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8/9/2019 J. Bacteriol.-1991-Michiels-4994-5009.pdf
1/16
V o l .
1 7 3 ,
N o .
1 6
A n a l y s i s o f v i r C ,
an
O p e r o n I n v o l v e d
i n
t h e S e c r e t i o n
o f
Yop
P r o t e i n s
b y Y e r s i n i a
e n t e r o c o l i t i c a
THOMAS
MICHIELS,t JEAN-CLAUDE
VANOOTEGHEM,
CATHERINE
LAMBERT DE
ROUVROIT,
BERNARD
CHINA, ANNE
GUSTIN,
PASCAL BOUDRY,
AND
GUY
R .
CORNELIS*
M i c r o b i a l P a t h o g e n e s i s U n i t ,
I n t e r n a t i o n a l
I n s t i t u t e
o f
C e l l u l a r a n d M o l e c u l a r
P a t h o l o g y ,
and
F a c u l t e d e M e d e c i n e ,
U n i v e r s i t e C a t h o l i q u e d e
L o u v a i n ,
UC L
5 4 - 9 0 , B J 2 0 0
B r u s s e l s ,
B e l g i u m
R e c e i v e d 1 A p r i l
1 9 9 1 / A c c e p t e d
5
J u n e
1 9 9 1
Upon
i n c u b a t i o n
a t
3 7 ° C
i n
t h e a b s e n c e o f
C a 2
i o n s , p a t h o g e n i c
y e r s i n i a e
r e l e a s e
l a r g e
a m o u n t s o f
pYV
p l a s m i d - e n c o d e d p r o t e i n s
c a l l e d
Y o p s t h a t are i n v o l v e d i n
p a t h o g e n e s i s .
Y e r s i n i a e n t e r o c o l i t i c a a l s o
expresses
an o u t e r
membrane
p r o t e i n
t h a t
i s
c o n s i d e r e d
an a d h e s i n a n d c a l l e d YadA
( p r e v i o u s l y
c a l l e d
P 1 or
Y o p A ) . T h e
p r o d u c t i o n o f
Y o p s
i s
c o o r d i n a t e l y r e g u l a t e d b y a 2 0 - k b
r e g i o n o f
t h e
p l a s m i d r e f e r r e d
t o as t h e
C a 2 +
d e p e n d e n c e
r e g i o n
a n d
c o n t a i n i n g
a t
l e a s t
f o u r
l o c i
c a l l e d
v i r A ,
v i r B , v i r C ,
a n d
v i r F . T h e v i r F
gene
e n c o d e s
a
k e y
t r a n s c r i p t i o n a l
a c t i v a t o r
o f yo p
genes.
We
h a v e s h o w n h e r e t h a t
v i r F i s
a l s o
r e q u i r e d
f o r
t r a n s c r i p t i o n
o f
y a d A
a n d
t h a t
v i r B i s
necessary f o r
f u l l t r a n s c r i p t i o n o f
t h e
yo p
a n d
y a d 4
genes.
I n
c o n t r a s t ,
m u t a t i o n s
i n
genes
v i r A
a n d
v i r C h a d
o n l y
a w e a k
i n f l u e n c e on t h e
t r a n s c r i p t i o n o f
yop
a n d
y a d 4 genes.
T h e s e m u t a t i o n s d i d n o t
a f f e c t
t h e
p r o d u c t i o n o f
YadA
b u t
t h e y c o m p l e t e l y
i n h i b i t e d t h e
t r a n s l o c a t i o n o f
Y o p s
f r o m
t h e
i n t r a c e l l u l a r
c o m p a r t m e n t
t o t h e e x t r a c e l l u l a r
m i l i e u . We i n f e r r e d f r o m
t h e s e d a t a
t h a t v i r A a n d
v i r C ar e i n v o l v e d i n
t h e
s p e c i f i c
t r a n s p o r t o f Y o p s .
We
a n a l y z e d
t h e
8 . 5 - k b
v i r C r e g i o n
a n d s h o w e d
t h a t
i t
i s
m o s t p r o b a b l y a
s i n g l e
operon c o n t a i n i n g
1 3
open r e a d i n g
f r a m e s c a l l e d
y s c A t o
y s c M
( f o r
Yo p
s e c r e t i o n ) .
P r o t e i n Y s c C
h a s
a
p u t a t i v e
s i g n a l sequence
a n d
s h a r e s s i g n i f i c a n t
h o m o l o g y w i t h
o u t e r
membrane
p r o t e i n s
i n v o l v e d
i n
t h e
s e c r e t i o n
o f
p u f l u l a n a s e
b y
K l e b s i e l l a
p n e u m o n i a e
( P u I D )
or i n t h e
a s s e m b l y o f i f i a m e n t o u s
b a c t e r i o p h a g e s
( g e n e
I V
p r o d u c t ) . A t
l e a s t
t h e
p u t a t i v e p ro d u c t s o f
y s c D ,
yscJ, a n d
y s c L were s h o w n t o b e
r e q u i r e d f o r
t h e
e x p o r t
o f
Y o p s .
Y s c J
t u r n e d o u t t o
b e Y l p B ,
a
l i p o p r o t e i n t h a t we
h a d
d e t e c t e d
p r e v i o u s l y .
T h e
y s c M gene
s h a r e s
h o m o l o g y w i t h
y o p H ,
t h e
a d j a c e n t gene
o n t h e
pYV
p l a s m i d .
I t s
p r o d u c t
d o e s
n o t
appear
t o
b e
necessary f o r
t h e p r o d u c t i o n o f
Y o p s .
T r a n s c r i p t i o n
o f t h e v i r C
operon wa s s u b j e c t e d
t o t h e
same
r e g u l a t i o n
as
t h e
y o p
g e n e s .
Human p a t h o g e n i c
y e r s i n i a e ( Y e r s i n i a
e n t e r o c o l i t i c a ,
Y .
p s e u d o t u b e r c u l o s i s ,
a n d
Y .
p e s t i s )
h a r b o r
c l o s e l y
r e l a t e d
7 0 - k b
p l a s m i d s
t h a t
ar e e s s e n t i a l
f o r
v i r u l e n c e
a n d
c a l l e d
pYV
( F i g . 1 ) ( f o r r e v i e w s , s ee
r e f e r e n c e s 1 2 , 1 7 ,
5 0 , a n d 5 4 ) .
I n response
t o
c u l t i v a t i o n
a t 3 7 ° C i n t h e
a b s e n c e
o f
C a 2 +
i o n s ,
s t r a i n s
h a r b o r i n g
t h e
p l a s m i d
cease
g r o w i n g a n d
syn-
t h e s i z e
a
s e r i e s
o f
p l a s m i d - e n c o d e d
p r o t e i n s i n c l u d i n g
2
o u t e r
membrane
p r o t e i n s ,
YadA a n d
Y l p A ,
a n d
1 1
s e c r e t e d
p r o t e i n s
c a l l e d
Y o p s . YadA
( 4 9 ) , an a d h e s i n
f o r m i n g
a
f i b r i l l a r m a t r i x
on t h e c e l l s u r f a c e ( 2 6 ) ,
p r o t e c t s
Y .
e n t e r o -
c o l i t i c a
a g a i n s t t h e
b a c t e r i c i d a l
a c t i o n o f
human
serum
( 1 )
a n d
promotes
t h e c o l o n i z a t io n
o f t h e
mouse
i n t e s t i n e ( 2 6 ) .
YIpA
i s a
l i p o p r o t e i n r e l a t e d
t o
T r a T
( 1 0 ) . More
s p e c t a c u l a r
i s
t h e
e x t r a c e l l u l a r s e c r e t i o n
o f t h e Y o p s
( 5 ,
2 4 ,
2 5 , 4 2 )
i n
s u c h
l a r g e
amounts
t h a t
t h e y
f o r m v i s i b l e
a g g r e g a t e s i n t h e
c u l t u r e
( 3 5 ) .
T h e s e
p r o t e i n s
are
e s s e n t i a l f o r
p a t h o g e n i c i t y
( 6 ,
2 1 a ,
2 8 ,
3 7 , 5 1 ) .
S e q u e n c e a n a l y s i s
o f
yop genes ( 6 ,
2 1 a ,
3 3 , 3 5 )
s h o w s t h a t
Y o p s
are
h i g h l y
c o n s e r v e d i n t h e
genus
Y e r s i n i a b u t t h a t
no
h o m o l o g y e x i s t s b e t w e e n
d i f f e r e n t Yops
i n a
s i n g l e s p e c i e s . T h e
f u n c t i o n s o f
i n d i v i d u a l Yops are
now
e m e r g i n g .
YopE f r o m Y .
p s e u d o t u b e r c u l o s i s i s c y t o t o x i c t o
c u l t u r e d
HeLa
c e l l s ( 4 5 ) ,
a n d
YopH
f r o m
Y .
p s e u d o t u b e r -
c u l o s i s
c o n t r i b u t e s t o t h e
a b i l i t y
o f
t h e b a c t e r i a
t o
r e s i s t
p h a g o c y t o s i s
b y
p e r i t o n e a l m a c r o p h a g e s
( 4 4 ) .
R e c e n t l y ,
YopH
f r o m Y .
e n t e r o c o l i t i c a was
f o u n d
t o h a v e
t y r o s i n e
p h o s p h a t a s e
a c t i v i t y (EC 3 . 1 . 3 . 4 8 ) , w h i c h
s u g g e s t s t h a t i t
i n t e r a c t s w i t h
h o s t c e l l
r e g u l a t i o n ( 2 3 ) . YopM f r o m Y .
p e s t i s
C o r r e s p o n d i n g
a u t h o r .
E l e c t r o n i c
m a i l a d d r e s s :
CORNELIS a t
BUCLLN11.BITNET.
t
P r e s e n t
a d d r e s s : U n i t e d e s
V i r u s
L e n t s ,
D e p a r t e m e n t
d e s
R e t r o v i r u s ,
I n s t i t u t
P a s t e u r , 7 5 7 2 4 P a r i s ,
C e d e x 1 5 ,
F r a n c e .
s h a r e s s i m i l a r i t i e s
w i t h
GPIba
a n d i n h i b i t s
p l a t e l e t aggrega-
t i o n
( 2 8 ,
2 9 ) .
C o o r d i n a t e
r e g u l a t i o n
o f
yop
gene e x p r e s s i o n
i s
e n s u r e d
b y
a
2 0 - k b
r e g i o n
o f t h e
pYV p l a s m i d ,
c a l l e d t h e
C a 2 +
d e p e n d e n c e
r e g i o n . I n s e r t i o n m u t a g e n e s i s
i n
t h i s
r e g i o n
d e f i n e d
a
s e r i e s
o f
l o c i
c a l l e d
v i r A , v i r B ,
v i r C ,
a n d
v i r F
i n Y .
e n t e r o c o l i t i c a
( 1 4 - 1 6 )
a n d
I c r B
a n d
l c r C
( 2 2 ) ,
l c r D
a n d
I c r E
( 5 7 ,
6 4 ) ,
a n d
l c r F
( 6 3 )
i n Y .
p e s t i s .
M u t a t i o n s
i n
I c r E ,
w h i c h
e n c o d e s
YopN,
a l l o w t h e c e l l s t o s e c r e t e t h e
o t h e r
Y o p s
a t
3 7 ° C ,
even i n
t h e presence o f
C a 2 +
i o n s ,
s u g g e s t i n g
a
r o l e
o f
t h e
e x p o r t e d YopN
p r o t e i n
i n
C a 2 + r e g u l a t i o n ( 2 1 ,
4 5 , 5 7 ,
6 4 ) .
M u t a t i o n s
i n
any
o f
t h e o t h e r
v i r
or
Ic r
genes
c o m p l e t e l y
a bo l i s h t h e
e x t r a c e l l u l a r Yop p r o d u c t i o n a n d e i t h e r make
t h e
s t r a i n s
i n d e p e n d e n t
on
C a 2 +
i o n s f o r
g r o w t h
a t
3 7 ° C ( C I
p h e n o t y p e )
or u n a b l e t o
g r o w
a t t h a t
t e m p e r a t u r e ,
even
i n
t h e presence
o f
C a 2 +
i o n s
( G t s p h e n o t y p e ) . v i r F m u t a t i o n s
h a v e
t h e
s t r o n g e s t i n h i b i t o r y e f f e c t on yop
gene t r a n s c r i p -
t i o n ,
w h i c h l e d t o t h e
d i s c o v e r y
t h a t
v i r F
( c o r r e s p o n d i n g
t o
I c r F
i n Y .
p e s t i s )
e n c o d e s
a
t r a n s c r i p t i o n a l
a c t i v a t o r
r e l a t e d
t o t h e
w e l l - c h a r a c t e r i z e d
AraC
r e g u l a t o r
( 1 4 ) . T r a n s c r i p t i o n
o f
v i r F
i s
t h e r m o r e g u l a t e d ,
w h i c h
a c c o u n t s
f o r
t h e
t h e r m o -
r e g u l a t i o n
o f t h e
yop r e g u l o n
( 1 4 ) .
T h e
t h e r m o r e g u l a t i o n o f
v i r F i s
i n
t u r n
m o d u l a t e d
b y
a
c h r o m o s o m e - e n c o d e d h i s t o n e -
l i k e
p r o t e i n
c a l l e d YmoA
( 1 3 ) .
S e c re t i o n o f
Y o p s
b y
Y e r s i n i a
s p e c i e s
d o e s n o t
i n v o l v e
t h e
c l e a v a g e
o f
a c l a s s i c a l
s i g n a l sequence
( 2 1 a ,
3 5 ) .
H o w e v e r ,
t h e
4 8 N - t er m i n a l
r e s i d u e s
o f YopH c o n t a i n
t h e i n f o r m a t i o n
r e q u i r e d
f o r
e x p o r t
( 3 4 ) . C o u p l i n g
t h e N
t e r m i n u s o f YopH
t o t h e
a - p e p t i d e
o f
, B - g a l a c t o s i d a s e , t o t h e a l k a l i n e p h o s -
p h a t a s e o f E s c h e r i c h i a
c o l i ( 3 4 ) , o r t o
t h e
B
s u b u n i t o f
c h o l e r a
t o x i n
( 5 2 )
r e s u l t s
i n e f f i c i e n t
e x t r a c e l l u l a r s e c r e t i o n
o f t h e
h y b r i d p r o t e i n .
The
r e c o g n i t i o n
o f
YopE
a n d
YopQ b y
4 9 9 4
J O U R N A L OF
B A C T E R I O L O G Y ,
A u g .
1 9 9 1 ,
p .
4 9 9 4 - 5 0 0 9
0 0 2 1 - 9 1 9 3 / 9 1 / 1 6 4 9 9 4 - 1 6 $ 0 2 . 0 0 / 0
C o p y r i g h t
©
1 9 9 1 , A m e r i c a n
S o c i e t y f o r
M i c r o b i o l o g y
8/9/2019 J. Bacteriol.-1991-Michiels-4994-5009.pdf
2/16
ir
PERON
OF
Y .
ENTEROCOLITICA 4 9 9 5
o r i R
9 1 s
.
I
I
t -
I z
t o
V i r C
operon
0
g F O r W t h
a t 3 7 °
C
F I G . 1 . Map o f t h e
pYV
p l a s m i d f r o m Y . e n t e r o c o l i t i c a W 2 2 7 0 3 ( s e r o t y p e 0 : 9 ) i n t e g r a t i n g t h e new d a t a w i t h t h e d a t a o f B a l l i g a n d e t
a l .
( 1 ) ,
B i o t
a n d C o m e l i s ( 2 ) , C o r n e l i s e t a l . ( 1 4 - 1 6 ) ,
M u l d e r
e t a l . ( 3 7 ) ,
C h i n a e t
a l .
( 1 0 ) , a n d V a n o o t e g h e m a n d C o r n e l i s
( 5 6 )
t o g i v e a c o m p l e t e
p i c t u r e . T h e
r e s t r i c t i o n map
i s p r e s e n t e d f o r
e n d o n u c l e a s e s
BamHI
a n d
E c o R I . S h a d o w e d
a r e a s
a r e s e q u e n c e d . F l a g s
g iv e t h e l o c a l i z a t i o n
a n d
o r i e n t a t i o n o f m i n i - M u d I 1 7 3 4 a n d
T n 2 5 0 7 i n s e r t i o n s
a s f o l l o w s : < , s t r o n g t r a n s c r i p t i o n a t 3 7 ° C ;
~ ,
weak t r a n s c r i p t i o n a t 3 7 ° C ;
' , n o
t r a n s c r i p t i o n
a t
3 7 ° C . T h e
g e n e s
e n c o d i n g t h e Y o p s ( y o p g en e s)
a r e i n d i c a t e d a n d o r i e n t e d b y
a r r o w s . We a d o p t e d
t h e n o m e n c l a t u r e u n i f o r m
f o r
y o p
g e n e s
i n
Y . e n t e r o c o l i t i c a , Y .
p s e u d o t u b e r c u l o s i s ,
a n d
Y .
p e s t i s :
yopH
=
y o p 5 l ; yopE
=
y o p 2 5 ;
yopO
=
y o p 8 4 ; yopP
=
y o p 3 O ;
yopQ
=
y o p 2 O ;
yopM
=
y o p 4 8 ; yopD
=
y o p 3 7 ; y o p B
=
y o p 4 4 ;
l c r V
=
y o p 4 l
( e n c o d i n g t h e V
a n t i g e n ) .
yadA i s t h e g en e e n c o d i n g
t h e
o u t e r
m e m b r a n e a d h e s i n p r e v i o u s l y c a l l e d P 1 o r YopA.
y I p A
e n c o d e s
a l i p o p r o t e i n
r e l a t e d
t o
T r a T .
T h e C a 2 + d e p e n d e n c e
r e g i o n
c o n t a i n s
t h e v i r
g e n e s
a n d
o p e r o n s
i n v o l v e d i n t h e c o o r d i n a t e r e g u l a t i o n o f Yop p r o d u c t i o n a s w e l l a s i n t h e
l o w
c a l c i u m r e s p o n s e . T h e d e t a i l s
o f
t h e
v i r C
o p e r o n ( g e n e s y s c A
t o
y s c M ) a r e f r o m t h i s s t u d y . i n c D
i s
t h e p a r t i t i o n
a n d
s t a b i l i z a t i o n
l o c u s ;
r e p B , r e p A ,
a n d
o r i R i d e n t i f y t h e r e p l i c o n
o f
t h e
p l a s m i d .
t h e
e x p o r t a p p a r a t u s
a l s o
i n v o l v e s
t h e
N - t e r m i n a l
r e g i o n
( 3 4 ) .
T h e r e i s n o
s i m i l a r i t y b e t w e e n t h e
e x p o r t
d o m a i n s o f
t h e s e
p r o t e i n s
w i t h r e s p e c t
t o
a m i n o
a c i d s e q u e n c e ,
h y d r o -
p h o b i c i t y p r o f i l e , d i s t r i b u t i o n o f c h a r ge d
r e s i d u e s , o r
p r e d i c -
t i o n
o f
s e c o n d a r y s t r u c t u r e ,
s u g ge s t i ng a c o n f o r m a t i o n a l
r e c o g n i t i o n
( 3 4 ) .
I n
t h i s
s t u d y ,
we
a i m e d
a t
i d e n t i f y i n g t h e
g e n e s i n v o l v e d
i n
t h e
s p e c i f i c
e x p o r t
o f
Y o p s .
MATERIALS AND M ETHOD S
B a c t e r i a l
s t r a i n s , p l a s m i d s ,
a n d
g r o w t h
c o n d i t i o n s .
Y . e n -
t e r o c o l i t i c a
W22703
( n a l i d i x i c
a c i d
r e s i s t a n t )
i s a r e s t r i c t i o n
m u t a n t i s o l a t e d
e a r l i e r
f r o m
W227
( 1 1 ) .
T h e
pYV p l a s m i d
o f
t h a t s t r a i n
( p Y V e 2 2 7 )
i s
u n d i s t i n g u i s h a b l e
b y
r e s t r i c t i o n
a n a l y s i s f r o m
p Y V e 4 3 9 - 8 0 ,
t h e
pYV
p l a s m i d
f r o m
Y . e n t e r o -
c o l i t i c a
4 3 9 - 8 0 ,
a n o t h e r s e r o t y p e 0 : 9
s t r a i n
2 ) .
E .
c o l i
J M 1 0 1 ( 6 2 ) w a s
u s e d
f o r c l o n i n g e x p e r i m e n t s .
E .
c o l i
S 1 7 . 1 ( 4 8 )
a n d
S M 1 0 ( A p i r ) ( 3 6 )
w e r e u s e d
a s
m a t i n g
d o n o r s t o m o b i l i z e
pTM200
a n d
i t s
d e r i v a t i v e s
i n t o
Y .
e n t e r o c o l i t i c a
W 2 2 7 0 3 .
P l a s m i d s
a r e l i s t e d i n
T a b l e 1 .
G r o w t h c o n d i t i o n s
a n d
i n d u c t i o n
o f t h e
y o p r e g u l o n
were
a s
d e s c r i b e d
b y
M i c h i e l s e t a l .
( 3 5 ) .
M i n i - M u
d
l a c
m u t a g e n e s i s
was
p e r f o r m e d
a s
p r e v i o u s l y
d e s c r i b e d
( 1 5 ) .
A n a l y s i s o f
t h e
Y o p s , Y a d A ,
a n d
l i p o p r o t e i n s .
The
Y o p s
w e r e
p r e p a r e d a n d a n a l y z e d b y
s o d i u m
d o d e c y l
s u l f a t e -
p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( S D S - P A G E )
a n d
W e s t -
e r n b l o t s
( i m m u n o b l o t s )
a s
p r e v i o u s l y
d e s c r i b e d
( 1 7 ,
5 2 ) .
R a t
m o n o c l o n a l
a n t i b o d i e s
( M A b )
6G1
( a n t i - Y o p E ) ,
1 3 A 4
( a n t i -
Y o p D ) ,
a n d 6 H1
( a n t i - Y o p B
a n d
- Y o p N )
were
u s e d
f o r
t h e
d e t e c t i o n
o f
p r o t e i n s
4 ) .
F o r
i m m u n o f l u o r e s c e n c e
a n a l y s i s ,
t h e b a c t e r i a
were h e a t
i n d u c e d f o r 2
h i n
BHI-OX
( 3 7 ) . F i f t y
m i c r o l i t e r s o f
c u l t u r e
was
a p p l i e d
t o
e a c h w e l l o f
a
1 2 - w e l l
s l i d e
a n d
r e m o v e d ,
i n o r d e r
t o
l e a v e a t h i n f i l m
o f c u l t u r e .
V O L .
1 7 3 ,
1 9 9 1
8/9/2019 J. Bacteriol.-1991-Michiels-4994-5009.pdf
3/16
4 9 9 6 MICHIELS
ET A L .
TABLE 1 . B a c t e r i a l p l a s m i d s
P l a s m i d ( s ) G e n e t i c s t r u c t u r e
S o u r c e o r
r e f e r e n c e
pAGl pBC19R + E c o R I - X b a I f r a g m e n t o f
p Y V e 4 3 9 - 8 0 ( c o o r d i n a t e s , 3 7. 3 - 4 3. 1 k b ) T h i s
s t u d y
pAG8 pBC18R
+ E c o R I - X b a I f r a g m e n t o f
p Y V e 4 3 9 - 8 0 ( c o o r d i n a t e s ,
3 7 . 3 - 4 3 . 1
k b )
T h i s
s t u d y
pBC5 pBC19R
+ E c o R I
f r a g me n t 4 o f
p Y V e 4 3 9 - 8 0 ( c o o r d i n a t e s , 0 - 9 . 6 k b )
y l p A +
1 0
pBC18R
a n d
pBC19R pTZ18R
a n d pTZ19R
+
o ri T o f
RK 2 1 0
pCL4
pBC18R
+
E c o R I - B a m H I
f r a g m e n t
o f
p Y V e 4 3 9 - 8 0
( c o o r d i n a t e s ,
3 3. 7 -3 5 . 6 k b )
T h i s s t u d y
pGC216
pGB63 y s c H - 2 1 6 : : m i n i - M u
d l l a c
1 5 ; t h i s
s t u d y
p G C 2 1 7
pGB63 y s c C - 2 1 7 : : m i n i - M u d l l a c
1 5 ; t h i s
s t u d y
p G C 2 7 4
pGB63
v i r A -2 7 4: : m i n i - M u d l
l a c
1 5
p G C 3 9 3 pGB63 y s c D - 3 9 3 : : m i n i - M u d l l a c
1 5 ; t h i s
s t u d y
p G C 4 0 3 pGB63
y s c D - 4 0 3 : : m i n i - M u
d l
l a c 1 5 ;
t h i s
s t u d y
p G C 4 4 5
pGB63 y s c C - 4 4 5 :
: m i n i - M u d l l a c
1 5 ; t h i s
s t u d y
p G C 6 3 3
pGB63 v i r B - 6 3 3 : : m i n i - M u
d l l a c
1 5
p G C 6 7 8
pGB63 v i r B - 6 7 8 : : m i n i - M u
d l
l a c
1 5
p G C 8 3 0
pGB63 v i r B - 8 3 0 : : m i n i - M u d l l a c
1 5
p G C 1 1 5 2 - 9 p G C 1 1 5 2
v i r F - 9 : : T n 8 1 3
1 6
p G C S 3 3 4 pBM33
v i r F - 4 : : p G C S 9 0 4
2 7 a
p G C S 6 5 2
pTZ19R
+
c o o r d i n a t e s
3 2 . 6 - 3 5 . 6
k b o f p Y V e 4 3 9 - 8 0
1 4
p J C V 1 2 7 5
pGB63 y s c L - 1 2 7 5 : : m i n i - M u d l l a c
T h i s
s t u d y
p J C V 1 2 7 9
pGB63
y s c G - 1 2 7 9 : : m i n i - M u
d l
l a c
T h i s s t u d y
p J C V 1 2 8 2
p G B 6 3 y s c H - 1 2 8 2 : : m i n i - M u
d l l a c
T h i s s t u d y
p J C V 1 2 8 9
pGB63
y s c H - 1 2 8 9 : : m i n i - M u
d l
l a c
T h i s
s t u d y
pTM200 p A C Y C 1 8 4 - o r i T
+
E c o R I f r a g m e n t 3 o f
p Y V e 4 3 9 - 8 0 ( c o o r d i n a t e s ,
3 7 . 3 - 4 6 . 8
k b 1 4
pTM262 F i l l i n g i n
o f
B g I I I
s i t e o f
pTM200
T h i s
s t u d y
pTM268 D e l e t i o n
o f B s s H I I f r a g m e n t o f
pTM200
T h i s
s t u d y
pTM269
D e l e t i o n
o f M l u I f r a g m e n t o f
pTM200
T h i s
s t u d y
pTM270
pTZ18R
+
B a m H I - E c o R I f r a g m e n t o f p Y V e 4 3 9 - 8 0 ( c o o r d i n a t e s ,
3 5 . 6 - 3 7 . 3
k b )
T h i s
s t u d y
pTM271
pTZ18R
+
Sau3A 4 6 0
b p
f r o m BamHI
f r a g m e n t
9 o f
p Y V e 4 3 9 - 8 0
T h i s
s t u d y
pTM277
D e l e t i o n o f
B s t E I I - B g l I I
o f pTM200
T h i s
s t u d y
pTM284
pTZ19R
+
B a m H I - E c o R I
f r a g m e n t
o f
p Y V e 4 3 9 - 8 0 ( c o o r d i n a t e s ,
3 5 . 6 - 3 7 . 3
k b )
T h i s
s t u d y
pTZ18R
a n d
pTZ19R
o r i
p B R 3 2 2
+
o r i f l l a c Z '
b l a +
P h a r m a c i a
p Y V e 2 2 7
pYV
p l a s m i d
f r o m W22703
( s e r o t y p e
0 : 9 )
2
p Y V e 4 3 9 - 8 0
pYV p l a s m i d f r o m 4 3 9 - 8 0 ( s e r o t y p e 0 : 9 )
2
T h e
s l i d e was
e i t h e r
d r i e d
a t
room
t e m p e r a t u r e
a n d
f i x e d f o r
a f e w
s e c o n d s
a t
5 0 ° C
o r i m m e r s e d f o r 1 0
m i n
i n
m e t h a n o l .
I t
was t h e n
i m m e r s e d f o r
3 0 m i n
i n
p h o s p h a t e - b u f f e r e d
s a l i n e
( 5 0
mM
p h o s p h a t e ,
1 5 0
mM
N a C l , pH 7 . 4 )
( P B S )
c o n t a i n i n g
t h e
a n t i - Y o p E
6 G 1
MAb
d i l u t e d 1 / 5 0
a n d
s u b s e q u e n t l y
w a s h e d
t w i c e
w i t h
PBS f o r
5
m i n
e a c h t i m e . T h e s l i d e s w e r e
t h e n
i n c u b a t e d
i n f l u o r e s c e i n
i s o t h i o c y a n a t e - c o n j u g a t e d
r a b -
b i t a n t i - r a t
i m m u n o g l o b u l i n s
(DAKO
I m m u n o g l o b u l i n s ,
G l o s t r u p , D e n m a r k )
d i l u t e d 1 / 5 0 . T h e s l i d e s were
t h e n
w a s h e d
i n
PBS
f o r
5
m i n
a n d
m o u n t e d
i n
P B S - g l y c e r o l ( 5 0 %
[ v o l / v o l ] ) .
YadA was
d e t e c t e d
b y
W e s t e r n
b l o t
a n a l y s i s
o f w h o l e - c e l l
e x t r a c t s , u s i n g
a r a b b i t
p o l y c l o n a l
a n t i s e r u m
( 5 3 ) .
T h e
l i p o p r o t e i n s
w e r e
v i s u a l i z e d
b y SDS-PAGE
a f t e r
l a b e l l i n g
w i t h
[ 3 H ] p a l m i t i c
a c i d a s
d e s c r i b e d
b y C h i n a
e t
a l .
( 1 0 ) .
DNA
s e q u e n c i n g
a n d
s e q u e n c e
a n a l y s i s .
T h e n u c l e o t i d e
s e q u e n c e
o f
v i r C
was d e t e r m i n e d o n
p A G 1 ,
p A G 8 ,
p G C S 6 5 2 ,
p C L 4 , p T M 2 7 0 ,
a n d
p T M 2 8 4 .
S u b c l o n e s
o f t h e s e
p l a s m i d s
were
c o n s t r u c t e d b y
c l o n i n g
o r
d e l e t i n g s p e c i f i c
r e s t r i c t i o n
f r a g m e n t s . P r o g r e s s i v e
d e l e t i o n
m u t a g e n e s i s
was
p e r f o r m e d
on some
o f t h e
c l o n e s ,
e i t h e r
w i t h T 4
DNA
p o l y m e r a s e
( 1 8 ) b y u s i n g
t h e
C y c l o n e s y s t e m
o f
I n t e r n a -
t i o n a l
B i o t e c h n o l o g i e s ,
I n c .
( N e w H a v e n , C o n n . ) ,
o r w i t h
e x o n u c l e a s e
I I I
( E r a s e - a - B a s e ;
P r o m e g a , M a d i s o n , W i s . ) .
S e q u e n c e s
w e r e d e t e r m i n e d
b y
t h e
d i d e o x y - c h a i n
t e r m i n a -
t i o n m e t h o d
o f S a n g e r e t a l .
( 4 6 )
a n d
a n a l y z e d
a s
p r e v i o u s l y
d e s c r i b e d
( 3 5 ) .
T h e
c o n t i n u i t y o f
t h e s e q u e n c e a c r o s s
t h e
j u n c t i o n s
o f
t h e
p Y V e 4 3 9 - 8 0
E c o R I a n d BamHI
f r a g m e n t s
w a s
c h e c k e d
b y d i r e c t l y
s e q u e n c i n g
t h e d o u b l e - s t r a n d e d
pYV
p l a s m i d
w i t h s y n t h e t i c o l i g o n u c l e o t i d e s .
T h e
s e q u e n c e
o f
t h e m i n i - M u d l a c i n s e r t i o n s i t e s was d e t e r m i n e d o n
t h e
pYV m u t a n t s
w i t h t h e s y n t h e t i c
o l i g o n u c l e o t i d e
MIPA24
( 5 '
CAGATCCCGAATAATCC 3 ' )
d e r i v e d
f r o m
t h e
s e q u e n c e
o f t h e
r i g h t
e n d
o f b a c t er i o ph a g e
Mu ( 3 8 ) .
S i g n a l s e q u e n c e s
w e r e
d e t e c t e d b y u s i n g t h e S i g s e q
p r o -
g r a m ( 4 1 ) , w h i c h
i s
b a s e d o n
t h e
r u l e s o f v o n
H e i j n e ( 5 8 ) .
H y d r o p h o b i c i t y ( 2 7 )
w a s
c a l c u l a t e d b y u s i n g t h e
FAST
p r o g r a m
w i t h a
w i n d o w
o f
1 0 .
RNA e x t r a c t i o n , N o r t h e r n
( R N A )
b l o t a n a l y s e s , a n d p r i m e r
e x t e n s i o n s . T h e s e
e x p e r i m e n t s
w e r e
p e r f o r m e d
a s p r e v i o u s l y
d e s c r i b e d
( 3 5 ) .
U n l e s s
s p e c i f i e d ,
RNA
w a s e x t r a c t e d
a f t e r 9 0
m i n
o f i n d u c t io n
a t 3 7 ° C .
RESULTS
I n f l u e n c e
o f
t h e v a r i o u s
v i r
l o c i
o n t r a n s c r i p t i o n
a n d
e x p o r t
o f
t h e
Y o p s .
T h e
g e n e s r e q u i r e d
f o r
e x p o r t
o f
t h e Y o p s
a r e
m o s t
l i k e l y
c o n t a i n e d
i n
t h e
C a 2 + d e p e n d e n c e r e g i o n
o f
pYV. B e c a u s e t h e r e g u l a t i o n o f y o p g e n e s
i s
m u l t i f a c t o r i a l
J .
B A C T E R I O L .
8/9/2019 J. Bacteriol.-1991-Michiels-4994-5009.pdf
4/16
ir
P ERON OF
Y .
ENTEROCOLITICA
4 9 9 7
a n d b e c a u s e t h e Yops a r e
n o t
e x p r e s s e d when
t h e pYV
p l a s m i d i s t r a n s f e r r e d t o
E . c o l i ( 1 6 ) ,
we
d e c i d e d t o i d e n t i f y
t h e
s e c r e t i o n g e n e s
b y m u t a t i o n a l a n a l y s i s i n Y . e n t e r o c o -
l i t i c a
r a t h e r t h a n
b y
c l o n i n g t e c h n i q u e s .
We f i r s t a n a l y z e d
Y . e n t e r o c o l i t i c a W 2 2 7 0 3
s t r a i n s
w i t h
v a r i o u s m u t a t i o n s
i n t h e v i r l o c u s
( v i r A , v i r B ,
v i r C , a n d
v i r F )
w i t h r e s p e c t
t o
t h e e x p r e s s i o n
o f t h e
Y o p s a n d t h e
a d h e s i n
Y a d A .
S i n c e
YadA i s a n
o u t e r
membrane
p r o t e i n
p o s s e s s i n g
a
t y p i c a l
s i g n a l
s e q u e n c e ,
t h i s
p r o t e i n
i s
e x p e c t e d
t o
b e
t a r g e t e d t o
t h e o u t e r membrane
b y a n e x p o r t
p a t h w a y
d i f f e r e n t
f r o m t h a t
u s e d b y
t h e Y o p s . T h u s , m u t a t i o n s i n
t h e
Y o p - s p e c i f i c
s e c r e t i o n a p p a r a t u s w e r e e x p e c t e d t o
p r e v e n t
t h e
e x t r a c e l l u l a r a p p e a r a n c e
o f t h e Y o p s b u t n o t
t h e p r o d u c -
t i o n o f
YadA
a n d
i t s
i n s e r t i o n i n t h e o u t e r
m e m b r a n e .
We
m o n i t o r e d
t h e t r a n s c r i p t i o n
o f y o p E ,
y o p H , a n d
y a d A
i n t h e v ar i o u s v i r m u t a n t s b y N o r t h e r n b l o t t i n g
( F i g .
2 ) .
T r a n s c r i p t i o n
o f
t h e t h r e e g e n e s w a s
s t r o n g
i n
t h e
w i l d t y pe
a n d
i n t h e v ir A
a n d v i r C m u t a n t s , much
w e a k e r i n t h e
v i r B
m u t a n t s ,
a n d n e a r l y
u n d e t e c t a b l e
i f
p r e s e n t a t a l l )
i n
t h e
v i r F
m u t a n t s . We a l s o a n a l y z e d t h e m u t a n t s
f o r
p r o d u c t i o n o f
Y o p s . As e x p e c t e d
f r o m o u r
p r e v i o u s w o r k ( 1 5 , 1 6 ) ,
n o n e
o f
t h e
v i r m u t a n t s s e c r e t e d
e x t r a c e l l u l a r Y o p s a s
e s t i m a t e d b y
SDS-PAGE ( T a b l e 2 ) .
T h e p r e s e n c e o f i n t r a c e l l u l a r
Y o p s
w a s a n a l y z e d b y
i m m u n o b l o t t i n g ,
u s i n g
r a t
MAb d i r e c t e d
a g a i n s t YopE, YopD,
a n d Y o p B . T h e
d et e c t i o n o f YopE
i n
t h e v a r i o u s v i r m u t a n t s
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t h e YopE
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e x t r a c t s f r o m v i r A
a n d v i r C
m u t a n t s , f a i n t e r i n
p r e p a r a t i o n s f r o m v i r B
m u t a n t s ,
a n d
n o t d et e c t a bl e i n t h e
v i r F
m u t a n t s
( F i g .
3 ) .
T h e
p r e s e n c e
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c o r r e l a t e d
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p r e s e n c e o f
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e x c e p t i n t h e v i r A
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s m a l l e r
a m o u n t s
t h a n
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p r o d u c t i o n
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YadA w a s
m o n i t o r e d
b y
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i m m u n o b l o t t i n g ,
u s i n g a p o l y c l o n a l
m o n o s p e c i f i c r a b b i t
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a m o u n t o f
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w e l l
w i t h t h e
t r a n s c r i p t i o n a l
l e v e l
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t h e g e n e .
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m u t a n t s
p r o d u c e d
w i l d - t y p e
l e v e l s
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w h i l e
v i r B
m u t a n t s p ro d u c e d
l o w
l e v e l s o f
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w a s
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d e t e c t e d i n
v i r F m u t a n t s
( T a b l e
2 ) . We
c o n c l u d e f r o m
t h e s e e x p e r i m e n t s
t h a t i ) v i r B
a n d v i r F a r e
i n v o l v e d
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t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n
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g e n e s a n d i i ) v i r A a n d
v i r C a r e
i n v o l v e d
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p o s t t r a n s c r i p t i o n a l p r o c e s s
s p e c i f i c t o t h e Y o p s .
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v i r C
m u t a n t s
a n d t h e v ir A
m u t a n t s
p r o d u c e d
Y o p s b u t d i d
n o t
s e c r e t e t h e m ,
s u g g e s t i n g t h a t
t h e s e l o c i a r e
i n v o l v e d
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t h e
e x p o r t o f
t h e
Y o p s o r i n t h e
s p e c i f i c
c o n t r o l o f t h e
e x p o r t
f u n c t i o n .
I t
i s w o r t h
n o t i n g t h a t i n
n o n e
o f
t h e m u t a n t s
t e s t e d
d i d t h e a m o u n t
o f i n t r a c e l l u l a r
Y o p s
r e a c h t h e a m o u n t s
s e c r e t e d b y t h e
w i l d - t y p e
s t r a i n , s u g g e s t i n g t h a t
s o m e f e e d -
b a c k
i n h i b i t i o n
o f
t r a n s c r i p t i o n o r t r a n s l a t i o n
o r
b o t h
o c -
c u r r e d when
e x p o r t
w a s
p r e v e n t e d ,
a s we
p r e v i o u s l y
s u g -
g e s t e d
( 1 6 ) .
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a n d
v i r C m u t a n t s a c c u m u -
l a t e
Y o p s
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c e l l s
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t h e i r s u r f a c e ,
we e x a m i n e d
t h e r m o i n d u c e d
c u l t u r e s o f t h e
v a r i o u s
m u t a n t s , b y i m m u n o -
f l u o re s c en c e , u s i n g
t h e
a n t i - Y o p E MAb.
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we
e x a m i n e d
c u l t u r e s
o f
t h e
w i l d
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a s s t r o n g l y
f l u o r e s c e n t
f i l m p a r t i c l e s
a n d t h e
b a c t e r i a t h e m s e l v e s w e r e
p o o r l y
f l u o r e s c e n t
( F i g . 4 A ) .
T h e
c u l t u r e s
o f v i r A
a n d
v i r C
m u t a n t s
d i d n o t
c o n t a i n t h e
f l u o r e s c e n t
p a r t i c l e s , a n d t h e
v a s t
m a j o r i t y
o f t h e
b a c t e r i a t h e m s e l v e s
w e r e
n o t f l u o r e s -
c e n t . O t h e r
p r e p a r a t i o n s
o f
t h e s a m e
c u l t u r e s w e r e
t r e a t e d
w i t h
m e t h a n o l
b e f o r e
i m m u n o f l u o r e s c e n c e s t a i n i n g
i n o r d e r
t o
e n s u r e
p e r m e a b i l i t y
o f
t h e
c e l l s t o t h e
MAb. I n t h e s e
p r e p a r a t i o n s ,
t h e
w i l d - t y p e
b a c t e r i a
w e r e
s t i l l
p o o r l y
f l u o -
r e s c e n t , t h e v i r A
a n d
v i r C m u t a n t s w e r e
s t r o n g l y
f l u o r e s c e n t
( F i g . 4B
a n d C ,
r e s p e c t i v e l y ) , a n d t h e
v i r F m u t a n t
r e m a i n -
p Y V
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p Y V
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1 2 3
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2
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4 4 . .
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5 6 8
9
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s c r i p t i o n
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e x t r a c t e d a f t e r
1 . 5 - t o
2 - h
i n du c t i o n o f t h e c u l t u r e s
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3 7 ° C
i n BHI-OX.
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f r o m
y o p H
was
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2 6 4 - b p
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t o
7 8 4
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yopH
s e q u e n c e
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M i c h i e l s a n d
C o r n e l i s
[ 3 3 ] )
3 2 p
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b y
n i c k t r a n s l a t i o n . T h e
y o p E t r a n s c r i p t
was
h y b r i d i z e d
w i t h
t h e
3 2 P - e n d - l a b e l l e d
o l i g o n u c l e o t i d e
MIPA9
c o m p l e m e n t a r y
t o
b a s e s
3 1 6 t o 3 3 0 o f
t h e
y o p E s e q u e n c e
o f M i c h i e l s e t a l .
3 5 ) .
T h e
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mRNA
w a s
i d e n t i f i e d
w i t h
3 2 P - l a b e l l e d
o l i g o n u c l e o t i d e
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c o m p l e m e n t a r y
t o
n u c le ot i d es 1 1 7 8 t o 1 20 2 o f t h e
y a d A
s e q u e n c e
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d e t e r m i n e d
b y
M.
S k u r n i k
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W o l f - W a t z
4 9 ) .
L a n e s : 1 ,
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e n t e r o c o l i t i c a
W 2 2 7 0 3
( n o t c a r r y i n g
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p l a s m i d ) ;
2 ,
W 2 2 7 0 3 ( p Y V e 2 2 7 )
( w i l d t y p e ) ;
3 , W 2 2 7 0 3 ( p G C 2 7 4 )
( v i r A ) ; 4 ,
W 2 2 7 0 3
( p G C 6 3 3 ) ( v i r B ) ;
5 ,
W 2 2 7 0 3 ( p G C 8 3 0 ) ( v i r B ) ;
6 ,
W 2 2 7 0 3 ( p G C 2 1 6 )
( v i r C ) ;
7 ,
W 2 2 7 0 3 ( p G C 4 4 5 ) ( v i r C ) ; 8 ,
W 2 2 7 0 3 ( p G C 1 2 7 5 )
( v i r C ) ;
9 ,
W 2 2 7 0 3 ( p G C S 3 3 4 ) v i r F ) .
e d
u n d e t e c t a b l e
( F i g .
4 D ) .
T h i s r e s u l t c o n f i r m e d
t h a t
YopE
i n d e e d
a c c u m u l a t e d
i n t r a c e l l u l a r l y
i n
v i r A
a n d
v i r C
m u t a n t s
( T a b l e
2 ) .
F u r t h e r
g e n e t i c m a p p i n g
o f t h e v i r C
r e g i o n .
F i v e
m i n i -
M u
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i n s e r t i o n s d e f i n e d
t h e v i r C l o c u s a s
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r e g i o n
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+4
k b
w i t h
t h e r m o d e p e n d e n t
u n i d i r e c t i o n a l
t r a n s c r i p t i o n 1 5 ) .
I n s e r t i o n s
i n t h i s
r e g i o n
a b o l i s h e d
t h e
r e l e a s e o f
Y o p s
a n d
r e n d e r e d
t h e
s t r a i n s
g r o w t h
t h e r m o s e n s i t i v e
( G t s
p h e n o t y p e )
( 1 , 1 5 ) .
I n t h i s
w o r k ,
we
c h a r a c t e r i z e d
f o u r
a d d i t i o n a l
m i n i - M u d
l a c
i n s e r t i o n
m u t a n t s
o f
p Y V e 2 2 7
e x h i b i t i n g
t h e
same
p r o p e r t i e s :
p J C V 1 2 7 5 ,
p J C V 1 2 7 9 , p J C V 1 2 8 2 ,
a n d
p J C V 1 2 8 9 .
P l a s m i d
p J C V 1 2 7 5
h a d
a
m i n i - M u d l a c
i n s e r t i o n
2 . 0
k b
d o w n s t r e a m o f
t h e i n s e r t i o n
p o i n t
o f
p G C 2 1 6 ,
t h e
VOL.
1 7 3 ,
1 9 9 1
; 4 0 . j W .
' o
8/9/2019 J. Bacteriol.-1991-Michiels-4994-5009.pdf
5/16
4 9 9 8 M IC HI EL S E T A L .
v i r B
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Y o p
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F I G .
3 . W e s t e r n b l o t
a n a l y s i s
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Y o p E ,
Y o p B ,
Y o p D ,
a n d
YadA
i n v a r i o u s v i r m u t a n t s . T o t a l
c e l l p r o t e i n s
w e r e e x t r a c t e d
f r o m
b a c t e r i a
i n d u c e d a t
3 7 ° C
f o r
4 .
h i n t h e a b s e n c e
o f
C a 2 .
I m m u n o -
b l o t s w e r e r ev ea l e d w i t h a
p o l y c l o n a l
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s e r u m
( A )
o r
w i t h
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m i x t u r e o f
MAbs
d i r e c t e d a g a i n s t
Y o p E , Y o p B ,
a n d
YopD ( B )
( s e e
M a t e r i a l s a n d
M e t h o d s ) .
L a n e s :
1 , W 2 2 7 0 3 ( p J C V 1 2 7 5 ) ( v i r C ) ;
2 , W 2 2 7 0 3 ( p G C 4 4 5 ) ( v i r C ) ;
3 , W 2 2 7 0 3 ( p G C 4 0 3 )
( v i r C ) ;
4 ,
W 2 2 7 0 3
( p G C 2 1 6 ) ( v i r C ) ;
5 ,
W 2 2 7 0 3 ( p G C 8 3 0 ) ( v i r B ) ; 6 ,
W 2 2 7 0 3 ( p G C 6 7 8 )
( v i r B ) ;
7 ,
W 2 2 7 0 3 ( p G C 6 3 3 )
( v i r B ) ;
8 , W 2 2 7 0 3 ( p G C 2 7 4 )
( v i r A ) ;
9 ,
W 2 2 7 0 3 ( p G C 1 1 5 2 - 9 )
( v i r F ) ;
1 0 , W 2 2 7 0 3 ( p G C 1 1 5 2 )
( y o p H ) ;
1 1 ,
W 2 2 7 0 3 ( p Y V E 2 2 7 )
( w i l d
t y p e ) .
m o s t
d i s t a l
p r e v i o u s l y d e s c r i b e d
v i r C
m u t a n t
( 1 5 ) .
T h i s
i n d i c a t e d
t h a t
t h e v i r C
r e g i o n r e g i o n
i s
a t l e a s t
6
k b
l o n g
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c o u l d e x t e n d f r o m
v i r F
t o
yopH ( T a b l e
2 ) .
N u c l e i c
a c i d
s e q u e n c e
o f
v i r C .
We
s e q u e n c e d
t h e 8 . 5 - k b
r e g i o n
b e t w e e n v i r F a n d
yopH ( c o o r d i n a t e s
o f
3 4 . 0
t o
4 2 . 5
k b
o n
t h e
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p r e s e n t e d
i n F i g . 1 ) . The s e q u e n c e
p r e s e n t e d i n
F i g . 5 c o n t a i n s 1 2 o p e n
r e a d i n g f r a m e s ( O R F s ) e n c o d i n g
p r o t e i n s
o f
a t
l e a s t 6 0
a m i n o a c i d s
a n d o r i e n t e d
a s e x p e c t e d
f r o m
t h e
p r e v i o u s
g e n e t i c
d a t a
( 1 5 ) .
An
a d d i t i o n a l
3 2 - c o d o n
ORF
l o c a t e d
i n t h e 5 '
r e g i o n
was
a l s o r e t a i n e d a s a
p o t e n t i a l
g e n e . T h e s e p u t a t i v e
g e n e s
w e r e c a l l e d
y s c A
t o
yscM ( y s c
f o r
Yop
s e c r e t i o n ) .
I f
o n e
t a k e s
i n t o a c c o u n t t h a t yscD
a n d
y s c J
p r o b a b l y s t a r t
w i t h
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i n i t i a t i o n c o d o n , ORFs
y s c B
t o
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a r e
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c o n t i g u o u s , w h i c h
s t r o n g l y
s u g g e s t s
t h a t
t h e y
a r e
p a r t o f
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s i n g l e
l a r g e
m u l t i c i s t r o n i c
o p e r o n .
T h e i n s e r t i o n
p o i n t
o f
m i n i - M u
d
l a c i n n i n e d i f f e r e n t v i r C
m u t a n t s w a s
s e q u e n c e d
d i r e c t l y o n
t h e
d o u b l e - s t r a n d e d
pYV
d e r i v a t i v e ,
u s i n g
a n o l i g o n u c l e o t i d e
c o m p l e m e n t a r y
t o t h e
r i g h t
e n d
o f b a c t er i o p h a g e Mu. M u t a n t s
p J C V 1 2 7 9
a n d
p J C V 1 2 8 2
t u r n e d
o u t t o
b e
i d e n t i c a l . T h e s e v e n
o t h e r
m u t a t i o n s
w e r e
a l l
d i f f e r e n t
f r o m
e a c h
o t h e r
a n d
o c c u r r e d
i n
f i v e d i f f e r e n t
O R F s .
R e l e v a n t f e a t u r e s
o f t h e
Y s c
p r o t e i n s .
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t h e ORFs o f
t h e
v i r C
r e g i o n
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p r e c e d e d
b y
p o t e n t i a l
r i b o s o m e
b i n d i n g
s e q u e n c e s
w i t h
g o o d h o m o l o g y
t o t h e
c o n s e n s u s ,
w h i c h
s u g g e s t s
t h a t
t h e y
a l l
c o r r e s p o n d
t o t r a n s l a t e d
g e n e s .
I n v i e w
o f
t h e
i n v o l v e m e n t o f t h e v i r C
r e g i o n
i n t h e
Yo p e x p o r t
p r o c e s s ,
p r e d i c t e d p r o t e i n s e q u e n c e s
w e r e c h e c k e d f o r
t h e
p r e s e n c e
o f
a
s i g n a l s e q u e n c e
a n d
h y d r o p h o b i c
d o m a i n s
t h a t
c o u l d
c o r r e s p o n d
t o
m e m b r a n e
a n c h o r i n g
d o m a i n s .
T h e y
w e r e
a l s o u s e d
t o s c r e e n
t h e
G e n P e p t
l i b r a r y u s i n g
t h e
FASTA
p r o c e d u r e ( 3 9 ) b y
e l e c t r o n i c
m a i l . T h e r e l e v a n t
f e a t u r e s
o f t h e v a r i o u s
p u t a t i v e
y s c g e n e
p r o d u c t s
a r e
d e s c r i b e d
h e r e
b el o w a n d
s u m m a r i z e d
i n T a b l e 3 .
i )
Y s c A . T h e s m a l l
3 2 - r e s i d u e - l o n g
h y p o t h e t i c a l
YscA
p r o t e i n h a s
a h y d r o p h o b i c
C - t e r m i n a l d o m a i n . T h e
p r e s e n c e
o f a p u t a t i v e
r i b o s o m e
b i n d i n g
s e q u e n c e
a n d t h e
f a c t
t h a t
t h i s
r e g i o n
i s t r a n s c r i b e d
( s e e b e l o w )
o f f e r
s u p p o r t
f o r
t h e
h y p o t h e s i s
t h a t t h i s
ORF
i s t r a n s l a t e d .
i i )
Y s c B .
T h e
1 3 7 - r e s i d u e - l o n g
YscB
p r o t e i n
h a s
n e i t h e r
a
p u t a t i v e
s i g n a l
s e q u e n c e n o r
a n y h y d r o p h o b i c
d o m a i n .
i i i )
Y s c C . T r a n s l a t i o n o f
y s c C y i e l d s
a
6 0 7 - r e s i d u e - l o n g
p r o t e i n
w i t h
a
p r o b a b l e
s i g n a l
s e q u e n c e
o f 2 6
r e s i d u e $ .
TABLE 2 .
P h e n o t y p i c
c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e v i r m u t a n t s a
P l a s m i d
M u t a t i o n
P h e n o t y p e
y o p H y o p E
y a d A
E x t r a c e l l u l a r
I n t r a c e l l u l a r
I n t r a c e l l u l a r P r o d u c t i o n
t r a n s c r i p t i o n
t r a n s c r i p t i o n t r a n s c r i p t i o n Y o p s
Y o p E Y o p B
a n d
Y o p D
o f YadA
None
C I -
-
-
-
- -
-
p Y V e 2 2 7 C D
+
+
+
+ + + +
pGC274
v i r A
C I b +
+
+
-
+
+
+
p G C 6 3 3 v i r B
C I + +
NT
- + +
+
p G C 6 7 8
v i r B
C I NT
NT NT
-
+
+ +
p G C 8 3 0 v i r B
C I
+
+
+
-
+
+
+
p G C 2 1 6 v i r C G t s
+
+
+
-
+ + +
p G C 4 0 3
v i r C
G t s
NT NT NT
-
+
+
+
p G C 4 4 5 v i r C G t s
+
+
NT
-
+ +
+
p J C V 1 2 7 5
v i r C
G t s
+
+
+
-
+
+C
+
p G C 1 1 5 2 - 9 v i r F
C I
NT
NT NT
p G C 3 3 4
v i r F
C I
-
- -
-
NT
NT
a
P h e n o t y p i c
c h a r a c t e r i s t i c s
a r e i n d i c a t e d a s f o l l o w s :
,
w i l d - t y p e l e v e l ;
- ,
n o t p r e s e n t ;
+ , l o w l e v e l ;
N T , n o t t e s t e d .
b
As
m e n t i o n e d
i n
R e s u l t s , t h i s
m u t a n t h a s
a
r ed u c ed g r o wt h r a t e
a t
3 7 ° C
i n
t h e
a b s e n c e o f C a 2 + .
c
O n l y YopD ( n o
Y o p B , p r o b a b l y
b e c a u s e o f
a
p o i n t
m u t a t i o n
o f
y o p B ) .
v i r C
1 2 3
4
5
J .
B A C T E R I O L .
8/9/2019 J. Bacteriol.-1991-Michiels-4994-5009.pdf
6/16
Vir
PERON
OF
Y .
ENTEROCOLITICA
4 9 9 9
A
B
C ,
D
F I G . 4 .
I m m u n o f l u o r e s c e n c e
a n a l y s i s , w i t h a n t i - Y o p E M Ab
6 G 1 , o f v a r i o u s c u l t u r e s
i n d u c e d a t 3 7 ° C
i n
a b s e n c e o f
C a 2
a n d
m e t h a n o l
f i x e d . ( A )
W 2 2 7 0 3 ( p Y V e 2 2 7 ) ( w i l d t y p e ) ; ( B ) W 2 2 7 0 3 ( p G C 2 7 4 )
( v i r A ) ;
( C )
W 2 2 7 0 3 ( p G C 2 1 6 )
( v i r C ) ; ( D ) W 2 2 7 0 3 ( p G C S 3 3 4 )
( v i r F ) .
A c c o r d i n g
t o
t h e h y d r o p h o b i c i t y a n a l y s i s ,
t h i s
p r o t e i n
h a s
n o
o b v i o u s
t r a n s m e m b r a n e o r membrane
a n c h o r i n g s e g -
m e n t .
H o w e v e r , YscC s h a r e s s i g n i f i c a n t s i m i l a r i t y
w i t h t w o
d e s c r i b e d o u t e r
membrane p r o t e i n s : P u l D
a n d p I V ( F i g . 6 ) .
P u l D
i s a f a c t o r
r e q u i r e d f o r
t h e
e x p o r t
o f
p u l l u l a n a s e b y
s t r a i n s
o f K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e
( 2 0 ) . P r o t e i n
p I V , t h e
p r o d u c t
o f g e n e I V
o f t h e
f i l a m e n t o u s b a c t e r i o p h a g e s , i s a n
i n t e g r a l
membrane
p r o t e i n
r e q u i r e d
f o r v i r u s a s s e m b l y .
T h i s
p r o t e i n
c o u l d b e p a r t
o f
t h e s t r u c t u r e t h r o u g h w h i c h t h e
a s s e m b l i n g
p h a g e i s e x t r u d e d ( 8 ) .
I n t e r e s t i n g l y ,
t h e s a m e
d o m a i n i s c o n s e r v e d
b e t w e e n t h e t h r e e p r o t e i n s ,
s u g g e s t i n g
a
common f u n c t i o n ( F i g . 6 ) .
( i v )
Y s c D . I n
v i e w
o f t h e a d j a c e n c y
o f
m o s t
y s c
g e n e s , we
a s s u m e d
t h a t
y s c D i n i t i a t e s
a t
a GTG
c o d o n l o c a t e d
4 9
c o d o n s
u p s t r e a m
o f t h e
f i r s t
ATG i n i t i a t i o n c o d o n ,
t h u s
e n c o d i n g
a
4 1 8 - r e s i d u e - l o n g
p r o t e i n . T h i s
p r o t e i n h a s n o
p u t a t i v e s i g n a l
s e q u e n c e
b u t
c o n t a i n s
a
h i g h l y
h y d r o p h o b i c
d o m a i n
( r e s i d u e s 1 2 0 t o
1 3 0 )
w i t h
a
v a l u e
o f 2 . 9 o n t h e
s c a l e
o f
K y t e
a n d
D o o l i t l e
( 2 7 ) , w h i c h s u g g e s t s
a n
i n n e r
m e m b r a n e
l o c a l i z a t i o n .
R e s i d u e s
1 0 0
t o
1 1 5 w h i c h a r e c o n t a i n e d b e -
t w e e n
t w o
h y d r o p h o b i c s e g m e n t s a r e
s t r o n g l y
p o l a r
a n d
c o n t a i n f i v e
p o s i t i v e l y
c h a r g e d
r e s i d u e s
w h i c h d e n o t e a
p o t e n t i a l c y t o p l a s m i c d o m a i n .
( v )
Y s c E .
T h e
6 6 - r e s i d u e - l o n g h y p o t h e t i c a l YscE
p r o t e i n
h a s n o
p u t a t i v e
s i g n a l
s e q u e n c e .
I t
c o n t a i n s
a
h y d r o p h o b i c
d o m a i n
a t i t s
C t e r m i n u s
( h y d r o p h o b i c i t y
v a l u e ,
+ 1 . 8 ) .
( v i )
Y s c F .
y s c F
e n c o d e s
a 8 7 - a m i n o - a c i d
h y p o t h e t i c a l
p r o t e i n t h a t
h a s n e i t h e r a p u t a t i v e
s i g n a l s e q u e n c e
n o r
a n y
s t r o n g l y
h y d r o p h o b i c o r
h y d r o p h i l i c d o m a i n .
v i i )
Y s c G .
T h e 1 1 5 - r e s i d u e - l o n g
h y p o t h e t i c a l YscG
p r o -
t e i n
h a s
a n N - t e r m i n a l
h y d r o p h o b i c
d o m a i n
p r e c e d e d
b y
t w o
l y s y l r e s i d u e s .
H o w e v e r ,
t h i s
r e g i o n
i s n o t
p r e d i c t e d
t o
b e a
c l e a v a b l e
s i g n a l
s e q u e n c e , s u g g e s t i n g
t h a t
t h i s
p r o t e i n
c o u l d
b e
a n c h o r e d i n t h e
i n n e r
membrane
b y
i t s
N
t e r m i n u s .
v i i i ) Y s c H . T h e
1 6 5 - r e s i d u e - l o n g YscH
p r o t e i n
c o n t a i n s
t w o
i n t e r n a l
d o m a i n s
o f a v e r a g e h y d r o p h o b i c i t y .
( i x ) Y s c I .
Y s c I
h a s
n o
h y p o t h e t i c a l
s i g n a l
s e q u e n c e
a n d
n o
h y d r o p h o b i c d o m a i n .
( x )
Y s c J . As i n t h e
c a s e o f y s c D , we
a s s u m e d t h a t
y s c J
b e g i n s
a t
a GTG c o d o n
l o c a l i z e d
3 4 r es i d u es
u p s t r e a m
o f
t h e
f i r s t
ATG
a n d t h u s e n c o d e s
a
2 4 4 - r e s i d u e - l o n g
p o l y p e p t i d e .
W i t h
t h i s
h y p o t h e s i s ,
t h e
y s c J g en e
p r o d u c t
c o n t a i n s
a
n e a r l y p e r f e c t l i p o p r o t e i n - s p e c i f i c s i g n a l
s e q u e n c e .
C l e a v a g e
b y s i g n a l
p e p t i d a s e
I I
w o u l d o c c u r
a t t h e l e v e l o f
t h e
L e u - T h r - G l y
C y s s e q u e n c e i n s t e a d
o f t h e c o n s e n s u s L e u -
A l a / S e r / V a l - G l y / A l a ' C y s
s e q u e n c e
( 6 1 ) . Y s c J c o n t a i n s a
h y d r o p h o b i c C - t e r m i n a l d o m a i n
f o l l o w e d
b y
t h r e e
p o s i t i v e l y
c h a r g e d
r e s i d u e s . T h i s f e a t u r e
i s
c h a r a c t e r i s t i c o f
a
s t o p
t r a n s f e r
d o m a i n
a n c h o r i n g
p r o t e i n s
i n
t h e
membrane
( 7 ) .
T h e
p r e s e n c e o f
l y s y l
r e s i d u e s a t
t h e C - t e r m i n a l e n d o f t h i s
l i p o p r o t e i n
a l s o
b r i n g s
t o m i n d
t h e
l i p o p r o t e i n s
w h i c h
a r e
c o v a l e n t l y
b o u n d t o
p e p t i d o g l y c a n
v i a
t h e i r
C - t e r m i n a l
l y s y l
r e s i d u e
( 5 5 ) .
The
r e g i o n
c e n t e r e d a t
p o s i t i o n 1 3 0
i s
e x t r e m e l y
h y d r o p h i l i c
a n d i s
c o n t a i n e d
b e t w e e n
h y d r o p h o b i c r e g i o n s .
T h e
s i m i l a r i t y
s e a r c h
o n
t h e
G e n P e p t
l i b r a r y
d i d n o t
r e v e a l
a n y
s t r i k i n g s e q u e n c e s i m i l a r i t y . H o w e v e r ,
Y s c J
a p p e a r e d
t o
h a v e 1 4 . 8 %
i d e n t i t y
w i t h Lon
p r o t e a s e ( 9 )
o n a 1 8 3 - a m i n o -
a c i d s t r e t c h
s t a r t i n g
a t
t h e
s i g n a l
c l e a v a g e
s i t e .
A c c o r d i n g
t o
i t s
p r e d i c t e d
m o l e c u l a r
m a s s ,
Y s c J
i s a
g o o d
c a n d i d a t e
f o r
b e i n g Y l p B ,
t h e
p Y V - e n c o d e d
2 7 - k D a
l i p o p r o -
t e i n
t h a t
we d e t e c t e d p r e v i o u s l y
( 1 0 ) .
To
v e r i f y
t h i s
h y p o t h -
e s i s ,
we
l a b e l l e d t h e c u l t u r e s o f
two
v i r C
m i n i - M u
d
l a c
m u t a n t s
w i t h
[ 3 H l p a l m i t i c
a c i d
a n d
a n a l y z e d
t h e
p r o t e i n s b y
SDS-PAGE
a n d
f l u o r o g r a p h y .
As
shown
i n
F i g . 7 , Y l p B
was
p r e s e n t
i n
W 2 2 7 0 3 ( p J C V 1 2 7 5 ) ( i n s e r t i o n
i n
y s c L )
a n d
m i s s -
i n g
i n
W 2 2 7 0 3 ( p G C 2 1 6 ) ( i n s e r t i o n
i n
y s c H ) .
I n v i e w
o f
t h e
p o l a r i t y
o f
m i n i - M u d l a c
i n s e r t i o n s ,
t h e s e d a t a
show
t h a t
Y l p B
i s
e n c o d e d
b y y s c H , - I , - J ,
o r
- K .
The
p r o d u c t
o f
y s c J
i s t h e
o n l y
o n e
h a v i n g
t h e
e x p e c t e d
s i z e
a n d a
p o t e n t i a l
l i p o p r o t e i n
s i g n a l
s e q u e n c e .
Hence
Y s c J i s i n d e e d
Y l p B .
F o r
t h e s a k e
o f
c l a r i t y ,
we
p r o p o s e
t o
u s e t h e
Y s c J
d e s i g n a t i o n .
( x i )
Y s c K . The
2 0 9 - r e s i d u e - l o n g
YscK
p r o t e i n
d o e s
n o t
V O L .
1 7 3 ,
1 9 9 1
8/9/2019 J. Bacteriol.-1991-Michiels-4994-5009.pdf
7/16
5 0 0 0
MICHIELS ET A L .
J . B A C T E R I O L .
1 1 6 0
o f v i r F s e q ( J . B a c t e r i o L . 1 7 1 :
2 5 9, 1 9 8 9 )
M e t S e r G L n I l e T h r T h r L y s H i s I l e T h r V a l L e u P h e
T T T A A A A A C A C T T T T G G A C T A T A A A G T A A A A T A C G G G G T T A G A T T T T G A A G A T T C A A T G G G A T G A G C C A A A T T A C A A C G A A A C A T A T A A C A G T A T T A T T
1
Dral
5 r b s
.
y s c A
.
1 0 0
A r g A r gT r p M e t A L a l e l L e C y s C y s L e u l
e l
l e L y s I
L e A L a T y r L e u A L a T y r * * *
T C G C C G C T G G A T G G C A A T A A T A T G TT G T T TA A T A A T C A A G A TA G C T T A T C T G G C T T A T TA A G T G C G G T G G C G C A A G A A A C G A G C G C C A T C A A A T A G A G C
1 0 0
A A G T C T C A T T A G T T C G A T T A A C G T A A T A T C A T C T A T T G C T A T A T A G G T G G T T G A T A A T T A T C A C G A A C A T T T T T T T G A A T A T C T G G A A G T T T G A G C T G A
2 0 0
M e t G L n A s n L e u
A C C G C G A A A C C T T A T G T C A C G A T G A C A T G A A G T A G G T T A T T T A T T T G G C G C A G G A T T A C T T A G T T T A C A T A T A A C C A T C J § A G A A A T A A T G C A A A A T T T
3 0 0 r b s y s c B .
L e u L y s A s n L e u A l a T h r S e r L e u G l y A r g L y s P r o P h e V a L A l a A s p L y s G l n G l y V a l T y r A r g L e u T h r I
l e A s p L y s H i s L e u V a L M e t L e u T h r
A C T A A A A A A C T T G G C T A C C A G T T T A G G A A G A A A A C C G T T T G T T G C C G A T A A A C A A G G T G T T T A C C G T T T A A C T A T A G A T A A G C A T C T T G T C A T G C T G A C
4 0 0
P r o H i s G l y S e r G l u L e u V a l L e u A r g T h r P r o l L e A s p A l a P r o M e t L e u A r g G L u G L y A s n A s n V a L A s n V a l T h r L e u L e u A r g S e r L e u M e t G l n
T C C G C A T G G T T C A G A A C TG G T T T TA C G C A C T C C T A T TG A C G C A C C A A T G T T A C G T G A A G G A A A TA A C G T T A A C G T C A C A T T G C T TC G C T C C C T A A T G C A
5 0 0
G L n A L a L e u A l a T r pA L a L y s A r g Ty r P r o G L n T h rL e u V a L L eu A s p A s p C y s G L y G l n L e u V a l L eu G l u A L a A r g L e u A r gL e u G L n G L u L e u A s p
A C A A G C G T T G G C A T G G G C T A A A C G T T A TC C T C A A A C T T TA G T A T TG G A T G A T T G T G G T C A A T T G G T G C T G G A G G C G C G T T TA C G T C T A C A A G A G C T T G A
6 0 0
T h r H i s G L y L e u G L n G t u V a L I
l e A s n L y s G l n L e u A l a L e u L e u G l u H i s L e u I
l e P r o G l n L e u T h rP r o P h e S e rV a l A l a $ e r A r gV a l G l y T r p
T A C T C A C G G A T T G C A A G A A G T A A T A A A T A A A C A A C T G G C T C T G C T A G A A C A T T T A A T T C C T C A G T T A A C G C C A T T T T C T G T A G C G T C T C G C G T G G G G T G
7 0 0
A s n * * *
M e t A l a P h e P r o L e u H i s S e r P h e P h e L y s A r g V a l L e u T h r G l y T h r L e u L e u L e u L e u S e r S e r T y r S e r T r p A l a G l n G l u L e u
G A A T T A A G T A A T A T G G C T T T T C C G C T A C A T T C T T T T T T C A A G C G C G T A C T C A C C G G G A C G T T A C T G T T A C T T T C T A G C T A T A G C T G G G C G C A A G A A C T T
r b s
8 0 0 y s c C
s i g n a l s e q u e n c e
A s p T r p L e u P r o l L e P r o T y r V a l T y r V a l A l a L y s G l y G l u S e r L e u A r g A s p L e u L e u T h r A s p P h e G t y A l a A s n T y r A s p A l a T h r V a l V a l V a l
G A T T G G T T G C C T A T A C C T T A T G T T T A T G T G G C G A A G G G G G A A A G T T T A C G C G A T T T A T T A A C T G A T T T C G G C G C T A A T T A T G A T G C T A C A G T G G T A G T A
9 0 0
S e r A s p L y s I L
l e A s n A s pL y s V a l S er G l y G l n P h e G l u H i s A s pA s n P r o G l n A s p P h eL e u G l n H i s
I L e A l a S e r L e u T y r A s n L e u V a l T r p T y r
A G C G A T A A G A T T A A T G A C A A A G T T T C C G G C C A G T T T G A G C A T G A T A A C C C T C A G G A T T T C C T A C A G C A T A T T G C C T C T C T T T A C A A T T T G G T T T G G T A C
1 0 0 0
.
T y r A s p G l y A s n V a l L e u T y r l
L e P h e L y s A s n S e r G l u V a l A l a S e r A r g L e u I
l e A r g L e u G L n G l u S e r G l u A l a A L a G L u L e u L y s G L n A L a L e u
T A T G A T G G C A A T G T G C T C T A C A T T T T T A A A A A T A G T G A G G T A G C G T C T C G T C T C A T T C G T T T A C A G G A A A G T G A G G C C G C A G A G T T A A A G C A G G C A T T A
1 1 0 0
D r a l
G l n A r g S e r G L y I
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1 9 9 1
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B a m H I
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