Investigation of Fecal Contamination in the Little River Basin, Kentucky using Microbial Source Tracking and Fecal 

Indicator Bacteria, 2013 ‐2014

Mac A Cherry ‐ Hydrologist U.S. Geological Survey : Indiana‐Kentucky WSC

macherry@usgs.gov

2016 Soil and Water Conservation Society Annual 

Conference

Partnerships

Local producers

In 2009, the Kentucky Division of Water completed and approved a pathogen TMDL for the Little River Basin

Pathogens – including bacteria, viruses, protozoa, and some parasites ‐ are responsible for numerous human diseases including hepatitis and pneumonia

Background

BackgroundPathogens are not directly sampled (typically)• A large number of pathogens exist• Difficult/dangerous to culture• Distributed sporadically in water

Fecal‐indicator bacteria (FIB) used as proxy• Can be easily cultured• Have a correlation with pathogens• Escherichia coli (E. coli), total coliform, fecal coliform

IDEXX 2014

Drawbacks of only using FIB to evaluate pathogens• Do not identify host sources of contamination• FIB can not only survive, but reproduce in natural 

environments• FIB can be found in bottom sediments

Background

IDEXX 2014

Objective

To use microbial‐source tracking and fecal indicator bacteria to identify the sources and geographic distribution of fecal contamination in the Little River Basin

Goals:– Quantify concentrations of fecal‐indicator bacteria (E. coli) in water and sediment samples

– Isolate the geographic areas and host sources that contribute fecal contamination with the quantitative polymerase chain reaction (qPCR) method

• SOURCES: Mixed, Human, Bovine, Canine, and Waterfowl

###

#

## # #

#

#

#

# #

#

#

#

#

#

#

LR03

SF05

SF04SF03

SF02 SF01

NF02

NF01

LR01

LR02

SF08

SF07 SF06SF09

SF10

SF11SF12

SF13SF14

19 sites total

3 main stream sites

2 north forksites

14 south fork sites

Drainage mi 2

Developed %

Forest%

Pasture%

Row Crop %

Water% Other     %

SF 67.4 22 30 17 19 10 2NF 58.1 14 36 32 17 1 na

Study Area 200 10 27 24 38 1 na

Methods 

FIB E. coli –Water : 225 samples

• Colilert®/Quanti‐Tray®2000• 8‐hour holding time

– Fluvial Sediment : 238 sample• Colilert®/Quanti‐Tray®2000• 24‐hour holding time

Microbial Source Tracking ‐ qPCR

–Water samples• 24‐hour holing times

–Host‐source samples• Waste‐water treatment plant

• Dogs/cows/chicken

Timeline: 2013 – 2014 recreation season(April to October)

Methods ‐MSTqPCR analytical method

– Based on concept that intestinal microbes  ‐Bacteriodes ‐ vary between warm‐bloodedintestinal systems

– 5 markers:• GenBac – General• qHF183 – Human• BacCan – Canine• BoBac – Bovine• GFD – Waterfowl 

http://thebookofhealthblog.blogspot.com/2010/12/bacteroides.html

Results: E. coli Water

LR01

LR02

LR03

NF01SF01

SF02

SF03

SF04

SF05

SF06

SF07

SF08SF10

SF11

SF12

SF13

SF14

20

100

1,000

10,000

100,000

E. co

li MPN

/ 100

mL

ab

ab

b

a

b

a

b

ab

a b

b

410

ab

ab

ab

ab

ab ab

ab

ab

NF02

34 % > the 410 MPN/100mL STV

SF09

Peto and Peto modified Gehan‐Wilcoxon test (p‐value < 0.001)

E. Coli in Water

LR03

SF05

SF04

SF03SF

02

SF05

NF02

NF01

LR01

LR02

SF08

SF07

SF06

SF09

SF10

SF11

SF12SF

14

3 main stream sites

2 north forksites

14 south fork sites

Results – E. coli Water SF02 SF

01

Study AreaBoundary

SF13

SF10

LR03

SF05

SF04 SF

03

NF02

NF01

LR01

LR02

SF08

SF07

SF06

SF10

SF11

SF12SF13

SF14

3 main stream sites

14 south fork sites

Results – E. coli Fluvial Sediment

Study AreaBoundary

SF02 SF

01

LR03

NF02

NF01

2 north forksites

SF12

SF13

SF11

SF10

NF01

NF01

Percent (%) detection in water samples, (samples above detection limit / number of samples)

Pecent det ection6 WWTP 100(5/5) 100(5/5) 100(5/5) 100(5/5) 0( 0/ 5)

Results – MST water samples

Site Genbac qHF183 BacCan BoBacNF02 100 (13/13) 100 (13/13) 69 (9/13) 100 (13/13)SF01 100 (12/12) 17 (2/12) 25 (3/12) 58 (7/12)SF02 100 (9/9) 33 (3/9) 55 (5/9) 67 (6/9)SF04 100 (10/10) 0 (0/9) 44( 4/9) 78 (7/9)SF06 100 (13/13) 30 (3/10) 31 (4/13) 42 (5/12)SF07 100 (13/13) 38 (5/13) 17 (2/12) 67 (8/12)SF10 100 (13/13) 18 (2/11) 15 (2/13) 23 (3/13)SF13 100 (14/14) 0 (0/14) 43 (6/14) 93 (13/14)SF14 100(12/12) 09 (1/11) 17 (2/12) 75 (9/12)LR01 100 (8/8) 25 (2/8) 0 (0/8) 38 (3/8)LR02 100 (4/4) 0 (0/4) 0 (0/5) 100 (4/4)

SiteGenbac(General)

qHF183(Human)

BacCan(Canine)

BoBac(Bovine)

NF02 5.0 x 10 7 2.9 x 10 5 5.4 x 10 3 1.9 x 10 4

SF01 1.5 x 10 7 NQ 2.5 x 10 3 1.2 x 10 3

SF02 2.0 x 10 6 NQ 1.2 x 10 3 2.1 x 10 4

SF04 2.5 x 10 6 NQ NQ 6.1 x 10 4

SF06 9.6 x 10 5 NQ NQ NQ

SF07 1.7 x 10 7 NQ NQ 1.6 x 10 3

SF10 1.3 x 10 7 NQ NQ NQ

SF13 2.5 x 10 7 NQ NQ 9.4 x 10 3

SF14 5.7 x 10 6 NQ NQ 1.1 x 10 3

LR01 1.9 x 10 7 NQ NQ NQ

LR02 4.0 x 10 7 NQ NQ 6.5 x 10 3

Medians copies/100mL (not quantifiable)Results – MST water samples

NF02 08/13/20132,250 MPN/100mL

SiteGenbac(General)

qHF183(Human)

BacCan(Canine)

BoBac(Bovine)

NF02 5.0 x 10 7 2.9 x 10 5 5.4 x 10 3 1.9 x 10 4

SF01 1.5 x 10 7 NQ 2.5 x 10 3 1.2 x 10 3

SF02 2.0 x 10 6 NQ 1.2 x 10 3 2.1 x 10 4

SF04 2.5 x 10 6 NQ NQ 6.1 x 10 4

SF06 9.6 x 10 5 NQ NQ NQSF07 1.7 x 10 7 NQ NQ 1.6 x 10 3

SF10 1.3 x 10 7 NQ NQ NQSF13 2.5 x 10 7 NQ NQ 9.4 x 10 3

SF14 5.7 x 10 6 NQ NQ 1.1 x 10 3

LR01 1.9 x 10 7 NQ NQ NQLR02 4.0 x 10 7 NQ NQ 6.5 x 10 3

Results – MSTMedians copies/100mL ; NQ not quantifiable

SF04

SiteGenbac(General)

qHF183(Human)

BacCan(Canine)

BoBac(Bovine)

NF02 5.0 x 10 7 2.9 x 10 5 5.4 x 10 3 1.9 x 10 4

SF01 1.5 x 10 7 NQ 2.5 x 10 3 1.2 x 10 3

SF02 2.0 x 10 6 NQ 1.2 x 10 3 2.1 x 10 4

SF04 2.5 x 10 6 NQ NQ 6.1 x 10 4

SF06 9.6 x 10 5 NQ NQ NQSF07 1.7 x 10 7 NQ NQ 1.6 x 10 3

SF10 1.3 x 10 7 NQ NQ NQSF13 2.5 x 10 7 NQ NQ 9.4 x 10 3

SF14 5.7 x 10 6 NQ NQ 1.1 x 10 3

LR01 1.9 x 10 7 NQ NQ NQLR02 4.0 x 10 7 NQ NQ 6.5 x 10 3

Results –MST water samplesMedians copies/100mL (not quantifiable)

The greatest amount of FIB (water), and Mixed, Human, and Canine contamination came from from NF02(mouth of the North Fork)

The greatest amount of Bovine contamination came from the headwaters of SF02

Which basin is contributing more fecal contamination ‐????? Need flow data and more sites in the North Fork

Conclusions

The END