ISOLASI DNA SEDERHANA

 Dosen pengampu: Luisa Diana Handoyo, M. Si.

Oleh:1.      Margaretha Bertie Riyani           1014340112.      Evi Lianawati                             1014340133.      Treresia Winda S.                       101434015

4.      Yolanda Endear G. M. S.          101434019

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2012

A.    Acara PraktikumJudul praktikum    : Isolasi DNA SederhanaHari, tanggal         : Jumat, 14 September 2012Waktu                   : Pukul 14.20 – 16.20 WIBTempat                  : Laboratorium Biologi Universitas Sanata Dharma

B.     Tujuan PraktikumTujuan yang ingin dicapai dalam praktikum ini adalah mahasiswa mampu mempraktikkan cara mengisolasi DNA secara sederhana.

C.    Dasar TeoriDNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang

membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Molekul DNA terdapat pada nukleus, mitokondria, plastida dan sentriol. Molekul DNA pada nucleus memiliki bentuk sebagai benang lurus dan tidak bercabang, sedangkan DNA yang terletak pada mitokondria dan plastida berbentuk lingkaran (Suryo, 2012 : 59).

 DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan.

Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA.

Setelah menunggu beberapa saat terjadi presipitasi pada lapisan atas bukan lapisan bawah, yang menunjukkan bahwa DNA tidak larut dalam etanol tetapi larut dalam air. Ketika molekul DNA terlarut, mereka tersebar dalam larutan sehingga tidak terlihat. Ketika molekul tersebut berpindah kedalam larutan yang bukan pelarut meraka akan berkumpul/ menggumpal sehingga dapat dilihat. Presipitat DNA terlihat seperti serabut-serabut putih yang terkumpul diatas permukaan larutan karena masa jenis etanol lebih kecil dari pada masa jenis air. Etanol yang digunakan harus benar-benar dingin dan berasal dari lemari pendingin,

hal ini bertujuan untuk menyempurnakan presipitasi. Apabila etanol yang digunakan kurang dingin, maka mengakibatkan pembentukan presipitat kurang sempurna.

D.    Alat, Bahan dan Cara Kerja1.      Alat

a.       Gelas plastikb.      Beker glassc.       Pipet tetesd.      Saringan biasae.       Kain penyaringf.       Kertas saringg.      Blenderh.      Corong glassi.        Tabung reaksij.        Rak tabung reaksik.      Spatulal.        Gelas ukurm.    Timbangann.      Stopwatcho.      Pisau

2.      Bahana.       Buah-buahan (melon, semangka, tomat, nanas, jeruk, dan strawberry)b.      Detergen bubukc.       Akuadesd.      Garam dapur (NaCl)e.       Etanol absolut dingin

3.      Cara Kerjaa.       Buah dibersihkan dari kulitnya dan ditimbang sebanyak 250 gram.b.      Kemudian buah tersebut dimasukkan ke dalam blender dan ditambah 250 ml akuades,

diblender selama 1 menit.c.       Jus buah yang telah diblender disaring sebanyak tiga kali. Penyaringan pertama

menggunakan penyaring biasa, penyaringan kedua menggunakan kain penyaring, dan penyaringan ketiga menggunakan kertas saring.

d.      Air hasil saringan (alikot) dimasukkan ke dalam beker glass.e.       Larutan garam dan detergen dibuat dengan mencampurkan 1 (satu) sendok detergen

ditambah 2 (dua) spatula NaCl lalu ditambah dengan 56 ml akuades, diaduk selama 15 menit hingga larut. Pengadukan dilakukan secara perlahan agar tidak ada buih yang dihasilkan dari pengadukan.

f.       Alikot yang sudah siap dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 2 ml, kemudian ditambah dengan larutan detergen-garam. Lalu diaduk secara perlahan agar tidak menghasilkan buih selama sekitar 3 menit.

g.      Setelah 3 menit, alikot yang telah tercampur dengan larutan detergen-garam ditambahkan dengan etanol absolut dingin tetes demi tetes sebanyak 6 ml melalui dinding tabung reaksi.

h.      Waktu pembentukan dan ketebalan benang-benang DNA dicatat pada masing-masing jus buah.

E.     Hasil PercobaanHasil yang diperoleh dari percobaan dapat dilihat pada tabel di bawah ini:

Tabel 1. Hasil penghitungan waktu dan pengukuran ketebalan benang-benang DNA pada beberapa jenis buah yang terbentuk.

No. Nama Buah Waktu (detik) Ketebalan (cm)1. Melon 10,76 0.32. Nanas 9 0.53. Jeruk 7 4.4 dengan gumpalan di bagian atas4. Strawberry 77 1.65. Tomat 9 0.56. Semangka 10 0.3

Dimana waktu merupakan waktu pembentukan benang-benang DNA yang dihitung sejak pertama kali diteteskan etanol absolut dingin.

F.     PembahasanBerdasarkan hasil percobaan pada tabel 1, diperoleh hasil bahwa setiap buah memiliki

waktu yang berbeda-beda dalam pembentukan molekul DNA dan ketebalan DNA yang terbentuk. Saat penetesan etanol ke tabung reaksi yang berisi alikot melon, dibutuhkan waktu 10,76 detik untuk terbentuknya benang-benang DNA. Sementara pada alikot nanas dan tomat membutuhkan waktu 9 detik untuk pembentukan benang DNA. Waktu untuk pembentukan

benang DNA yang tersingkat terjadi pada buah jeruk, yaitu hanya membutuhkan waktu selama 7 detik. Buah semangka membutuhkan waktu 10 detik untuk membentuk benang-benang DNA. Dan buah strawberry memiliki waktu yang paling lama untuk membentuk benang-benang DNA, yaitu selama 77 detik.

Ketebalan DNA yang terbentuk pun bervariasi, mulai dari yang tipis sampai yang tebal. Lapisan DNA yang paling tebal berada pada alikot buah jeruk dengan ketebalan 4,4 cm, tetai terdapat gumpalan berwarna kuning di bagian atas lapisan benang DNA. Sementara pada alikot buah lain tidak terjadi gumpalan seperti pada alikot buah jeruk. Ketebalan benang DNA pada buah semangka dan melon sama, yaitu hanya 0,3 cm. Sementara pada buah nanas dan tomat ketebalan benang DNA memiliki angka yang lebih besar, yaitu 0,5 cm. Dan pada buah semangka diperoleh ketebalan benang DNA sepanjang 1,6 cm.

Buah dengan kadar air tinggi akan menghasilkan isolat yang berbeda jika dibandingkan dengan buah berkadar air rendah (kaya serat). Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit. Suatu sumber menyatakan bahwa dalam proses pembuatan sumber DNA untuk isolasi DNA hendaknya jangan terlalu encer karena semakin encer sumber DNA, DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit. Karena sel yang lisis di dalam air tentunya lebih sedikit jika dibandingkan dengan sumber DNA yang lebih kental (Anonim, 2005). Namun, masalah pengaruh keenceran terhadap hasil isolasi DNA dapat diatasi dengan pengurangan jumlah Akuades yang digunakan sehingga walaupun sumber DNA yang digunakan adalah buah dengan kadar air tinggi, tetap dapat diperoleh ekstrak yang cukup kental.

Dengan adanya garam (kation kovalen seperti Na+) dan pada suhu dibawah 20˚ C atau kurang, ethanol absolut akan mempresipitasikan asam nukleat polimerik dengan baik. Pemekatan ini dilakukan dengan penambahan ethanol pada lapisan atas sampel sehingga terjadi pesipitasi DNA pada perbatasan kedua larutan. Dalam proses ini ion Na+ akan memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif ion fosfat DNA. Kutub tersebut bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak menolak satu sama lain sehingga pada saat ion Na+ membentuk ikatan dengan kutub negatif fosfat DNA, DNA akan berkumpul. garam juga berperan penting, yaitu untuk menghilangkan protein dan karbohidrat karena garam dapat menyebabkan keduanya terpresipitasi, dan bersama-sama dengan detergent,

G.    Kesimpulan1.      DNA dapat diisolasikan dari sumber DNA berupa buah dengan penambahan larutan

deterjen dan etanol serta garam untuk membantu presipitasi DNA.2.      Hasil isolasi DNA sangat dipengaruhi oleh jenis buah. Terbukti dari hasil pengamatan, pada

masing-masing buah didapatkan hasil yang berbeda.3.      Semakin encer alikot, DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit. Karena sel yang lisis

di dalam air tentunya lebih sedikit jika dibandingkan dengan sumber DNA yang lebih kental.

Daftar Pustaka

http://zuzoqu.wordpress.com/tag/genetika/, diakses pada 17 September 2012http://mubtadiahc.blogspot.com/2012/04/isolasidna-dengan-metode-kitchen.html, diakses pada 16 September 2012

laporan isolasi DNA buah

A.  Tujuan

Adapun tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui DNA buah berdaging

lunak.

B. Dasar Teori

Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya

ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan

campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul

besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas

tabung. Deoxyribo nucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam

makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk

hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya (Suryo, 2004).

Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian

gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen

dan intergen. Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya

membrane sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein

dan lemak pada membrane membentuk senyawa “lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa

tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik,

demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia (Chambell,

2002).

Ketika mendengar kata DNA, seolah kita berhadapan dengan sesuatu yang begitu

abstrak dan sangat kecil. Apalagi jika berbicara tentang isolasi DNA, sering terpikirkan

sebuah proses yang sangat rumit dengan alat-alat yang sangat canggih. Padahal tidak

selamanya isolasi DNA demikian, beberapa teknik isolasi DNA sederhana terbukti efektif

untuk mengisolasi DNA, bahkan selain prosedurnya yang sederhana, bahan-bahan yang

dipakaipun mudah didapatkan dari lingkungan sekitar.DNA (Deoxyribose Nucleic Acid)

adalah master molecul (molekul utama) yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan

untuk proses metabolisme dalam setiap organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama

yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida.

Molekul DNA ini terikat membentuk kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan

kloroplas. (Arhan, 2009).

Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena deterjen dapat

menyebabkan rusaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik

deterjen dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa ”lipid protein-

deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki

ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk

suatu ikatan kimia (Istianti, 1999).

menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara

lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun

isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian

tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol

dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika

isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah, maka kadar air pada masing-masing buah

berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel

yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga

akan sedikit (Achmad, 2010).

C. Metode Praktikum

1.    Waktu dan Tempat

       Adapun waktu dan tempat pelaksanaan praktikum ini adalah :

Hari/Tanggal      : Senin , 18 November 2013

Pukul                 : 08.00 – 10.00 WITA

Tempat               : Laboratorium Genetika Lantai II

                            Fakultas Sains dan Teknologi

                            Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar

                            Samata-Gowa.

2.    Alat dan Bahan

a.    Alat

       Adapun alat yang digunakan pada praktikum ini adalah gelas kimia, lumping, mortal,

corong, gelas ukur, tabung reaksi, pisau dan batang pengaduk.

b.    Bahan

       Adapun bahan yang digunakan adalah buah pisang, buah semangka, buah mangga, etanol

absolut, deterjen, NaCl, kapas dan kain saring.

3.    Cara Kerja

       Adapun cara kerja yang dilakukan pada praktikum ini adalah sebagai berikut :

a.    Mengupas buah dan memotong menjadi 4 bagian lalu melumat buah menggunakan mortal

dan lumpang.

b.    Menambahkan 10 gram NaCl kedalam gelas kimia

c.    Menambahkan cairan deterjen sebanyak 10 ml

d.   Menambahkan 50 ml aquadest kedalam gelas kimia tadi dan mengaduk secara perlahan

hingga homogen

e.    Menyaring buah tadi kedalam gelas kimia baru

f.     Menuang buah yang telah disaring kedalam tabung reaksi sekitar seperempat tabung reaksi.

g.    Menambhakan etanol absolut dingin dengan cara mengalirkan melalui dinding tabung reaksi

secara perlahan

h.    Mengamati perubahan yang terjadi.

D. Hasil dan Pembahasan

1.    Hasil Pengamatan

       Adapun hasil yang diperoleh dari pengamatan yang dilakukan adalah :

a.   Buah Pisang

                                                                             Keterangan:

1.   Ekstrak DNA

2.   Etanol

3.   Sari buah

b.    Buah Mangga

                                                                                            Keterangan :

1.   Ekstrak DNA

2.   Etanol

3.   Sari buah

c.    Buah Semangka

                                                                               Keterangan :

1.   Ekstrak DNA

2.   Etanol

3.   Sari buah

2.      Pembahasan

Isolasi DNA pada dasarnya dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai macam

sumber DNA yang dapat diperoleh dari hewan maupun tumbuhan. Upaya untuk

mengeluarkan DNA dari sel dilakukan dengan merusak dinding dan membran sel dan juga

membran inti. Cara yang digunakan untuk merusak membran-membran tersebut sangat

beraneka ragam, misalnya dengan pemblenderan atau penggerusan dengan mortal dan pistil.

Selain perusakan secara fisik, membran dan dinding sel dapat pula dirusak dengan

menggunakan senyawa-senyawa kimia. Perusakan dinding sel dan membran sel pada

praktikum isolasi DNA kali ini dilakukan dengan cara penggerusan. DNA yang didapatkan

dalam pengamatan kali ini adalah DNA yang berupa benang-benang halus.

Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding

sel, membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi

DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa

protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat

dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortal dan pastle. Sedangkan

secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen, penambahan sabun cair dan

garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang

berisi DNA.

Berdasarkan pengamatan yang dilakukan dimana bahan-bahan yang digunakan

dihancurkan. Proses penghancuran dilakukan untuk merusak membran sel, dinding sel dan

membran inti sehingga DNA bisa keluar dari sel dan masuk ke larutan.  Selanjutnya

dimasukkan NaCl (garam dapur) sebanyak 3 gram ke dalam buah tersebut yang telah

dihancurkan sebelumnya. NaCl yang diberikan berfungsi sebagai bahan penetral pada gula

fosfat DNA, menyebabkan protein dan karbohidrat terpresipitasi ke dalam larutan yang

kemudian tersaring pada proses penyaringan, serta berperan sebagai “lysing buffer”, yakni

menjaga pH larutan agar tetap konstan, sehingga diharapkan tidak terjadi denaturasi DNA.

Kemudian ditambahkan deterjen cair, proses pemberian deterjen cair ini disebut dengan

proses lisis yaitu proses untuk meluruhkan membran sel pada nukleus. Tujuan diberikannya

deterjen cair yaitu untuk merusak membran sel dan membran inti sehingga DNA yang

diinginkan dapat dikeluarkan dari dalam sel, untuk mengurangi kontaminan dan

mengurangi browning.

Setelah dilakukan proses penghancuran dan lisis, maka larutannya ditambahkan air

dan dihomogenkan serta didiamkan. Pada saat pengadukan harus pelan-pelan karena deterjen

mudah sekali berbusa. Busa yang ditimbulkan oleh deterjen akan mengganggu pengamatan,

karena DNA yang berhasil diisolasi nampak tipis, dan dapat dipastikan lapisan DNA tersebut

akan tertutupi jika terdapat banyak buih. Setelah itu larutan tersebut disaring ke gelas kimia

baru, adanya proses penyaringan dilakukan agar komponen sel selain DNA tidak

mengkontaminasi DNA yang hendak diisolasi. Lalu dituang ke tabung reaksi dan diberikan

larutan etanol dingin dengan tujuan untuk memperitifikasi DNA. Ethanol yang dingin akan

mempercepat proses tersebut.

E. Kesimpulan

Adapun kesimpulan dari praktikum ini yaitu isolasi DNA merupakan metode untuk

memisahkan DNA dari sel, baik dari inti, mitokondria maupun kloroplas.Isolasi DNA pada

dasarnya dapat dilakukan dengan merusak dinding dan membran sel dan juga membran inti.

Perusakan ini dapat dilakukan dengan pemblenderan, penggerusan atau yang lainnya.  DNA

dapat diisolasikan dari sumber DNA berupa buah dengan penambahan larutan deterjen,

etanol serta garam untuk membantu presipitasi DNA.

.

Daftar Pustaka

Arhan“Isolasi DNA”, Blog Arhan, http://endikdenibiotransmitther.blogspot.com.

(20 November 2013).

Achmad, Wendy. Isolasi DNA. Bandung 2010.

Istanti,  Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UM. 1999.

Neil, Campbell. Biologi. Jakarta : Erlangga. 2002.

Suryo. Genetika Strata 1. Yogyakarta : UGM Press. 2004.Diposkan oleh Ibnul Buqhoriis di 21.01 Kirimkan Ini lewat EmailBlogThis!Berbagi ke TwitterBerbagi ke FacebookBagikan ke Pinterest

GENETIKA “ISOLASI DNA”

OLEHKELOMPOK V

NAMA                                :                                               LIA ALLO LAYUKSTAMBUK                        :                                               10270013PRODI                                :                                               BIOLOGIKELAS                               :                                               AASISTEN                           :                                            

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKANUNIVERSITAS VETERAN REPUBLIK INDONESIA

MAKASSAR2012/2013

BAB IPENDAHULUAN

A.                 LATAR BELAKANG                       Ketika mendengar kata DNA, seolah kita berhadapan dengan sesuatu yang begitu abstrak dan sangat kecil. Apalagi jika berbicara tentang isolasi DNA, sering terpikirkan sebuah proses yang sangat rumit dengan alat-alat yang sangat canggih.Padahal tidak selamanya isolasi DNA demikian, beberapa teknik isolasi DNA sederhana terbukti efektif untuk mengisolasi DNA, bahkan selain prosedurnya yang sederhana, bahan-bahan yang dipakaipun mudah didapatkan dari lingkungan sekitar. Sangat cocok untuk praktikum pengenalan DNA pada siswa MTs/SMP juga MA/SMA. Berikut ini pembahasan tentang isolasi DNA secara sedasar teori. DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul

(molekul utama) yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme (Jamilah, 2005). DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida (Istanti, 1999).            DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu DNA juga bisa diisolasi. Zubaidah (2004) dalam Jamilah (2005) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan melauli tahapan-tahapan antara lain: preparasi esktrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah,

B.                 TUJUAN      Untuk mengetahui cara/metode mengisolasi DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) jaringan tumbuhan dengan metode sederhana.

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

            DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Molekul DNA terdapat pada nukleus, mitokondria, plastida dan sentriol. Molekul DNA pada nucleus memiliki bentuk sebagai benang lurus dan tidak bercabang, sedangkan DNA yang terletak pada mitokondria dan plastida berbentuk lingkaran (Suryo, 2012 : 59).

DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan.

Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA.

Setelah menunggu beberapa saat terjadi presipitasi pada lapisan atas bukan lapisan bawah, yang menunjukkan bahwa DNA tidak larut dalam etanol tetapi larut dalam air. Ketika molekul DNA terlarut, mereka tersebar dalam larutan sehingga tidak terlihat. Ketika molekul tersebut berpindah kedalam larutan yang bukan pelarut meraka akan berkumpul/ menggumpal sehingga dapat dilihat. Presipitat DNA terlihat seperti serabut-serabut putih yang terkumpul diatas permukaan larutan karena masa jenis etanol lebih kecil dari pada masa jenis air. Etanol yang digunakan harus benar-benar dingin dan berasal dari lemari pendingin, hal ini bertujuan untuk menyempurnakan presipitasi. Apabila etanol yang digunakan kurang dingin, maka mengakibatkan pembentukan presipitat kurang sempurna.

DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul (molekul utama) yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap

organisme (Jamilah, 2005). DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida (Istanti, 1999). Molekul DNA ini terikat membentuk kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan kloroplas. DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda (double helix), dimana basa nitrogen dan kedua ”benang” polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup dan disebut sebagai ”cetak biru kehidupan” karena molekul ini berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain (Jamilah, 2005).

DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu DNA juga bisa diisolasi. Zubaidah (2004) dalam Jamilah (2005) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan melauli tahapan-tahapan antara lain: preparasi esktrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah, maka kadar air yang pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda pula. Buah dengan kadar air tinggi akan menghasilkan isolat yang berbeda jika dibandingkan dengan buah berkadar air rendah. Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.

Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan dengan hati-hati, sehingga tidak menyebabkan kerusakan pada DNA. Untuk mengeluarkan DNA dari sel, dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik dengan cara mekanik maupun secara kimiawi. Cara mekanik bisa dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dengan pemberian yang dapat merusak membran sel dan membran inti, salah satunya adalah deterjen.

Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena deterjen dapat menyebabkan rusaknya mebran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa ”lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia (Machmud, 2006).

BAB IIIMETODOLOGI PRAKTIKUM

A.                Waktu & tempat :            Waktu             : Senin, 27 mei 2013            Pukul               : 09.00 – 11.30 WITA            Tempat            : Laboratorium Biologi Universitas Veteran Republik Indonesia

B.                 Alat & bahan :

Alat     Bahan             

          Tabung Reaksi          Pisau          Pipet 5 ml          Garpu          Gelas beaker 250 ml          Mortal          Saringan / tapisan          Corong          Gelas ukur          Gelas kenlia 100 ml tambah analik          Batang Pengaduk

          Es serut          NaCl 3 gram          Detergen          Etanol 95 – 100 % dingin( dari – 20°C

)          Tumbuhan ( buah pisang )

C.                  Cara kerja

1.                       Pilihlah buah yang masak dan potong dengan pisau, keluarkan isinya dengan menggunakan garpu dan simpan dalam gelas beaker 250 ml. Tumbuk sampai halus dengan menggunakan mortal.

2.                       Tambahkan 3 gram NaCl yang telah dilarutkan, kemudian tambahkan 10 ml detergen, buat sampai volume 100 ml dengan menambahkan air.

3.                       Campurkan dan aduk dengan garpu sampai benar – benar tercampur kemudian disaring dan disimpan cairan yang telah di saring tersebut.

4.                       Biarkan beberapa menit kemudian di isi sebanyak 6 ml cairan tersebut kedalam tabung reaksi

5.                       Tambahkan 9 ml etanol dingin pada bagian  bawah tabung reaksi dan tunggu beberapa menit untuk presipitasi DNA sampai terdapat dua bagian yang terpisah etanol dan bagian yang berwarna putih.

6.                       Bagian putih dipindahkan ke tabung reaksi yang lainnya, bagian itu merupakan DNA hasil ekstraksi.

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN

A.    HASIL  Gambar hasil pengamatan

           A                                                            B                                          keterangan :                                                                                       

                                                                                                     a.2 

                                                                                                     b.2a.1                                                                                                c.2

a.1b.1

a.2b.2c.2

d.2

busaekstrak pisang dan larutan NaCl & sabun sunlightlarutan etanol & esbusahasil isolasi DNA berupa bentuk DNAekstrak pisang dan larutan NaCl & sabun sunlight

 

b.1                                                                                                     d.2

a.       Sebelum dicamur larutan                    b. Setelah dicampur etanolEtanol dan es                                      dan es

   Tabel hasil pengamatan isolasi DNA pada buah pisang

No.

Buah PerlakuanHasil Pengamatan

Warna Bentuk Waktu Jumlah

1. pisangSabunsunlight

Keruh ke-orangean Benang yang menggumpal

65 s +++++

B.     PEMBAHASAN             

                Praktikum ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh buah dan  deterjen terhadap kualitas DNA yang dihasilkan dalam proses isolasi. Buah yang digunakan dalam proses isolasi DNA ini adalah buah pisang. Sedangkan jenis deterjen yang dipakai adalah deterjen sunlight. Hal yang pertama kami lakukan yaitu, menyiapkan buah yang akan di tumbuk. 

Isolasi DNA pada dasarnya dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai macam sumber DNA yang dapat diperoleh dari hewan maupun tumbuhan. Upaya untuk mengeluarkan DNA dari sel dilakukan dengan merusak dinding dan membrane sel dan juga membran inti. Cara yang digunakan untuk merusak membran-membran tersebut sangat beraneka ragam, misalnya dengan pemblenderan atau penggerusan dengan mortal dan pistil. Selain perusakan secara fisik, membrane dan dinding sel dapat pula dirusak dengan menggunakan senyawa-senyawa kimia. Perusakan dinding sel dan membrane sel pada praktikum isolasi DNA kali ini dilakukan dengan cara penggerusan. DNA yang didapatkan dalam pengamatan kali ini adalah DNA yang berupa benang-benang halus.

Apabila dilihat dari sumber DNA yang digunakan untuk pengisolasian ini, macam buah yang digunakan menunjukkan perbedaan yang nyata. Masing-masing buah untuk sumber DNA menghasilkan DNA yang berbentuk benang-benang halus berwarna sesuai dengan warna asal buah tersebut. Kelima macam buah yang digunakan dalam proses pengisolasian DNA kali ini adalah jenis buah yang memiliki kadar air yang tinggi. Tidak ada perbedaan yang ditunjukkan untuk perlakuan variasi jenis buah ini. Suatu sumber menyatakan bahwa dalam proses pembuatan sumber DNA untuk isolasi DNA hendaknya jangan terlalu encer karena semakin encer sumber DNA, DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit. Karena sel yang lisis di dalam air tentunya lebih sedikit jika dibandingkan dengan sumber DNA yang lebih kental (Anonim, 2005). Namun, masalah pengaruh

keenceran terhadap hasil isolasi DNA dapat diatasi dengan pengurangan jumlah air yang digunakan sehingga walaupun sumber DNA yang digunakan adalah buah dengan kadar air tinggi, tetap dapat diperoleh ekstrak yang cukup kental.

Membran sel pada setiap organisme dapat mengalami kerusakan yang disebabkan oleh pengaruh senyawa-senyawa kimia. Senyawa kimia yang mampu merusak membrane ataupun dinding sel antara lain lisozim yang mampu mempengaruhi kerja senyawa polimerik sehingga kekakuan sel tidak lagi dapat terjaga. Selain itu, ada pula senyawa EDTA (etilendiamintetraasetat) yang berfungsi untuk menghilangkan ion Mg2+ yang penting untuk mempertahankan struktur selubung sel serta menghambat enzim yang dapat merusak DNA. Dalam proses isolasi DNA, deterjen berfungsi menggantikan senyawa-senyawa kimia tersebut di atas. Deterjen mengandung sodium dodesil sulfat (SDS) yang dapat menyebabkan hilangnya molekul lipid pada membran sel sehingga struktur membrane akan rusak dan melisiskan isi sel.

Pada Pengisolasian DNA menggunakan garam dapur dengan tujuan untuk memekatkan DNA. Hal ini dapat terjadi karena ion Na+ yang dikandung oleh garam mampu membentuk ikatan dengan kutub negative pada ikatan fosfat DNA. Saat ion Na+garam berikatan dengan fosfat, pada saat itulah DNA akan berkumpul. Sedangkan penambahan alcohol pada permukaan larutan betujuan untuk melakukan presipitasi sehingga DNA yang telah terkumpul tadi mampu memisah dari larutan dan terbentuklah lapisan-lapisan yang dapat diidentifikasi unsur penyusunnya.

Paraf asistensi

           

                                                                                                              (                         )                  

BAB V

PENUTUP

A.    Kesimpulan

Berdasarkan hasil pengamatan dan pembahasan, maka dapat diambil kesimpulan, bahwa :1. Cara pengisolasian DNA dilakukan dengan cara mekanik dan kimiawi. Cara mekanik dengan alat-alat yang berfungsi untuk menghancurkan membran sel. Sedangkan secara kimiawi dengan penambahan-penambahan reagen, yaitu detergent, NaCl, danalkohol dingin 96%.2.Tahap-tahap dalam isolasi DNA ada tiga. Tahap pertama dari isolasi DNA adalah penghancuran dinding sel dengan cara memblender bahan, Tahap kedua isolasi DNA adalah melisiskan sel dengan menambahkan detergent dan garam ke dalam campuran. Pemberian detergent berfungsi untuk membuka atau memecah membran sel (baik membran sitoplasma maupun membran nukleus. Tahap ketiga adalah pemurnian DNA. Cara ini dilakukan dengan manambahkan alkohol dingin 96%. Alkohol berfungsi untuk memisahkan DNA dengna molekul-molekul lain,seperti protein.

B.     Saran

Dalam melakukan praktikum.Sebaiknya praktikan serius dalam melakukan praktikum.Sebaiknya asisten mendampingi masing-masing kelompok saat praktikum.

DAFTAR PUSTAKA

 Arhan. 2009. Laporan Pratikum isolasi DNA.http://endikdenibiotransmitther.blogspot.com/2009/01/praktikum-isolasi-dna-buah.html)http://endikdenibiotransmitther.blogspot.com/2009/01/praktikum-isolasi-dna-buah-pisang-

dan.htmlIstanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UM.Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Deterjen, Penambahan Garam dan Ekstrak Nanas(Ananas Comusus) terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah sebagai TopikPraktikum Mata Kuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Program SarjanaBiologi.

Ketika mendengar kata DNA, seolah kita berhadapan dengan sesuatu yang begitu abstrak dan sangat kecil. Apalagi jika berbicara tentang isolasi DNA, sering terpikirkan sebuah proses yang sangat rumit dengan alat-alat yang sangat canggih.Padahal tidak selamanya isolasi DNA demikian, beberapa teknik isolasi DNA sederhana terbukti efektif untuk mengisolasi DNA, bahkan selain prosedurnya yang sederhana, bahan-bahan yang dipakaipun mudah didapatkan dari lingkungan sekitar. Sangat cocok untuk praktikum pengenalan DNA pada siswa MTs/SMP juga MA/SMA. Berikut ini pembahasan tentang isolasi DNA secara sederhana

DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul (molekul utama) yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme (Jamilah, 2005).DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida (Istanti, 1999). Molekul DNA ini terikat membentuk kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan kloroplas. DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda (double helix), dimana basa nitrogen dan kedua ”benang” polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan

yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup dan disebut sebagai ”cetak biru kehidupan” karena molekul ini berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain (Jamilah, 2005).DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu DNA juga bisa diisolasi. Zubaidah (2004) dalam Jamilah (2005) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan melauli tahapan-tahapan antara lain: preparasi esktrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah, maka kadar air yang pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda pula. Buah dengan kadar air tinggi akan menghasilkan isolat yang berbeda jika dibandingkan dengan buah berkadar air rendah. Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan dengan hati-hati, sehingga tidak menyebabkan kerusakan pada DNA. Untuk mengeluarkan DNA dari sel, dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik dengan cara mekanik maupun secara kimiawi. Cara mekanik bisa dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dengan pemberian yang dapat merusak membran sel dan membran inti, salah satunya adalah deterjen.Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena deterjen dapat menyebabkan rusaknya  mebran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa  ”lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia (Machmud, 2006).

Alat dan Bahan Isolasi DNA SederhanaAlat     

I. Beaker glass atau gelas aquaII. Pisau

III. PengadukIV. PenyaringV. Mesin blender

VI. SpatulaVII. Tabung reaksi dan rak tabungBahan

I. Berbagai jenis buahII. Deterjen

III. Aquades

IV. Garam dapurV. Etanol 96% dingin

Prosedur Kerja1.      Melarutkan deterjen, sabun cair dan sabun krim ke dalam 56 mL aquades, diaduk pelan

selama 15 menit.2.      100 gram daging buah ditambah 100 mL aquades dimasukkan ke dalam mesin blender,

kemudian diblender selama 1 menit.3.      4 mL masing-masing larutan sabun dicampurkan dengan masing-masing 4 mL jus buah4.      Menambahkan 1 spatula garam dapur kemudian diaduk selama 10 menit sampai diperoleh

campuran yang homogen.5.      Menyaring campuran yang dihasilkan pada poin sebelumnya sebanyak dua kali6.      6 mL hasil penyaringan pada point dia atas dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan

menambahkan 9 mL etanol 96% dingin7.      Mengamati proses timbulnya DNA, meliputi waktu yang diperlukan, warna, serta banyak

sedikitnya DNA yang terbentuk

Sumber:Artikel ini dirangkum dari kegiatan praktikum kelas Genetika di S1 Pendidikan Biologi Universitas

Negeri Malang.Anonim. 2005. DNA Extraction from Wheat Germ. (Online),

(The University of Utah).www.gslc.genetics.utah.edu Diakses tanggal 31 Maret 2007Anonim. Tanpa tahun. Isolation of DNA from Strawberry and

Rashberries, (Online).www.science.projects.com Diakses tanggal 31 Maret 2007Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UM.Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Deterjen, Penambahan Garam dan Ekstrak Nanas (Ananas

Comusus) terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah sebagai Topik Praktikum Mata Kuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Prtogram Sarjana Biologi.

Machmud, Wildan. 2006. Penentuan Lc50 48 Jam Deterjen dan Pengaruhnya terhadap Mortalitas Larva Ikan Mas (Cyprus carpio) Ras Punten dengan Tipe Ploidi yang Berbeda. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Program sarjana Biologi.

Laporan Praktikum Biologi Molekuler "ISOLASI DNA"

BAB IPENDAHULUAN

    A.    Latar Belakang

Mempelajari DNA bukanlah hal yang mudah karena DNA itu terlalu kecil (tidak mungkin bisa dilihat dengan mata telanjang) dan konsep-konsep mengenai DNA cukup abstrak. Kerja laboratorium berikut ini memungkinkan anda untuk bekerja dengan DNA secara kongrit dengan mengisolasi DNA total dengan menggunakan peralatan dasar dan juga metode yang sama dengan yang digunakan para Ilmuwan (Dollard, 1994).

Dan merupakan bagian Vital dalam setiap makhluk hidup karena DNA memberikan suatu karakteristik individual bagi setiap sel. Sangatlah menrik untuk melihat percobaan ini dilakukan dengan menggunakan peralatan yang sederhana, meskipun untuk keperluan lanjut, tentu membutuhkan peralatan yang lebih memadai (Anonim b, 2005 ).

Proses isolasi DNA dari suatu sel merupakan langkah awal bagi banyak prosedur laboratorium dalam bioteknologi. Seorang ilmuwan harus mampuh memisahkan DNA dari molekul lain yang tidak diinginkan dalam sel dengan sangat cermat dan hati-hati sehingga DNA tidak rusak atau terpotong-potong. Prosedur yang akan dilakukan berikut ini adalah modifikasi dari preparasi “Marmur” yang telah dilakukan secara luas di laboratoium bioteknologi (Dollard, 1994 )

   B.     Rumusan         Apa itu DNA dan seperti apa Teknik analisis biologi molekuler?         Mengapa dilakukan uji  isolasi DNA pada buah pisang ?         Bagaiman melihat adanya Isolasi DNA pada ekstrat buah yang sudah di campurkan

dengan detergent dan etanol?

   C.    Tujuan PraktikumKegiatan Praktikum Ini Bertujuan untuk mengisolasi DNA dari Buah Pisang dan

Semangka.

   D.    ManfaatBisa Melihat dengan mata telanjang bagaimana bentuk DNA, dan Selain kita bisa

mengetahui secara rinci apa dan seperti apa itu isolasi DNA, kita juga bisa blajar dari praktikum ini cara-cara memberikan praktikum pada siswa yang nantinya akan menjadi siswa kita,pada saat kita menjadi Guru.

BAB II   LANDASAN TEORI

    A.    DNADNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang

membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Molekul DNA terdapat pada nukleus, mitokondria, plastida dan sentriol. Molekul DNA pada nucleus memiliki bentuk sebagai benang lurus dan tidak bercabang, sedangkan DNA yang terletak pada mitokondria dan plastida berbentuk lingkaran (Suryo, 2012 : 59).

DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA.

Setelah menunggu beberapa saat terjadi presipitasi pada lapisan atas bukan lapisan bawah, yang menunjukkan bahwa DNA tidak larut dalam etanol tetapi larut dalam air. Ketika molekul DNA terlarut, mereka tersebar dalam larutan sehingga tidak terlihat. Ketika molekul tersebut berpindah kedalam larutan yang bukan pelarut meraka akan berkumpul/ menggumpal sehingga dapat dilihat. Presipitat DNA terlihat seperti serabut-serabut putih yang terkumpul diatas permukaan larutan karena masa jenis etanol lebih kecil dari pada masa jenis air. Etanol yang digunakan harus benar-benar dingin dan berasal dari lemari pendingin, hal ini bertujuan untuk menyempurnakan presipitasi. Apabila etanol yang digunakan kurang dingin, maka mengakibatkan pembentukan presipitat kurang sempurna.

DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul (molekul utama) yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme (Jamilah, 2005). DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida (Istanti, 1999). Molekul DNA ini terikat membentuk kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan kloroplas.

DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda (double helix), dimana basa nitrogen dan kedua ”benang” polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup dan disebut sebagai ”cetak biru kehidupan” karena molekul ini berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain (Jamilah, 2005).

DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu DNA juga bisa diisolasi. Zubaidah (2004) dalam Jamilah (2005) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan melauli tahapan-tahapan antara lain: preparasi esktrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah, maka kadar air yang pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda pula. Buah dengan kadar air tinggi akan menghasilkan isolat yang berbeda jika dibandingkan dengan

buah berkadar air rendah. Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.

   B.     Teknik Analisis Biologi MolekulerSejak akhir 1950-an dan awal 1960-an, ahli biologi molekuler telah belajar untuk

mengkarakterisasi, mengisolasi, dan memanipulasi komponen molekul sel dan organisme. Komponen-komponen ini mencakup DNA, repositori informasi genetik; RNA, kerabat dekat DNA yang fungsinya melayani sebagai berkisar dari copy pekerjaan sementara DNA untuk fungsi struktural dan enzimatik aktual serta bagian fungsional dan struktural dari aparat translasi, dan protein, jenis struktural dan enzimatik utama dari molekul dalam sel. Ada beberapa macam teknik analisis biomol antara lain :

1)      Ekspresi kloningSalah satu teknik yang paling dasar biologi molekuler untuk mempelajari fungsi protein

adalah kloning ekspresi. Dalam teknik ini, DNA coding untuk suatu protein bunga kloning (menggunakan PCR dan / atau enzim restriksi) ke dalam sebuah plasmid (dikenal sebagai vektor ekspresi). Plasmid ini mungkin memiliki elemen promotor khusus untuk mendorong produksi protein yang menarik, dan mungkin juga memiliki penanda resistensi antibiotik untuk membantu mengikuti plasmid.

Plasmid ini dapat dimasukkan ke dalam sel-sel bakteri baik atau hewan. Memperkenalkan DNA ke dalam sel bakteri dapat dilakukan dengan transformasi (melalui penyerapan DNA telanjang), konjugasi (melalui kontak sel-sel) atau dengan transduksi (melalui vektor virus). Memperkenalkan DNA ke dalam sel eukariotik, seperti sel hewan, dengan cara fisik atau kimia yang disebut transfeksi. Beberapa teknik transfeksi berbeda tersedia, seperti transfeksi kalsium fosfat, elektroporasi, injeksi dan transfeksi liposom. DNA juga dapat diperkenalkan ke dalam sel eukariotik menggunakan virus atau bakteri sebagai pembawa, yang terakhir ini kadang-kadang disebut bactofection dan khususnya menggunakan Agrobacterium tumefaciens. Plasmid dapat diintegrasikan ke dalam genom, menghasilkan transfeksi stabil, atau mungkin tetap independen dari genom, yang disebut transfeksi sementara. Dalam kedua kasus, DNA coding untuk suatu protein yang menarik sekarang di dalam sel, dan protein sekarang dapat dinyatakan.

Berbagai sistem, seperti promotor diinduksi dan spesifik sel-sinyal faktor, yang tersedia untuk membantu mengekspresikan protein kepentingan di tingkat tinggi. Jumlah besar protein kemudian dapat diekstrak dari sel bakteri atau eukariotik. Protein dapat diuji untuk aktivitas enzimatik bawah berbagai situasi, protein dapat mengkristal sehingga struktur tersier yang dapat dipelajari, atau, dalam industri farmasi, aktivitas obat baru terhadap protein dapat dipelajari.

2)      Polymerase chain reaction (PCR)Reaksi berantai polimerase adalah teknik yang sangat serbaguna untuk menyalin

DNA. Secara singkat, PCR memungkinkan urutan DNA tunggal untuk disalin (jutaan kali), atau diubah dengan cara-cara yang telah ditentukan. Sebagai contoh, PCR dapat digunakan untuk memperkenalkan situs enzim restriksi, atau untuk bermutasi (mengubah) basa tertentu DNA, yang terakhir adalah metode disebut sebagai "perubahan Cepat". PCR juga dapat digunakan untuk menentukan apakah suatu fragmen DNA tertentu ditemukan di perpustakaan

cDNA. PCR memiliki banyak variasi, seperti PCR transkripsi terbalik (RT-PCR) untuk amplifikasi RNA, dan, baru-baru ini, real-time PCR (QPCR) yang memungkinkan untuk pengukuran kuantitatif molekul DNA atau RNA.

3)      Gel elektroforesisElektroforesis gel adalah salah satu alat utama biologi molekuler. Prinsip dasarnya adalah

bahwa DNA, RNA, dan protein semuanya dapat dipisahkan melalui medan listrik. Dalam elektroforesis gel agarosa, DNA dan RNA dapat dipisahkan berdasarkan ukuran dengan menjalankan DNA melalui gel agarosa. Protein dapat dipisahkan berdasarkan ukuran dengan menggunakan gel SDS-PAGE, atau berdasarkan ukuran dan muatan listrik mereka dengan menggunakan apa yang dikenal sebagai elektroforesis gel 2D.

ISI  Isolasi DNA

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader, 1993).

Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Corkill dan Rapley, 2008; Dolphin, 2008). Menurut Surzycki (2000), ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat. Prisnsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan. Bahkan beberapa teknik menjadi lebih mudah dengan menggunakan kit yang diproduksi oleh suatu perusahaan sebagai contoh kit yang digunakan untuk isolasi DNA pada tumbuhan seperti Kit Nucleon Phytopure sedangkan untuk isolasi DNA pada hewan digunakan GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit. Namun tahapan-tahapan isolasi DNA dalam setiap langkahnya memiliki protokol sendiri yang disesuaikan dengan keperluan. Penggunaan teknik isolasi DNA dengan kit dan manual memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode konvensional memiliki kelebihan harga lebih murah dan digunakan secara luas sementara kekurangannya membutuhkan waktu yang relatif lama dan hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel. 

Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel (Holme dan Hazel, 1998). Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi (Giacomazzi et al., 2005). Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran sel (Surzycki, 2000). Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase K seperti untuk melisiskan membran pada sel darah (Khosravinia et al., 2007)

serta mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel (Brown, 2010; Surzycki (2000).

BAB IIIMETODE PRAKTIKUM

Judul                           : Isolasi DNA                         : Untuk mengetahui jenis detergen dan buah yang memberikan hasil isolasi    terbaik serta

pengaruh kombinasi detergen, penambahan garam serta ekstark Nanas terhadap kualitas presipitat DNA (Untuk mengisolasi DNA dari Buah Pisang dan Semangka )

Waktu Pelaksanaan     : Sabtu, 30 November 2013 (Pukul 09.00 – 14.30 )                       Tempat                        : Laboratorium Biologi ,FMIPA UNIMA.

a.      Alat dan BahanPeralatan yang digunakan dalam praktikum ini adalah :

1.      Alat-alat untuk ekstraksi  Pisau  Blender  Gelas ukur  Waskom/Mangkuk  Pengaduk/sendok spatula  Gelas air mineral

2.      Alat-alat untuk Filtrasi  Saringan  Kain (sapu tangan )  Waskom/Mangkuk

3.      Alat-alat untuk isolasi DNA  Lemari es (freezer)  Tabung reaksi  Rak tabung reaksi  Pipet  Pipet 5 ml  Pipet 10 ml

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah :  Buah pisang  Aquades  Detergen bubuk  Garam Dapur  Ethanol 90%

  Kertas saring  Buah nanas untuk diekstrak

b.      Prosedur Kerja1.      Membuat Ekstrat Nanas  Nenas di bersihkan terlebih dahulu,dan di pisahkan ke dalam Waskom tersendiri.  Nanas diblender sebanyak 200 gr dengan 200 ml aquades  Jus nanas di saring menggunakan saringan, kemudian di saring lagi menggunakan kain

rangkap dua,lalu di saring dengan dua lapis kertas saring.

                                                                                                                               

2.      Membuat larutan Detergent dan garam  Menyiapkan gelas air mineral berisi 56 ml aquades /aqua (6 gelas pertama )  Masing-masing di masukan 1 sdt detergent dan satu sendok spatula garam

  

Kemudian masing-masing larutan di aduk selama kurang lebih 15 menit.(pengadukan di lakukan perlahan-lahan agar tidak menimbulkan banyak buih,jika terbentuk buih langsung di ambil dengan pipet)

3.      Menyediakan Sumber DNA  Buah pisang dan buah semangka di kupas  terlebih dahulu, kemudian di timbang sebanyak

200 gr.  

Pisang di potong kecil-kecil kemudian diblender  dengan 200 ml aquades selama 1-3 menit (sampai terbentuk bubur pisang yang lembut )

4.      Mengekstrak DNA  Pisang yang sudah di blender dan semangka,di masukan ke dalam  gelas berisi protocol

masing-masing 3 gelas (pisang 3,dan semangka 3 ) sebanyak dua sdt,dan di tambahkan satu sendok spatula garam kemudian di aduk perlahan-lahan selama 10-15 menit.

  Kemudian ke enam campuran (a) di saring menggunakan 2 lapis kain kemudian dengan dua lapis kertas saring.

  Filtrat kemudian di masukan ke dalam tabung reaksi  Tabung yang berisi filtrat di tambahkan 2 ml enzim (nanas)  Larutan pada tabung berisi enzim,di homogenkan dengan cara memiringkan tabung perlahan-

lahan.

  Kemudian di tambahkan 9 ml ethanol 96% dingin ke dalam setiap tabung perlahan-lahan dari tepi tabung.

  Biarkan DNA terpresipitasi ke dalam alkohol (tabung jangan di guncang )  

Mengamati hasil presipitasi.

 

BAB IVHASIL PENGAMATAN

Hasil Pengamatan praktikum Isolasi DNA:

No Buah Perlakuan Hasil pengamatanWarna Bentuk Waktu Jumlah

1. Pisang Rinso (1)

Attack (2)

Sunlight (3)

Keruh,Kekuningan

Kuningmudah

Putih susu

DNA Rusak

DNA Rusak

Gumpalan berwarna putih seperti kabut dan gelembung kecil.

-

-

2

2. Semangka Rinso (4)

Attack (5)

Sunlight (6)

Kuning kecoklatan

Merah muda

Hampirmendekati putih bening

Benang yang menggumpalGumpalan

Gumpalan putih seperti kabut

Gumpalan putih seperti kabut (tidak terlalu

1

2

2

2

Nampak )

Tabung 1         : Tidak terdapat gumpalan ataupun bebang-banang. Karena DNA dinyatakan Rusak

Tabung 2         : Sama Halnya dengan tabung 1Tabung 3         : Terbentuk 2 lapisan larutan. Larutan terlihat putih susu. Terlihat gelembung kecil sedikit.

DNA membentuk seperti gumpalan awan.

Tabung 4         : Terbentuk 2 lapisan larutan. Larutan terlihat berwarna bening dan kuning kecoklatan. Terlihat gelembung kecil sedikit. DNA membentuk seperti gumpalan awan, ada juga yang menyebar berbentuk benang yang sangat halus di larutan.

Tabung 5         : Terbentuk 2 lapisan larutan. Larutan terlihat berwarna merah muda. DNA membentuk seperti gumpalan awan.

Tabung 6         : Terbentuk 2 lapisan larutan.Larutan hamper tidak terlihat.Tapi masi bisa di amati DNAnya membentuk seperti gumpalan awan

  Pertanyaan Diskusi1.      Mengapa buah pisang digunakan sbagai sumber energy?

Jawab        : Karena buah pisang termasuk tumbuhan sel tumbuhan (eukariotik) yang di dalam sel terdapat inti sel dan di dalam inti sel memiliki DNA.

2.      Mengapa pemblenderan buah pisang tidak boleh dilakukan terlalu lama?Jelaskan!Jawab        : Agar DNA yang ada di dalamnya tidak hancur

3.      Jelaskan Fungsi bahan-bahan berikut ini dalam proses isolasi DNA dan bagaimana mekanisme kerjanya!

a.       Detergentb.      Garamc.       Ekstrak nanasd.      Ethanol 96% dingin

Jawab  :a)      Detergent ,berfungsi memisahkan membrane inti sel agar lipid lemak bisa terlepas dari

membran inti.b)      Garam, karena garam mengandung NaCL yang berfungsi menyatukan semua DNA yang

telah terurai dan membuat satu ikatan dengan garam.Dan akan terangkat sehingga terpisah dari yang akan terkontaminasi.

c)      Ekstrak Nanas, Sebagai Enzim karena nanas mengandung glimalin yang berfungsi sebagai pengurai.sehingga protein menjadi lunak,dan terpisah dari membrane

d)     Ethanol 96% dingin, Mempresipitasikan asam nukleat polimerik dengan baik untuk meningkatkan konsentrasi DNA.

  Tugas Individu1.      Apa yang dimaksud dengan DNA?

Jawab :Asam deoksiribonukleat, lebih dikenal dengan DNA (bahasa Inggris:deoxyribonucleic acid), adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul utama penyusun berat kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA umumnya terletak di dalam inti sel.Secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagaimateri genetik; artinya, DNA menyimpan cetak biru bagi segala aktivitas sel. Ini berlaku umum bagi setiap organisme. Di antara perkecualian yang menonjol adalah beberapa jenis virus (dan virus tidak termasuk organisme) seperti HIV (Human Immunodeficiency Virus).

2.      Bagaimana Struktur DNA?Jawab :DNA terdiri atas dua utas  benang polinukleotida yang saling berpilin membentuk heliks ganda (double helix). Model struktur DNA itu pertama kali dikemukakan olehJames Watson dan Francis Crick pada tahun 1953 di Inggris. Struktur tersebut mereka buat berdasarkan hasil analisis foto difraksi sinar X pada DNA yang dibuat oleh Rosalind Franklin. Karena yang difoto itu tingkat molekul, maka yang tampak hanyalah bayangan gelap dan terang saja. Bayangan foto itu dianalisis sehingga mereka berkesimpulan bahwa molekul DNA merupakan dua benang polinukleotida yang berpilin.

3.      Apakah fungsih DNA?jelaskan

Jawab :fungsi DNA adalah sebagai materi genetik; artinya, DNA menyimpan cetak biru bagi segala aktivitas sel. Ini berlaku umum bagi setiap organisme.

4.      Apa yang dimaksud dengan Keanekaragaman?Jawab :Keanekaragaman hayati adalah keanekaragaman makhluk hidup yang menunjukkan keseluruhan variasi gen, spesies, dan ekosistem suatu daerah. Keanekaragaman hayati ditunjukkan dengan adanya variasi makhluk hidup yang meliputi bentuk, penampilan, jumlah serta ciri lain. Penyebabnya adalah faktor genetik (faktor yang bersifat relatif konstan atau stabil terhadap morfologi (fenotip) organisme), dan factor lur (factor yang bersifat relatif labil terhadap morfologi organisme).

Keanekaragaman hayati mencakup tiga tingkatan pengertian yang berbeda, yaitu keanekaragaman gen, keanekaragaman jenis,dan keanekaragaman ekosistem.

1. Keanekaragaman Gen    Keanekaragaman gen adalah keanekaragaman individu dalam satu jenis makhluk hidup. Gen adalah substansi terkecil/unit dasr yang membawa faktor keturunan. Gen terdapat di dalam kromosom yang tersusun atas molekul rantai dobel heliks yang disebut DNA.

  2. Keanekaragaman Jenis      Keanakaragaman jenis menunjukkan seluruh variasi yang terdapat pada makhluk hidup antar jenis (interspesies) dalam satu marga. Keanekaragaman jenis lebih mudah diamati daripada keanekaragaman gen.perbedaan antarspesies makhluk hidup dalamsatu marga atau genus lebih mencolok shingga lebih mudah diamati daripada perbedaan antarindividu dalam satu spesies. Misalnya nangka, keluwih, dan sukun ketiganya termasuk dalam genus yang sama, yaitu Arthocarpus.

3. Keanekaragaman EkosistemEkosistem adalah komunitas organic yang terdiri atas tumbuhan, hewan, dan mikroorganisme bersama lingkungan fisik dan kimia tempat hidup atau habitatnya.Antara komunitas organik, habitat, serta factor-faktor fisik dan kimia dalam suatu ekosistem selalu berinteraksi. Factor fisik meliputi iklim, air, tanah, udara, cahaya, suhu, dan kelembapan. Factor kimia meliputi tingkat keasaman, kandungan mineral, dan salinitas. Factor fisik dan kimia disbut komponen abiotik.

BAB VPENUTUP

A.    Kesimpulan1.      DNA di tempeli oleh makromolekul-makromolekul seperti karbohidrat,lemak, protein dan

lain-lainnya, cara mudah memisahkan makromolekul adalah dengan menggunakan detergen.

2.      Jenis detergen berpengaruh terhadapa hasil isolasi DNA pada buah, tingkat kualitas detergen dalam membentuk DNA adala bervariasi tergantung dari jenis buah dan kandungan air buah. Detergen bubuk berkualitas lebih baik pada buah dengan kadar air tinggi  sedangkan detergen cair berkualitas lebih baik pada buah dengan kadar air sedang dan rendah.

3.      Detergen cair memiliki kualitas paling baik dalam kecepatan membentuk DNA sedangkan detergen bubuk mempunyai kecepatan paling rendah dalam membentuk DNA.

B.     SaranSaat melakukan praktikum sebaiknya serius. Jangan main-main,agar hasilnya nantipun tidak main-main.Dan sebaiknya,sebelum praktikum,ada baiknya sehari sebelum praktikum,alat-alat yang akan di pakai di siapkan terlebih dahulu.Agar tidak membuang-buang waktu banyak.

DAFTAR PUSTAKA

http://deallia.blogspot.com/2013/09/laporan-pengamatan-isolasi-dna.html

http://biologiaja.blogspot.com/2012/05/isolasi-dna-buah-pisang.html

http://aisyatunnurlaelyshare.wordpress.com/science/isolasi-dna/

http://biology-community.blogspot.com/2012/08/isolasi-dna.html

http://www.news-medical.net/health/Molecular-Biology-Techniques-%28Indonesian

%29.aspx

PAGE VIEWS

KATEGORI

anatomy  (2)

Artikel  (7)

Astrobiology  (1)

Biofisika  (4)

Bioinformatika  (3)

Biokimia  (7)

Biologi Molekular  (18)

Biologi SMA  (28)

BioMath  (1)

BioReligi  (1)

BioSpiritual  (2)

Bioteknologi  (7)

Botani  (2)

Connectome  (1)

E-Book Biologi  (97)

Ekspedisi  (4)

Enzimology  (3)

Evolusi  (1)

filsafat  (1)

Fisiologi Hewan  (4)

Fisiologi Tumbuhan  (7)

Forensik  (1)

Genetika  (8)

Global Warming  (2)

Histologi  (2)

Kesehatan  (9)

Laboratorium  (3)

Lingkungan  (5)

Mikrobiologi  (2)

Mikroteknik  (7)

Nutrisi  (1)

Rekayasa Genetika  (2)

Virologi  (5)

zoologi  (6)

COPYRIGHT THIS BLOG

ISOLASI DNA

Kamis, Agustus 16, 2012  Biologi Molekular, Laboratorium  9 comments

Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Corkill dan Rapley, 2008; Dolphin, 2008). Menurut Surzycki (2000), ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat.

Prisnsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan. Bahkan beberapa teknik menjadi lebih mudah dengan menggunakan kit yang diproduksi oleh suatu perusahaan sebagai contoh kit yang digunakan untuk isolasi DNA pada tumbuhan seperti Kit Nucleon Phytopure sedangkan untuk isolasi DNA pada hewan digunakan GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit. Namun tahapan-tahapan isolasi DNA dalam setiap langkahnya memiliki protokol sendiri yang disesuaikan dengan keperluan. Penggunaan teknik isolasi DNA dengan kit dan manual memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode konvensional memiliki kelebihan harga lebih murah dan digunakan secara luas sementara

kekurangannya membutuhkan waktu yang relatif lama dan hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel. 

 Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel (Holme dan Hazel, 1998). Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi (Giacomazzi et al., 2005). Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran sel (Surzycki, 2000). Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase K seperti untuk melisiskan membran pada sel darah (Khosravinia et al., 2007) serta mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel (Brown, 2010; Surzycki (2000). 

Pada proses lisis dengan menggunakan detergen, sering digunakan sodium dodecyl sulphate (SDS) sebagai tahap pelisisan membran sel. Detergen tersebut selain berperan dalam melisiskan membran sel juga dapat berperan dalam mengurangi aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim pendegradasi DNA (Switzer, 1999). Selain digunakan SDS, detergen yang lain seperti cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) juga sering dipakai untuk melisiskan membran sel pada isolasi DNA tumbuhan (Bettelheim dan Landesberg, 2007). Parameter keberhasilan dalam penggunaan CTAB bergantung pada beberapa hal. Pertama, Konsentrasi NaCl harus di atas 1.0 M untuk mencegah terbentuknya kompleks CTAB-DNA. Karena jumlah air dalam pelet sel sulit diprediksi, maka penggunaan CTAB sebagai pemecah larutan harus dengan NaCl dengan konsentrasi minimal 1.4 M. Kedua, ekstrak dan larutan sel yang mengandung CTAB harus disimpan pada suhu ruang karena kompleks CTAB-DNA bersifatinsolublepada suhu di bawah 15°C. Ketiga, penggunaan CTAB dengan kemurnian yang baik akan menentukan kemurnian DNA yang didapatkan dan dengan sedikit sekali kontaminasi polisakarida. Setelah ditambahkan CTAB, sampel diinkubasikan pada suhu kamar. Tujuan inkubasi ini adalah untuk mencegah pengendapan CTAB karena CTAB akan mengendap pada suhu 15°C. Karena efektivitasnya dalam menghilangkan polisakarida, CTAB banyak digunakan untuk purifikasi DNA pada sel yang mengandung banyak polisakarida seperti terdapat pada sel tanaman dan bakteri gram negatif seperti Pseudomonas, Agrobacterium, dan Rhizobium (Surzycki, 2000). 

Dalam penggunaan buffer CTAB seringkali ditambahkan reagen-reagen lain seperti NaCl, EDTA, Tris-HCl, dan 2-mercaptoethanol. NaCl berfungsi untuk menghilangkan polisakarida sementara 2-mercaptoethanol befungsi untuk menghilangkan kandungan senyawa polifenol dalam sel tumbuhan (Ranjan et al., 2010). 2-mercaptoethanol dapat menghilangkan polifenol dalam sel tanaman dengan cara membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa polifenol yang kemudian akan terpisah dengan DNA (Lodhi et al., 1994). Senyawa polifenol perlu dihilangkan agar diperoleh kualitas DNA yang baik (Moyo et al., 2008). Polifenol juga dapat menghambat reaksi dari enzim Taq polimerase pada saat dilakukan amplifikasi. Disamping itu polifenol akan mengurangi hasil ektraksi DNA serta mengurangi tingkat kemurnian DNA (Porebskiet al., 1997). Penggunaan 2-mercaptoethanol dengan pemanasan juga dapat

mendenaturasi protein yang mengkontaminasi DNA (Walker dan Rapley, 2008). 

Konsentrasi dan pH dari bufer yang digunakan harus berada dalam rentang pH 5 sampai 12. Larutan buffer dengan pH rendah akan mengkibatkan depurifikasi dan mengakibatkan DNA terdistribusi ke fase fenol selama proses deproteinisasi. Sedangkan pH larutan yang tinggi di atas 12 akan mengakibatkan pemisahan untai ganda DNA. Fungsi larutan buffer adalah untuk menjaga struktur DNA selama proses penghancuran dan purifikasi sehingga memudahkan dalam menghilangkan protein dan RNA serta mencegah aktivitas enzim pendegradasi DNA dan mencegah perubahan pada molekul DNA. Untuk mengoptimalkan fungsi larutan buffer, dibutuhkan konsentrasi, pH, kekuatan ion, dan penambahan inhibitor DNAase dan detergen (Surzycki 2000). 

 Pada tahapan ekstraksi DNA, seringkali digunakan chelating agent seperti ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) yang berperan menginaktivasi enzim DNase yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim nuklease dengan cara mengikat ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor enzim DNAse (Corkill dan Rapley, 2008). DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi. Fenol seringkali digunakan sebagai pendenaturasi protein, ekstraksi dengan menggunakan fenol menyebabkan protein kehilangan kelarutannya dan mengalami presipitasi yang selanjutnya dapat dipisahkan dari DNA melalui sentrifugasi (Karp, 2008). Bettelheim dan Landesberg (2007) menyebutkan bahwa setelah sentrifugasi akan terbentuk 2 fase yang terpisah yakni fase organik pada lapisan bawah dan fase aquoeus (air) pada lapisan atas sedangkan DNA dan RNA akan berada pada fase aquoeus setelah sentrifugasi sedangkan protein yang terdenaturasi akan berada pada interfase dan lipid akan berada pada fase organik (Gambar 1). Selain fenol, dapat pula digunakan campuran fenol dan kloroform atau campuran fenol, kloroform, dan isoamil alkohol untuk mendenaturasi protein. Ekstrak DNA yang didapat seringkali juga terkontaminasi oleh RNA sehingga RNA dapat dipisahkan dari DNA ekstrak dengan cara pemberian RNAse (Birren, et al., 1997; Clark, 2010). 

Gambar 1. Asam nukleat berada pada lapisan air setelah disentrifugasi 

pada tahapan ekstraksi (Clark, 2010). klik gambar untuk memperbesar. 

Asam nukleat adalah molekul hidrofilik dan bersifat larut dalam air. Disamping itu, protein juga mengandung residu hidrofobik yang mengakibatkan protein larut dalam pelarut organik.

Berdasarkan sifat ini, terdapat beberapa metode deproteinisasi berdasarkan pemilihan pelarut organik. Biasanya pelarut organik yang digunakan adalah fenol atau kloroform yang mengandung 4% isoamil alkohol. Penggunaan kloroform isoamil alkohol (CIA) berdasarkan perbedaan sifat pelarut organik. Kloroform tidak dapat bercampur dengan air dan kemampuannya untuk mendeproteinisasi berdasarkan kemampuan rantai polipeptida yang terdenaturasi untuk masuk atau termobilisasi ke dalam fase antara kloroform – air. Konsentrasi protein yang tinggi pada fase antara tersebut dapat menyebabkan protein mengalami presipitasi. Sedangkan lipid dan senyawa organik lain akan terpisah pada lapisan kloroform (Clark, 2010). 

 Proses deproteinisasi yang efektif bergantung pada besarnya fase antara kloroform-air. Proses ini dapat dilakukan dengan membentuk emulsi dari air dan kloroform. Hal ini hanya dapat dilakukan dengan penggojogan atau sentrifugasi yang kuat karena kloroform tidak dapat bercampur dengan air. Isoamil alkohol berfungsi sebagai emulsifier dapat ditambahkan ke kloroform untuk membantu pembentukan emulsi dan meningkatkan luas permukaan kloroform-air yang mana protein akan mengalami presipitasi. Penggunaan kloroform isoamil alkohol ini memungkinkan untuk didapatkan DNA yang sangat murni, namun dengan ukuran yang terbatas (20.000–50.000 bp). Fungsi lain dari penambahan CIA ini adalah untuk menghilangkan kompleks CTAB dan meninggalkan DNA pada fase aquoeus. DNA kemudian diikat dari faseaquoeus dengan presipitasi etanol (Surzycki, 2000). 

Setelah proses ekstraksi, DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui presipitasi.Pada umumnya digunakan etanol atau isopropanol dalam tahapan presipitasi. Kedua senyawa tersebut akan mempresipitasi DNA pada fase aquoeus sehingga DNA menggumpal membentuk struktur fiber dan terbentuk pellet setelah dilakukan sentrifugasi (Switzer, 1999).Hoelzel (1992) juga menambahkan bahwa presipitasi juga berfungsi untuk menghilangkan residu-residu kloroform yang berasal dari tahapan ekstraksi. 

 Menurut Surzycki (2000), prinsip-prinsip presipitasi antara lain pertama, menurunkan kelarutan asam nukleat dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar mengelilingi molekul DNA di larutan aquoeus. Muatan dipole positif dari air berinteraksi dengan muatan negatif pada gugus fosfodiester DNA. Interaksi ini meningkatkan kelarutan DNA dalam air. Isopropanol dapat bercampur dengan air, namun kurang polar dibandingkan air. Molekul isopropanol tidak dapat berinteraksi dengan gugus polar dari asam nukleat sehingga isopropanol adalah pelarut yang lemah bagi asam nukleat; kedua, penambahan isopropanol akan menghilangkan molekul air dalam larutan DNA sehingga DNA akan terpresipitasi; ketiga, penggunaan isopropanol dingin akan menurunkan aktivitas molekul air sehingga memudahkan presipitasi DNA. 

Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu-residu RNA dan protein yang masih tersisa. Residu tersebut juga mengalami koagulasinamun tidak

membentuk struktur fiber dan berada dalam bentuk presipitat granular.Pada saat etanol atau isopropanol dibuang dan pellet dikeringanginkan dalam tabung, maka pellet yang tersisa dalam tabung adalah DNA pekat.Proses presipitasikembali dengan etanol atau isopropanol sebelum pellet dikeringanginkan dapat meningkatkan derajat kemurnian DNA yang diisolasi (Bettelheim dan Landesberg, 2007). Keller dan Mark (1989) menerangkan bahwa pencucian kembali pellet yang dipresipitasi oleh isopropanol dengan menggunakan etanol bertujuan untuk menghilangkan residu-residu garam yang masih tersisa. Garam-garam yang terlibat dalam proses ekstraksi bersifat kurang larut dalam isopropanol sehingga dapat terpresipitasi bersama DNA, oleh sebab itu dibutuhkan presipitasi kembali dengan etanol setelah presipitasi dengan isopropanol untuk menghilangkan residu garam (Ausubel et al., 2003). 

Setelah dilakukan proses presipitasi dan dilakukan pencucian dengan etanol, maka etanol kemudian dibuang dan pellet dikeringanginkan, perlakuan tersebut bertujuan untuk menghilangkan residu etanol dari pelet DNA. Penghilangan residu etanol dilakukan dengan cara evaporasi karena etanol mudah menguap (Surzycki, 2000). Pada tahap pencucian biasanya etanol dicampur dengan ammonium asetat yang bertujuan untuk membantu memisahkan kontaminan yang tidak diinginkan seperti dNTP dan oligosakarida yang terikat pada asam nukleat (Sambrook et al., 2001). 

Setelah pellet DNA dikeringanginkan, tahap selanjutnya adalah penambahan buffer TE ke dalam tabung yang berisi pellet dan kemudian disimpan di dalam freezer dengan suhu sekitar -20ºC. Verkuil et al. (2008) menyatakan bahwa buffer TE dan penyimpanan suhu pada -20ºC bertujuan agar sampel DNA yang telah diekstraksi dapat disimpan hingga waktu berminggu-minggu. Keller dan Mark (1989) juga menjelaskan bahwa pelarutan kembali dengan buffer TE juga dapat memisahkan antara RNA yang mempunyai berat molekul lebih rendah dibandingkan DNA sehingga DNA yang didapatkan tidak terkontaminasi oleh RNA dan DNA sangat stabil ketika disimpan dalam keadaan terpresipitasi pada suhu -20ºC. 

Gambar 2. Proses pufrifikasi DNA dengan menggunakan metode silika dan kolom kromatografi (a) proses pengikatan DNA ke silika dengan bantuan perubahan konsentrasi garam, (b) DNA dielusi untuk memperoleh DNA (Brown, 2010). Klik gambar untuk memperbesar. 

Isolasi DNA juga dapat dilakukan dengan menggunakan kit yang sudah diproduksi oleh beberapa perusahan untuk mempermudah dan mempercepat proses isolasi DNA. Kit isolasi juga disesuaikan dengan kebutuhan oleh konsumen dan jenis sel yang akan digunakan. Berikut adalah bagan contoh isolasi DNA tanaman dengan menggunakan Kit Nucleon Phytopure yang disajikan pada Gambar 3. 

 

Gambar 3. Bagan isolasi DNA dengan menggunakan kit phytopure. 

Klik gambar untuk memperbesar.

ISOLASI GENOM DNA, ANALISIS SEQUEN DNA dan IDENTIFIKASI SEQUEN DNA

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Perkembangan bioteknologi modern di awal tahun 1970-an telah membuka cakrawala baru dunia ilmu pengetahuan dan teknologi. Berbagai disiplin ilmu bergerak bersama dalam proses pengembangan teknik-teknik yang digunakan dalam penelitian biologi molekuler.  Kajian aktivitas terpadu antar ilmu-ilmu biologi, biokimia, genetika, mikrobiologi, teknik

kimia, komputasi, dan biofisika dengan menggunakan pendekatan biologi molekuler untuk menghasilkan suatu barang dan jasa yang terkait dengan perkembangan IPTEK.

       Bioteknologi berasal dari kata latin yaitu bio (hidup), teknos (teknologi = penerapan) dan logos (ilmu). Bioteknologi adalah cabang biologi yang mempelajari pemanfaatan prinsip ilmiah dan rekayasa terhadap organisme, proses biologis untuk meningkatkan potensi organisme maupun menghasilkan produk dan jasa bagi kepentingan manusia.

        DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponenkomponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponenkomponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincin ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika guanin berikatan dengan sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika adenin berikatan dengan timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida.

Penggunaan PCR telah berkembang secara cepat seirama dengan perkembangan biologi molekuler. PCR digunakan untuk identifikasi penyakit genetik, infeksi oleh virus, diagnosis dini penyakit seperti AIDS, Genetic profiling in forensic, legal and bio-diversity applications, biologi evolusi,Site-directed mutagenesis of genes dan mRNA Quantitation di sel ataupun jaringan.

1.2. Tujuan Praktikum

1.      Mengetahui cara mengekstraksi DNA secara sederhana

2.      Melihat presipitasi DNA

3.      Mengidentifikasi kekerabatan terdekat sekuen DNA isolate

4.      Mengetahui cara membuat pohon filogenetik yang menunjukan tingkat kekerabatan terdekat dengan mikroorganisme yang lain

1.3. Manfaat Praktikum

1.      Praktikan dapat melakukan cara mengekstraksi dari DNA

2.      Praktikan mempunyai kemampuan untuk mengidentifikasi dari kekerabatan terdekat sekuen DNA isolate

3.     Praktikan mempunyai kemampuan untuk teknik – teknik membuat pohon filogenik yang menunjukkan tingkat kekerabatan terdekat dengan mikroorganisme

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Pengertian DNA dan RNA

     Asam nukleat adalah polinukleotida yang terdiri dari unit-unit mononukleotida, jika unit-unit pembangunnya dioksinukleotida maka asam nukleat itu disebut dioksiribonukleat(DNA) dan jika terdiri dari unit-unit mononukleotida disebut asam ribonukleat(RNA). DNA dan RNA mempunyai sejumlah sifat kimia dan fisika yang sama sebab antara unit-unit mononukleotida terdapat ikatan yang sama yaitu melalui jembatan fosfodiester antara posisi 3′ suatu mononukleotida dan posisi 5′ pada mononukleotida lainnya(Harpet, 1980).            DNA merupakan suatu  polimer  besar dengan property karakteristik fisik yang unik. Eksploitasi ukuran dan struktur kimia DNA dapat dilakukan dengan isolasi dan purifikasi. Sebagian besar teknik isolasi DNA memerlukan lisis sel, yang dilanjutkan dengan ekstraksi protein dengan menggunakan larutan organic berbasis fenol dan presipitasi DNA dalam ethanol. Kemurnian DNA dapat diketahui dengan menggunakan spektrofotometri dengan menghitung ratio hasil pengamatan pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm = 1,8. Keutuhan relative DNA dapat dilakukan dengan gel elektroforesis. Apabila purifikasi diperlukan, metode kromatografi bisa digunakan atau dengan penambahan enzim RNase.

DNA ditemukan pada Tahun 1869 Oleh Johann Friedrich Miescher, seorang Ahli Biokimia pertama kali Miescher mengekstrak sel-sel menggunakan darah putih dan memperoleh campuran antara DNA dan protein-protein kromosom. Yang berikutnya ekstrak asam nukleat adalah murni diperoleh menggunakan sperma ikan salmon. Uji kimiawi DNA menunjukkan bahwa DNA tersebut ditemukan Miescher Yang bersifat asam banyak mengandung dan fosfor.  

Tiga Tahun sebelum Miescher menemukan DNA, Gregor Mendel telah mempublikasikan Perkawinan Hasil percobaan kacang ercis Dan menghipotesiskan bahwa pewarisan genetik dikendalikan faktor unit Oleh, Oleh materi butir Yang Ahli genetika disebut gen sekarang.   Asam-asam nukleat seperti asam dioksiribosa nukleat (DNA) dan asam ribonukleat (RNA) memberikan dasar kimia bagi pemindahan keterangan di dalam semua sel. Asam nukleat merupakan molekul makro yang memberi keterangan tiap asam nukleat mempunyai urutan nukleotida yang unik sama seperti urutan asam amino yang unik dari suatu protein tertentu karena asam nukleat merupakan rantai polimer yang tersusun dari satuan monomer yang disebut nukleotida(Dage, 1992). Dua tipe utama asam nukleat adalah asam dioksiribonukleat(DNA) dan asam ribonukleat(RNA). DNA terutama ditemui dalam inti sel, asam ini merupakan pengemban kode genetik dan dapat memproduksi atau mereplikasi dirinya dengan tujuan membentuk sel-sel baru untuk memproduksi organisme itu dalam sebagian besar organisme, DNA suatu sel mengerahkan sintesis molekul RNA, satu tipe RNA, yaitu messenger RNA(mRNA), meninggalkan inti sel dan mengarahkan tiosintesis dari

berbagai tipe protein dalam organisme itu sesuai dengan kode DNA-nya(fessenden, 1990). Meskipun banyak memiliki persamaan dengan DNA, RNA memiliki perbedaan dengan DNA, antara lain yaitu(Poedjiati, 1994):

1.      Bagian pentosa RNA adalah ribosa, sedangkan bagian pentosa DNA adalah           dioksiribosa

2.      .Bentuk molekul DNA adalah heliks ganda, bentuk molekul RNA berupa   rantai tunggal yang    terlipat,   sehingga menyerupai rantai ganda     

3.      RNA mengandung basa adenin, guanin dan sitosin seperti DNA tetapi tidak          mengandung   timin,             sebagai gantinya RNA mengandung urasil.   

4.      Jumlah guanin dalam molekul RNA tidak perlu sama dengan sitosin,           demikian pula jumlah adenin, tidak perlu sama dengan urasil.Selain itu        perbedaan RNA dengan         DNA   yang lain adalah          dalam hal(Suryo,        1992): 

a.       Ukuran dan bentuk    Pada umumnya molekul RNA lebih pendek dari molekul DNA. DNA berbentuk double helix, sedangkan RNA berbentuk pita tunggal. Meskipun demikian pada beberapa virus tanaman, RNA merupakan pita double namun tidak terpilih sebagai spiral.   

b.      Susunan kimia            Molekul RNA juga merupakan polimer nukleotida, perbedaannya dengan DNA yaitu:     

1.      Gula yang menyusunnya bukan dioksiribosa, melainkan ribosa.

2.                 Basa pirimidin yang menyusunnya bukan timin seperti DNA, tetapi urasil. 

c.        Lokasi            DNA pada umumnya terdapat di kromosom, sedangkan RNA tergantung dari macamnya, yaitu:

1.      RNA d(RNA duta), terdapat dalam nukleus, RNA d dicetak oleh salah satu  pita DNA yang berlangsung didalam nukleus.           

2.      RNA p(RNA pemindah) atau RNA t(RNA transfer), terdapat di sitoplasma

3.      RNA r(RNA ribosom), terdapat didalam ribosom.  

d.      Fungsinya       DNA berfungsi memberikan informasi atau keterangan genetik, sedangkan fungsi RNA tergantung dari macamnya, yaitu:

1.      RNA d, menerima informasi genetik dari DNA, prosesnya dinamakan transkripsi, berlangsung  didalam inti sel.

2.                 RNA t, mengikat asam amino yang ada di sitoplasma

3.                 .RNA t, mensintesa protein dengan menggunakan bahan asam amino, proses ini berlangsung di ribosom dan hasil akhir berupa polipeptida. Ada beberapa cara untuk menentukan DNA dan RNA, yaitu(Frutan and Sofia, 1968):          

     DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincinganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika guanin berikatan dengan sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika adenin berikatan dengan timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan.

     Genom adalah set lengkap materi genetic (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA dapat diisolasi, baik dari sel hewan, manusia, maupun pada tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Darah manusia terdiri atas plasma darah, globules lemak, substansi kimia (karbohidrat, protein dan hormon), dan gas (oksigen, nitrogen dan karbon dioksida). Plasma darah terdiri atas eritrosit (sel darah merah),

leukosit (sel darah putih) dan trombosit (platelet). Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih. Sel darah putih dijadikan pilihan karena memiliki nukleus, dimana terdapat DNA di dalamnya. DNA pada tumbuhan juga dapat diisolasi, contohnya pada tumbuhan bawang merah (Allium cepa) dan pada pisang (Musa sp.). Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu:      

     (1)Isolasi sel

     (2)Lisis dindingdan membran sel

     (3)Ekstraksi dalamlarutan

     (4)Purifikasi dan

     (5)Presipitasi.

       Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm.

       Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan  memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipuri-fikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung DNA/RNA total. Prinsip-prinsip isolasi DNA plasmid hampir sama dengan isolasi total DNA/RNA dari jaringan. Langkah pertama untuk mendapatkan DNA plasmid adalah dengan menumbuhkan sel-sel bakteri yang mengandung plasmid rekombinan. Setelah itu sel dipanen, dinding serta membran sel dipecah sehingga isi sel (ekstrak sel) keluar. Ekstrak sel ini kemudian dipurifikasi dengan serangkaian perlakuan sehingga diperoleh DNA plasmid yang murni. Isolasi DNA yang dilakukan dalam

penelitian ini menurut standar prosedur yang sudah biasa dilaksanakan. Homogenisasi sel dengan prosedur ini akan menghasilkan DNA utuh karena proses ini menyebabkan disrupsi sel dan tercucinya komponen-komponen sel lain selain DNA. Penambahan kloroform setelah sentrifugasi memisahkan larutan menjadi fase cair dan padat dimana fase cair merupakan DNA dan fase padat adalah campuran protein dan DNA.

2.2. PCR (Polymerase Chain Reaction)

               Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. Metoda PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106-107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap n siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target.

               Penggunaan PCR telah berkembang secara cepat seirama dengan perkembangan biologi molekuler. PCR digunakan untuk identifikasi penyakit genetik, infeksi oleh virus, diagnosis dini penyakit seperti AIDS, Genetic profiling in forensic, legal and bio-diversity applications, biologi evolusi, Site-directed mutagenesis of genes dan mRNA Quantitation di sel ataupun jaringan.

2.2.1.  Teknik Dasar Amplifikasi PCR

Penemuan awal dari teknik PCR didasarkan pada tiga waterbaths yang mempunyai temperatur yang berbeda. Thermal-cycler pertama kali dipublikasikan pada tahun 1986, akan tetapi DNA polymerase awal yang digunakan masih belum thermostable, dan harus ditambahkan disetiap siklusnya. Kelemahan lain temperature 37°C yang digunakan bias dan menyebabkan non-specific priming, sehingga menghasilkan produk yang tidak dikehendaki. Taq DNA polymerase yang diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus (Taq) dikembangkan pada tahun 1988.  Ensim ini tahan sampai temperature mendidih 100°C, dan aktifitas maksimal pada temperatur 92-95°C.

Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing dan ekstensi oleh enzim DNA polimerase. Sepasang primer oligonukleotida yang spesifik digunakan untuk membuat hibrid dengan ujung-5’ menuju ujung-3’ untai DNA target dan mengamplifikasi untuk urutan yang diinginkan. Dasar siklus PCR ada 30-35 siklus meliputi:

–        denaturation (95°C), 30 detik

–        annealing (55–60°C), 30 detik

–        extension (72°C), waktu tergantung panjang pendeknya ukuran DNA yang diinginkan  sebagai produk amplifikasi.

Peningkatan jumlah siklus PCR diatas 35 siklus tidak memberikan efek yang positif, seperti yang terlihat pada gambar1B

Gambar1. Siklus dasar PCR. A. Sistem tiga temperatur yang berbeda. B.   Kenaikan hasil amplifikasi menunjukkan pertumbuhan sigmoid.2.2.2.  Denaturasi untai ganda DNA

         Denaturasi untai ganda DNA merupakan langkah yang kritis selama proses PCR. Temperatur yang tinggi pada awal proses menyebabkan pemisahan untai ganda DNA. Temperatur pada tahap denaturasi pada kisaran 92-95ºC, suhu 94ºC merupakan pilihan standar.

Gambar2. Reaksi skematis proses amplifikasi.

Temperatur denaturasi yang tinggi membutuhkan kandungan GC yang tinggi dari DNA template, tetapi half-life dari Taq DNA Polymerase menekan secara tajam pada temperatur sekitar 95ºC.

2.2.3. Primer Annealing

                           Primer Annealing, pengenalan (annealing) suatu primer terhadap DNA target tergantung pada panjang untai, banyaknya kandungan GC, dan konsentrasi primer itu sendiri. Optimalisasi temperatur annealing dimulai dengan menghitung Melting Temperature (Tm) dari ikatan primer dan DNA template.  Cara termudah menghitung untuk mendapatkan melting-temperatur yang tepatmenggunakan rumus Tm = {(G+C)x4} +{ (A+T)x2}. Rumus standar dapat dilihat di subbab primer pada komponen PCR. Sedang temperatur annealing biasanya 5ºC ddibawah Tm primer yang sebenarnya. Secara praktis, Tm ini dipengaruhi oleh komponen buffer, konsentrasi primer dan DNA template

          Gambar3. Optimalisasi Temperatur Annealing. Primer dikalkulasi untuk menentukan annealing temperature (misal 54°C). Temperature must be confirmed practically dengan menggunakan gradient cycler. Step temperature berjarak 2°C per gradient analysis.

                 Amplifikasi akan lebih effisien bila temperatur annealing tidak kurang dari 37ºC agar tidak terjadi mispriming. Oleh karena itu, pada temperatur sekitar 55ºC akan dihasilkan amplifikasi produk yang mempunyai spesifitas yang tinggi. Penyusunan primer dapat dilihat disubbab primer dari komponen primer. Primer ini akan menempel pada urutan nukleotida yang sesuai dengan urutan primer itu sendiri, dan menempel pada posisi ujung-5’ dari untai DNA target yang telah terurai pada proses sebelumnya.

2.2.4. DNA Polymerase extension

     Pada tahap extension ini terjadi proses pemanjangan untai baru DNA, dimulai dari posisi primer yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA target akan bergerak dari ujung 5’ menuju ujung 3’ dari untai tunggal DNA. Proses pemanjangan atau pembacaan informasi DNA yang diinginkan sesuai dengan panjang urutan basa nukleotida yang ditargetkan. Pada setiap satu kilobase (1000bp) yang akan diamplifikasi memerlukan waktu 1 menit. Sedang bila kurand dari 500bp hanya 30 detik dan pada kisaran 500 tapi kurang dari 1kb perlu waktu 45 detik, namun apabila lebih dari 1kb akan memerlukan waktu 2 menit di setiap siklusnya (lihat contoh pada tabel 2).  Adapun temperatur ekstensi berkisar antara 70-72°C.

Pada reaksi PCR diperlukan DNA template, primer spesifik, ensim DNA polimerase yang thermostabil,  buffer PCR, ion Mg 2+,  dan thermal cycler.

2.2.5. Template DNA

       Ukuran target amplifikasi biasanya kurang dari 1000 pasangan basa (bp) atau 1KB, Hasil amplifikasi yang efisien antara 100-400bp. Walaupun kemungkinan hasil amplifikasi lebih dari 1 kB tetapi prosesnya kurang efisien, karena produk yang panjang rentan terhadap inhibitor yang mempengaruhi kerja ensim DNA polymerase dan waktu yang diperlukan lebih lama. Hal ini  dapat menyebabkan hasil amplifikasi yang tidak diinginkan.

       Kemurnian DNA target sangat penting, karena ketidakmurnian suspensi DNA dapat mempengaruhi reaksi amplifikasi dan dapat menghambat kerja ensim DNA polymerase. Meskipun demikian, pada kondisi tertentu amplifikasi PCR masih dapat bekerja dalam suspensi kasar, seperti koloni bakteri. Bakteri tidak perlu diekstraksi dan secara langsung dicampurkan pada PCR mix solutionsebagai template.

       Pemilihan target yang akan diamplifikasi perlu memperhatikan kestabilan genetik dari daerah/urutan nukleotida yang ditargetkan. Perubahan atau hilangnya sebagian urutan target akan berakibat hilangnya reaktivitas. Bagian dari plasmid yang membawa sifat virulensi suatu bakteri adalah salah satu contoh elemen genetik yang potensial tidak stabil. Elemen genetik ini bisa hilang waktu isolai atau pemindahan serial. Untuk mengatasi hal ini sebaiknya amplifikasi segera dilakukan setelah isolasi DNA selesai. 

2.2.6.  Primers

Primer disusun dari sintesis oligonukleotida sepanjang 15-32bp dan primer ini harus mampu mengenali urutan yang akan diamplifikasi. Untuk standar amplifikasi sepasang primer akan mempunyai kisaran pasangan basa sekitar 20 basa panjangnya pada tiap primernya. Kandungan GC harus antara 45-60%. Annealing temperatur antara primer yang digunakan harus berkisar antara 1°C. Ujung 3’ dari setiap primer harus G atau C, akan tetapi hindari susunan nukleotida G/C berturut-turut tiga pada ujung ini, misal CCG, GCG, GGC, GGG, CCC, GCC. Pada penentuan atau penyusunan sepasang primer, penting diperhatikan urutan primer tidak saling komplementer sehingga membentuk dimer-primers, berikatan satu sama lain, atau membentukhairpins. Hal lainnya hindari menyusun primer pada daerah DNA repetitif. Selain itu, faktor homologi urutan nukleotida dengan urutan DNA target sangat

mempengaruhi kestabilan ikatan keduanya. Semakin tinggi prosentase homologi semakin stabil ikatan yang terbentuk.

                              5´-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3´

                                               | |  |  | |  | | |  | |

                     3´-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5´

Gambar4. Bentuk dimer-primer dari sepasang primer

Temperatur annealing sangat tergantung pada primer dengan Tm yang tertentu. Penentuan formula primer ditentukan secara teoritikal oleh Tm asam nukleat. Formula di bawah ini dapat digunakan untuk mengestimasi titik Tm untuk oligonucleotida primer yang diinginkan:

Tm = 81.5 + 16.6 x (log10[Na + ]) + 0.41 x 9%G+C) -675/n

Dimana  [Na+] adalah konsentrasi molar garam, [Na+]=[K+]; dan n= jumlah basa dalam oligonukleotida.

2.2.7.  Taq DNA polymerase

     Enzim ini bersifat thermostabil dan diisolasi dari Thermus aquaticus. Aktivitas polimerisasi DNAnya dari ujung-5’ ke ujung-3’ dan aktivitas enzimatik ini mempunyai waktu paruh sekitar 40 menit pada 95ºC. Biasanya untuk setiap 100μl volume reaksi ditambahkan 2.0-2.5 unit Taq polymerase.  Penggunaan enzim ini harus diperhatikan proses penyimpanan (selalu di freezer -20ºC) dan juga pada saat pengambilan tidak boleh terlalu lama di temperatur ruang, usahakan selalu dalam kotak berisi water-ice. Hal ini dilakukan untuk meminimalkan kerusakan enzim yang mungkin terjadi akibat pengaruh perubahan temperatur. Taq DNA polymerase yang digunakan dalam PCR adalah milik paten asli dari perusahaan Promega. Walaupun pada saat ini telah banyak dikembangkan oleh perusahaan yang lain.

2.2.8.  PCR buffer dan konsentrasi Mg2+

Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50mM KCl, 10mM Tris-Cl (pH8.3) dan 1.5mM MgCl2. Buffer standard ini akan bekerja dengan baik untuk DNA template dan primer dengan kondisi tertentu, tetapi mungkin tidak optimum dengan kombinasi yang lain.  Produk PCR buffer ini terkadang dijual dalam bentuk tanpa atau dengan MgCl2.

Konsentrasi ion magnesium dalam PCR buffer merupakan faktor yang sangat kritikal, karena kemungkinan dapat mempengaruhi proses annealing primer, temperatur dissosiasi untai DNA template, dan produk PCR. Hal ini disebabkan konsentrasi optimal ion Mg2+ itu sangat rendah. Hal ini penting untuk preparasi DNA template yang tidak mengandung konsentrasi chelating agent yang tinggi, seperti EDTA atau phosphat. Ion Mg2+ yang bebas bila terlalu rendah atau tidak ada, maka biasanya tidak menghasilkan produk akhir PCR, sedang bila terlalu banyak ion Mg2+yang bebas akan menghasilkan produk PCR yang tidak diinginkan. Penentuan kisaran konsentrasi Mg2+ dapat dilihat pada gambar 5, pada setiap step bervariasi berjarak0.5 mM.

2.2.9.  Nucleotides (dNTPs)

        Konsentrasi yang biasanya digunakan untuk setiap dNTP adalah 200 μM.Pada konsentrasi ini penting untuk mengatur konsentrasi ke-empat dNTP pada titik estimasi Km untuk setiap dNTP. 50mM, harus selalu diatur pH7.0. Konsentrasi yang tinggi akan menimbulkan ketidakseimbangan dengan enzim polymerase. Sedang pada konsentrasi rendah akan memberikan ketepatan dan spesifitas yang tinggi tanpa mereduksi hasil akhir. Total konsentrasi dNTP dan ion saling terkait dan tidak akan merubah secara bebas.

 

2.2.10.  PCR Thermal Cycler

         PCR thermal cycler pertama kali dikembangkan oleh perusahaanPerkinElmer sebagai pemegang paten asli. Pada saat ini telah diproduksi berbagai macam tipe alat PCR thermal cycler ini dari berbagai perusahaan yang bergerak dalam bioteknologi. Walaupun nama masing-masing alat itu berbeda tetapi prinsip kerjanya sama.

Gambar6. PCR thermal cycler multi-block system       Alat ini secara tepat meregulasi temperatur dan siklus waktu yang dibutuhkan untuk reprodusibilitas dan keakuratan reaksi amplifikasi. Seperti telah disebutkan di atas, siklus PCR terbagi atas tiga step utama yaitu DNA denaturation (92-95ºC, selama 30-60 detik), primer annealing (50-64ºC, selama 60-120 detik), dan extention (70-72ºC, selama 30-120 detik). Siklus ini berulang 20-35 kali.  Siklus utama ini diawali terlebih dahulu oleh dengan hot-start misal 94ºC selama 5 menit (lihat tabel 2 diatas). Langkah ini dilakukan untuk memaksimalkan proses denaturasi DNA template, karena apabila denaturasi tidak sempurna akan menyebabkan kegagalan proses PCR. Setelah siklus utama berakhir, maka ditambah program final extension dengan temperatur 70-72ºC selama 7-10 menit.              

2.3. Bioinformatika

2.3.1. Pengertian Bioinformatika

     Bioinformatika adalah ilmu yang mempelajari penerapan tekhnik komputasional untuk mengelola dan menganalisis informasi biologi. Bidang ini mencakup penerapan metode-metode matematika, statiska, dan informatika untuk memecahkan masalah-masalah biologis, terutama dengan menggunakan sekuens DNA dan asam amino serta informasi yang berkaitan dengannya. Contoh topik uttama bidang ini meliputi basis data untuk mengelola informasi biologis, penyejajaran sekuens, prediksi struktur untuk meramalakan bentuk struktur protein maupun struktur sekunder RNA, analisis filogenetik, dan analisis ekspresi gen

2.3.2. Sejarah Bioinformatika

     Istilah bioinformatika mulai dikemukakan pada pertengan era 1980-an untuk mengacu pada penerapan komputer dalam biologi. namun demikian, penerapan bidang-bidang dalam bioinformatika seperti pada pembuatan basis data dan pengembangan algoritma untuk analisis sekuens biologis sudah dilakukan sejak tahun 1960-an Kemajuan tekhnik biologi molekular dalam mengungkap sekuens biologis dari protein awal 1950-an dan asam nukleat sejak 1960-an mengawali perkembangan basis data dan tekhnik analisis sekuens biologis. Basis data sekuens protein mulai dikembangkan pada tahin 1960-an di Amerika Serikat, sementara basis data sekuens DNA dikembangkan pada 1970-an di Amerika Serikat dan Jerman. Penemuan tekhnik sekuensing DNA yang lebih cepat pada pertengahan 1970-an menjadi landasan terjadinya ledakkan jumlah sekuens DNA yang berhasil diungkapkan pada 1980-an dan 1990-an, menjadi salah satu pembuka jalan baig proyek-proyek pengungkapan genom, meningkatkan kebutuhan akan pengelolaan dan analisis sekuens, dan pada akhirnya menyebabkan lahirnya bioinformatika. Perkembangan internet juga mendukung berkembangnya bioinformatika. Basis data bioinformatika yang terhubung melalui internet memudahkan ilmuwan hasil sekuensing ke dalam basis dara tersebut mauoun memperoleh sekuens biologis sebagai bahan analisis. Selain itu, penyebaran program-program aplikasi bioinformatika melalui internet memudahkan ilmuwan mengakses program-program tersebut dan kemudian memudahkan pengembangannya.

2.3.3. Penerapan utama bioinformatika                          Sesuai dengan jenis informasi biologis yang disimpanya, basis data sekuens biologis berupa basis data primer asam nukleat maupun protein, basis data sekunder untuk menyimpan motif sekuens protein, dan basis data struktur untuk menyimpan data struktur protein maupun asam nukleat. Basis data utama untuk sekuens asam nukleat saat ini adalah GenBank (Amerika Serikat), EMBL  (Eropa), dan DDBJ(en) (DNA Data Bank of Japan, Jepang). Ketiga basis data tersebut bekerja sama dan bertukar data secara harian untuk menjaga keluasan cakupan masing-masing basis data. Sumber utama data sekuens asam nukleat adalah submisi langsung dari periset individual, proyek sekuensing genom, dan pendaftaran paten. Selain berisi sekuens asam nukleat, entri dalam basis data sekuens asam nukleat umumnya mengandung informasi tentang jenis asam nukleat (DNA  atau RNA), nama organisme  sumber asam nukleat tersebut, dan pustaka yang berkaitan dengan sekuens asam nukleat tersebut.   

          Sementara itu, contoh beberapa basis data penting yang menyimpan sekuens primer protein adalah PIR (Protein Information Resource, Amerika Serikat), Swiss-Prot (Eropa), dan TrEMBL (Eropa). Ketiga basis data tersebut telah digabungkan dalam UniProt (yang didanai

terutama oleh Amerika Serikat). Entri dalam UniProt mengandung informasi tentang sekuens protein, nama organisme sumber protein, pustaka yang berkaitan, dan komentar yang umumnya berisi penjelasan mengenai fungsi protein tersebut.   

          BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) merupakan perkakas bioinformatika yang berkaitan erat dengan penggunaan basis data sekuens biologis. Penelusuran BLAST (BLAST search) pada basis data sekuens memungkinkan ilmuwan untuk mencari sekuens asam nukleat maupun protein yang mirip dengan sekuens tertentu yang dimilikinya. Hal ini berguna misalnya untuk menemukan gen sejenis pada beberapa organisme atau untuk memeriksa keabsahan hasil sekuensing maupun untuk memeriksa fungsi gen hasil sekuensing. Algoritma yang mendasari kerja BLAST adalah penyejajaran sekuens.       

           PDB (Protein Data Bank, Bank Data Protein) adalah basis data tunggal yang menyimpan model struktural tiga dimensi protein dan asam nukleat hasil penentuan eksperimental (dengan kristalografi sinar-X, spektroskopi NMR dan mikroskopi elektron). PDB menyimpan data struktur sebagai koordinat tiga dimensi yang menggambarkan posisi atom-atom dalam protein ataupun asam nukleat.

2.3.4. Penyejajaran Sekuens

            Penyejajaran sekuens (sequence alignment) adalah proses penyusunan/pengaturan dua atau lebih sekuens sehingga persamaan sekuens-sekuens tersebut tampak nyata. Hasil dari proses tersebut juga disebut sebagai sequence alignment atau alignment  saja. Baris sekuens dalam suatu alignment diberi sisipan (umumnya dengan tanda "–") sedemikian rupa sehingga kolom-kolomnya memuat karakter yang identik atau sama di antara sekuens-sekuens tersebut. Berikut adalah contoh alignment DNA dari dua sekuens pendek DNA yang berbeda, "ccatcaac" dan "caatgggcaac" (tanda "|" menunjukkan kecocokan atau match di antara kedua sekuens).     

        Sequence alignment merupakan metode dasar dalam analisis sekuens. Metode ini digunakan untuk mempelajari evolusi sekuens-sekuens dari leluhur yang sama (common ancestor). Ketidakcocokan (mismatch) dalam alignment diasosiasikan dengan proses mutasi, sedangkan kesenjangan (gap, tanda "–") diasosiasikan dengan proses insersi atau delesi. Sequence alignment memberikan hipotesis atas proses evolusi yang terjadi dalam sekuens-sekuens tersebut. Misalnya, kedua sekuens dalam contoh alignment di atas bisa jadi berevolusi dari sekuens yang sama "ccatgggcaac". Dalam kaitannya dengan hal ini, alignment juga dapat menunjukkan posisi-posisi yang dipertahankan (conserved) selama evolusi dalam sekuens-sekuens protein, yang menunjukkan bahwa posisi-posisi tersebut bisa jadi penting bagi struktur atau fungsi protein tersebut.          

        Selain itu, sequence alignment juga digunakan untuk mencari sekuens yang mirip atau sama dalam basis data sekuens. BLAST adalah salah satu metode alignment yang sering digunakan dalam penelusuran basis data sekuens. BLAST menggunakan algoritma heuristik dalam penyusunan alignment. Beberapa metode alignment lain yang merupakan pendahulu BLAST adalah metode "Needleman-Wunsch" dan "Smith-Waterman". Metode Needleman-Wunsch digunakan untuk menyusun alignment global di antara dua atau lebih sekuens, yaitu

alignment atas keseluruhan panjang sekuens tersebut. Metode Smith-Waterman menghasilkan alignment lokal, yaitu alignment atas bagian-bagian dalam sekuens. Kedua metode tersebut menerapkan pemrograman dinamik (dynamic programming) dan hanya efektif untuk alignment dua sekuens (pairwise alignment)                

           Clustal adalah program bioinformatika untuk alignment multipel (multiple alignment), yaitu alignment beberapa sekuens sekaligus. Dua varian utama Clustal adalah ClustalW dan ClustalX. Metode lain yang dapat diterapkan untuk alignment sekuens adalah metode yang berhubungan dengan Hidden Markov Model ("Model Markov Tersembunyi", HMM). HMM merupakan model statistika yang mulanya digunakan dalam ilmu komputer untuk mengenali pembicaraan manusia (speech recognition). Selain digunakan untuk alignment, HMM juga digunakan dalam metode-metode analisis sekuens lainnya, seperti prediksi daerah pengkode protein dalam genom dan prediksi struktur sekunder protein.

2.3.5. Prediksi Struktur Protein

         Secara kimia/fisika, bentuk struktur protein diungkap dengan kristalografi sinar-X ataupun spektroskopi NMR, namun kedua metode tersebut sangat memakan waktu dan relatif mahal. Sementara itu, metode sekuensing  protein relatif lebih mudah mengungkapkan sekuens asam amino protein. Prediksi struktur protein berusaha meramalkan struktur tiga dimensi protein berdasarkan sekuens asam aminonya (dengan kata lain, meramalkan struktur tersier dan struktur sekunder berdasarkan struktur primer protein). Secara umum, metode prediksi struktur protein yang ada saat ini dapat dikategorikan ke dalam dua kelompok, yaitu metode pemodelan protein komparatif dan metode pemodelan de novo.      

         Pemodelan protein komparatif (comparative protein modelling) meramalkan struktur suatu protein berdasarkan struktur protein lain yang sudah diketahui. Salah satu penerapan metode ini adalah pemodelan homologi (homology modelling), yaitu prediksi struktur tersier protein berdasarkan kesamaan struktur primer protein. Pemodelan homologi didasarkan pada teori bahwa dua protein yang homolog memiliki struktur yang sangat mirip satu sama lain. Pada metode ini, struktur suatu protein (disebut protein target) ditentukan berdasarkan struktur protein lain (protein templat) yang sudah diketahui dan memiliki kemiripan sekuens dengan protein target tersebut. Selain itu, penerapan lain pemodelan komparatif adalah protein threading yang didasarkan pada kemiripan struktur tanpa kemiripan sekuens primer. Latar belakang protein threading adalah bahwa struktur protein lebih dikonservasi daripada sekuens protein selama evolusi; daerah-daerah yang penting bagi fungsi protein dipertahankan strukturnya. Pada pendekatan ini, struktur yang paling kompatibel untuk suatu sekuens asam amino dipilih dari semua jenis struktur tiga dimensi protein yang ada. Metode-metode yang tergolong dalam protein threading berusaha menentukan tingkat kompatibilitas tersebut.         

         Dalam pendekatan de novo atau ab initio, struktur protein ditentukan dari sekuens primernya tanpa membandingkan dengan struktur protein lain. Terdapat banyak kemungkinan dalam pendekatan ini, misalnya dengan menirukan proses pelipatan (folding) protein dari sekuens primernya menjadi struktur tersiernya (misalnya dengan simulasi

dinamika molekular), atau dengan optimisasi global fungsi energi protein. Prosedur-prosedur ini cenderung membutuhkan proses komputasi yang intens, sehingga saat ini hanya digunakan dalam menentukan struktur protein-protein kecil. Beberapa usaha telah dilakukan untuk mengatasi kekurangan sumber daya komputasi tersebut, misalnya dengan superkomputer (misalnya superkomputer Blue Gene dari IBM) atau komputasi terdistribusi (distributed computing, misalnya proyek Folding@home) maupun komputasi grid. 

2.3.6. Analisis ekspresi gen

         Ekspresi gen dapat ditentukan dengan mengukur kadar mRNA  dengan berbagai macam teknik (misalnya dengan microarray ataupun Serial Analysis of Gene Expression ["Analisis Serial Ekspresi Gen", SAGE]). Teknik-teknik tersebut umumnya diterapkan pada analisis ekspresi gen skala besar yang mengukur ekspresi banyak gen (bahkan genom) dan menghasilkan data skala besar. Metode-metode penggalian data (data mining) diterapkan pada data tersebut untuk memperoleh pola-pola informatif. Sebagai contoh, metode-metode komparasi digunakan untuk membandingkan ekspresi di antara gen-gen, sementara metode-metode klastering (clustering) digunakan untuk mempartisi data tersebut berdasarkan kesamaan ekspresi gen.

2.4. Isolasi Genom DNA

         Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan  memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipuri-fikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung DNA/RNA total. Prinsip-prinsip isolasi DNA plasmid hampir sama dengan isolasi total DNA/RNA dari jaringan. Langkah pertama untuk mendapatkan DNA plasmid adalah dengan menumbuhkan sel-sel bakteri yang mengandung plasmid rekombinan. Setelah itu sel dipanen, dinding serta membran sel dipecah sehingga isi sel (ekstrak sel) keluar. Ekstrak sel ini kemudian dipurifikasi dengan serangkaian perlakuan sehingga diperoleh DNA plasmid yang murni. Isolasi DNA yang dilakukan dalam penelitian ini menurut standar prosedur yang sudah biasa dilaksanakan. Homogenisasi sel dengan prosedur ini akan menghasilkan DNA utuh karena proses ini menyebabkan disrupsi sel dan tercucinya komponen-komponen sel lain selain DNA. Penambahan kloroform setelah sentrifugasi memisahkan larutan menjadi fase cair dan padat dimana fase cair merupakan DNA dan fase padat adalah campuran protein dan DNA.

2.5. Electrophoresis

                 Istilah elektroforesis digunakan untuk menggambarkan migrasi partikel bermuatan di bawah pengaruh medan listrik. Dengan demikian elektroforesis gel mengacu adalah teknik di mana molekul dipaksa di rentang gel, didorong oleh arus listrik. Pada kedua ujung gel terdapat elektroda diaktifkan yang menyediakan pendorong utama. Oleh karena itu sifat molekul khususnya milik kelompok ionisable, menentukan seberapa cepat medan listrik dapat menggerakkan molekul melalui media agar-agar.       Pada proses elektroforesis kapiler, produk-produk reaksi cycle sequencingdiinjeksikan secara

elektrokinetik ke dalam kapiler yang diisi dengan polimer. Dengan diberikannya tegangan listrik tinggi maka fragmen DNA yang bermuatan negatif akan bergerak melalui polimer di dalam kapiler menuju elektroda positif. Dengan diberikannya tegangan listrik tinggi maka fragmen DNA yang bermuatan negatif akan bergerak melalui polimer di dalam kapiler menuju elektroda positif (gambar 4). Elektroforesis kapiler dapat memisahkan molekul DNA yang memiliki perbedaan bobot molekul hanya satu nukleotida.          

         Salah satu aplikasi yang sangat penting bagi elektroforesis gel dalam DNA Teknologi. Bioteknologi telah selama ribuan tahun telah digunakan oleh orang yang telah menggunakan ragi untuk membuat tepung menjadi roti dan anggur menjadi anggur. Kami sekarang menggunakan bioteknologi untuk mempelajari proses dasar kehidupan, diagnosa penyakit, dan mengembangkan pengobatan baru untuk penyakit. Beberapa alat bioteknologi merupakan komponen alami dari sel-sel. Sebagai contoh enzim restriksi yang dibuat oleh bakteri untuk melindungi diri dari virus. Mereka membunuh DNA virus oleh pemotongan itu di tempat-tempat tertentu. DNA ligase adalah suatu enzim yang ada di semua sel dan bertanggung jawab untuk bergabung bersama untai DNA. enzim restriksi dapat digunakan untuk memotong DNA pada urutan tertentu disebut situs pengakuan. Mereka kemudian bergabung dengan alur dipotong dengan DNA ligase untuk kombinasi baru dari gen. DNA rekombinan urutan mengandung gen dari dua atau lebih organisme.      

          Teknik ini telah memungkinkan peneliti untuk mendapatkan kemampuan untuk mendiagnosa penyakit seperti anemia sel sabit, cystic fibrosis, dan chorea Huntington pada awal perjalanan penyakit ini. Banyak peneliti juga menerapkan teknik-teknik bioteknologi untuk menemukan pengobatan baru untuk penyakit genetik. teknologi DNA telah memicu kemajuan penelitian di hampir semua bidang biologi. Saat ini ratusan produk yang bermanfaat yang dihasilkan oleh rekayasa genetika. Hal ini telah menjadi rutin untuk menggabungkan gen dari sumber yang berbeda, spesies biasanya berbeda - dalam tabung reaksi, dan kemudian transfer ini DNA rekombinan ke sel-sel hidup di tempat yang dapat direplikasi dan diekspresikan. Prestasi yang paling penting yang dihasilkan dari teknologi DNA rekombinan telah kemajuan dalam pemahaman dasar kita tentang biologi molekular eukariotik. Misalnya, hanya melalui penggunaan teknik gen-splicing memiliki rincian eukaryotics pengaturan gen dan peraturan telah dibuka untuk analisis eksperimental.          

        Elektroforesis gel adalah salah satu alat pokok dalam biologi molekular dan nilai penting dalam banyak aspek manipulasi genetik dan belajar. Salah satu penggunaan adalah identifikasi molekul DNA tertentu oleh pola band mereka menghasilkan dalam elektroforesis gel setelah dipotong dengan berbagai enzim restriksi. Viral DNA, DNA plasmid, dan segmen tertentu DNA kromosom semua dapat diidentifikasi dengan cara ini. Penggunaan lainnya adalah isolasi dan pemurnian fragmen individu yang mengandung gen menarik, yang dapat pulih dari gel dengan penuh aktivitas biologis. Gel elektroforesis memungkinkan untuk menentukan perbedaan genetik dan hubungan evolusi di antara spesies tanaman dan hewan. Menggunakan teknologi ini adalah mungkin untuk memisahkan dan mengidentifikasi molekul protein yang berbeda dengan sesedikit asam amino tunggal.

        Gel Elektroforesis adalah proses di mana molekul (seperti protein, DNA, atau fragmen RNA) dapat dipisahkan menurut ukuran dan muatan listrik dengan menerapkan arus listrik kepada mereka. Pasukan saat ini molekul-molekul melalui pori-pori di dalam lapisan tipis

gel, sebuah perusahaan substansi seperti jelly. Gel dapat dibuat sedemikian rupa sehingga pori-pori yang hanya dimensi yang tepat untuk memisahkan molekul-molekul dalam jarak tertentu dari ukuran dan bentuk. fragmen yang lebih kecil biasanya perjalanan lebih jauh daripada yang besar. Proses ini terkadang disebut elektroforesis gel.        . 

       elektroforesis gel agarosa adalah metode yang digunakan dalam biokimia dan biologi molekuler untuk memisahkan populasi campuran DNA dan RNA dengan fragmen panjang, atau protein yang terpisah oleh muatan [1] molekul asam nukleat. dipisahkan dengan menerapkan medan listrik untuk memindahkan bermuatan negatif molekul melalui agarosa matriks. molekul yang lebih pendek bergerak lebih cepat dan bermigrasi jauh dari yang lama karena molekul-molekul yang lebih pendek lebih mudah bermigrasi melalui pori-pori gel. Fenomena ini disebut pemisahan. [2] Protein dipisahkan oleh muatan dalam agarosa karena pori-pori gel terlalu besar untuk saringan protein.

  Estimasi ukuran molekul DNA berikut restriksi enzim pencernaan, misalnya pembatasan dalam pemetaan DNA kloning. Analisis produk PCR, misalnya dalam diagnosis genetika molekuler atau genetik   fingerprinting

  Pemisahan DNA genomik Selatan dibatasi sebelum transfer, atau RNA sebelum mentransfer Utara.

     gel agarosa mudah cor dan ditangani dibandingkan dengan matriks lain dan asam nukleat tidak kimia diubah selama elektroforesis. Sampel juga mudah ditemukan. Setelah percobaan selesai, gel yang dihasilkan dapat disimpan dalam sebuah kantong plastik di kulkas. Ada batas untuk teknik elektroforesis. Sejak saat melewati gel menyebabkan pemanasan, gel bisa meleleh selama elektroforesis. Elektroforesis dilakukan dalam larutan buffer untuk mengurangi perubahan pH karena medan listrik, yang penting karena muatan DNA dan RNA tergantung pada pH, tetapi berjalan terlalu lama dapat menghabiskan kapasitas buffering dari solusi. Selanjutnya, berbagai persiapan bahan genetik tidak dapat bermigrasi secara konsisten satu sama lain, untuk alasan morfologi atau lainnya. Sunting Faktor-faktor yang mempengaruhi migrasi asam nukleat         

           Faktor paling penting adalah panjang dari molekul DNA, molekul kecil perjalanan jauh. Tapi konformasi molekul DNA juga faktor. Untuk menghindari masalah ini molekul linier biasanya dipisahkan, fragmen DNA biasanya dari pembatasan mencerna, linear DNA produk PCR, atau RNA. Meningkatkan konsentrasi gel agarosa dari migrasi mengurangi kecepatan dan memungkinkan pemisahan molekul DNA yang lebih kecil. Semakin tinggi tegangan, semakin cepat bergerak DNA. Tapi tegangan dibatasi oleh fakta bahwa memanaskan dan akhirnya menyebabkan gel mencair. Tegangan tinggi juga menurunkan resolusi (di atas sekitar 5 sampai 8 / cm V).

           Elektroforesis DNA 'digunakan untuk memisahkan fragmen DNA dengan ukuran. Jenis gel paling sering digunakan untuk elektroforesis DNA agarosa (untuk molekul DNA yang relatif besar) dan poliakrilamida (untuk resolusi tinggi fragmen DNA pendek). Yang pertama juga kadang-kadang disebut sebagai kapal selam karena elektroforesis gel yang terendam dalam buffer. The buffer digunakan untuk pemisahan adalah Tris-Borat-EDTA atau Tris-Asetat-EDTA dan DNA bermigrasi relatif terhadap ukuran: kecil fragmen bergerak lebih cepat melalui matriks gel dan fragmen yang bergerak lebih lambat. Setelah pemisahan, gel

dapat diwarnai atau ditransfer (Southern blotting). pemisahan DNA biasanya dideteksi dengan pewarna yang mengikat ke molekul dan biasanya dilihat di bawah sinar UV. asam nukleat dapat ditransfer dari gel matriks membran kapiler lembar melalui transfer atau listrik untuk menyelidik. DNA fragmen dalam kisaran 100 bp hingga 20 kb biasanya dipisahkan dalam gel agarosa menggunakan gaya elektroforesis unit kapal selam. Hoefer menawarkan 8 ukuran unit kapal selam untuk hasil cepat atau throughput tinggi.

2.6. Ekstraksi DNA

Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah-langkah kerja analisis DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan panjang pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh karakter sample itu sendiri, dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA. Mengisolasi DNA dengan kualitas tinggi dari berbagai jenis sample memiliki tantangan tersendiri, dan metode yang ideal akan beragam bergantung pada jenis jaringan/tissue (termasuk darah), bagaimana ia diperoleh dari sumbernya, dan bagaimana sample ditangani atau disimpan sebelum diekstrak. Metode untuk isolasi asam nukleat sering dikerjakan menggunakan penghancuran mekanik atau metode kimiawi, yang kadang-kadang juga terotomatisasi. Baik metode ekstraksi manual maupun otomatis yang digunakan, kita harus berhati-hati untuk meminimalisir degradasi DNA, dengan menghindari ekspos terhadap panas, cahaya, freeze-thaw yang berulang-ulang dan vortex. Selanjutnya, laboratorium harus diatur sedemikian rupa untuk meminimalisir kemungkinan kontaminasi silang diantara sample.

Sebuah sampel biologis dapat diperoleh dari suatu tindak kejahatan dalam bentuk darah atau noda air mani atau darah segar dari seorang tersangka yang berisi beberapa unsur di samping DNA. Molekul DNA harus dipisahkan dari materi sel lain sebelum diuji. Sel-sel protein terbungkus melindungi DNA di dalam lingkungan sel dapat menghalangi kemampuan analisa DNA.Sementara itu metode ekstrasi DNA dapat dikembangkan untuk memisahkan protein-protein dan materi sel-sel yang lain dari molekul-molekul DNA. Sebagai tambahan kuantitas dan kualitas DNA sering perlu diukur sebelum kelanjutan lebih lanjut  dengan prosedur analitis untuk memastikan hasil yang optimal. Ada tiga teknik utama yang digunakan saat ini untuk ekstrasi DNA pada laboratorium forensik DNA: ektraksi organik, ekstraksi Chelex, dan FTA paper (gambar 3.1). Ekstraksi eksak atau masam-macam prosedur isolasi DNA tergantung pada bukti-bukti tipe biologis yang akan diuji. Sebagai contoh darah utuh harus diperlakukan dengan cara yang berbeda dari suatu noda darah atau suatu fragmen tulang.

Ekstraksi organik, kadang-kadang dikenal sebagai ekstraksi zat asam karbol choloform, telah digunakan untuk waktu yang lama dan mungkin telah digunakan untuk situasi di mana baik  RFLP atau PCR dilakukan. Bobot molekular tinggi DNA, yang mana  penting bagi metoda RFLP, mungkin diperoleh secara paling efektif dengan ekstraksi organik.

Metoda Chelex dari ekstraksi DNA lebih cepat dibandingkan dengan metode ekstraksi organik. Sebagai tambahan, metoda Chelex membutuhkan lebih banyak langkah dan kebanyakan langkah itu digunakan untuk mengkontaminasi sampel ke sampel. Bagaimanapun hal itu menghasilkan DNA tunggal sebagai hasil proses ekstraksi dan oleh karena itu hanya yang bermanfaat untuk prosedur pengujian yang berbasis PCR.

Semua contoh harus secara hati-hati ditangani dengan mengabaikan metoda ekstraksi DNA untuk menghindari pencemaran sampel ke kesampel atau pengenalan tentang tambahan DNA. Proses ekstraksi memungkinkan di mana contoh DNA jadi lebih peka pada pencemaran di laboratorium dibanding pada waktu lain dalam proses analisa forensik DNA. Dengan suatu alasan laboratorium-laboratorium biasa memproses sampel-sampel petunjuk  pada waktu yang berbeda dan kadang-kadang dengan loksi yang tidak sama dari dimana sampel tersebut diambil.

Metoda yang populer untuk persiapan pengambilan referensi sampel adalah dengan menggunakan noda darah dengan mengoleskannya ke kain kapas, dikenal dengan suatu carikan, dengan menghasilkan bulatan kira-kira 1 cm2 pada kain kapas tersebut, dengan rata-rata 70.000-80.000 sel darah putih dan menghasilkan rata-rata 500ng DNA genomic. Hasil nyata akan bervariasi dengan jumlah sel-sel darah putih yang akan menunjukkan sampel dan efisiensi proses ekstraksi DNA.

Ekstraksi DNA disimpan secara khusus pda suhu -20oC, atau bahkan pada suhu -80oC pada penyimpanan dalam waktu lama, untuk menjaga aktifitas inti. Nucleas-nucleas adalah enzim-enzim (protein) yang diketemukan di dalam sel-sel turunan DNA untuk memungkinkan pendauran ulang menyangkut komponen-komponen nucleotide. Nucleases memerlukan magnesium untuk bekerja dengan baik sehingga salah satu pengujian untuk mencegah mereka dari mencerna DNA di dalam darah adalah menggunakan tabung purple-topped yang berisi bahan pengawet darah yang dikenal sebagai EDTA. EDTA meliputi, atau membalut, semua magnesium bebas dengan begitu mencegah nucleases menhancurkan DNA di dalam contoh darah yang dikumpulkan.

2.6.1. Ekstraksi Organik (Phenol-Cloroform)

           Ekstraksi organik melibatkan penambahan beberapa bahan kimia. Pertama, sodium Dodecylsulfate (SDS) dan Proteinase Kare ditambahkan untuk membuka dinding sel sepanjang protein yang melindungi molekul DNA selagi mereka ada di dalam kromosom. Selanjutnya campuranphenol/cloroform ditambahkan untuk memisahkan protein dari DNA. DNA menjadi lebih dapat larut di dalam air yang mengandung campuran organic-aqueous. Ketika proses sentrifuge, bekas peninggalan protein dan selular yang tak dikehendaki dipisahkan dari tahap yang mengandung air dan menggandakan molekul DNA  sehingga dapat ditransfer dengan baik untuk dianalisa. Beberapa protokol melibatkan dialisa centricon 100 (Millipore, Billerica, MA) dan konsentrasi di tempat timbulnya ethanol dan untuk memindahkan heme inhibitors (Comey et al 1994). Sementara metoda ekstraksi bekerja dengan baik untuk recovery bobot DNA dengan molekul tinggi, ini adalah waktu menggunakan bahan kimia yang penuh resiko dan memerlukan contoh untuk ditransfer antara banyak tabung (faktanya ini menaikkan resiko kesalahan dan kontaminasi)

2.6.2. Proses Penarikan Chelex

          Sebuah prosedur alternatif untuk penarikan DNA yang telah terkenal dikalangan ahli forensik adalah penggunaan dari suspensi resin kombinasi yang dapat ditambahkan langsung pada sampel (misalnya, darah, bercak darah, atau semen). Diperkenalkan kepada komunitas forensik DNA pada tahun 1991, chelexR  100 (Lab Bio-Rad, Hercules, CA) adalah pertukaran ion resin yang ditambahkan sebagai suspensi pada beberapa sampel (Walsh et.al.1991). chelex terdiri dari styrene divinylbenzene copolimers mengandung sepasang ion iminodiacetate yang bereaksi sebagai grup-grup kombinasi dalam ikatan ion metal polivalen seperti magnesium. Serupa dengan pengisian besi untuk menjadi sebuah magnet, beberapa ion magnesium tertarik dan terlempar keatas. Dengan memindahkan magnesium dari reaksi tersebut, DNA menghancurkan enzim-enzim dikenal sebagai nukleus yang tidak diaktifkan dan molekul-molekul DNA yang terlindungi.

          Pada sebagian besar protokol, sampel biologis seperti bercak darah ditambahkan sampai dengan 5% suspensi chelex dan dididihkan selama beberapa menit untuk memecah sel-sel dan melepaskan DNA. Sebuah permulaan, langkah pencucian sebelumnya sangat membantu untuk menghilangkan kontaminasi dan hambatan yang mungkin timbul seperti heme dan beberapa protein (Willard et.al. 1998). Pemanasan sampai temperatur 1000C memecahkan DNA protein sel sama seperti mengacaukan membran sel dan menghancurkan protein sel setelah pemusingan didalam mesin sentrifuse untuk mendorong resin chelex dan sisa-sisa selular kedasar tabung reaksi, cairan bagian atas setelah proses pengendapan dihilangkan dan dapat ditambahkan langsung ke reaksi pengerasan PCR.

2.7. Analisis sequen DNA dengan Blast

        Analisa DNA sequencing merupakan salah satu tools yang sangat penting dalam mengungkap rahasia genetik di balik kehidupan. Banyak sekali penelitian life science yang melibatkan analisa ini. Pencapaian terbesar teknologi DNA sequencing saat ini adalah terungkapnya urutan basa nukleotida yang menyusun genom manusia. Para peneliti yang menggunakantools ini seringkali menghadapi masalah dalam melakukan analisa, output yang dihasilkan seringkali tidak memuaskan. DNA sequencing menggunakan elektrophoresis kapiler merupakan teknologi kunci pada laboratorium-laboratorium life science. Berikut ini adalah beberapa hal yang penting untuk diketahui yang menjadi faktor penentu keberhasilan analisa DNA Sequencing.

Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.2.7.1. Sequencing Chemistries

                Cycle sequencing merupakan metode sederhana yang mana terdiri atas proses denaturasi, annealing dan ekstensi yang berulang-ulang dalam sebuah mesin thermal cycler, menghasilkan amplifikasi linear produk-produk ekstensi. Produk ini kemudian diinjeksikan ke dalam sebuah kapiler. Untuk Applied Biosystems, ada 2 kategori pendekatan sequencing chemistry: Dye Primer Chemistry dan Dye Terminator chemistry.

2.7.2. Sequencing menggunakan Dye Primers         Ketika menggunakan sequencing chemistry berbasis dye primer, dilakukan empat reaksi terpisah. Setiap reaksi dilabel pada ujung 5′-nya dengan menggunakan dyefluorescent yang berbeda. Masing-masing keempat reaksi ini akan mengandung apakah primer yang dilabel warna biru, hijau, kuning atau merah. Warna setiap reaksi berkorespondensi dengan A, C, G atau T. Dideoksiribonukleotida (ddNTP) terdapat dalam setiap campuran reaksi, dan menterminasi sintesis DNA secara acak, menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan panjang yang bervariasi. Karena digunakan primer yang dilabel fluorescent untuk ekstensi, seluruh fragmen yang diterminasi terlabel fluorescent. Setelah beberapa siklus yang cukup untuk terbentuknya produk ekstensi yang optimal, keempat reaksi tersebut digabungkan dan dielektroforesis menggunakan satu kapiler pada mesin Genetic Analyzer (gambar 2).

2.7.3. Sequencing menggunakan Dye Terminators

                DNA sequencing fluorescent dapat juga dilakukan menggunakan suatu bahan kimia dimana pewarna (dye) terikat pada ddNTP, sehingga membutuhkan hanya satu tabung reaksi per sample, bukan empat. Karena hanya membutuhkan satu tabung reaksi untuk reaksi dye terminator, bahan kimia ini lebih simple untuk digunakan dibanding dye primer chemistry. Template DNA, primer tak dilabel, buffer, empat jenis dNTP, empat jenis ddNTP yang terlabel fluorescent, dan DNA polymerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Fragmen-fragmen yang berfluorescent terbentuk karena inkorporasi ddNTP yang terlabel pewarna. Masing-masing ddNTP yang berbeda (ddATP, ddCTP, ddGTP, atau ddTTP) akan membawa sebuah warna dye yang berbeda. Dengan demikian semua fragmen yang diterminasi (yang berujung sebuah ddNTP), mengandung sebuah dye pada ujung 3′-nya (gambar 3)

3.3. Metodelogi

3.3.1. Visualisasi Ekstraksi DNA

3.3.1.1. Isolasi DNA Prokariot

1.      Dalam kondidi aseptis, isi tabung apendorf 1,5 ml dengan aquadest

2.      Kemudian ambil 1 ose kultur bakteri dan inokulasikan kedalam tabung apendorf tersebut

3.      Suspense bakteri tersebut kemudian dimasukkan kedalam freezer

4.      Diamkan hingga mengkristal

5.      Sementara itu panaskan air hingga suhu air mencapai 900C

6.      Sementara itu suspense mengkristal, rendam tabung apendorf di air selama 10 menit

7.      Ulangi langkah diatas sebanyak tiga kali

3.3.1.2. Isolasi DNA Euakriot

1. Ambil 1 buah strawberry, kemudian dibelah / dibagi menjadi 2 bagian.

2. Letakkan sebagian strawberry kedalam plastic ziplock dan remas-remas dengan jari tangan hingga menjadi cairan juice.

3. Tambahkan 10 ml buffer lisis kedalam plastic dan tutup kembali.

4. Lanjutkan meremas plastic kurang lebih 2-3 menit hingga bercampur/ homogeny dengan larutan juice

5. Kemudian larutan disaring/filter dan biarkan selama 10 menit

6. Buang saringan dan ekstrak yang ada

7. Teteskan sebanyak 2-4 tetes enzim ke dalam tabung yang telah berisi strawberi dan larutan.

8. Tuangkan sebanyak 30 ml 95 % alcohol dingin ke dalam tabung sentrifuge 50 ml

            Lalu tuangkan larutan yang telah disaring kedalam tabung, tutup tabungnya  

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil

4.1.1. Visualisasi Ekstraksi DNA

       Pada visualisasi ekstraksi dari DNA ini didapatkan beberapa hasil dari praktikum isolasi genom DNA  diantaranya yaitu:

a.       Isolasi DNA Prokariot

Pada isolasi DNA prokariot didapatkan  dari sampel DNA, dengan suspense mengkristal setelah dimasukkan kedalam freezer

b.      Isolasi DNA Eukariot

Pada isolasi DNA eukariot didapatkan hasil, DNA naik keatas setelah diberi alcohol dengan warna dari DNA itu sendiri berwarna bening dan berupa benang – benang putih.

4.2. Pembahasan

4.2.1. Visualisasi Ekstraksi DNA

        Pada ekstraksi suatu DNA, terdapat dua teknik dari isolasi DNA yaitu isolasi DNA prokariot dan isolasi DNA eukariot. materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon. Karena ukuran relatif kecil genom prokariotik, banyak urutan genom lengkap untuk berbagai bakteri dan archaea telah dipublikasikan selama beberapa tahun terakhir. Akibatnya, kita mulai mengerti banyak tentang anatomi genom prokariotik, dan dalam banyak hal kita tahu lebih banyak tentang organisme daripada kita tentang eukariota. Dari hasil elektroforesis menunjukkan pita DNA tampak jelas (berarti jumlah DNA yang terdeteksi banyak), sedangkan bagian bawah gel agarose masih terdapat berkas. Kemungkinan hal itu disebabkan adanya protein lain atau ada bagian-bagian sel yang terikut (debris sel) pada saat isolasi DNA. Jadi pada isolasi DNA ini kita mendapatkan DNA yang belum benar-benar murni. Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi sel, pelisisan dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi sel yang ingin digunakan, yaitu sel bakteri. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis sel. Pada isolasi dari genom DNA ini semua sel mempunyai membrane plasma, lapisan lipoprotein ganda yang membentuk penghalang memisahkan isi sel dari lingkungan ekstraseluler. pada DNA terdapat didalam suatu sel sehingga untuk emngisolasi dari suatu DNA, harus dilakukan pemecahan sel secara fisik yang diantaranya yaitu seperti mechanical destruption, liquid homozigation, sonofikasi, freeze dan manual grinding.

4.2.2. Analisis sequen DNA dengan Blast

          Analisa DNA sequencing merupakan salah satu tools yang sangat penting dalam mengungkap rahasia genetik di balik kehidupan. Banyak sekali penelitian life science yang melibatkan analisa ini. DNA sequencingmenggunakan elektrophoresis kapiler merupakan teknologi kunci pada laboratorium-laboratorium life science.Analisis sekuens perlu dilakukan untuk mengetahui beberapa karakteristik pentingnya seperti peta restriksi, rangka baca, kodon awal, dan kodon akhir, atau kemungkinan tempat promoternya. Di samping itu, perlu juga dipelajari hubungan kekerabatan suatu sekuens baru dengan beberapa sekuens lainnya yang telah terlebih dahulu diketahui. Pada kali ini untuk analisis sequen DNA dengan menggunakan BLAST. Dengan melakukan analisis sekuensing dari DNA, maka dapat diketahui dari jenis – jenis bakteri dan sumber atau asal dari suatu bakteri tersebut. Untuk pemilihan bakteri pada analisis sekuensing DNA ini, pemilihanya dilakukan secara random atau acak tidak berdasarkan ketentuan secara urut. Sedangkan untuk penetuan dari sequencing DNA ini diproses dengan progam bioinformatika, dengan progam tersebut maka akan diketahui dari pohon filogenik dari suatu bakteri yang dimasukan kedalam pemrosesan data tersebut. Data dari suatu DNA ini didapat dari GenBank.

4.2.3. Identifikasi Sekuen Menggunakan Program BioInformatika

          Pada proses identifikasi DNA dengan menggunakan progam bioinformatika ini untuk menentukan atau mengetahui dari tingkat hubungan dari kekerabatan dari suatu mikroorganisme. Dengan pengolahan data dari hasil sekuensing DNA tersebut maka dapat dihasilkan berupa pohon filogenetik, yang tujuanya juntuk membandingkan dari hasi sekuensing yang didapat pada sekuensing DNA. Dari analisis filogenetik terlihat beberapa bakteri yang mempunyai kekerabatan terdekat seperti pada jenis bakteri Brugia malayi, Plectus murrayi, Theobroma cacao KZ0ACAC, Tamarix hispida clone, Theobroma cacao, Tamarix hispida dan masih banyak yang mempunyai tingkat kekerabatan terdekat antar suatu bakteri. Dari hasil identifikasi bakteri yang didapat dengan menggunakan progam bioinformatika, sumber dari bakteri tersebut rata – rata berasal dari tanah, plastic. Ini merupakan dari karakteristik dari suatu organism yang didapat  dengan Eukaryota, Metazoa, Arthropoda, Hexapoda, Insecta, Pterygota, Neoptera, Endopterygota, Diptera, Nematocera, Culicoidea dan Culicidae.

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

       Dari praktikum dasar – dasar bioteknologi kali ini dapat diambil beberapa kesimpulan yang diantaranya yaitu:

1)      Isolasi DNA kromosom ataupun DNA plasmid dapat dilakukan dengan menggunakan prosedur isolasi sel; lisis dinding dan membran sel; ekstraksi dalam larutan; purifikasi; dan presipitasi. Diperoleh DNA kromosom dan plasmid dengan kemurniannya cukup tinggi dilihat dari hasil elektroforesis yang baik. Ketelitian dan kecermatan dalam pelaksanaan penelitian, sangat menentukan hasil kemurnian DNA kromosom dan plasmid.

2)      Analisa DNA sequencing merupakan salah satu tools yang sangat penting dalam mengungkap rahasia genetik di balik kehidupan. Banyak sekali penelitian life science yang melibatkan analisa ini. Para peneliti yang menggunakan tools ini seringkali menghadapi masalah dalam melakukan analisa, output yang dihasilkan seringkali tidak memuaskan.

3)      Identifikasi DNA dilakukan untuk mengetahui tingkat hubungan kekerabatan dari suatu bakteri dengan bakteri yang lain atau juga bisa disebut dengan istilah dengan pohon filogenik

5.2. Saran

1)      Mohon dijelaskan untuk lebih detail lagi tentang teknik – teknik isolasi DNA

2)      Pada praktikum berlangsung dengan sangat menyenangkan, karna asistenya sangat ramah – ramah dan menjelaskan dengan sabar.

3)      Kurangnya waktu untuk praktikum kali ini, karena banyak alat – alat dan teknik – teknik dari isolasi DNA yang belum diketahui oleh para praktikan.

Daftar Pustaka

Artama, W.T. 1991. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi. UGM.Yogyakarta.                       

Ausabel. F.M, et al. 1992. Short Protocols in Moleculer Biology, Third ed. John Wiley & Sons.

                        Inc. USA.

Brown, A.T. 1991. Pengantar Kloning Gen (Alih bahasa: S.A. Muhammad dan Praseno).Yayasan Esensia Medika. Yogyakarta.

Kimbal, John W. 1989. Biologi. Edisi kelima cetakan kedua. Penerbit Erlangga. Jakarta.

Lehninger, A.L. 1982. Dasar - dasar Biokimia. jilid 1. Penerbit Erlangga. Jakarta.

Lodish, Harvey, et al. 2001. Molecular Cell Biology, Fourth Edition. W.H. Freeman and Company. New York.

Murray. R.K, at al. 1995, Biokimia Harper, edisi ke-22. Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta.

Mubarika, Sofia. 1990. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi UGM. Yogyakarta.

Sambrook, L., et al. Molecular Clonning : A laboratory Manual, second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.

Schmid, R.D. 2003. Pocket Guide to Biotechnology and Genetic Engineering. Wiley-                    VCH. Germany.

Watson, James D. Tooze, John. Kurtz, David T. 1988. DNA Rekombinan. Penerbit Erlangga. Jakarta.