中南大学学报（医学版）

J Cent South Univ (Med Sci) 2014, 39(8) http://www.csumed.org764

IPO8 基因启动子的克隆及转录活性分析

熊建军1，龚帧1，周小鸥1，王庭1，刘建云2，李卫东2

(1. 九江学院基础医学院药理教研室，江西 九江 332000；2. 江西省系统生物医学重点实验室，江西 九江 332000)

[摘要] 目的：克隆IPO8基因5'端非编码序列，探讨其转录活性。方法：应用cDNA 5'末端快速扩增(rapid

ampli�cation of cDNA ends，5'�CE)方法定位IPO8基因转录起始点；在此基础上针对其5'端非编码区包括转录起始点在

内的–3302 ~ +134区域分段进行PCR扩增，将产物克隆入荧光素酶表达载体pGL3-Basic。经酶切鉴定后，将重组质粒与

内参质粒pRL-TK共转染人骨肉瘤细胞Saos-2，用双荧光素酶活性检测以确定其转录活性。结果：成功确定IPO8基因

转录起始位点，酶切结果证实IPO8基因5'端非编码区6条续减片段正确插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic。重组

质粒转染Saos-2细胞后检测到荧光素酶的高表达(P<0.05)。结论：成功构建具有转录活性的IPO8启动子片段，为进一

步研究IPO8表达调控机制奠定了基础。

[关键词] IPO8；启动子；报告基因

Cloning of IPO8 promoter and analysis of its transcription activity

XIONG Jianjun1, GONG Zhen1, ZHOU Xiao’ou1, WANG Ting1, LIU Jianyun2, LI Weidong2

(1. Department of Pharmacology, College of Basic Medical Science, Jiujiang University, Jiujiang Jiangxi 332000; 2. Key Laboratory of Jiangxi Province for the Systems Bio-medicine, Jiujiang Jiangxi 332000, China)

ABSTRACT Objective: To clone 5' untranslated region of human IPO8 gene and determine its transcription activity.

Methods: We used 5' rapid amplification of cDNA ends (RACE) analysis to identify the IPO8 transcription start site (TSS), and amplified series truncated 5' UTR fragment containing transcription start site. The PCR productions were inserted into luciferase report vector pGL3-Basic. After confirmation by restriction enzyme digestion, the recombinant plasmids were co-transfected into Saos-2 cells with plasmid pRL-TK. The luciferase activities were measured by dual luciferase reporter system.

Results: The IPO8 gene transcription start site was established. The electrophoresis analysis of restriction enzyme digestion and DNA sequencing verified the fragments were successfully

收稿日期(Date of reception)：2014-03-10

作者简介(Biography)：熊建军，博士，副教授，主要从事基因表达调控方面的研究。

通信作者(Corresponding author)：李卫东，Email: lwd626518@163.com

基金项目(Foundation item)：国家自然科学基金(81060075，81260140)；江西省教育厅科学研究项目(GJJ12683)。This work was supported by the

National Nature Science Foundation of China (81060075, 81260140), and the Key Projects of Jiangxi Provincial Education Department, P. R. China (GJJ12683).

DOI:10.11817/j.issn.1672-7347.2014.08.002

www.csumed.org/xbwk/fileup/PDF/201408764.pdf

IPO8 基因启动子的克隆及转录活性分析 熊建军，等 765

amplified and inserted into pGL3-Basic. After the recombinant plasmids transfected, the high-expressions of luciferase were detected in Saos-2 cells.

Conclusion: The recombinant vector containing IPO8 promoter is constructed successfully, which provides a foundation for determining expressional regulation of IPO8 in the further study.

KEY WORDS IPO8; promoter; report gene

核 转 运 受 体 包 括 Importin α 和 Importin β 两

个家族，在蛋白的主动运输过程中发挥了决定性

的 作 用。Importin α 和 β 分 别 识 别 不 同 的 蛋 白 核

定位信号，介导不同类型核蛋白入核 [1]。IPO8 是

Importin β 家 族 成 员 之 一， 定 位 于 人 类 常 染 色 体

的 12p11.21，其编码蛋白质的 N 端含有 Ran-GTP结合域，能够与核孔蛋白相互作用介导核蛋白的

入 核 转 运 [2]。 目 前 已 发 现 的 受 IPO8 蛋 白 转 运 的

底 物 有 信 号 识 别 颗 粒 19(signal recognition particle 19，SPR19)[3]、糖皮质激素受体 [4]、Smad 蛋白 [5]

和 NF-κB[6] 等。然而近来研究 [7-8] 显示 IPO8 蛋白

的功能并不仅局限于核质转运。例如，Weinmann等 [7] 发 现：IPO8 蛋 白 与 胞 质 内 miRNA 介 导 的

基 因 沉 默 有 内 在 联 系， 抑 制 IPO8 表 达 导 致 部 分

miRNA 靶 基 因 的 上 调， 其 原 因 在 于 IPO8 蛋 白 是

Argonaute(AGO) 蛋白重要的调节因素。已知 AGO蛋白在所有已知的小 RNA 沉默通路中发挥关键作

用， 其 选 择 性 地 与 miRNA 和 siRNA 结 合， 并 与

Dicer 酶相互作用，介导靶 mRNA 的降解 [8]。在这

一 过 程 中，IPO8 蛋 白 与 AGO 蛋 白 相 互 作 用 是 介

导后者与靶 mRNA 结合的必经环节 [9]。这一研究

表明 IPO8 蛋白的表达对于细胞具有重要的生理意

义。但是目前有关 IPO8 基因的转录调控的机制尚

未见报道。本研究通过克隆 IPO8 基因启动子，并

对其转录活性进行分析和研究，旨在为研究 IPO8

基因的表达调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌 DH5α、人骨肉瘤细胞株 Saos-2 均由

江西省系统生物医学重点实验室保存；质粒 pGL3-Basic 及 pRL -TK 转染试剂 Fugene6.0 及双荧光素酶

报告基因检测试剂盒为美国 Promega 公司产品；5'末 端 快 速 扩 增 (rapid amplification of cDNA ends，

5'RACE) 试剂盒、LA-TaqDNA 聚合酶、内切酶 Mlu I、

Bgl II、T4 DNA 连接酶、DL10000DNA Marker 等购

自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司；基因组抽提试剂

盒、DNA 凝胶回收试剂盒购自北京天为时代科技

有限公司；DMEM 培养基和胎牛血清 (FBS) 购自

美国 Gibco 公司；所有引物由广州英骏生物技术有

限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

采 用 引 物 设 计 软 件 Primer Premier 5.0， 根 据

人 IPO8 基 因 (NCBI 收 录 号：NM_001190995)第 2 个 编 码 外 显 子 序 列 设 计 5'-RACE 反 应 特

异 性 外 侧 引 物 和 内 侧 引 物： 外侧 引 物 序 列 为

5'-CTTCTTACACTTCCACCATA-3'；内侧引物序列

为 5'-CACCAGT TGATACAGGCATA-3'。1.2.2 5'-�CE

采 用 TRIzol 试 剂 提 取 Saos-2 细 胞 总 RNA，

RNA 经 去 磷 酸 化 处 理 及 去“ 帽 子” 反 应， 连 接

5'RACE 接头，以随机引物进行反转录。外侧 PCR反应：以反转录产物为模板，以 5'-RACE 外侧引

物和 IPO8 基因特异性外侧引物进行 PCR 反应，

于 94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，20 个循环；再 72 ℃ 10 min。内侧 PCR 反应：

以第 1 轮 PCR 产物为模板，以 5'-RACE 内侧引物

和 IPO8 基因特异性内侧引物进行 PCR 反应，于

94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，

30 个 循 环； 再 72 ℃ 10 min。PCR 产 物 经 琼 脂 糖

凝胶电泳鉴定回收，克隆到 pMD-18T 载体，转化

DH5α，挑取 30 个阳性克隆进行测序，根据测序结

果中 5'-RACE 内侧引物的序列来确定转录起始位

点，设定为 +1。

1.2.3 IPO8 基因 5' 侧翼区的克隆

在 鉴 定 IPO8 基 因 转 录 起 始 点 基 础 上， 提 取

Saos-2 细胞基因组 DNA，PCR 扩增 IPO8 基因上游

约 3.4 kb 片段。正向引物，5'-TTCCACGCGTAATC-AAAGGGTTAGGAATGT-3'(–3 302)，反向引物，5'- A A G G A G A T C T C G A C C C C T G G A T TA C C T C -AC-3'(+134)。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，

克隆到 pMD-18T 载体，挑取阳性克隆测序，选择

无突变的片段命名为 pMD-18-IPO8/–3 302。以该

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质粒载体为模板，PCR 扩增多条 5' 端续减片段。

引 物 序 列：5'-TTCCACGCGTGTGGGTCAAGGC-TAGAGTTA-3'(−2 193)；5'-TTCCACGCGTTGTGG-CTCGCTTCTTCAGTG-3'(−1 337)；5'-TTCCACGC-G T G T G T C A G T C C T C A C C TA G G T- 3 ' ( − 7 3 2 ) ；

5 ' -T TC C A C G C G TC G ATG C C C ATA C A G T TC T-CG-3'(−330)；5'-TTCCACGCGTGACGGGAGGCG-GTCATAGC-3'(−97)。 以 上 PCR 产 物 经 琼 脂 糖 凝

胶电泳鉴定，克隆到 pMD-18T 载体，挑取阳性克

隆测序。

1.2.4 荧光素酶报告质粒 pGL3-IPO8 启动子的构建

将测序正确的各 IPO8 启动子片段以 MluI/BglII双 酶 切， 凝 胶 回 收； 以 MluI/BglII 双 酶 切 pGL3-Basic，凝胶回收线性载体。IPO8 启动子片段分别

与 pGL3-Basic 连接、转化 DH5α，挑选阳性克隆鉴定。

载体构建成功后，以 MluI/BglII 双酶切鉴定。

1.2.5 细胞的瞬时转染与荧光素酶的检测

转染前 1 d 将 Saos-2 细胞接种于 24 孔板，密

度为 1×105，置无抗生素培养基培养，至次日进行

转染。转染试剂使用 Fugene 6.0 ( 操作按照说明书

进行 )。每种质粒转染设 3 个复孔，将 pGL3-IPO8

启动子、pGL -3 Basic 质粒各 1 μg 分别与内参质粒 pRL -TK 0.1 μg 共转染各孔。转染 24 h 后吸去孔中

的培养基，以 PBS 洗涤培养孔，每孔中加入 100 μL

裂解液 (passive lysis buffer，PLB)，置室温摇动孵

育 15 min，充分溶解转染细胞，吸取细胞裂解液转移

至 1.5 mL 离心管中，以 10 000 r/min 离心 5 min， 吸取上清液，上机检测 ( 操作按双荧光素酶报告

分析系统说明书 )，分别检测得到萤火虫荧光素酶

LUC 和海肾荧光素酶 RL 的荧光活性值，二者的比

值即为相对荧光素酶表达量。

1.3 统计学处理

数据以均数 ± 标准差 (x±s) 表示，两组间比较

采用 t 检验分析，使用统计学软件 SPSS 12.0 进行

相应的统计学分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 IPO8 基因转录起始点的确定

IPO8 基因定位于人类 12 号染色体，其翻译

起始点 AUG 位于第 2 外显子。为确定转录起始点，

本 实 验 提 取 高 表 达 IPO8 基 因 的 Saos-2 细 胞 总

RNA， 以 5'R ACE 技 术 寻 找 IPO8 基 因 的 TSS。

5'R ACE 的 PCR 产 物 电 泳 结 果 显 示 只 有 一 条 约 700 bp 大小的 DNA 片段得到有效扩增 ( 图 1A)。

测序结果表明，所有克隆的片段序列均一致，人

IPO8 基因的转录起始点为翻译起始点上游 222 bp处 ( 图 1B)。

2.2 IPO8 基因 5' UTR 片段克隆

以人 Saos-2 细胞基因组为模板，扩增出 IPO8

基 因 5' 上 游 位 于 –3 302~+134 bp， 大 小 为 3.4 kb 的片段 ( 图 2A)。序列测定结果与 GenBank (GeneID: 10526) 相符。以此为模板，分别扩增 5 条 IPO8 启

动子 5' 端续减片段 ( 图 2B)。

图1 5'RACE鉴定IPO8基因转录起始点

Figure 1 Determination of the transcriptional start site for IPO8 by 5'RACE

A : Electrophoresis result; 1: PCR production of 5' RACE amplication for IPO8 transcriptional start site; M: DNA marker

(DL2000); B: Sequencing of IPO8 gene depicting the positions of the transcriptional start site

1000bp

750bp

500bp

M 1

A B

translation start site

5' �CE inner primer TSS

IPO8 基因启动子的克隆及转录活性分析 熊建军，等 767

2.3 重组荧光素酶报告基因质粒的构建

MluI 与 BglII 双酶切各 IPO8 启动子片段，插

入质粒 pGL3-Basic 多克隆位点，转化 DH5α，构建

重组荧光素酶报告基因质粒。各重组质粒经酶切

鉴定，结果表明亚克隆片段与目标序列的理论序

列完全一致，质粒构建正确 ( 图 3)。

2.4 pGL3-IPO8 启动子转录活性分析

将 pGL3-Basic 及各段 pGL3-IPO8 启动子分别

与内参质粒 pRL -TK 共转染 Saos-2 细胞，以 pGL3-Basic 的荧光素相对活性 (LUC/RL) 为 1。结果显示：

阴性对照质粒 pGL3-Basic 在 Saos-2 细胞表现出非

常弱的活性，而各 pGL3-IPO8 启动子在 Saos-2 细

胞中表现出很强的荧光素酶活性 ( 图 4)。

图3 重组质粒pGL3-IPO8启动子的酶切鉴定

Figure 3 Identification of recombinant pGL3-IPO8 promoter

by restriction enzyme digestion

4 000 bp

2 000 bp

1 000 bp

500 bp

250 bp

10 000 bp DNA m

arker

–3 302/+134–2 192/+134–1 337/+134–732/+134–330/+134–97/+134

图4 IPO8启动子荧光素酶活性比较

Figure 4 Luciferase activity of the serial 5' deletion of

IPO8 promoter

–3302

Relative luciferase activity0 100 200 300 400LUC

PGL3-Basic+134

–2193

–1337

–732

–330

–97IPO8 5'flanking region

图2 PCR扩增IPO8基因5'UTR片段

Figure 2 Amplication of the IPO8 gene 5'UTR by PCR

A : PCR production of the –3302 to +134 promoter of IPO8 gene; M: 10 000 bp DNA marker; B: PCR production of the

5'truncated IPO8 promoter fragments; M: 10 000 bp DNA marker

M –3 302/+134

4 000 bp

2 000 bp

–97/+134

–330/+134

–732/+134

–1 337/+134

–2 193/+134

M

4 000 bp

2 000 bp

1 000 bp

500 bp

250 bp

A B

3 讨 论

作为核质转运蛋白，IPO8 被认为在细胞内有

着 稳 定 的 表 达 [10-12]。 随 着 IPO8 参 与 调 控 miRNA作用的发现，其生理功能不断拓展，例如，笔者近

期发现 IPO8 可能参与调控成骨干细胞的分化 [13]。 因此，IPO8 的转录调控可能受到多种因素的调节。

真核细胞基因转录调控中，启动子是最重要

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的调控区，控制转录起始，并决定了基因的表达强

度 的 第 一 步 即 mRNA 的 转 录 [14]。 要 进 行 IPO8 启

动子活性及转录调控的研究，必须先对上游调控

序列进行克隆，然而关键的问题是 IPO8 启动子中

的转录起始点在国内、外尚未见报道，导致启动

子位置无法确定。目前，定位转录起始点的常用

方法包括 S1 核酸酶法、引物延伸法、RNase 保护

法和 RACE。其中 RACE 具有灵敏度高，可以直接

测序等优点而被广泛使用。本研究通过对 IPO8 高

表达的 Saos-2 细胞进行 5'RACE 扩增，初步确定了

IPO8 只有一个转录起始点，为 ATG 上游 222 bp。

这一结果不仅为 IPO8 启动子的分离和克隆界定了

路标，而且证实了本研究前期对 IPO8 基因编码序

列克隆的可靠性。

在确立了转录起始位点后，笔者对 IPO8 基因

不同片段分别进行克隆，并将其插入质粒 pGL3-Basic 的多克隆位点，与报告基因连接，构建系列

IPO8 的报告基因载体 pGL3-IPO8 启动子。经转染

高表达 IPO8 的肿瘤细胞 Saos-2，结果显示 pGL3-IPO8 启动子在 Saos-2 细胞中表现出很强的荧光素

酶活性 (P<0.05)，表明构建的 IPO8 启动子具有明显

的转录活性。同时，在 5' 端续减片段中，各段的

荧光素酶活性并不相同。最长的片段 –3 302/+134及稍短的 –2 192/+134 片段并没有表现出最高的活

性。 片 段 –1 337/+134 的 活 性 最 高， 更 短 的 片 段

–732/+134 的活性略少，而片段 –330/+134 的活性

明 显 下 降， 大 约 只 有 –732/+134 的 50%。 笔 者 推

测在 IPO8 启动子的 –330 至 –732 之间存在较强的

正性调控序列；而在 –1 337 至 –2 192 之间存在负

性调控序列。此外，最短的片段 –97/+134 仍然诱

导出较强的荧光素酶活性，表明这一区域可能是

控制 IPO8 转录的基本启动子。

尽管 IPO8 基因的启动子已经被克隆，但调控

IPO8 转录的关键 DNA 元件及其转录因子并不清

楚，后续工作将对此作进一步研究。

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(本文编辑 陈丽文)

本文引用：熊建军, 龚帧, 周小鸥, 王庭, 刘建云, 李卫东. IPO8

基因启动子的克隆及转录活性分析[ J]. 中南大学学报: 医学版,

2014, 39(8): 764-768. DOI:10.11817/j.issn.1672-7347.2014.08.002

Cite this article as: XIONG Jianjun, GONG Zhen, ZHOU Xiao’ou,

WANG Ting, LIU Jianyun, LI Weidong. Cloning of IPO8 promoter

and analysis of its transcription activity[ J]. Journal of Central South

University. Medical Science, 2014, 39(8): 764-768. DOI:10.11817/

j.issn.1672-7347.2014.08.002