r a n dt h e o t h e r a g a l i n s t a p h s p h o n a t e m o n o e s t e rt r a n s i t i j ( ) n s t a t e a n a l o g . B o t h a n t i b o d i e l i s w e r ef o u n l d t o - i e r e m a r k a b l y e f f i c i e n t c a t a i N s t sw i t h e f f e c t i v e i m o l a r i t i e s ( t h e e t t e c t i v e c o n -c e n t r a t i o n o f s u b s t r a t e i n a n u n c a t a i N y : e d r e -a c t i o n t h a t a f f o r d s t h e s a m i e r a t e a s t h e c a t -a l y : e d r e a c t i o n ) on t h e o r d e r o ) f 5 X 1~t1 0 " M ( 1 8 , 1 9 ) . T h e e f f i c i e n c x , a n d s e l e c t i x li t y o f t h e s e r e a c t i o n s a r e r e f l e c t e d b y t h e t a c tt h a t b o t h a n t i b o d i e s e x c l u d e w a t e r f r o m p a r -t i c i p a t i n g in t h e r e a c t i o n , even t h o u g h w a t e ri s p r e s e n t i n b o t h c a s e s a t a c o n c e n t i a a n o na b o u t 1 0 ) t i m e s t h a t o f t h e more h i n d e r e ds e c o n 1 d a r v a l c o h o l , a c h a r a c t e r i s t i c o f m a n ye n . x r nc a al x ed re ac t io n s. A s i s a l s o t h ec a s e w i t h m a n y a c y l t r a n s f e r e n - x m e s , s u i c ha s t h e s e r i n e , a s p a i r t v l l , a n d m e t a i l l o p 1 - r o t e a s e s ,t h e t w o a n t i b o d ( ) i e s f u i n c t i o n b y means o ) fd i f f e r e n t m e c h a n i s m i s . T h e d i f t e r e n t i a l b i n d -i n g , a f f i n i t y o f o n e a n t i ' b o d y t o t h e p h o s p h o -n a t e c h e s t e r r e l a t i v e t o s u b s t r a t e s a p p e a r s t oa i c c o u n t f o r a l a r g e f r a c t i o n o ~ f t h e c a t a l y t i ca d v a n t a g e , u n d e r s c o r i n g t h e i m p o r t a n c e o fe n t r o p i c f a c t o r s i n b i o l o g i c a l c a t a l y s i s . I nc o n t r a s t , t h e s e c o n d t r a n s e s t e r i f i c a t i o n r e a c -n i o n p r o c e e d s t h i r o u g h l a p i n g - p o n g m e c h a -n i s m n i n v o l v i n g a c o v a l e n t a c x 1 a n t i b o d y ) l ~ i n -t e r m e d l i a l t e ( 1 8 ) . Mroethe f o ( r m a t i o ) n o f -t h e a c \ I i n t e r m e d i a t e a p p e a r s t o d e p e n d onan i n d u c e d f i t p h e n o m e n o n . T h e a b o x v e r e -s t i l t s s u g g e s t t h a t t h e s e t w o c a t a l y t i c a n t i b o d -i e s ca n in f a c t b e v i e w e d a s p r l i m - i t i v e c e n 1' v i l m e s f o l l o w i n g t w o ) d i s t i n c t e v o l u t i o n a r yp a t h w a y s . R e c e n t l y , t h e i d e a s u s e d t o g e n e r -a t e t h e s e c a l t a l y ~ t i c a n t i b o d i , - l e s h a v e b e e n e x -t e n d e d t o t h e g e n e r a t i o n o f a n t i b o d i e s t h a tc a t a l x y : e p e p t i d e b o n d f o r m a t i o n ( 2 0 , 2 1 )r a i s i n g t h e i n t r i g u i n g p o s s i b i i i t v o f u s i n g a n lt i b d e s a I t o s f o r p o l y p e p t i d e s y n t h e s i sS n u c r : u r a l s t u d i e s . S t r u c t u r a l s t u d i e s s u p -p o r t t h e n o t i o n t h a t c a t a l y t i c a n t i b o d y a c -t i v e s i t e s e v o l v e in r e s p o n s e t o t h e m l e c h a -r u s t i c i n f o r m n a t i o n c o n t a i n e d i n t h e s t r u c -t u r e o f t h e i m n i u n o g e n ( 3 - 5 ) . C o n s i d e r , f o re x a m p l e , t h e a n t l - ( - i b o d 1 7 E 8 , w h i c h wasr a i s e d t o p h o s p h o n a t e 2 ( F i g . 2 ) ( 4 . T i sa n t i 1 b o d y c a t a l y : e s t h e h y d r o l y s i s o f t h e c o t -r e s p o n d l i n g f o r r u n y I n o r l e u c i n e p h e n v l e s t e r3 w i 1 t h a I k o f 2 2 3 m m n 1 a n d r a t e a c c e l -r e r a t i o n ( k 1 )of22X 4 T h e x - r a yc r N s t a l s t r u c t u r e s o f t h e a n t i b o d y~ , t r a n s i t i o ns t a t e a n a l o g c o m p l e x a n d X l ic h ae li sc o

p l e x ( i n w h i c h a n a m i d e a n a l ' ( g O f t h es u b s t r a t e i s b o u n d i c ) h a v e b e e n r e c e n t l ys o l v e d ( 4 , 2 2 ) . T h e s e s t r u c t u r e s r e v e a l - ar e c o g n i t i o n p o c k e t i n l t h e a c t i v e s i t e f o rs p e c i f i c b i n d i n g l o f t h e s i d e c h a i n o f t h ea m i n i l o a c i d s u b s t r a t e a s x x e l i a s t h e l i g h tc h ii n l I v s i n e i r e s i d u e ( L w hx i i c h l i k c I vs t a b l i e t h e n a t x l c h a r g e d - t r a n s i t i o ns t a t e , i m u c h l i k e t h e o x y 1 a n i o n h o l e f o u n d i ns e r i n e p r o r e a s e s . A c o m p a r i s o n o f t h e s t r u i ct u r e s o f t h e M i c h a e l i s c o m p l e x a n d t h et r a n s i t i o n s t a t e a n a l o g c o m p l e x s h o x x s - , t h ei n c r e a s e d b i n d i n g i n t e r a c t i o n s t h a t o c c u i r a st h e r e a c t i o n p r o g r e s s e s t o x x a r d l t h e t r a n s i -t i o n s t a t e c o n f i g u r a t i o n . T h e a n t i b o d y a c -t i x e s i t e h a s a S e t H i s c a t r a l x t i c d y a d p r o x -i m a l t o t h e p h o s p h o r o u s o f t h e b o u n d h a p -t e n , r e s e m b l i n g t h e S e t - - - H i s ~ A s p c a t a i x y t i ct r i a d o f t h e s e r i n e p r o t e a s e s . T h e p o s i t i o n so f ' t h e a n t i b o d x a n d e n - - x me s i d e c h a i n sr e l a t i v e t o t h e a c x v 1 g r o u p unegignu-c l e o p h i l i c a d d i t i o n a r e v i r t u a l l y s u p e r l i m lp o s a b l e ( F i . 3 ) , s u g g e ( , s t i n g ( t h a t t h e a n l t i -b o d x r e s e m b l e s in many r e s p e c t s a p r i m i t i v es e r i n e p r o t e a s e . S t e a d y - s t a t e h x y d r o x y l a m l i n ep a r t i t i o n i n g e x p e r i i m e n t s l e n d s u p p o r t t o ac a t a l y t i c m e c h a n i s m i n v o l v i n g r a t e l t i m i t -i n g f o r m a t i o n o f a c o v a l e n t a c y l - a n t i b o d x c l ~i n t e r m e d i a t e . B ' 1 i n t r o d u c i n g y a d d i t i o n a lc a t a l y t i c g r o u p s i n t o t h e a c t i v e s i t e , a s x x a sd o n e i n t h e c a s e o f t h e p h o i ~ s p h o r y I c h - o l i n e -b i n d i n g , a n t i b o d y S 1 0 7 , o n l e m i g l h t b e a b l et o f u r t h e r e n h a n c e t h e a c t i v i t x o f t h i s c a t -a l y t i c a n t i b o d y ( 2 3 , - 2 4 ) .A s e c o n d h y d r o l y t i c a i n t i b o d y ) l ~ ( 4 8 ( 3 7 )h a s r e c e n t l y b e e n c r y s t a i i i l ~ e c l , a n d t h e s t r u c -t u r e o f t h e atbd h p e n c o m p l e x h a sb e e n d e t e r m i n e d t o h i g h 7 1 r e s o l u i f f o n ( 2 . 0 A )( 2 5 ) . T h i s a n t i b o i x x v a s r a i s e d a g a i n s t an i t r o p h e n y l p h o s p h o n a t e t r a n s i t i o n s t a t ea n a l o g , a n d c a t a l y , - e s t h e h y d r o l y s i s o f t h ec o r r e s p o n d i n g e s t e r s a r i d l c a r b o n a t e s . B o t hs t r u c t u r a l a n d m u i i t a g e n e s i s d a t a s u p p o r t t h ei m p o r t a n c e o f t r a n s i t i o n s t a t e s t a b i i i : a t i o ni n t h e m e c h a n i s m o f t h i s c a t a i x t i c a n i o yT h e g e n e s e n c o d i n g , b o t h a n t i b o d y 4 8 ( 3 7a n d t h e g e r m l i n e p r e c u i r s o r h a x e b e e nc l o n e d , s e q u e n c e d , a n d e x p r e s s e d . T h ee q u i l i b r i u m a n kneic bning c o n s t a n t sf o r t h e t r a n s i t i o n s t a t e a n a l o g , a s x x e l l a s t h eK I I a n d k a l i u e s f o r a n u m b e r o f s u b -s t r a t e s , x w e r e c i e t e r u i i n e c l f o r b o t h t h e g e r m i -l i n e a n t i b o - d y - a n d a n t i b o d y 1 4 8 G 3 7 , p r o x v i d i n gu t s a g l i m p s e i n t o t h e l i m m u n o l o g i c a l e v o l u -t i o n o f t h i s c a i t a i x t i c a i n t i b o d x ' . T h e g e r m i il i n e a n t i b o d x h a s an a f f i n i t y f o ( r t h e T S ~ ~

a n a l o g t h a t i s l e s s t h a n 1 0 - 4 t h a t o f a n tb o d y , 4 8 ( 3 7 a n d h a s s i g n i f i c a n t l x d i m i n i s hc a t a l y t i c a c t i v i t y i n c o m p a r i s o n t o atbd4 8 ( 3 7 . H o x x e v e r , t h e m u t a t i o n l l ( - s t h a t )c u i i r e d d u r i n g , a f f i n i t y V a u a i n t h r e et h e l i g h 1 t c h a i n a n d s i x i n t h e h e a v v c h a ia r c n u t i n t h e a c t i v e s i t e , i n d i t c a t i n g , t hs e c o n d a r x s t r u c t u r a l i n t e r a i c t i o n s ca n p l a xk e y r o l e i n t h e e v o l u i t i o ) n o f c a t a l y t i c ( a nb i n d i n g ) f u i n c t i o ) n , p e r h a p s bypeognia p a r t i c u l a r a c t i v e s i t e g e o m e l l t r y , . T h e s t r ut u r e o ) f a t h i r d e s t e r o l y r i l c a n t i b o d y h a s a lb e e n s o l v e d a n d s h o x x s a n u m b e r o ) f s t r u it u i r a l s i m n i l a r i t i e s t o a n t i b o d i e s 4 8 ( 3 7 a n1 7 E 8 ( 5 ) . H o x x e v e r , a d e t a i l e d aaxssOt h ' s c a t a i x t i c a n t i b o d y v a x x a i t s s t r u c t u rc h a r a c t e r i ~ a t i o n o f t h e h a ~ p t e n - a n t i b o d yc o m 1 p l e x .A n o t h e i c o m p a r i s o n b e t x x e e n e n . . i ma n d a n t i b o d y , c a t a l y , - e d r e a c t i o n s ca nm a d e i n t h e c a s e o f t h e c o n v e r s i o n o f c hr i s m i c a c i d t o p r e p h i e n i c : a c i d caayelbt h e e n - v y m e c h o r i s m n a t e m i u t a s e . T h i s 3 ,s i g m a t r o p i c r e a r r a n g e m e n t , x h i c h i i s a k es t e p i n t h e b i o ) s \ n t h e s i s o f a r o m i a t i c : amin, a c i d s i n p l a n t s a n d b a c t e r i a , p r o c e et h r o u g h a i n a s x m m i i - e t r i c c h a i r l i k e t r a n i i s i t i os t a t e ( 2 6 ) . One m n i g h i t e x p e c t t h a t an a n tb o d y - c o m b i n i ~ n g n s i t e cm eena\to tc o n f o ) r m a - c t i o n a l i x 1 1 ~ r e s t r i c t e d ] t r a n s i t i o n s t ax x u d a c c e l e r a t e t h i s r e a r r a n g e m n e n t , a g ab x w a c t i n g a s an t t e n t r o p y t r a p . " A n t i b o d i1 F 7 a n d 2 E l 1 e l i c i t e d t o d e r i v a t i v e s o fb i c y c l i c t r a n s i t i o n s t a t e i n h i b i t o r o ) f c h o r imate m u t a s e i n c r e a s e t h e r a t e o ) f t h e r e arangement 1 0 - f i s i d ( 2 7 ' 1 a n d l 0 o d ( 2 8 )r e s p e c t i x v e l y , o v e i t h e u i n c a i t a i l y z e d c r e a c t i oc o m p a r e d x x i t h t h e a p p r o x i m a t e l y I 0 " f oa i c c e l e r a i t ( i o n ( 1 k . , t / k t , , c I t ) o f t h e e n d x m eW 1 h e r e a s a n i - t i b o d y j ~ 2 E 1 ( 2 8 ) f u n c t i o n s p tm a r i x b v ' i n c r e a i s ' i n g t h e e n t r p o f a i c t i v

SH OH

OPh

4F i g . 2 . A n t i b o d y - c a t a l y z e d e s t e r h y d r o l y s i s .

F i g . 3 . T h e a c t i v e s i t e a t a n t i b o d y 1 7 E 8 s u p e r ip o s e d oni t h e a c t i v e s i t e u t t r y p s i n c u i i m p l e x e d w ib o v i n e p a n c r e a t i c t r y p s i n i n h i b i t o t ( I B P T I ) . T h e c aa l y t i c r e s i d u e s a r e on t h e r i g h t s id e w i th b a c k b oa n d s i d e c h a i n atoms o t t r y p s i n i n w h i t e a n d p i nr e s p e c t i v e l y , a n d b a c k b o n e a nd s i d e c h a i n atoo t 1 7 E 8 i n y e l l o w a n d r e d , r e s p e c t i v e l y . T h e p h op h o n a t e h a p t e n 2 i s shown i n y e l l o w w i t h tp h o s p h o r o u s atom i n r e d ( 4 ) .1 8 3 6 ~ ~ ~ ~ ~ ~ s C I J E N C E . V O L . 1 6 9 * 2 9 S E P T E M I B E R 1 9 % 58 3 6

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t i o n ' S t f o r t h e r e a c t i o n ( A S t = - 1 . 2 c a lm o l 1 K 1 , A H * = 1 8 . 3 k c a l m o l - 1 ) , a n t i -b o d y 1 F 7 ( 2 7 ) p r i m a r i l y l o w e r s t h e e n t h a l p yo f a c t i v a t i o n A H : ( , A S t = - 2 2 c a l m o l l 1K - 1 , A H ' = 1 5 k c a l m o l e 1 ) , a n d t h e e n -z y m e a f f e c t s b o t h ( A S T = 0 . 0 c a l m o l l 1K - 1 , A H * = 1 5 . 9 k c a l m o l e 1 ) ( 2 6 ) .T h e x - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e s o f t h e e n -z y m e a n d a n t i b o d y 1 F 7 h a v e b e e n s o l v e d( 3 ) . T h e s t r u c t u r a l d a t a s u g g e s t t h a t t h ee n z y m e a n d t h e a n t i b o d y s t a b i l i z e t h e s a m ec o n f o r m a t i o n a l l y r e s t r i c t e d c h a i r l i k e t r a n s i -t i o n s t a t e . T h e o v e r a l l s h a p e a n d c h a r g ec o m p l e m e n t a r i t y b e t w e e n t h e c o m b i n i n gs i t e s a n d t h e t r a n s i t i o n s t a t e a n a l o g r e s u l t i nb i n d i n g o f t h e c o r r e c t e n a n t i o m e r o f c h o -r i s m a t e i n t h e c o n f o r m a t i o n r e q u i r e d f o rr e a c t i o n . D i f f e r e n c e s i n t h e n u m b e r a n dn a t u r e o f s p e c i f i c i n t e r a c t i o n s a v a i l a b l e f o rr e s t r i c t i n g c o n f o r m a t i o n a l e n t r o p y a n d s t a -b i l i z i n g t h e h i g h l y p o l a r i z e d t r a n s i t i o n s t a t em a y a c c o u n t f o r t h e o b s e r v e d l o w e r ( 1 0 - 4t i m e s ) a c t i v i t y o f t h e a n t i b o d y 1 F 7 r e l a t i v et o t h a t o f t h e n a t u r a l e n z y m e s . S t r u c t u r a li n f o r m a t i o n o n a n t i b o d y 2 E 1 1 , w h i c h i si n t e r m e d i a t e i n a c t i v i t y b e t w e e n a n t i b o d y1 F 7 a n d t h e e n z y m e , s h o u l d s h e d a d d i t i o n a ll i g h t o n t h e e v o l u t i o n o f t h i s e n z y m a t i ca c t i v i t y .T h e x - r a y s t r u c t u r e s d e s c r i b e d a b o v es h o w t h a t t h e p r o p e r t i e s o f c a t a l y t i c a n t i -b o d i e s d o i n d e e d r e f l e c t t h e m e c h a n i s t i ci n f o r m a t i o n c o n t a i n e d i n t h e h a p t e n s t r u c -t u r e . O t h e r m e c h a n i s t i c s t u d i e s a l s o b e a r t h i so u t . F o r e x a m p l e , i t h a s b e e n s h o w n t h a t b yr a i s i n g a n t i b o d i e s t o a p o s i t i v e l y c h a r g e dh a p t e n , o ne c an g e n e r a t e a n a n t i b o d y w i t h ac o m p l e m e n t a r y n e g a t i v e l y c h a r g e d g l u t a -m a t e r e s i d u e i n t h e c o m b i n i n g s i t e c a p a b l eo f e f f i c i e n t l y c a t a l y z i n g a n e l i m i n a t i o n r e a c -t i o n o f a r e l a t e d 1 - f l u o r o k e t o n e s u b s t r a t e( 2 9 ) . R e c e n t l y , H i l v e r t a n d c o - w o r k e r s h a v ee x p l o i t e d c h a r g e c o m p l e m e n t a r i t y t o g e n e r -a t e v e r y e f f i c i e n t c a t a l y t i c a n t i b o d i e s t h a ta l s o o p e r a t e b y m e a n s o f g e n e r a l b a s e c a t a l -y s i s ( 3 0 ) . An a n t i b o d y s p e c i f i c f o r a p o s i t i v e -l y c h a r g e d 2 - a m i n o b e n z i m i d a z o l e w a s f o u n dt o c a t a l y z e t h e d e c o m p o s i t i o n o f t h e c o r r e -s p o n d i n g b e n z i s o x a z o l e t o g i v e 2 - c y a n o p h e -n o l w i t h g r e a t e r t h a n 1 0 8 - f o l d r a t e a c c e l e r a -t i o n . I n a d d i t i o n t o d e m o n s t r a t i n g t h e l a r g ec a t a l y t i c a d v a n t a g e s t h a t c a n b e r e a l i z e dw i t h a n t i b o d i e s , t h i s e x p e r i m e n t a l s o b e g i n st o d e f i n e t h e d e g r e e t o w h i c h o p t i m a l l y p o -s i t i o n e d g e n e r a l b a s e s a n d a c i d s c a n c o n t r i b -u t e t o e n z y m a t i c c a t a l y s i s .N a t u r a l l y o c c u r r i n g c a t a l y t i c a n t i b o d i e s .A l t h o u g h i n e a c h e x a m p l e d e s c r i b e d a b o v et h e c a t a l y t i c a n t i b o d y e v o l v e d i n r e s p o n s et o a s y n t h e t i c i m m u n o g e n , r e c e n t r e p o r t ss u g g e s t t h a t t h e i m m u n e s y s t e m c a n p r o -d u c e c a t a l y t i c a n t i b o d i e s i n t h e a b s e n c e o fs u c h i m m u n o g e n s ( 3 1 , 3 2 ) . F o r e x a m p l e ,a u t o i m m u n e a n t i b o d i e s i s o l a t e d f r o m p a -t i e n t s w i t h s y s t e m i c l u p u s e r y t h e r m a t o s u sw e r e f o u n d t o h y d r o l y z e DNA w i t h a n a p -

p a r e n t k c a t v a l u e o f 1 4 m i n 1 a n d K m v a l u eo f 4 3 nM ( 3 1 ) . T h e s e k i n e t i c c o n s t a n t s ,w h i c h w e r e o b t a i n e d w i t h h i g h l y p u r i f i e dF a b f r a g m e n t s , a r e r e m a r k a b l y c l o s e t o t h o s eo f r e s t r i c t i o n e n z y m e s s u c h a s E c o R I . U n -r a v e l i n g t h e m e c h a n i s m b y w h i c h t h e s ea n t i b o d i e s a r e g e n e r a t e d d u r i n g t h e i m -m u n e r e s p o n s e c o u l d p r o v e e x t r e m e l y u s e f u li n t h e g e n e r a t i o n o f o t h e r e f f e c t i v e a n t i -b o d y c a t a l y s t s f o r b i o l o g i c a l a n d b i o m e d i c a la p p l i c a t i o n s .

E v o l v i n g New F u n c t i o n sP e r i c y c l i c r e a c t i o n s . B e c a u s e t h e i m m u n e s y s -t e m r e s p o n d s r a p i d l y t o a g i v e n s e t o f c h e m -i c a l i n s t r u c t i o n s , o n e c a n a t t e m p t t o e v o l v ea n t i b o d i e s t h a t c a t a l y z e r e a c t i o n s f o r w h i c he n z y m e s h a v e y e t t o b e f o u n d . C o n c e r t e dp e r i c y c l i c r e a c t i o n s , w h i c h i n c l u d e c y c l o a d -d i t i o n r e a c t i o n s , s i g m a t r o p i c r e a r r a n g e -m e n t s , a n d e l e c t r o c y c l i c r i n g c l o s u r e r e a c -t i o n s , r e p r e s e n t o n e s u c h o p p o r t u n i t y .T h e s e r e a c t i o n s h a v e n o t o n l y r e c e i v e d ag r e a l d e a l o f t h e o r e t i c a l a n d m e c h a n i s t i ca t t e n t i o n f r o m c h e m i s t s , t h e y h a v e a l s of o u n d m a n y a p p l i c a t i o n s i n o r g a n i c s y n t h e -s i s ( 3 3 ) . T h e r e i s o n l y o n e e x a m p l e o f e n -z y m i c c a t a l y s i s o f w h a t i s f o r m a l l y a p e r i c y -c l i c r e a r r a n g e m e n t , t h e 3 , 3 - s i g m a t r o p i c r e -a r r a n g e m e n t ( C l a i s e n r e a r r a n g e m e n t ) c a t a -l y z e d b y c h o r i s m a t e m u t a s e ( 2 6 ) . H o w e v e r ,t h e e n z y m a t i c r e a c t i o n i s l a r g e l y a s y n c h r o -n o u s a n d m a y e v e n i n v o l v e a s t e p w i s em e c h a n i s m ( 2 6 ) . C o n s e q u e n t l y , p e r i c y c l i cr e a c t i o n s r e p r e s e n t a n i d e a l t a r g e t t o t e s tt h e d e g r e e t o w h i c h c a t a l y t i c a n t i b o d i e s c a nb e g e n e r a t e d f o r r e a c t i o n s t h a t a r e r a r e o rd o n o t o c c u r i n n a t u r e .T h e f i r s t s u c h r e a c t i o n t o b e c o n s i d e r e dw a s t h e D i e l s - A l d e r r e a c t i o n ( 3 4 , 3 5 ) ,w h i c h i n i t s s i m p l e s t f o r m c o n s i s t s o f t h er e a c t i o n b e t w e e n b u t a d i e n e a n d e t h y l e n et o y i e l d c y c l o h e x e n e ( 3 6 ) . T h e t r a n s i t i o ns t a t e i n v o l v e s a h i g h l y o r d e r e d c y c l i c a r r a yo f i n t e r a c t i n g o r b i t a l s i n w h i c h c a r b o n -c a r b o n b o n d s a r e b r o k e n a n d f o r m e d i n as i n g l e c o n c e r t e d s t e p . A s a r e s u l t o f t h es t r i n g e n t a l i g n m e n t o f o r b i t a l s i n t h e t r a n -s i t i o n s t a t e , a n u n f a v o r a b l e e n t r o p y o f a c t i -v a t i o n ( A S t ) o n t h e o r d e r o f - 3 0 t o - 4 0 c a lm o l - 1 K` i s g e n e r a l l y o b s e r v e d . T h e d e s i g no f a h a p t e n f o r t h i s r e a c t i o n s h o u l d a g a i ne x p l o i t t h e n o t i o n o f p r o x i m i t y e f f e c t s a sw e l l a s i n c o r p o r a t e a m e c h a n i s m f o r m i n i -m i z i n g p r o d u c t i n h i b i t i o n . O n e g e n e r a l

y0j0 + ( N - C ~ i - N 1 t . C H 3H N 7 O , , , , o - C NHCH5 05 6

s t r a t e g y f o r c a t a l y s i n g t h e D i e l s - A l d e r r e -a c t i o n i s i l l u s t r a t e d b y t h e a n t i b o d y - c a t a -l y z e d c y c l o a d d i t i o n o f t h e a c y c l i c d i e n e 5 t oN - p h e n y l m a l e i m i d e 6 t o y i e l d t h e c y c l o h e x -e n e p r o d u c t 7 ( F i g . 4 ) ( 3 5 ) . H a p te n 8 i sb a s e d o n a b i c y c l o [ 2 . 2 . 2 ] o c t e n e s k e l e t o n i nw h i c h t h e e t h a n o b r i d g e l o c k s t h e c y c l o -h e x e n e r i n g i n t o a c o n f o r m a t i o n r e s e m b l i n gt h e h i g h l y o r d e r e d t r a n s i t i o n s t a t e o f t h eD i e l s - A l d e r r e a c t i o n . B e c a u s e t h e r e a c t i o np r o d u c t d o e s n o t c o n t a i n t h i s h y d r o p h o b i cb r i d g e a n d h a s a c o n f o r m a t i o n d i s t i n c t f r o mt h a t o f t h e h a p t e n , i t w a s e x p e c t e d t o b i n dl e s s t i g h t l y i n t h e a n t i b o d y - c o m b i n i n g s i t e ,m i n i m i z i n g p r o d u c t i n h i b i t i o n . I n f a c t , a na n t i b o d y g e n e r a t e d t o h a p t e n 8 c a t a l y z e dt h e f o r m a t i o n o f t h e D i e l s - A l d e r a d d u c tw i t h a k c a t / K m v a l u e o f 9 0 0 M' s 1( d i e n e ) ; p r o d u c t w a s b o u n d w i t h a d i s s o c i -a t i o n c o n s t a n t ( K D ) o f 1 0 g i M , w h i c h c a nb e c o m p a r e d w i t h a K D o f 1 2 6 nM f o r t h eh a p t e n .G o u v e m e u r a n d c o - w o r k e r s t h e n a s k e dw h e t h e r a s i m i l a r a p p r o a c h c o u l d b e t a k e nt o g e n e r a t e a n t i b o d i e s t h a t s e l e c t i v e l y c a t a -l y z e f o r m a t i o n o f t h e D i e l s - A l d e r p r o d u c t sr e s u l t i n g f r o m e i t h e r e n d o o r e x o a t t a c k o ft h e d i e n o p h i l e o n t h e d i e n e ( 3 7 ) . F o r r e a c -t i o n s u n d e r k i n e t i c c o n t r o l , t h e e n d o p a t h -w a y i s t y p i c a l l y f a v o r e d o v e r t h e e x o p a t h -w a y a s a r e s u l t o f s e c o n d a r y o r b i t a l i n t e r a c -t i o n s i n t h e t r a n s i t i o n s t a t e . C o n s e q u e n t l y ,a n t i b o d y b i n d i n g e n e r g y m u s t b e u s e d t oc o n t r o l t h e r e l a t i v e e n e r g y o f t r a n s i t i o ns t a t e s , i n a d d i t i o n t o t h e r e l a t i v e e n e r g i e s o ft h e t r a n s i t i o n s t a t e a n d s u b s t r a t e . T h e r e a c -t i o n c h o s e n f o r s t u d y w a s t h e c y c l o a d d i t i o nb e t w e e n t r a n s - 1 - N - a c y l a m i n o - 1 , 3 - b u t a d i e n e( 9 ) a n d N , N - d i m e t h y l a c r y l a m i d e ( 1 0 ) ( F i g .5 ) . I n t h e a b s e n c e o f a c a t a l y s t , t h e r e a c t i o np r o c e e d s u n d e r a q u e o u s c o n d i t i o n s t o g i v ea n 8 5: 1 5 m i x t u r e o f t h e e n d o 1 1 t o e x oa d d u c t 1 2 . A b i c y c l o [ 2 . 2 . 2 ] o c t e n e f r a m e -w o r k w a s a g a i n u s e d t o m i m i c t h e b o a t l i k et r a n s i t i o n s t a t e f o r t h e p e r i c y c l i c r e a c t i o n .H a p t e n 1 3 m i m i c s t h e e n d o a p p r o a c h i n t h et r a n s i t i o n s t a t e i n w h i c h t h e a m i d e g r o u p o ft h e d i e n o p h i l e i s o r i e n t e d t o w a r d t h e n To r b i t a l s o f t h e d i e n e . C o n v e r s e l y , t h e e x ot r a n s i t i o n s t a t e , i n w h i c h t h e d i e n o p h i l es u b s t i t u e n t i s o r i e n t e d a w a y f r o m t h e r s y s -t e m , i s m i m i c k e d b y h a p t e n 1 4 . T h e s e t w oh a p t e n s w e r e u s e d t o g e n e r a t e a n t i b o d i e st h a t c a t a l y z e t h e e x c l u s i v e f o r m a t i o n o f e i -t h e r t h e e n d o o r e x o a d d u c t s ( 3 7 ) . T h ee f f e c t i v e m o l a r i t i e s f o r t h e a n t i b o d y - c a t a -

Q - & ~ - A C H 3H H00 7

c 0 2 -F i g . 4 . A n t i b o d y - c a t a l y z e d D i e l s - A l d e r r e a c t i o n s .

SCIENCE * V O L . 2 6 9 * 2 9 SEPTEMBER 1 9 9 5 1 8 3 7

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4/8

l y z e d r e a c t i o n s were 4 . 8 a n d 1 8 M , respec-t i v e l y , a n d i n e a c h case t h e d e g r e e o f enan-t i o s e l e c t i v i t y w as g r e a t e r t h a n 9 8 % .A n o t h e r w e l l - s t u d i e d p e r i c y c l i c r e a c t i o nf o r w h i c h e n z y m i c c a t a l y s i s h a s yet t o b ed e m o n s t r a t e d i s t h e C o p e rearrangement( 3 8 ) . T o generate c a t a l y s t s f o r t h i s r e a c t i o n ,a n t i b o d i e s w ere r a i s e d a g a i n s t t h e d i p h e n y l -s u b s t i t u t e d c y c l o h e x a n e d e r i v a t i v e 1 5 . T h i sh a p t e n i s e x p e c t e d t o m i m i c t h e s i x - m e m -b e r e d r i n g t r a n s i t i o n s t a t e f o r t h i s c o n c e r t e drearrangement ( F i g . 6 ) ( 3 9 ) . F o u r a n t i b o d -i e s w ere i s o l a t e d t h a t c a t a l y z e t h e o x y - C o p erearrangement o f d i e n e 1 6 t o 1 7 , one w i t ha k c a t l k u n c a t v a l u e o f 5 3 0 0 . An a n a l y s i s o fK , k c t , a n d t h e i n h i b i t i o n constant K i f o rt h e f o u r a n t i b o d i e s s u g g e s t s t h a t h a p t e n 1 5d o e s i n d e e d i n d u c e c a t a l y s t s b y a c t i n g a s am i m i c o f t h e c y c l i c t r a n s i t i o n s t a t e . T h e s es t u d i e s o f t h e D i e l s - A l d e r a n d o x y - C o p er e a c t i o n s u n d e r s c o r e t h e a b i l i t y o f t h e i m -mune s y s t e m , w h e n g u i d e d b y c a r e f u l l y d e -f i n e d m e c h a n i s t i c c r i t e r i a , t o e v o l v e c a t a -l y s t s f o r a w i d e range o f c h e m i c a l t r a n s f o r -m a t i o n s , some o f w h i c h are h e r e t o f o r e u n-k n o w n i n n a t u r e .U n n a t u r a l c o f a c t o r s . M a n y e n z y m a t i c r e -a c t i o n s d e p e n d on a s m a l l s e t o f n o n p e p t i -d y l c o f a c t o r s s u c h a s h e m e s , f l a v i n , p y r i d o x -a l , a n d n i c o t i n a m i d e . C h em i st s h a ve d e v e l -o p e d t h e i r own s e t o f c h e m i c a l a u x i l l a r i e s ,i n c l u d i n g m e t a l h y d r i d e s , t r a n s i t i o n m e t a l s ,a n d L e w i s a c i d s , t h a t p e r f o r m s i m i l a r f u n c -t i o n s . T h e l a r g e n u m b e r a n d u t i l i t y o f t h ec o f a c t o r s a v a i l a b l e t o t h e c h e m i s t r a i s e s t h eq u e s t i o n w h e t h e r a n t i b o d i e s can b e d e v e l -o p e d t h a t use t h e s e c h e m i c a l " c o f a c t o r s " i na d d i t i o n t o e n z y m a t i c c o f a c t o r s f o r c a t a l y s i s( 4 0 ) . One s u c h e x a m p l e i s t h e a n t i b o d y -c a t a l y z e d o x y g e n a t i o n r e a c t i o n o f a s u l f i d et o t h e c o r r e s p o n d i n g s u l f o x i d e ( 4 1 ) . T h emonooxygenase enzymes r e s p o n s i b l e f o rt h i s t r a n s f o r m a t i o n us e f l a v i n or h e m e co -f a c t o r s t h a t t y p i c a l l y r e q u i r e NADPH( N A D , n i c o t in a m i de a d e n in e d i n u c l e o t i d e )f o r c o f a c t o r r e g e n e r a t i o n ( 4 2 ) . H s i e h a n dc o - w o r k e r s ( 4 1 ) a s k e d t h e q u e s t i o n w h e t h e rt h e i n e x p e n s i v e o x i d a n t N a I O 4 c o u l d b eu s e d t o carry out t h i s r e a c t i o n , e l i m i n a t i n gt h e n e e d f o r c o f a c t o r r e c y c l i n g , a s i g n i f i c a n tb a r r i e r t o t h e use o f many enzymes i n syn-t h e s i s ( F i g . 7 ) .

H a m m e t t u-p s t u d i e s , s o l v e n t i s o t o p e e f -f e c t s , a n d p H - d e p e n d e n c e s t u d i e s on s u l f i d eo x i d a t i o n b y p e r i o d a t e s u g g e s t t h a t t h e t r a n -s i t i o n s t a t e f o r t h i s r e a c t i o n r e s e m b l e s t h a td e p i c t e d i n F i g . 7 . C o n s e q u e n t l y , a m i n o -p h o s p h o n i c a c i d 1 8 w a s d e s i g n e d t o g e n e r a t ea n t i b o d i e s t h a t c a t a l y z e t h e c o n v e r s i o n o fs u l f i d e 1 9 t o s u l f o x i d e 2 0 . B e c a u s e h a p t e n1 8 c o n t a i n s an a m i n e t h a t i s p r o t o n a t e d a tp h y s i o l o g i c a l p H , a n t i b o d i e s s p e c i f i c f o r 1 8were e x p e c t e d t o s t a b i l i z e t h e i n c i p i e n t pos-i t i v e charge on sulfur present i n the transi-t i o n s t a t e . A p h o s p h o n i c a c i d m o i e t y w a si n t r o d u c e d i n t o t h e h a p t e n t o p r o v i d e a1 8 3 8

0yH0

R9

CONMe210

k r k O N M e 20 OyH0

R1 1

IpCONII20yNH

0

12

F i g . 5 . A n t i b o d y c a t a l y s i s o f an ex o D i e l s - A l d e r r e a c t i o n .

b i n d i n g s i t e f o r t h e p e r i o d a t e i o n . A n t i b o d y2 8 B 4 . 2 w as i s o l a t e d , w h i c h c a t a l y z e s t h eN a I O 4 - d e p e n d e n t o x i d a t i o n o f s u l f i d e 1 9with a k c a t v a l u e o f 8 . 2 s i ; no i n a c t i v a t i o nw a s o b s e r v e d as a r e s u l t o f a n t i b o d y o x i d a -t i o n . T h e turnover n u m b e r a n d c a t a l y t i c e f -f i c i e n c y o f t h i s a n t i b o d y are c o m p a r a b l e t ot h o s e o f t h e c o r r e s p o n d i n g enzymes ( 4 2 ) .A s e c o n d e x a m p l e o f a n t i b o d y c a t a l y s t si n v o l v i n g an " u n n a t u r a l c o f a c t o r " i s t h e an-t i b o d y - c a t a l y z e d r e d u c t i o n o f k e t o n e s t o t h ec o r r e s p o n d i n g a l c o h o l s ( 4 3 , 4 4 ) . T h e enzy-m a t i c r e d u c t i o n o f c a r b o n y l groups t o a l c o -h o l s u s u a l l y r e q u i r e s t h e c o f a c t o r NADH orNADPH. C h e m i c a l r e d u c t i o n s , on t h e o t h e rh a n d , are u s u a l l y c a r r i e d out w i t h i n e x p e n -s i v e a n d v e r s a t i l e m e t a l h y d r i d e s , s u c h a sN a B H 4 or L i A I H 4 . I n an e f f o r t t o g e n e r a t ea n t i b o d i e s t h a t c a t a l y z e t h e m e t a l h y d r i d e -d e p e n d e n t r e d u c t i o n o f k e t o n e 2 1 , a n t i b o d -i e s were g e n e r a t e d a g a i n s t N - o x i d e 2 3 ( F i g .8 ) . A n t i b o d i e s r a i s e d a g a i n s t t h i s h a p t e n

CO2H

,OH

i s

CO2H

0

1 i s . wo,F i g . 6 . A n t i b o d y - c a t a l y z e d o x y - C o p e r e a r r a n g e -m e n t .

S02N

19

were e x p e c t e d t o s t a b i l i z e t h e t e t r a h e d rt r a n s i t i o n s t a t e a r i s i n g f r o m n u c l e o p h i l i ct a c k o f h y d r i d e on t h e c a r b o n y l group,w e l l as p r o v i d e a s i t e t o a c c o m m o d a t e tr e d u c t a n t . T h e c h i r a l a c t i v e s i t e o f an a nb o d y s p e c i f i c f o r one o f t h e tw o e n a n t i o m eo f h a p t e n 2 3 s h o u l d a l s o d i s c r i m i n a t e btw e en t h e e n a n t i o t o p i c f a c e s o f a p r o c h i rs u b s t r a t e , a f f o r d i n g h i g h s t e r e o s e l e c t i v i tA n t i b o d y 3 7 B . 3 9 . 3 was f o u n d t o c a t a l y z e tr e d u c t i o n o f s u b s t r a t e 2 1 w i t h a k c a t l K m vue o f 1 . 9X0 3 M - 1 m i n ' ( R = E t ) ( 4 4A s e x p e c t e d , t h e a n t i b o d y s t a b i l i z e d onetw o p o s s i b l e e n a n t i o m e r i c t r a n s i t i o n s t at o g i v e t h e S a l c o h o l i n 96% e n a n t i o m e rexcess. T h e r e d u c t i o n o f k e t o n e s c o n t a i n ib r a n c h e d a n d a r y l s u b s t i t u e n t s , i n c l u d i n g th i g h l y s y m m e t r i c a l 1 - n i t r o p h e n y l - 3 - p h e n y2 - p r o p a n o n e , a l s o s h o w e d h i g h e n a n t i o s e l et i v i t y . M o r e o v e r , t h e a n t i b o d y c a t a l y z e d tr e d u c t i o n o f d i k e t o n e 2 4 r e g i o s e l e c t i vw i t h g r e a t e r t h a n 7 5 : 1 s e l e c t i v i t y f o r onet h e tw o n e a r l y e q u i v a l e n t k e t o n e m o i e t ia n d w i t h h i g h s t e r e o s e l e c t i v i t y , a f f o r d i n g tS e n a n t i o m e r o f h y d r o x y k e t o n e 2 5 i n 9 6e n a n t i o m e r i c excess a n d a 9 4 % o v e r a l l y i eI n c o n t r a s t , t h e u n c a t a l y z e d r e a c t i o n a f f oed r o u g h l y a s t a t i s t i c a l m i x t u r e o f e i g h t p r ou c t s . T h i s s t r a i g h t f o r w a r d s t r a t e g y f o r c a tl y z i n g c a r b o n y l r e d u c t i o n may f i n d g e n e ra p p l i c a b i l i t y t o t h e r e g i o - a n d s t e r e o s e l e c tr e d u c t i o n o f a b r o a d range o f c o m p o u na n d may b e u s e f u l f o r r e a c t i o n s not amenb l e t o e x i s t i n g b i o l o g i c a l or c h e m i c a l ap r o a c h e s . M o r e o v e r , t h i s a n t i b o d y - c a t a l yr e a c t i o n a n d o t h e r s ( 4 5 ) i l l u s t r a t e t h e d e g r

- + 8- o+ 0 1 1 O N -+ NalO4

02N.02+NW03-0 020

F i g . 7 . A n t i b o d y - c a t a l y z e d , p e r i o d a t e - d e p e n d e n t o x y g e n a t i o n r e a c t i o n .SCIENCE * VOL. 2 6 9 * 2 9 SEPTEMBER 1 9 9 5

4 A C O N M W 2N C O N M e 2 NH

14R1 3 1 4

1

1

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t o w h i c h a n t i b o d i e s c a n s e l e c t i v e l y b i n d a n ds t a b i l i z e o n e o f m a n y n e a r l y i s o e n e r g e t i ct r a n s i t i o n s t a t e s o n a r e a c t i o n c o o r d i n a t e .O t h e r e x a m p l e s o f a n t i b o d i e s t h a t u s en o v e l c o f a c t o r s i n c l u d e t h e p e r o x y c a r b o x -i m i d i c a c i d - d e p e n d e n t o x i d a t i o n o f u n -f u n c t i o n a l i z e d a l k e n e s t o y i e l d e p o x i d e s( 4 6 ) . T h e e n a n t i o s e l e c t i v i t y f o r t h i s r e a c -t i o n w a s g r e a t e r t h a n 98% a n d e x c e e d s t h a tw h i c h c a n b e a c h i e v e d w i t h t h e h e m e -d e p e n d e n t e n z y m e c h l o r o p e r o x i d a s e .

l y z e d p y r a n r i n g f o r m a t i o n .A n t i b o d i e s h a v e a l s o b e e n g e n e r a t e d t h a tc a t a l y z e a d i s f a v o r e d s y n e l i m i n a t i o n r e a c -t i o n o f t h e a c y c l i c s u b s t r a t e 3 2 t o t h e ( c i s ) Zo l e f i n 3 3 ( 4 9 ) ( F i g . 1 0 ) . F o r a c y c l i c s y s t e m s ,a n t i p e r i p l a n a r e l i m i n a t i o n i s g e n e r a l l y f a -v o r e d o v e r s y n e l i m i n a t i o n ( 5 0 ) . M o r e o v e r ,a l l a c c o u n t s o f a c y c l i c s y n e l i m i n a t i o n p r o -v i d e a t r a n s ( E ) o l e f i n w h e n t h e c o m p e t i n ga n t i e l i m i n a t i o n s u f f e r s s i g n i f i c a n t d e s t a b i l i z -i n g s t e r i c i n t e r a c t i o n s e n r o u t e t o t h e a l t e r -

n a t i v e c i s o l e f i n . I n f a c t , o f t h e f o u r p o s s i b l ee l i m i n a t i o n p a t h w a y s ( a n t i t o t r a n s , a n t i t oc i s , s y n t o t r a n s , a n d s y n t o c i s ) , s y n e l i m i -n a t i o n t o a c i s o l e f i n i s r e g a r d e d a s t h e l e a s tf a v o r e d t r a n s f o r m a t i o n ( 5 0 ) . C o n s i s t e n tw i t h t h e s e g e n e r a l i z a t i o n s , s u b s t r a t e 3 2 u n -d e r g o e s a n t i e l i m i n a t i o n t o g i v e e x c l u s i v e l yt h e t r a n s o l e f i n 3 4 i n a q u e o u s b u f f e r . H a p t e n3 5 w a s d e s i g n e d t o g e n e r a t e a n t i b o d i e s t h a tw o u l d b i n d a n d l o c k s u b s t r a t e 3 2 i n a ne c l i p s e d c o n f o r m a t i o n , s u c h t h a t s u b s e q u e n t

D i f f i c u l t C h e m i c a lT r a n s f o r m a t i o n sR e c e n t l y , t h e f i e l d o f c a t a l y t i c a n t i b o d i e sh a s b e g u n t o f o c u s on c a t a l y t i c t r a n s f o r m a -t i o n s t h a t are d i f f i c u l t t o carry out u s i n ge x i s t i n g c h e m i c a l m e t h o d s . T h e s e i n c l u d er e a c t i o n s t h a t h a ve b ee n t e r m e d d i s f a v o r e d ,t h a t i s , k i n e t i c a l l y c o n t r o l l e d r e a c t i o n s i nw h i c h t h e p r o d u c t s a r i s e not f r o m t h e l o w -e s t energy t r a n s i t i o n s t a t e ( f a v o r e d ) b u tf r o m a h i g h e r energy t r a n s i t i o n s t a t e ( d i s f a -v o r e d ) . I n p r a c t i c e i t h a s proven d i f f i c u l t t oc h e m i c a l l y d i s c r i m i n a t e a n d c o n t r o l t h e r e l -a t i v e e n e r g i e s o f t h e s e tw o t r a n s i t i o n s t a t e s .We h a v e a l r e a d y seen t h a t a n t i b o d i e sc an m o d u l a t e t h e r e l a t i v e e n e r g i e s o f t h et r a n s i t i o n s t a t e s l e a d i n g t o t h e e x o a n de n d o p r o d u c t s o f a D i e l s - A l d e r r e a c t i o n .A n o t h e r d i s f a v o r e d r e a c t i o n t h a t h a s b e e ns u c c e s s f u l l y c a t a l y z e d b y a n t i b o d i e s i s t h e6 - e n d o - t e t c y c l i z a t i o n o f t h e e p o x y a l c o h o li l l u s t r a t e d i n F i g . 9 ( 4 7 ) . T h i s a n t i b o d y -c a t a l y z e d r e a c t i o n i s f o r m a l l y a v i o l a t i o n o fB a l d w i n ' s " r u l e s " f o r r i n g c l o s u r e r e a c t i o n s( 4 8 ) , w h i c h s t a t e t h a t t h e p r e f e r r e d p r o d u c ta r i s i n g f r o m t h e 1 8 0 0 t r a n s i t i o n s t a t e geom-e t r y o f an i n t r a m o l e c u l a r n u c l e o p h i l i c s u b -s t i t u t i o n r e a c t i o n i s t h e 5 - e x o - t e t p r o d u c t .I n o r d e r t o c a t a l y z e 6 - e n d o - t e t c y c l i z a t i o n ,i t was necessary t o generate an a n t i b o d yt h a t not o n l y l o w e r s t h e energy b a r r i e r f o re p o x i d e r i n g o p e n i n g b u t a l s o overcomest h e e n t r o p i c b a r r i e r a n d s t r a i n necessary t ob r i n g t h e h y d r o x y l group i n t o a geometryt h a t f a v o r s a s i x - m e m b e r e d ( d i s f a v o r e d )versus f i v e - m e m b e r e d ( f a v o r e d ) r i n g t r a n s i -t i o n s t a t e geometry. I t was a n t i c i p a t e d t h a th a p t e n 2 8 w ou ld generate a c o m b i n i n g s i t et h a t w o u l d s t a b i l i z e b o t h t h e d e v e l o p i n gc h a r g e i n t h e b r e a k i n g C - O b o n d a n d t h es i x - m e m b e r e d r i n g geometry ( 4 7 ) . T h e d i f -f e r e n c e i n d i p o l e b e t w e e n t h e h a p t e n a n dr e a c t i o n p r o d u c t was e x p e c t e d t o m i n i m i z ep r o d u c t i n h i b i t i o n . Two a n t i b o d i e s g e n e r a t -e d a g a i n s t N - o x i d e 2 8 were f o u n d t o c a t a l y z et h e r e g i o s e l e c t i v e r i n g o p e n i n g o f e p o x i d e2 9 t o f o r m t h e s i x - m e m b e r e d r i n g p r o d u c t3 1 . C o m p a r i s o n o f t h e k c a t v a l u e w i t h t h a t o ft h e u n c a t a l y z e d r e a c t i o n was not p o s s i b l eb e c a u s e o n l y t h e f i ve -m e mb e re d B a ld w i nr i n g c l o s u r e p r o d u c t was f o r m e d i n t h e a b -sence o f a n t i b o d y . I n a d d i t i o n , o n l y t h e S , Se p o x i d e was a s u b s t r a t e f o r a n t i b o d y - c a t a -

RN a C N B H 3 , I g0 2 N 0 2 N

2 1

0 -O 0 C H 3

2 N N 0 24

* ROH -NOCH3

2 2 0 2 N OH 2 5OH ,

N a C N B H 3 0 - * N0 2 N 2 6

OH ~C3OCH30 2 N OH 27

F i g . 8 . A n t i b o d y - c a t a l y z e d , b o r o h y d r i d e - d e p e n d e n t k e t o n e r e d u c t i o n .

@3 5 - e x o - t e t r4 6 - e n d o - t e t 3C2 0 2 9

"Favored" H "Disfavored" 2

HOyq

R 33 1

F i g . 9 . A n t i b o d y c a t a l y s i s o f a n a n t i - B a l d w i n c y c l i z a t i o n r e a c t i o n .O FPh C H 3h

P hH

S t a g g e r e dt r a n s i t i o n s t a t e

3 2

E c l i p s e dt r a n s i t o n s t a t eF i g . 1 0 . A n t i b o d y c a t a l y s i s o f a d i s f a v o r e d e l i m i n a t i o n r e a c t i o n .

SCIENCE * V O L . 2 6 9 * 2 9 SEPTEMBER 1 9 9 5

0P h CH3

H Ph3 4

]

0

Ph H3 3

1 8 3 9

- 0 0 1 1 1 m -

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e l i m i n a t i o n w o u l d o cc u r s yn t o a f f o r d s e l e c -t i v e l y t h e d i s f a v o r e d c i s o l e f i n 3 3 ( F i g . 1 0 ) .A p r i m a r y a m i n e was i n t r o d u c e d i n a p o s i -t i o n c o r r e s p o n d i n g t o t h e a - k e t o proton o fs u b s t r a t e 3 2 t o i n d u c e a g e n e r a l b a s e i n t h ea n t i b o d y - b i n d i n g p o c k e t . An a n t i b o d y spe-c i f i c f o r 3 5 was f o u n d t h a t c a t a l y z e d e x c l u -s i v e l y t h e syn e l i m i n a t i o n o f s u b s t r a t e 3 2 t ot h e d i s f a v o r e d p r o d u c t 3 3 . A g a i n , t h e r a t ea c c e l e r a t i o n ( k c a t l k u n c a t ) f o r t h i s a n t i b o d y -c a t a l y z e d r e a c t i o n c o u l d not b e d e t e r m i n e d ,b e c a u s e i n t h e a b s e n c e o f a n t i b o d y , f o r m a -t i o n o f t h e c i s p r o d u c t w a s i m m e a s u r a b l ys l o w u n d e r t h e r e a c t i o n c o n d i t i o n s . An en-ergy d i f f e r e n c e o f u p t o a 5 k c a l m o l - h a sb e e n e s t i m a t e d ( 4 9 ) b e t w e e n t h e f r e e energyz A G * f o r t h e a n t i a n d sy n e l i m i n a t i o n reac-t i o n s o f s u b s t r a t e 3 2 t o p r o d u c t s 3 4 a n d 3 3 .T h e c o m p l e t e r e v e r s a l o f r e a c t i o n p a t h w a y sas i l l u s t r a t e d b y t h e s e tw o a n t i b o d y - c a t a -l y z e d r e a c t i o n s s u g g e s t s t h a t even more d i f -f i c u l t t r a n s f o r m a t i o n s , p o s s i b l y even " d i s a l -l o w e d " r e a c t i o n s , may b e a m e n a b l e t o a n t i -b o d y c a t a l y s i s .Many o t h e r e x a m p l e s ar e a p p e a r i n g i nw h i c h a n t i b o d i e s p r o v i d e t h e c h e m i s t ah i g h d e g r e e o f c o n t r o l ov er t h e outcome o fc h e m i c a l r e a c t i o n s . R e c e n t l y i t w a s s h o w nt h a t a n t i b o d i e s can e f f e c t i v e l y e x c l u d e s o l -vent f r o m p a r t i c i p a t i n g i n r e a c t i o n s . K e i n a na n d c o - w o r k e r s s h o w e d t h a t an a n t i b o d yg e n e r a t e d a g a i n s t a q u a t e r n a r y ammoniumi o n h a p t e n was a b l e t o c a t a l y z e t h e c y c l i z a -t i o n o f a h y d r o x y e t h y l e n o l e t h e r t o t h ec o r r e s p o n d i n g k e t a l i n water w i t h h i g h en-a n t i o m e r i c p u r i t y ( 5 1 ) . O r d i n a r i l y , k e t a lf o r m a t i o n d o e s not occ ur u n d e r aqueousc o n d i t i o n s ; t h e o x o c a r b o n i u m i o n i n t e r m e -d i a t e i s r a p i d l y t r a p p e d b y water t o y i e l d ah e m i k e t a l a n d u l t i m a t e l y a k e t o n e . A n t i -b o d i e s h a v e a l s o b e e n r e p o r t e d t h a t c o n t r o lt h e s y n : a n t i r a t i o o f t h e o x i m e p r o d u c t t h a tr e s u l t s f r o m c o n d e n s a t i o n o f h y d r o x y l a m i n ew i t h a k e t o n e ( 5 2 ) a s w e l l a s t h e f o r m a t i o no f 3 - h y d r o x y o x e p a n e r i n g s f r o m s i m p l e h y -d r o x y e p o x i d e s ( 5 3 ) . A s e r i e s o f e s t e r o l y t i ca n t i b o d i e s h av e b ee n g e n e r a t e d t h a t ar ea b l e t o r e s o l v e e a c h o f f o u r d i a s t e r o m e r i ce s t e r s ( 4 5 ) , a n d e s t e r o l y t i c a n t i b o d i e s h a v eb e e n r e p o r t e d t h a t ar e a b l e t o r e g i o s e l e c -t i v e l y d e p r o t e c t an a c y l a t e d c a r b o h y d r a t e( 5 4 ) . F i n a l l y , a n t i b o d i e s g e n e r a t e d a g a i n s t aquaternary ammonium h a p t e n c a t a l y z e t h es t e r e o s e l e c t i v e h y d r o l y s i s o f an e n o l e t h e ru n d e r aqueous c o n d i t i o n s t o g i v e t h e corre-s p o n d i n g a l d e h y d e w i t h g r e a t e r t h a n 98 %e n a n t i o s e l e c t i v i t y ( 5 5 ) .

Me-Si-Me

0

U o ~NHAc3 7

38

SiPhMe2OH

3 9

F i g . 1 1 . An a n t i b o d y - c a t a l y z e d c a t i o n i c c y c l i z a t i o n r e a c t i o n .

g e n e r a t e d a g a i n s t h a p t e n 3 6 , c a t a l y z e s t h ec a t i o n i c rearrangement o f 3 7 t o c y c l o h e x -ene 3 8 ( 2 % ) a n d t r a n s - 2 - d i m e t h y l - p h e n y l -s i l y l c y c l o h e x a n o l 3 9 ( 9 8 % ) ( F i g . 1 1 ) .S u c h a narrow d i s t r i b u t i o n o f p r o d u c t s i ss u r p r i s i n g b e c a u s e c a t i o n i c c y c l i z a t i o n re-a c t i o n s c o n d u c t e d u n d e r s o l v o l y s i s c o n d i -t i o n s u s u a l l y y i e l d a p l e t h o r a o f p r o d u c t s .T h e a l m o s t s i n g u l a r p r o d u c t i o n o f t h e cy-c l i z e d p r o d u c t 3 9 was a t t r i b u t e d t o t h ea n t i b o d y ' s a b i l i t y t o b o t h e n f o r c e a p s e u d o -c y c l i c t r a n s i t i o n s t a t e geometry a n d t r i g g e rt h e r e a c t i o n u n d e r c o n d i t i o n s so m i l d t h a tt h e r e i s no d e t e c t a b l e b a c k g r o u n d r e a c t i o n .T h e s e s t u d i e s w i l l u n d o u b t e d l y l e a d t o e f -f o r t s a i m e d a t l a r g e r m u l t i r i n g c y c l i z a t i o nr e a c t i o n s .New s t r a t e g i e s . We w i l l c o n t i n u e to se et h e d e v e l o p m e n t o f new a p p r o a c h e s f o r

ARH2N

B01k H2N H 2 0

4 1 e J )_-- 1 9F u t u r e D i r e c t i o n s

N o v e l t r a n s f o r m a t i o n s . A n t i b o d y c a t a l y s i sw i l l u n d o u b t e d l y b e e x te n d e d t o manyo t h e r i n t e r e s t i n g c l a s s e s o f r e a c t i o n s . F o re x a m p l e , r e c e n t l y i t was r e p o r t e d t h a t an-t i b o d i e s can c a t a l y z e a c a t i o n i c c y c l i z a t i o nr e a c t i o n ( 5 6 ) . A n t i b o d y 4 C 6 , w h i c h was1840

R " ' 0 H4 3 OH O

+ H2N9

g e n e r a t i n g c a t a l y t i c a n t i b o d i e s . One recena p p r o a c h i n v o l v e s t h e us e o f m e c h a n i s mb a s e d screens i n w h i c h c o v a l e n t m o d i f i c at i o n b y a h a p t e n i s u s e d t o i d e n t i f y a n t i b o di e s w i t h an a p p r o p r i a t e l y p o s i t i o n e d n u c l e op h i l e group i n t h e a c t i v e s i t e ( 5 7 , 5 8 ) . T h ia p p r o a c h h a s b e e n a p p l i e d t o t h e generat i o n o f a n t i b o d i e s t h a t c a t a l y z e t h e a l dc o n d e n s a t i o n o f an e n o l a t e w i t h an a l dh y d e t o g i v e t h e c o r r e s p o n d i n g 3 - h y d r o x yk e t o n e , a r e a c t i o n a t t h e h e a r t o f o r g a n is y n t h e s i s . C l a s s I a l d o l a s e enzymes s p e c i fc a l l y c a t a l y z e t h i s r e a c t i o n t h r o u g h a comp l e x m e c h a n i s m t h a t i n v o l v e s t h e f o r m at i o n o f a c o v a l e n t S c h i f f b a s e f o r m e d b et w een an a c t i v e s i t e l y s i n e r e s i d u e a n d t hk e t o n e s u b s t r a t e f o l l o w e d b y e n a m i n e f om a t i o n , c o n d en s at io n w i t h a l d e h y d e , a nh y d r o l y s i s .

C o v a l e n t a d d u c t

R3)420 Hi_ROH MN

+H20

F i g . 1 2 . ( A ) M e c h a n i s m - b a s e d screen f o r an a c t i v e s i t e l y s i n e r e s i d u e . ( B ) The c o r r e s p o n d i n g a n t i b o dc a t a l y z e d a l d o l c o n d e n s a t i o n . I g , i m m u n o g l o b u l i n .SCIENCE * VOL. 2 6 9 * 2 9 SEPTEMBER 1 9 9 5

Q j M eM e 4 O

H3 6

- 1 5 ~ w o I i i l

RH 0H0 0 NH

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9 8 % y i e l d>9 9 % ee

H

| ( - ) - a c - m u l t i s t r i a t i n |F i g . 1 3 . S y n t h e s i s o f (-)-a m u l t i s t r i a t i n i n w h i c hth e k e y f i r s t s t e p i s c a t a l y z e d b y an a n t i b o d y ( e e ,e n a n t i o m e r i c e x c e s s ) .

T o generate a n t i b o d i e s t h a t m i g h t f u n c -t i o n b y a s i m i l a r m e c h a n i s m , W a g n e r a n dc o - w o r k e r s d e s i g n e d d i k e t o n e h a p t e n 4 0( F i g . 1 2 ) . T h i s h a p t e n c a n f o r m a s t a b l ev i n y l o g o u s a m i d e b y r e a c t i o n w i t h a p r i -mary a m i n e , s u c h as t h a t o f a l y s i n e s i d ec h a i n , i n an a n t i b o d y c o m b i n i n g s i t e . I t w a sa n t i c i p a t e d t h a t t h e i m m u n o l o g i c a l s e l e c -t i o n process w o u l d s e l e c t f o r c l o n e s t h a tf o r m s u c h c o v a l e n t a d d u c t s b e c a u s e o f t h e i rapparent h i g h a f f i n i t y f o r a n t i g e n , a n dt h e r e b y e l i c i t an a c t i v e s i t e n u c l e o p h i l e .Two a n t i b o d i e s t h a t f o r m s u c h a d d u c t swere i d e n t i f i e d a n d b o t h are e f f i c i e n t c a t a -l y s t s f o r t h e a l d o l c o n d e n s a t i o n o f 4 1 ( a c e -t o n e ) w i t h 4 2 ( 2 - p h e n y l p r o p i o n a l d e h y d e ) ;a n t i b o d y 3 3 F 1 2 p r o v i d e s a r a t e a c c e l e r a t i o n[ ( k c a t l K m ) I k i i n c , t ] o f g r e a t e r t h a n 1 0 9 - f o l d .B y p r e f e r e n t i a l l y c a t a l y z i n g t h e a d d i t i o n o ft h e e n a m i n e t o t h e s i f a c e o f t h e a l d e h y d e ,r e g a r d l e s s o f t h e s t e r e o c h e m i s t r y a t t h e2 - p o s i t i o n , t h e a n t i b o d y p r o d u c e s P - h y -d r o x y k e t o n e s i n h i g h ( > 9 5 % ) d i a s t e r e o -m e r i c excess. I n some cases t h e i n h e r e n ts t e r e o c h e m i c a l p r e f e r e n c e o f t h e r e a c t i o n i sr e v e r s e d , a f f o r d i n g t h e n o r m a l l y d i s f a v o r e dp r o d u c t i n d i a s t e r e o m e r i c excess as h i g h as8 3 % . T h i s r e a c t i o n u n d e r s c o r e s t h e m e c h -a n i s t i c c o m p l e x i t y t h a t c an b e g e n e r a t e dw i t h a p p r o p r i a t e l y d e s i g n e d h a p t e n .

11 . 0 -=t45 4

ff3F i g . 1 4 . A n R N A - c a t a l y z e d i s o m e r i z a t i o n r e a c t i o n .

I n a d d i t i o n t o s t r a t e g i e s i n v o l v i n g s y n -t h e t i c i m m u n o g e n s , m o r e b i o l o g i c a l l y o r i -e n t e d a p p r o a c h e s a r e b e i n g d e v e l o p e d f o rg e n e r a t i n g c a t a l y t i c a n t i b o d i e s . F o r e x a m -p l e , t h e h y d r o l y t i c a n t i b o d y 4 8 G 7 h a s b e e ne f f i c i e n t l y e x p r e s s e d i n E s c h e r i c h i a c o l i f o ru s e a s a m o d e l s y s t e m t o d e m o n s t r a t e t h ef e a s i b i l i t y o f u s i n g g e n e t i c s e l e c t i o n s b a s e do n c o m p l e m e n t a t i o n o f c o f a c t o r - d e f i c i e n ta u x o t r o p h s a s a g e n e r a l s t r a t e g y t o e n h a n c ec a t a l y t i c a c t i v i t y ( 5 9 ) . S i m i l a r a p p r o a c h e sa r e b e i n g d e v e l o p e d f o r s e l e c t i n g a n t i b o d i e sw i t h e n h a n c e d a c t i v i t y t h a t c a t a l y z e b i o -s y n t h e t i c r e a c t i o n s , s u c h a s t h e c o n v e r s i o no f c h o r i s m i c a c i d t o p r e p h e n i c a c i d ( 6 0 )a n d t h e d e c a r b o x y l a t i o n o f o r o t a t e ( 6 1 ) . F o rb o t h r e a c t i o n s , a n t i b o d i e s h a v e b e e n f o u n dt h a t c o m p l e m e n t a u x o t r o p h s l a c k i n g t h ec o r r e s p o n d i n g b i o s y n t h e t i c e n z y m e s . I n t h el a t t e r c a s e , t h i s c o m p l e m e n t a t i o n w a s u s e da s t h e b a s i s f o r s c r e e n i n g a l i b r a r y o f a n t i -b o d i e s g e n e r a t e d f r o m a m o u s e i m m u n i z e dw i t h a s y n t h e t i c i m m u n o g e n .

O t h e r i n t e r e s t i n g s t r a t e g i e s h a v e a l s o a p -p e a r e d f o r g e n e r a t i n g c a t a l y t i c a n t i b o d i e si n c l u d i n g t h e d e v e l o p m e n t o f r a p i d p l a t ea s s a y s f o r s c r e e n i n g l a r g e n u m b e r s o f a n t i -b o d i e s d i r e c t l y f o r c a t a l y s i s ( 6 2 , 6 3 ) . F o re x a m p l e , G r e e n a n d c o - w o r k e r s u s e d a na n t i b o d y s p e c i f i c f o r a r e a c t i o n p r o d u c t t os c r e e n h y b r i d o m a s u p e r n a t a n t s f o r c a t a l y s t s( 6 3 ) . T r a n s g e n i c m i c e h a v e b e e n g e n e r a t e dt h a t p r o d u c e a n t i b o d i e s w i t h a h i g h p e r -c e n t a g e o f m e t a l i o n - b i n d i n g l i g h t c h a i n s( 6 4 ) , a n a p p r o a c h t h a t m a y f a c i l i t a t e t h eg e n e r a t i o n o f c a t a l y t i c a n t i b o d i e s t h a t u s em e t a l i o n s a n d o t h e r c o f a c t o r s . C a t a l y t i ca n t i b o d i e s w i t h c h o l i n e s t e r a s e a c t i v i t y h a v ea l s o b e e n g e n e r a t e d b y i m m u n i z i n g m i c ew i t h a m o n o c l o n a l a n t i b o d y d i r e c t e da g a i n s t t h e a c t i v e s i t e o f a c e t y l c h o l i n e s t e r -a s e ( 6 5 ) . T h e c a t a l y t i c e f f i c i e n c y o f t h i sa n t i b o d y ( k c a t l k u n c a t - 4 X 1 0 8 ) i s q u i t eh i g h , s u g g e s t i n g t h a t t h i s a p p r o a c h m a yp r o v e u s e f u l f o r g e n e r a t i n g s t r u c t u r a l a n df u n c t i o n a l v a r i a n t s o f e n z y m e s .A p p l i c a t i o n s . I t i s l i k e l y t h a t w e w i l l b e -g i n t o s e e a p p l i c a t i o n s o f a n t i b o d y c a t a l y s i st o p r a c t i c a l p r o b l e m s i n c h e m i s t r y a n d m e d -i c i n e . A l r e a d y t h e r e h av e b ee n r e p o r t s i nt h e l i t e r a t u r e o f a n t i b o d y - c a t a l y z e d c o c a i n eh y d r o l y s i s ( 6 6 ) a n d a n t i b o d y - c a t a l y z e d p r o -d r u g a c t i v a t i o n ( 6 7 , 6 8 ) . I n t h e l a t t e r c a s e ,t h e u s e o f a c a t a l y t i c a n t i b o d y m a k e s p o s s i -b l e p r o d r u g a c t i v a t i o n b y a r e a c t i o n n o tc a t a l y z e d b y e n d o g e n o u s e n z y m e s . I n a d d i -t i o n , r e s e a r c h e f f o r t s a r e f o c u s i n g o n m e t h -o d s f o r e f f i c i e n t l y g e n e r a t i n g p o l y c l o n a lc a t a l y t i c a n t i b o d i e s i n t h e h o p e t h a t s o m e -d a y o n e m a y b e a b l e t o a c t i v e l y i m m u n i z ea n d p r o d u c e t h e r a p e u t i c c a t a l y t i c a n t i b o d -i e s ( 6 9 ) .T h e r e c e n t d e m o n s t r a t i o n t h a t e n a n t i -o s e l e c t i v e c o n v e r s i o n s c a n b e c a r r i e d o u t b ya n t i b o d i e s o n m u l t i g r a m s c a l e ( 7 0 ) a s w e l la s e f f o r t s a i m e d a t e x t e n d i n g a n t i b o d y c a -

SCIENCE * VOL. 2 6 9 * 2 9 SEPTEMBER 1 9 9 5

t a l y s i s t o o r g a n i c s o l v e n t s ( 7 1 ) s h o u l d f a c i l -i t a t e t h e u s e o f a n t i b o d i e s i n o r g a n i c c h e m -i s t r y . A r e c e n t r e p o r t d e s c r i b e s t h e u s e o f ac a t a l y t i c a n t i b o d y t o c a r r y o u t t h e k e y s y n -t h e t i c s t e p , t h e e n a n t i o s e l e c t i v e p r o t o n o l y -s i s o f a n e n o l e t h e r , i n t h e t o t a l s y n t h e s i s o f( - ) - a - m u l t i s t r i a t i n , t h e a g g r e g a t i o n p h e r o -m o n e o f t h e E u r o p e a n e l m b a r k b e e t l e ( F i g .1 3 ) ( 7 2 ) . T h i s r e a c t i o n , w h i c h w a s c a r r i e do u t i n g r e a t e r t h a n 9 9 % e n a n t i o m e r i c e x -c e s s a n d 9 8 % c h e m i c a l y i e l d , w a s f o l l o w e db y 1 0 c h e m i c a l s t e p s w i t h a l l f o u r a s y m m e t -r i c c e n t e r s o r i g i n a t i n g f r o m t h e c h i r a l i t ya c h i e v e d t h r o u g h t h e u s e o f t h e c a t a l y t i ca n t i b o d y .L i m i t a t i o n s . G i v e n t h a t o n e c a n g e n e r -a t e c a t a l y s t s f o r m a n y r e a c t i o n s ( e v e nt h o s e t h a t m a y h a v e c o m p l e x m e c h a -n i s m s ) , a t t e n t i o n h a s n a t u r a l l y f o c u s e d o nt h e p r a c t i c a l a s p e c t s o f t h e t e c h n o l o g y .T h e a b i l i t y t o u s e a n t i b o d y c a t a l y s t s i no r g a n i c s y n t h e s i s , m e d i c i n e , a n d i n d u s t r yr e d u c e s t o t h e s a m e g e n e r a l i s s u e s a s d oo t h e r e n z y m e s , s u c h a s t u r n o v e r , a c c e s s i -b i l i t y , a n d c o s t . W h e r e a s e a r l y a n t i b o d yc a t a l y s t s a c h i e v e d o n l y m o d e s t r a t e a c c e l -e r a t i o n s , m o r e r e c e n t l y d e v e l o p e d c a t a -l y s t s h a v e e n h a n c e d r a t e s , s o m e t i m e s r i -v a l i n g t h o s e o f n a t u r a l e n z y m e s . S t i l l , w em u st i mp r o ve t h e r a t e s o f t h o s e c a t a l y s t st h o u g h t t o b e o f p r a c t i c a l s i g n i f i c a n c e b yi m p r o v i n g m e t h o d s f o r g e n e r a t i n g a n ds c r e e n i n g a n t i b o d i e s . T h e r e a r e a l s o m a n yc l a s s e s o f r e a c t i o n s t h a t r e m a i n t o b e s u r -v e y e d ; e f f e c t i v e h a p t e n s m u s t b e d e s i g n e di n o r d e r t o c a t a l y z e s u c h r e a c t i o n s . I t i sn o t c l e a r , h o w e v e r , w h et h er s o m e o f t h em o r e c o m p l e x b e h a v i o r o f e n z y m e s s u c h a sa l l o s t e r i c a c t i v a t i o n c a n b e r e p l i c a t e d w i t ha n t i b o d i e s . A n o t h e r a s p e c t o f m o s t a n t i -b o d y c a t a l y s t s i s t h e i r h i g h s p e c i f i c i t y . I nm a n y i n s t a n c e s t h i s i s a g r e a t a s s e t , b u t f o rs o m e a p p l i c a t i o n s , f o r e x a m p l e i n o r g a n i cs y n t h e s i s , o n e w o u l d r a t h e r h a v e a c a t a l y s tt h a t w i l l c a r r y o u t a g i v e n t y p e o f t r a n s -f o r m a t i o n r e g a r d l e s s o f t h e s t r u c t u r e f e a -t u r e s s u r r o u n d i n g t h e r e a c t i v e c e n t e r . T h i si s l e s s l i k e l y w i t h a n t i b o d y c a t a l y s t s a n dw e e n v i s i o n t h a t m o s t o f t e n t h e y w i l l b ec u s t o m i z e d f o r s p e c i f i c t r a n s f o r m a t i o n sa n d w i l l o n l y u s e s u b s t r a t e s t h a t h a v e r e -l a t e d s t r u c t u r a l f e a t u r e s . C o s t e f f i c i e n c ya n d a v a i l a b i l i t y o f a n t i b o d i e s m u s t b e i m -p r o v e d . I n t e r m s o f a v a i l a b i l i t y , t h e m o n o -c l o n a l a n t i b o d y a n d c o m b i n a t o r i a l l i b r a r ym e t h o d o l o g y h a v e t u r n e d a n t i b o d i e s i n t or e a g e n t s l i k e a n y o t h e r i n t h a t h o m o g e -n e o u s a n d i m m o r t a l s o u r c e o f t h e r e a g e n te x i s t s a n d t h e r e a g e n t c a n b e t r a n s f e r r e df r o m l a b o r a t o r y t o l a b o r a t o r y o r s o l d .H o w e v e r , t h e d i v e r s i t y o f t h e i m m u n e s y st e m d i c t a t e s t h a t c a t a l y s t s i n d u c e d b y d i ff e r e n t i n v e s t i g a t o r s m a y d i f f e r i n t e r m s of i n e s p e c i f i c i t i e s . T h i s i s g e n e r a l l y a n a d -v a n t a g e s o l o n g a s f r e e e x c h a n g e a n d c a ta l o g i n g p r o c e d u r e s a r e c o m m e n s u r a t e w i t h

1 8 4 1

i . . .. 1 . 1 -- - - J low will

7/27/2019 Introduction to Enzyme Kinetics.pdf

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t h e g r o w i n g l i s t o f c a t a l y s t s , p a r t i c u l a r l yt h o s e o f i n t e r e s t f o r o r g a n i c s y n t h e s i s . T h ec u r r e n t h i g h c o s t o f a n t i b o d i e s i s b e i n ga d d r e s s e d w i t h i m p r o v e d b a c t e r i a l a n dy e a s t e x p r e s s i o n s y s t e m s a n d e x p r e s s i o n i np l a n t s a n d t h e i r s e e d s . I n a d d i t i o n , s o m ep r a c t i c a l p r o b l e m s a s s o c i a t e d w i t h t h e u s eo f a n t i b o d i e s m a y b e o v e r c o m e b y m a k i n gs c a f f o l d s t h a t c a r r y o u t t h e s a m e f u n c t i o n so f a n t i b o d y c a t a l y s t s ( 7 3 ) .F r o m a n t i b o d y l i b r a r i e s t o m a t e r i a l s s c i e n c e .F i n a l l y , m a n y o f t h e i d e a s t h a t f o r m t h eb a s i s f o r t h e w o r k d e s c r i b e d i n t h i s r e v i e wa r e b e i n g a p p l i e d e l s e w h e r e ( 6 - 1 0 ) . F o re x a m p l e , t h e p l a n a r p h e n a n t h r e n e t r a n s i -t i o n - s t a t e a n a l o g 4 4 h a s b e e n u s e d t o s c r e e nn u c l e i c a c i d l i b r a r i e s f o r RNAs t h a t c a t a l y z et h e i s o m e r i z a t i o n o f t h e s u b s t i t u t e d b i p h e -n y l 4 5 ( F i g . 1 4 ) ( 7 4 ) . I n v i t r o m e c h a n i s m -b a s e d s e l e c t i o n s u s i n g l a r g e RN A l i b r a r i e sh a v e y i e l d e d c a t a l y t i c RNAs f o r a v a r i e t y o fr e a c t i o n s . S u c h e x p e r i m e n t s a r e e x t e n d i n gRNA c a t a l y s i s f r o m p h o s p h o r y l t r a n s f e r r e -a c t i o n s t o n e w c l a s s e s o f c h e m i c a l t r a n s f o r -m a t i o n s . T h e s u c c e s s o f c h e m i s t r y i n e x -p l o i t i n g t h e m o l e c u l a r d i v e r s i t y o f t h e i m -m u n e s y s t e m t o g e n e r a t e s e l e c t i v e c a t a l y s t sp o i n t s t o t h e t r e m e n d o u s p o t e n t i a l o f c o m -b i n a t o r i a l l i b r a r i e s . I n d e e d t h e l e s s o n sl e a r n e d f r o m t h e c a t a l y t i c a n t i b o d i e s h a v er e c e n t l y f o u n d t h e i r w a y f r o m t h e b i o l o g ya n d c h e m i s t r y c o m m u n i t i e s t o t h e p h y s i c sc o m m u n i t y w i t h t h e r e p o r t t h a t l i b r a r i e se n c o m p a s s i n g v i r t u a l l y t h e e n t i r e p e r i o d i ct a b l e c a n n o w b e s c r e e n e d f o r i n t e r e s t i n gn e w p h y s i c a l p r o p e r t i e s s u c h a s s u p e r c o n -d u c t i v i t y a n d m a g n e t i s m ( 1 0 ) .

REFERENCES A ND NOTES1 . S . J . P o l l a c k , J . W . J a c o b s , P . G . S c h u l t z , S c i e n c e2 3 4 , 1 5 7 0 ( 1 9 8 6 ) ; A . T r a m o n t a n o , K . D . J a n d a , R . A .L e r n e r , i b i d . , p . 1 5 6 6 .2 . R . A . L e m e r , S . J . B e n k o v i c , P . G . S c h u l t z , i b i d . 2 5 2 ,6 5 9 ( 1 9 9 1 ) ; P . G . S c h u l t z a n d R . A . L e m e r , A c c .C h e m . R e s . 2 6 , 3 9 1 ( 1 9 9 3 ) .3 . M . R . H a y n e s , E . A . S t u r a , D . H i l v e r t , I . A . W i l s o n ,S c i e n c e 2 6 3 , 6 4 6 ( 1 9 9 4 ) .4 . G . W . Z h o u , J . G u o , W . H u a n g , R . J . F l e t t e r i c k , T . S .S c a n l a n , i b i d . 2 6 5 , 1 0 5 9 ( 1 9 9 4 ) .5 . B . P i m p a n e a n G o l i n i e l l i e t a l . , S t r u c t u r e 2 , 1 7 5( 1 9 9 4 ) .6 . C . F . B a r b a s , A . K a n g , R . A . L e r n e r , S . J . B e n k o v i c ,P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 8 8 , 7 9 7 8 ( 1 9 9 1 ) ; L .S a s t r y e t a l . , i b i d . 8 6 , 5 7 2 8 ( 1 9 8 9 ) ; J . D . M a r k s e t a l . ,J . M o l . B i o l . 2 2 2 , 4 8 1 ( 1 9 9 1 ) .7 . C . T u e r k a n d L . G o l d , S c i e n c e 2 4 9 , 5 0 5 ( 1 9 9 0 ) ; A . D .E l l i n g t o n a n d J . W . S z o s t a k , N a t u r e 3 4 6 , 8 1 8 ( 1 9 9 0 ) .8 . J . K . S c o t t a n d G . P . S m i t h , S c i e n c e 2 4 9 , 3 8 6 ( 1 9 9 0 ) ;J . J . D e v i i n , L . C . P a n g a n i b a n , P . E . D e v i i n , i b i d . , p .4 0 4 ; S . E . C w i r l a , E . A . P e t e r s , R . W . B a r r e t t , W . J .D o w e r , P r o c . N a t i . A c a d . S c i . U . S . A . 8 7 , 6 3 7 8 ( 1 9 9 0 ) ;A . M . B r a y , N . J . M a e j i , H . M . G e y s e n , T e t r a h e d r o nL e t t . 3 1 , 5 8 1 1 ( 1 9 9 0 ) ; M . C . N e e d l e s e t a l . , P r o c . N a t i .A c a d . S c i . U . S . A . 9 0 , 1 0 7 0 0 ( 1 9 9 3 ) ; S . P . A . F o d o r e ta l , S c i e n c e 2 5 1 , 7 6 7 ( 1 9 9 1 ) ; M . H . J . O h i m e y e r e t a l . ,P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 9 0 , 1 0 9 2 2 ( 1 9 9 3 ) .9 . B . A . B u n i n , M . J . P l u n k e t t , J . A . E l l m a n , P r o c . N a t l .A c a d . S c i . U . S . A . 9 1 , 4 7 0 8 ( 1 9 9 4 ) .1 0 . X . - D . X i a n g e t a l . , S c i e n c e 2 6 8 , 1 7 3 8 ( 1 9 9 5 ) .1 1 . D . P r e s s m a n a n d A . G r o s s b e r g , T h e S t r u c t u r a l B a s i so f t A n t i b o d y S p e c i f i c i t y ( B e n j a m i n , Ne w Y o r k , 1 9 6 8 ) ;

J . W . G o o d m a n , T h e A n t i g e n , M . S e l a , E d . ( A c a d e m -i c P r e s s , New Y o r k , 1 9 8 5 ) , v o l . 3 ; A . N i s o n o f f , J .H o p p e r , S . S p r i n g , T h e A n t i b o d y M o l e c u l e ( A c a d e m -i c P r e s s , New Y o r k , 1 9 7 5 ) ; T . H o n j o a n d S . H a b u ,A n n u . R e v . B i o c h e m . 5 4 , 8 0 3 ( 1 9 8 5 ) .1 2 . J . B . S . H a l d a n e , E n z y m e s ( L o n g m a n s G r e e n , L o n -d o n , 1 9 3 0 ) , p . 1 8 2 ; L . P a u l i n g , C h e m . E n g . News 2 4 ,1 3 7 5 ( 1 9 4 6 ) .1 3 . D . K . L a v a i l e e , M o l . S t r u c t . E n e r g y 9 , 2 7 9 ( 1 9 8 8 ) .1 4 . H . A . D a i l e y a n d J . E . F l e m i n g , J . B i o l . C h e m . 1 1 , 4 5 3( 1 9 8 3 ) .1 5 . A . G . C o c h r a n a n d P . G . S c h u l t z , S c i e n c e 2 4 9 , 7 8 1( 1 9 9 0 ) .1 6 . S . J . P o l l a c k , P . H s u i n , P . G . S c h u l t z , J . A m . C h e m .S o c . 1 1 1 , 5 9 6 1 ( 1 9 8 9 ) ; K . D . J a n d a e t a l . , i b i d . 1 1 2 ,8 8 8 6 ( 1 9 9 0 ) ; S . I k e d a , M . I . W e i n h o w e , K . D . J a n d a ,R . A . L e r n e r , S . J . D a n i s h e f s k y , i b i d . 1 1 3 , 7 7 6 4( 1 9 9 1 ) ; K . D . J a n d a , S . J . B e n k o v i c , R . A . L e r n e r ,S c i e n c e 2 4 4 , 4 3 7 ( 1 9 8 9 ) ; A . D . N a p p e r , S . J . B e n -k o v i c , A . T r a m o n t a n o , R . A . L e r n e r , i b i d . 2 3 7 , 1 0 4 1( 1 9 8 7 ) .1 7 . K . D . J a n d a , D . S c h l o e d e r , S . J . B e n k o v i c , R . A .L e r n e r , S c i e n c e 2 4 1 , 1 1 8 8 ( 1 9 8 8 ) ; B . L . I v e r s o n a n dR . A . L e m e r , i b i d . 2 4 3 , 1 1 8 4 ( 1 9 8 9 ) .1 8 . P . W i r s c h i n g , J . A . A s h l e y , S . J . B e n k o v i c , K . D .J a n d a , R . A . L e r n e r , i b i d . 2 5 2 , 6 8 0 ( 1 9 9 1 ) .1 9 . J . R . J a c o b s e n , J . R . P r u d e n t , L . K o c h e r s p e r g e r , S .Y o n k o v i c h , P . G . S c h u l t z , i b i d . 2 5 6 , 3 6 5 ( 1 9 9 2 ) .2 0 . J . R . J a c o b s e n a n d P . G . S c h u l t z , P r o c . N a t i . A c a d .S c i . U . S . A . 9 1 , 5 8 8 8 ( 1 9 9 4 ) .2 1 . R . H i r s c h m a n n e t a l . , S c i e n c e 2 6 5 , 2 3 4 ( 1 9 9 4 ) .2 2 . R . J . F l e t t e r i c k a n d T . S . S c a n l a n , u n p u b l i s h e dr e s u l t s .2 3 . D . Y . J a c k s o n , J . R . P r u d e n t , E . P . B a l d w i n , P . G .S c h u l t z , P r o c . N a t i . A c a d . S c i . U . S . A . 8 8 , 5 8 ( 1 9 9 1 ) .2 4 . F o r t h e i n t r o d u c t i o n o f a g e n e r a l b a s e i n t o a n o n c a t a -l y t i c a n t i b o d y , s e e E . B a l d w i n a n d P . G . S c h u l t z ,S c i e n c e 2 4 5 , 1 1 0 4 ( 1 9 8 9 ) .2 5 . P . A . P a t t e n , R . S t e v e n s , P . G . S c h u l t z , u n p u b l i s h e dr e s u l t s .2 6 . P . R . A n d r e w s , G . D . S m i t h , I . G . Y o u n g , B i o c h e m -i s t r y 1 2 , 3 4 9 2 ( 1 9 7 3 ) ; H . G b r i s c h , i b i d . 1 7 , 3 7 0 0( 1 9 7 9 ) ; S . G . S o g o e t a l . , J . A m . C h e m . S o c . 1 0 6 ,2 7 0 1 ( 1 9 8 4 ) ; S . D . C o p l e y a n d J . R . K n o w l e s , i b i d .1 0 9 , 5 0 0 8 ( 1 9 8 7 ) ; i b i d . 1 0 7 , 5 3 0 6 ( 1 9 8 5 ) ; W . J . G u i l -f o r d , S . D . C o p l e y , J . R . K n o w l e s , i b i d . 1 0 9 , 5 0 1 3( 1 9 8 7 ) ; J . V . G r a y , D . E r e n , J . R . K n o w l e s , B i o c h e m -i s t r y 2 9 , 8 8 7 2 ( 1 9 9 0 ) .2 7 . D . H i l v e r t , S . H . C a r p e n t e r , K . D . N a r e d , M . - T . M .A u d i t o r , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 8 5 , 4 9 5 3( 1 9 8 8 ) ; D . H i l v e r t a n d K . D . N a r e d , J . A m . C h e m .S o c . 1 1 0 , 5 5 9 3 ( 1 9 8 8 ) .2 8 . D . Y . J a c k s o n e t a l . , J . A m . C h e m . S o c . 1 1 0 , 4 8 4 1( 1 9 8 8 ) ; D . Y . J a c k s o n , M . N . L i a n g , P . A . B a r t l e t t , P .G . S c h u l t z , A n g e w . C h e m . I n t . E d . E n g l . 3 1 , 1 8 2( 1 9 9 2 ) .2 9 . K . M . S h o k a t , C . J . L e u m a n n , R . S u g a s a w a r a , P . G .S c h u l t z , N a t u r e 3 3 8 , 2 6 9 ( 1 9 8 9 ) ; K . M . S h o k a t , T .U n o , P . G . S c h u l t z , J . A m . C h e m . S o c . 1 1 6 , 2 2 6 1( 1 9 9 4 ) .3 0 . S . N . T h o r n , R . G . D a n i e l s , M . - T . M . A u d i t o r , D .H i l v e r t , N a t u r e 3 7 3 , 2 8 8 ( 1 9 9 5 ) .3 1 . A . M . S h u s t e r e t a l . , S c i e n c e 2 5 6 , 6 6 5 ( 1 9 9 2 ) ; G . V .G o l o l o b o v e t a l . , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 9 2 ,2 5 4 ( 1 9 9 5 ) .3 2 . S . P a u l e t a l . , S c i e n c e 2 4 4 , 1 1 5 8 ( 1 9 8 9 ) .3 3 . F o r g e n e r a l r e v i e w s o f p e r i c y c l i c r e a c t i o n s , s e e A . P .M a r c h a n d a n d R . E . L e h r , P e r i c y c l i c R e a c t i o n s ( A c -a d e m i c P r e s s , New Y o r k , 1 9 7 7 ) ; R . B . Woodwarda n d R . H o f f m a n n , T h e C o n s e r v a t i o n o f O r b i t a l S y m -m e t r y ( C a m b r i d g e U n i v . P r e s s , L o n d o n , 1 9 7 2 ) .3 4 . D . H i l v e r t , K . W . H i l l , K . D . N a r e d , M . - T . M . A u d i t o r , J .A m . C h e m . S o c . 1 1 1 , 9 2 6 1 ( 1 9 8 9 ) .3 5 . A . C . B r a i s t e d a n d P . G . S c h u l t z , i b i d . 1 1 2 , 7 4 3 0( 1 9 9 0 ) .3 6 . F o r a g e n e r a l r e v i e w , s e e J . S a u er a n d R . S u s t m a n n ,A n g e w . C h e m . I n t . E d . E n g l . 1 9 , 7 7 9 ( 1 9 8 0 ) .3 7 . V . E . G o u v e r n e u r e t a l . , S c i e n c e 2 6 2 , 2 0 4 ( 1 9 9 3 ) .3 8 . F o r r e v i e w o f t h e C o p e r e a r r a n g e m e n t , s e e S . J .R h o a d s a n d N . R . R a u l i n s , O r g . R e a c t . 2 2 , 1 ( 1 9 7 5 ) ;W . v . E . D o e r i n g a n d W . R . R o t h , A n g e w . C h e m . I n t .E d . E n g l . 2 , 1 1 5 ( 1 9 6 3 ) .3 9 . A . C . B r a i s t e d a n d P . G . S c h u l t z , J . Am. C h e m . S o c .1 1 6 , 2 2 1 1 ( 1 9 9 4 ) .

4 0 . F o r e x a m p l e s o f c a t a l y t i c a n t i b o d i e s t h a t u s e e n zm a t i c c o f a c t o r s , s e e A . C o c h r an a n d P . G . S c h u l ti b i d . 1 1 2 , 9 4 1 4 ( 1 9 9 0 ) ; A . G . C o c h r a n , T . P h a m ,S u g a s a w a r a , P . G . S c h u l t z , i b i d . 1 1 3 , 6 6 7 0 ( 1 9 9 1 )4 1 . L . C . H s i e h , J . C . S t e p h a n s , P . G . S c h u l t z , i b i d . 1 12 1 6 7 ( 1 9 9 4 ) .4 2 . B . P . B ra n c h a u d a n d C . T . W a l s h , i b i d . 1 0 7 , 2 1 5( 1 9 8 5 ) ; D . R . L i g h t , D . J . W a x m a n , C . W a l s h , B ic h e m i s t r y 2 1 , 2 4 9 0 ( 1 9 8 2 ) ; D . J . W a x m a n , D .L i g h t , C . W a l s h , i b i d . , p . 2 4 9 9 .4 3 . G . R . N a k a y a m a a n d P . G . S c h u l t z , J . A m . C h emS o c . 1 1 4 , 7 8 0 ( 1 9 9 2 ) ; J . S u h e t a l . , B u l l . K o r e aC h e m . S o c . 1 2 , 3 5 2 ( 1 9 9 1 ) .4 4 . L . C . H s i e h , S . Y o n k o v i c h , L . K o c h e r s p e r g e r , P . GS c h u l t z , S c i e n c e 2 6 0 , 3 3 7 ( 1 9 9 3 ) .4 5 . T . K i t a z u m e e t a l . , J . A m . C h e m . S oc . 1 13 , 8 5 7( 1 9 9 1 ) .4 6 . A . K o c h , J . - L . R e y m o n d , R . A . L e r n e r , i b i d . 1 1 6 , 8 0( 1 9 9 4 ) .4 7 . K . D . J a n d a , C . G . S h e v i i n , R . A . L e r n e r , S c i e n2 5 9 , 4 9 0 ( 1 9 9 3 ) .4 8 . J . E . B a l d w i n , C h e m . Commun. 1 9 7 6 , 7 3 4 ( 1 9 7 6 ) ;E . B a l d w i n e t a l . , i b i d . 1 9 7 7 , 2 3 3 ( 1 9 7 7 ) ; J . E . B a lw i n a n d M . J . L u s c h , T e t r a h e d r o n 1 9 , 2 9 3 9 ( 1 9 8 2 )4 9 . B . F . C r a v a t t e , J . A . A s h l e y , K . D . J a n d a , D . L . B o g eR . A . L e r n e r , J . A m . C h e m . S o c . 1 1 6 , 6 0 1 3 ( 1 9 9 4 )5 0 . R . A . B a r t s c h a n d J . Z d v a d a , C h e m . R e v . 8 0 , 4 5( 1 9 8 0 ) ; J . M a r c h , A d v a n c e d O rg a ni c C h em i st( W i l e y , New Y o r k , 1 9 8 5 ) , p p . 8 7 4 - 8 8 0 ; J . K . B oc h a r d t , J . C . S w a n s o n , W . H . S a u n d e r s J r . , J . A mC h e m . S o c . 9 6 , 3 9 1 8 ( 1 9 7 4 ) .5 1 . D . S h a b a t , H . I t z h a k y , J . - L . R e y m o n d , E . K e i n aN a t u r e 3 7 4 , 1 4 3 ( 1 9 9 5 ) .5 2 . T . U n o , B . G o n g , P . G . S c h u l t z , J . A m . C h e m . S o c1 1 6 , 1 1 4 5 ( 1 9 9 4 ) .5 3 . K . D . J a n d a , C . G . S h e v i i n , R . A . L e m e r , i b i d . ,p r e s s .5 4 . Y . I w a b u c h i e t a l . , i b i d . 1 1 6 , 7 7 1 ( 1 9 9 4 ) .5 5 . J . - L . R e y m o n d , K . D . J a n d a , R . A . L e r n e r , i b i d . 1 12 2 5 7 ( 1 9 9 2 ) .5 6 . T . L i , K . D . J a n d a , J . A . A s h l e y , R . A . L e r n e r , S c i e n2 6 4 , 1 2 8 9 ( 1 9 9 4 ) .5 7 . K . D . J a n d a e t a l . , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 92 5 3 2 ( 1 9 9 4 ) .5 8 . C . B a r b a s e t a l . , u n p u b l i s h e d r e s u l t s .5 9 . S . A . L e s l e y , P . A . P a t t e n , P . G . S c h u l t z , P r o c . N a tA c a d . S c i . U . S . A . 9 0 , 1 1 6 0 ( 1 9 9 3 ) .6 0 . Y . T a n g , J . B . H i c k s , D . H i l v e r t , i b i d . 8 8 , 8 7 8 4 ( 1 9 9 16 1 . J . A . S m i l e y a n d S . J . B e n k o v i c , i b i d . 9 1 , 8 3 1( 1 9 9 4 ) .6 2 . B . G o n g , S . A . L e s l e y , P . G . S c h u l t z , J . A m . C h e mS o c . 1 1 4 , 1 4 8 6 ( 1 9 9 2 ) ; J . Y u e t a l . , A n g e w . C h e mI n t . E d . E n g l . 3 3 , 3 3 9 ( 1 9 9 4 ) .6 3 . D . S . T a w f i k , B . S . G r e e n , R . C h a p , Z . E s h h a r , P r oN a t i . A c a d . S c i . U . S . A . 9 0 , 3 7 3 ( 1 9 9 3 ) .6 4 . N . S a r v e t n i c k e t a l . , i b i d . , p . 4 0 0 8 .6 5 . L . I z a d y a r , A . B r i b o u l e t , M . H . R e m y , A . R o s e t o ,T h o m a s , i b i d . , p . 8 8 7 6 .6 6 . D . W . L a n d r y , K . Z h a o , G . X . - Q . Y a n g , M . G l i c k m a nT . M . G e o r g i a d i s , S c i e n c e 2 5 9 , 1 8 9 9 ( 1 9 9 3 ) .6 7 . H . M i y a s h i t a , Y . K a r a k i , M . K i k u c h i , I . F u j i i , P r o c . N a tA c a d . S c i . U . S . A . 9 0 , 5 3 3 7 ( 1 9 9 3 ) .6 8 . D . A . C a m p b e l l e t a l . , J . A m . C h e m . S o c . 1 1 6 , 2 1 6( 1 9 9 4 ) .6 9 . G . G a l l a c h e r , M . S e a r c y , C . S . J a c k s o n , K . B r o c k lh u r s t , B i o c h e m . J . 2 8 4 , 6 7 5 ( 1 9 9 2 ) ; D . B . S t e p h aa n d B . L . I v e r s o n , B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n1 9 2 , 1 4 3 9 ( 1 9 9 3 ) .

7 0 . J . - L . R e y m o n d , J . - L . R e b e r , R . A . L e m e r , A n g e wC h e m . I n t . E d . E n g i . 3 3 , 4 7 5 ( 1 9 9 4 ) .7 1 . C . N . D u r f o r e t a l . , J . A m . C h e m . S o c . 1 1 0 , 8 7 1( 1 9 8 8 ) ; J . A . A s h l e y a n d K . D . J a n d a , J . O r g . C h e m5 7 , 6 6 9 1 ( 1 9 9 2 ) .7 2 . S . C . S i n h a a n d E . K e i n a n , J . Am. C h e m . S o c . 1 13 6 5 3 ( 1 9 9 5 ) .7 3 . J . K u a n d P . G . S c h u l t z , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S .9 2 , 6 5 5 2 ( 1 9 9 5 ) .7 4 . J . R . P r u d e n t , T . U n o , P . G . S c h u l t z , S c i e n c e 2 61 9 2 4 ( 1 9 9 4 ) .7 5 . We a re g r a t e f u l f o r f i n a n c i a l s u p p o r t f o r t h i s w o r k f rt h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h , O f f i c e o f N a v a l Rs e a r c h , a n d t h e U . S . D e p a r t m e n t o f E n e r g y . P . G . S .a H o w a r d H u g h e s M e d i c a l I n s t i t u t e I n v e s t i g a t o r .

SCIENCE * V O L . 2 6 9 * 2 9 SEPTEMBER 1 9 9 5

m b~-l o w l O M 1 . M i ll e og c ib ~ .,

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