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Jasco Chromatography Data System - MauroSabella · 1 Caratteristiche del programma ChromNAV...

Date post: 31-Aug-2018
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Jasco Chromatography Data System M M a a n n u u a a l l e e U U t t e e n n t t e e Traduzione a cura di Zanfi Stefano – Jasco Europe Srl
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Jasco Chromatography Data System

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Traduzione a cura di Zanfi Stefano – Jasco Europe Srl

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Indice

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4.1 Come utilizzare un progetto �������������������������������������������������������������������������������������������$&���

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1 Caratteristiche del programma ChromNAV Chromatography Data System Software

1.1 Dati tecnici 1) Dallo stesso PC possono essere controllati fino a 4 sistemi HPLC

Per i dettagli relativi alle impostazioni ed avvio, vedere le sezioni “3

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2) Le Applicazioini sono classificate in “Progetti”(Project), e i metodi possono essere separati tra loro.

Vedere la sezione “4 Cosa�(�����(�����(�����(������������������D����������D����������D����������D���;������;������;������;���” per approfondire il concetto

di progetto.

3) Lo stesso Progetto può essere condiviso tra I vari sistemi HPLC collegati. Questa caratteristica viene utilizzata nel caso più sistemi HPLC debbano

esseguire la stesa analisi ed utilizzare gli stessi metodi.

4) Ogni sistema HPLC può acquisire contemporaneamente fino a 4 segnali analogici. L’acquisizione dei 4 canali cromatografici dipende dalle impostazioni assegnate

(nel caso vi sisa installato un rivelatore PDA, anche i il dato PDA è incluso nelle

impostazioni). Vedere la sezione “1.2 I Dati Cromatografici nel programma I *����

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5) Il rivelatore PDA può essere utilizzato con uno dei quattro sistemi HPLC. Nel caso del rivelatore PDA, possono essere processati simultaneamente fino a 8

cromatogrammi a diverse lunghezze d’onda, per determinazioni quantitative.

I dati cromatografici provenineti dal rivelatore PDA possono essere trattati come

un normale dato cromnatografico. Vedere la sezione “Errore. L'origine

riferimento non è stata trovata. Canale Virtuale” per maggiori dettagli.

6) Utilizzando il pacchetto opzionale ChromNAV GPC, sarà possibile analizzare i Pesi Molecolari e la loro distribuzione.

1.2 I dati cromatografici nel programma ChromNAV

Nel programma ChromNAV, tutti i dati generati, sono acquisiti e trattati come un singolo dato

cromatografico. Quindi, i dati cromatografici generati da più rivelatori compreso il rivelatore

PDA sono trattati come un singolo dato cromatografico con lo stesso nome. Nel programma

ChromNAV, questi dati collettivi sono chiamati Dato Cromatografico.

Quindi il Dato Cromatografico includerà le seguenti informazioni:

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Figura 1-1 Struttura del Dato Cromatografico nel programma ChromNAV

Per esempio, 4 canali provenienti dall’interfaccia LC-Net II/ADC collegata al sistema

HPLC e 8 canali virtuali provenienti dal rivelatore PDA potranno essere trattati come un singolo

Dato Cromatografico.

Il Dato Cromatografico include i vari Metodi utilizzati per l’acquisizione e l’analisi dei

risultati.

1.3 Canale Virtuale

ChromNAV può ricevere simultaneamente fino a 4 canali di un sistema HPLC. Il canale

indica il segnale proveniente da un rivelatore e inviato al PC dall’interfaccia LC-Net II/ADC.

Quando viene utilizzato un rivelatore PDA, in aggiunta ai 4 canali analogici, nel dato

cromatografico possiamo includere fino a 8 canali presi a diuverse lunghezze d’onda. I Canali

relativi al rivelatore PDA sono assegnati come Canali Virtuali.

I Canali Virtuali possono essere definiti nel pannello di controllo del rivelatore PDA e

memorizzati nel Metodo di Controllo (Control Method). Questi possono essere designati anche

dopo l’acquisizione nel Pannello [Contour+Chrom+Spec] dale Visualizzazioni [PDA].

I canali da Ch-9 a Ch-16 possono essere assegnati come Canali Virtuali. I Canali Virtuali

possono essere utilizzati per l’analisi quantitativa dei dati PDA. Grazie a questa caratteristica,

sarà possibile quantificare simultaneamente fino a 8 differenti lunghezze d’onda.

1.4 Acquisizione ed Esecuzione di una Sequenza

Quando viene esguita una Sequenza, i dati verranno memeorizzati per Sequenza di

acuisizione. I dati immagazzinati sono nel File della Sequenza esguita.

Il File della sequenza eseguita ha lo stesso nome assegnato alla sequenza corrispondente,

tuttavia, questi files sono memorizzati in diverse cartelle che veranno nominate con la data e

l’ora di esecuzione. La struttura del File e delle Cartelle è la seguente:

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�Figura 1-2 Sequenze di Acquisizione e File generarti dalla Sequenza eseguita

1.5 Finestre di Navigazione

La finestra sul lato sinistro del programma ChromNAV è chiamata Finestra di Navigazione.

Può essere utilizzata per selezionare le sezioni [Acquisition] e [Analysis], e per selezionare il

cromatogramma attivo.

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Figura 1-3 Finestra di Navigazione

I contenuti della Finestra di Navigazione sono differenti tra le due finestre Acquisition e

Analysis.

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1.6 Finestra di Acquisizione e Finestra di Analisi

I contenuti delle finestre Acquisitione e Analysis di [ChromNAV] variano in accordo alla

funzione selezionata dall’utente.

L’operatore può passare dalla finestra Acquisition a quella Analysis premendo i seguenti

pulsanti.

Seleziona la Finestra Acquisition.

Seleziona la Fienstra Analysis.

1.7 Visualizzazioni

Procedura

Ci sono due strade per selezionare le due visulizzazioni.

1) Anadare sul menu [View], selezionare l’opzione [Acquisition Window]/[Analysis

Window], e quindi scegliere la finestra di visualizzazione desiderata.

2) Premere i pulsanti o per

selezionare la finestra , quindi selezionare la sezione di interesse dalle liste sotto

elencate:

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Figura 1-4 Selezione delle visualizzazioni

1.8 Preferenze

Il contenuto delle Preferenze varia tra le finestre Acquisition e Analysis. Inoltre lo stesso

punto della finestra Acquisition Window e della fienstra Analysis può essere impostato in modo

differente.

Procedura

1) Andare sul menu [File], e selezionare [Preferences].

2) Premere il pulsante dalla barra degli strumenti.

3) Clioccare sulla cartella che contiene il punto che si desidera modificare.

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4) Modificare le impostazioni e confermare con il pulsante [OK].

5) Se si desidera non apportare modifiche uscire premendo il pulsante [Cancel].

6) Se clicchiamo sul pulsante [Default], tutti i punti verranno riportati alle impostazioni

originali della fabbrica.

1.8.1 Impostazioni nella Finestra Acquisition

Generale

1) Title: E’ possible impostare il formato del titolo che compare in alcune Finestre.

Font

Color 2) Legend: Impostazioni relative alla Legenda che compare nella finestra del

cromatogramma e dello spettro.

Font

Position: è possibile definire la posizione della legenda.

Transparent: quando la legenda è sovrapposta al cromatogramma, è possibile selezionare la trasparenza per visualizzare entrem,be le

informazioni.

3) Background: Seleziona i colori dello sfondo del cromatogramma e della fienstra

relativa al rivelatore PDA.

Plot Area: colore dello sfondo dell’area del grafico

Graph Area: colore dello sfondo dell’area esterna all’area del grafico

Highlight: colore della zona principale 4) Axis: Consente di personalizzare il formato degli assi del Cromatogramma e della

finestra di acquisizione del PDA.

Font

Color

LineStyle

Show Unit 5) Grid: Definisce il formato delle griglie del Cromatogramma e della finestra di

acquisizione del PDA.

Color

LineStyle

Show Grid

Cromatogramma

6) Chromatogram: Definisce i colori e lo stile delle linee del cromartogramma

visualizzato.

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1 – 32: E’ possibile scegliere tra trentadue modi diversi di visualizzazione dei cromatogrammi.

Spettro

7) Spectrum: E’ possible selezionare i colori e lo stile delle linee per la

visualizzazione dello spettro.

1: E’ possibile selezionare un formato di raffigurazione dello spettro.

Mappa cromatografica

8) Contour Map: impostazione della Mappa.

Contour Map/3D Color: impostazioni dei colori di raffigurazione della Mappa.

Color Layers

1.8.2 Impostazioni nella Finestra Analysis

Generale

1) Title: E’ possible impostare il formato del titolo che compare in alcune Finestre.

Font

Color 2) Legend: Impostazioni relative alla Legenda che compare nella finestra del

cromatogramma e dello spettro.

Font

Position: è possibile definire la posizione della legenda.

Transparent: quando la legenda è sovrapposta al cromatogramma, è possibile selezionare la trasparenza per visualizzare entrem,be le

informazioni.

3) Background: Seleziona i colori dello sfondo di ogni finestra.

Plot Area: colore dello sfondo dell’area del grafico

Graph Area: colore dello sfondo dell’area esterna all’area del grafico

Highlight: colore della zona principale. 4) Axis: Consente di personalizzare il formato degli assi di ogni finestra.

Font

Color

LineStyle

Show Unit 5) Grid: Definisce il formato delle griglie di ogni finestra.

Color

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LineStyle

Show Grid 6) Retention Time: consente di impostare il numero di decimali con cui visualizzare

il tempo di ritenzione.

Decimal Digits 7) Calculation Value: permette di definire il numero di decimali utilizzati per I

calcoli.

Effective Digits

Cromatogramma

8) Chromatogram: Definisce i colori e lo stile delle linee del cromartogramma

visualizzato.

9) .

1 – 32: E’ possibile selezionare fino a 32 modi differenti di visualizzazione del cromatogramma.

Time Scale Offset: opzione disponibile solo nella visualizzazione stacked. Quando il valore di offset è impostato a 0, l’area del grafico è la

stessa della scala dell’asse X. Quando questo valore è diverso da 0, l’offset

dell’asse X sarà impostato a sinistra del valore inserito.

Intensity Scale Offset: opzione disponibile solo nella visualizzazione stacked. When the offset value is set to 0, the ruler of the graphic area is the

same as the Y-Axis scale. Quando il valore di offset è impostato a 0, l’area

del grafico è la stessa della scala dell’asse Y. Quando questo valore è

diverso da 0, l’offset dell’asse Y sarà impostato in percentuale per ottenere

la visualizzazione massima.

Baseline & Marker

10) Baseline

Impostazione del colore della linea di base

Impostazione dello stile della linea di base 11) Peak Marker

Colore del Marker di inizio picco

Stile del Marker di inizio picco

Colore del Marker sul massimo del picco

Stile del Marker sul massimo del picco

Colore del Marker di fine picco

Stile del Marker di fine picco

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12) Annotation

Selezione Font

Selezione Colori

Annotazioni set 1

Annotazioni set 2

Annotazioni set 3

Orientamento

Calibration Curve

13) Calibration Curve

1: E’ possibile selezionare un modi di rappresentazione delle curve di calibrazione.

14) Marker

Abilita il colore dei Marker

Abilita lo stile dei Marker

Disabilita il colore del Marker

Disabilita lo stile dei Marker 15) Axis Title

X Axis Esterno/Interno

Y Axis Esterno/Interno

Spectrum

16) Spectrum: E’ possible impostare i colori e gli stili dello spettro.

1 – 32: E’ possible selezionare fino a 32 modi di visualizzazione degli spettri.

17) Peak Marker

Colore del Marker sul massimo del picco

Stile del Marker sul massimo del picco 18) Annotation

Selezione dei Font

Selezione dei Colori

Selezione delle Annotazioni set 1

Selezione delle Annotazioni set 2

Selezione dell’orientamento

Contour Map & 3D

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19) Contour Map: Consente di impostare il formato della Mappa.

Contour Map/3D Color: impostazione dei colori della Mappa.

Color Layers: colori degli strati della Mappa 20) 3D: seleziona il metodo di presentazione dei dati cromatografici 3D.

Display Mode: modalità di visualizzazione 21) Display Option

3D: cromatogramma tridimensionale

Two Contours: 2 Mappe

Ratio Chromatogram: rapporto tra cromatogrammi

On Peak Spectra: sul picco dello spettro

Peak Purity: purezza del picco

1.9 Linee di Base: linea di base del picco, visualizzazione della linea di base e

linea di base dello spettro.

Nel programma ChromNAV ci sono 3 differenti significati per la linea di base. Prestare

attenzione leggendo questa sezione a non fare confusione.

1) Linea di base dei picchi cromatografici

2) Linea di base del cromatogramma

3) Linea di base dello spettro

1.9.1 Linea di base dei picchi cromatografici La linea di base dei picchi cromatografici è la linea utilizzata dal programma per il calcolo

dell’area o dell’altezza del picco, ottenuta attraverso l’0algoritmo del programma o definita in

modo manuale dall’operatore. Normalmente, questo tipo di linea di base è chiamata

semplicemente “Linea di base”. Quindi quando ci sarà possibilità di fare confuzione, la

chiameremo “linea di base del picco cromatografico”. Quando utilizzeremo i termini

“baseline edge” e “baseline deletion”, intenderemo la linea di base sopra descritta.

1.9.2 Linea di base del cromatogramma Nelle miusre HPLC, è necessario condizionare il sistema prima di eseguire le iniezioni.

Durante la fase di condizionamento, il segnale del rivelatore dove essere una linea piatta, una

volta raggiunto il perfetto equilibrio. Questo segnale è assegnato come linea di base. Vedere la

sezione “7.1.2 Starting Monitor” relativa al condizionamento.

1.9.3 Linea di base dello spettro Quando acquisiamo uno spettro utilizzando i rivelatori UV o CD, La linea di base dello

spettro (background dello spettro) deve essere acquista prima della misura spettrale. Al termine

della misura spettrale, il dato visualizzato sarà il risultato della sottrazione: misura dello spettro

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– misura della linea di base. Questo tipo di linea di base verrà definita come linea di base dello

spettro.

La misura dello spettro e della sua linea di base può essere programmata dal programma dei

vari rivelatori nel metodo di controllo di ChromNAV. O premendo semplicente il pulsante quando richiesto.

1.10 Chiave di protezione del programma

Il programma ChromNAV è fornito con una chiave di protezione per ogni licenza acquistata.

(mentre l’opzione ChromNAV GPC ha un’altra chiave di protezione). Non rimuovere la chiave

o le chiavi dal PC, mantenerle sempre collegate. Non è possible utilizzare il programma You

cannot use ChromNAV (e l’estenzione ChromNAV GPC) senza le relative chiavi di protezione.

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Se le chiavi di protezione vengono rimosse durante l’acquisizione di

una sequenza, il programma ChromNAV arresta immediatamente

l’acquisizione del dato, bloccherà la sequenza e arresterà lo

strumento.

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2 Avvio e Chiusura del programma ChromNAV

2.1 Avvio di ChromNAV

Per avviare il programma ChromNAV, aprire la finestra [Control Center]. Selezionare il

sistema HPLC o la modalità di analisi che dovrà essere utilizzata, ed aprire la finestra di

[ChromNAV]. La finestra [ChromNAV] rappresenta il corpo principale del programma

ChromNAV, da cui è possibile acquisire o elaborare dati. Nella finestra [Control Center]

Window, è possibile selezionare il sistema HPLC ed attivare l’utente registrato ed il sistema

cromatografico.

2.1.1 Avvio della finestra [Control Center]

Per avviare la finestra [Control Center], fare un doppio clic sull’icona o selezionare dal

menu [Start] > [All Programs] > [Jasco] > [ChromNAV] > [ChromNAV Control Center].

Inserire il nome dell’utente e la password, e cliccare sul pulsante [Logon] per accedere alla

finestra [Control Center].

2.1.2 Avvio della finestra [ChromNAV] Vedere la sezione “0 Come selezionare il sistema HPLC da utilizzare”

2.2 Come selezionare il sistema HPLC da utilizzare

Nel programma ChromNAV, possono essere controllati fino a 4 sistemi HPLC. Dalla finestra

[Control Center], cliccando sulle icone [ChromNAV] > [Start ChromNAV] verranno visualizzati

I sistemi HPLC registrati. Cliccando sul sistema che dovrà essere utilizato si aprirà la finesra del

programma [ChromNAV]. Se l’operatore vuole utilizzare solo la sezione di analisi dei dati senza

utilizzare un sistema HPLC, fare un doppio clic sul pulsante [Start in Ana. Mode].

Se l’operatore vuole utilizzare simultaneamente più sistemi HPLC, o utilizzare la sezione di

analisi dei dati mentre acquisisce cromatogrammi da un sitema, tornare alla finestra [Control

Center], lasciando aperta la finestra corrente di [ChromNAV], e selezionare il secondo sistema

da utilizzare o fare un doppio clic sul pulsante [Start in Ana. Mode].

�%����%����%����%���IIII����

Quando si utilizzano più sistemi HPLC, verranno aperte le

corrispondenti finestra di [ChromNAV]. La finestra di [ChromNAV]

per l’analisi dei dati può essere aperta mentre il sistema HPLC è in

uso.

In entrambi i casi, la finestra di dialogo [Open Project] Dialog Box apparirà per prima. In

��

������

questa finestra di dialogo selezionare il progetto esistente che verrà aperto dalla finestra di

[ChromNAV]. Per maggiori dettagli vedere la sezione “4.2 Come creare un Progetto”

2.3 Chiusura di ChromNAV

�--�����)��--�����)��--�����)��--�����)�IIII����

Il programma ChromNAV non può essere chiuso mentre è in corso

una Sequenza di analisi. Aspettare il termine della sequenza o

arrestare la sequenza premendo il pulsante [STOP], quindi chiudere

il programma ChromNAV.

Per chiudere ChromNAV, andare sul menu [File] della finestra [ChromNAV] e selezionare

l’opzione [Exit]. La finestra di [ChromNAV] verrà chiusa.

Quindi andare sul menu [Operation] Menu > selezinare [Exit] dalla fienstra [Control Center]

o premere il pulsante [X]. La finestra [Control Center] verà chiusa.

�����%)���������%)���������%)���������%)����IIII����

Quando sono aperte più fineste di [ChromNAV], la finestra [Control

Center] non potrà essere chiuso fino a quando tutte le finestre

[ChromNAV] non saranno state chiuse.

��

���$��

3 Impostazioni in ChromNAV e in CONTROL CENTER Le impostazioni come la reistrazione degli utenti e dei sistemi HPLC devono essere effettuate

dalla finestra [Control Center]. La finestra [Control Center] appare dopo aver cliccato sull’icona

[ChromNAV] situata sul desktop di Windows.

Le funzioni del [Control Center] sono le seguenti:

1) Avvio di ChromNAV (Start ChromNAV)

2) Vista dei Progetti (Project View)

3) Progetti (Project)

4) Utenti (User)

5) Controllo dell’interfaccia (LC-NetII/ADC)

6) Sistemi HPLC (HPLC System)

7) Libreria spettrale (Spectra Library)

8) Controllo del registro di sistema (System Log View)

9) Controlo del registro delle Applicazioni (Application Log View)

10) Informazioni sul sistema (Sytem Info).

11) Controlli di Sicurezza del sistema (System Policy)

3.1 Avvio di ChromNAV (Start ChromNAV)

La figura seguente viusalizza la selezione dei sistemi HPLC e l’avvio del programma

ChromNAV.

procedura

1) Dalla Finestra [Control Center], cliccare sulle icone [ChromNAV] > [Start ChromNAV].

Figura 3-1 Avvio di ChromNAV

��

���&��

2) Fare un doppio clic sull’icona del sistema HPLC o sull’icona [Start in Ana. Mode]

visualizzate in alto sul lato destro. Quindi, comparirà la finestra [ChromNAV] assieme

alla finestra di selezione del Progetto [Open Project].

Figura 3-2 finestra di dialogo [Open Project] e finestra principale di [ChromNAV]

3.2 Nomi dei Files

Il programma ChromNAV permette di utilizzare caratteri alfanumerici e alcuni simboli per I

nomi dei progetti, I nomi degli utenti, metodi e nomi cromato grammi.

�--�����)��--�����)��--�����)��--�����)�IIII����

Il nome dei files non deve contenere caratterici come:

(backslash) / ; * ? " < > |

3.3 Vista dei Progetti (Project View)

Questa videata compare quando premiamo il pulsante [ChromNAV] quindi l’icona Project

List dalla finestra [Control Center]. Il monitor presenta la Lista dei Progetti. Da questa videata

possiamo avviare l’opzione Project Manager.

Procedura

1) Dalla finestra [Control Center], clicare sul pulsante [ChromNAV] quindi sull’icona

[Project List].

��

���+��

Figura 3-3 Lista Progetti

3.4 L’opzione Project Management

Dalla finestra [Control Center], cliccare sul pulsante [Management Tools] quindi sull’icona

[Project List]. A questo punto l’operatore potrà creare un nuovo Progetto. Per maggiori dettagli

vedere la sezione “4.2 Come crerae un Progetto.” Da questa videata sarà possibile avviare

l’opzione Project Manager.

�--�����)��--�����)��--�����)��--�����)�IIII����

Il noime del Progetto non potrà mai essere cambiato una volta

creato. Nel programma ChromNAV, l’operatore può creare un nuovo

Progetto con lo stesso nome di un Progetto già esistente. Tuttavia si

raccomanda di evitare l’utilizzo dello stesso nome per progetti

differenti.

Procedura

1) Dalla finestra [Control Center], premere il pulsante [Management Tools]

quindi cliccare sull’icona [Project].

��

���.��

Figura 3-4 Opzione Project Management

2) Nella parte in alto a destra di questa fienstra, cliccare il tasto destro del mouse e

selezionare [New] dal menu di popup. Compare la finestra di dialogo seguente

[New Project].

Figura 3-5 Fiestra di dialogo [New User]

3) Nel caso sia installata l’opzione GPC MW per il calcolo dei pesi molecolari, è

possibile selezionare il tipo di progetto nel Project Type. Inserire il nome del

progetto nel campo [Project Name] ed una descrizione nel campo [Description

(se necessario)], quindi cliccare sul pulsante [New].

��

���/��

3.5 Opzione User Management

Nella finestra [Control Center], cliccare sul pulsante [Management Tools] quindi l’icona

[user], comparirà la finestra di fig. 3-6. A questo punto l’operatore può creare una lista di Utenti

autorizzati all’utilizzo del programma.

%���%���%���%�����������������������������������

Nel programma ChromNAV, non ci sono differenze nei privilegi e

permessi di ogni utente. Tutti i parametri del Progetto possono

essere modificati, ed ogni utente può utilizzare il Progetto. Tuttavia,

le informazioni relative a chi ha creato i Metodi e a chi ha esguito

misure vengono registrate ed abbinate al nome dell’utente.

�--�����)��--�����)��--�����)��--�����)�IIII����

Per il nome dell’Utente E’ vietato utilizzare i seguenti caratteri:

(backslash) / : * ? " < > |.

�--�����)��--�����)��--�����)��--�����)�IIII����

Se un Utente dimentica la sua Password, non potrà pIù entrare nel

programma. NON DIMENTICARE MAI LA PASSWORD.

Procedura

1) Dalla Fienestra [Control Center], premere il pulsante [Management Tools]

quindi clicacre sull’icona [User].

�Figura 3-6 Fienstra User Management

��

���0��

2) Nella parte alta a destra della finestra, cliccare con il destro del mouse e

selezionare [New] dal menu di popup. Comparirà la seguente finestra di

dialogo.

Figura 3-7 Finestra di dialogo [New User]

3) Inserire il nome dell’utente che verrà visualizzato [User Name], il nome intero

[Full Name], la sua password [Password], rinserire la password [Retype

Password], infine cliccare sul pulsante [Create]. Assicurarsi di inserre la stessa

password nel campo [retype Password].

%����������%����������%����������%����������IIII����

Non è possibile cambiare il nome dell’utente dopo la sua creazione.

Se il nome dell’utente deve essere cambiato, è necessario

rimuovere il nome utente corrente quindi crearne uno nuovo.

�--�����)��--�����)��--�����)��--�����)�IIII����

Ogni nome utente una volta utilizzato non può più essere utilizzato

per altri nuovi utenti.

%����������%����������%����������%����������IIII����

Vedere la sezione “3.12 Controlli di Sicurezza del sistema”

relativamente alla lunghezza ammessa della password, alla sua

durata ecc..

3.5.1 Come cambiare la Password La password può essere solo cambiata quando il programma è stato aperto dall’utente

interessato (entrando con il suo nome e relativa password)

��

���2��

Procedura

1) Dal menu della finestra [Control Center], selezionare l’opzione [Operation] e

quindi [Change Password of Logon User]. Compare la seguente finestra di dialogo

[Change Password].

Figura 3-8 Finestra di dialogo [Change Password]

2) Inserire la password attuale nel box [Current Password], digitare la nuova

password nel campo [New Password], quindi confermare la nuova password nel

campo [Retype New Password].

3.6 Impostazioni dell’interfaccia LC-NetII/ADC

Nella finestra [Control Center], cliccare sul pulsante [Management Tools] e successivamente

sull’icona [LC-NetII/ADC]. A questo punto sarà possibile registrare una nuova interfaccia

LC-NetII/ADC.

�--�����)��--�����)��--�����)��--�����)�IIII����

Normalmente questa operazione viene eseguita dal personale

tecnico durante la fase di installazione e configurazione del

programma. Nel caso sia necessario modificare la registrazione

successivamente all’installazione, effettuare questa procedura con

molta attenzione.

Procedura

1) Dalla finestra [Control Center], cliccare sul pulsante [Management Tools] e

successivamente sull’icona [LC-NetII/ADC].

��

���5��

Figura 3-9 impostazione interfaccia LC-NetII/ADC

2) Nella parte alta a destra della fienstra, cliccare con il destro del mouse e

selezionare [New] dal menu di popup. Comparirà la seguente finestra di dialogo:

[Register LC-NetII/ADC].

Figura 3-10 finestra di dialogo [Register LC-NetII/ADC].

3) Digitare il “MAC address” dell’interfaccia LC-NetII/ADC che verrà utilizzata,

quindi cliccare sul pulsante [Register].

3.7 Impostazioni dei sistemi HPLC

Dalla finestra [Control Center], cliccare sul pulsante [Management Tools] e successivamente

sull’icona [HPLC System]. Il programma ChromNAV permette di registrare fino a 4 sistemi

HPLC. Fatta eccezione per casi particolari, ad ogni sistema HPLC deve essere assegnata un

interfaccia LC-NetII/ADC. Per questa ragione l’interfaccia LC-NetII/ADC deve essere stata

registrata precedentemente a questa operazione.

��

������

�--�����)��--�����)��--�����)��--�����)�IIII����

Normalmente questa operazione viene eseguita dal personale

tecnico durante la fase di installazione e configurazione del

programma. Nel caso sia necessario modificare la registrazione

successivamente all’installazione, effettuare questa procedura con

molta attenzione.

Procedura

1) Dalla fienstra [Control Center], cliccare sul pulsante [Management Tools] e

successivamente sull’icona [HPLC System].

Figura 3-11 Impostazione dei sistemi HPLC

2) Nella parte in alto a destra dello schermo, cliccare con il destro del mouse e

selezionare [New] dal menu di popup. Comparirà la finestra di dialogo [HPLC

System Registration].

��

������

Figura 3-12 Finestra di dialogo [HPLC System Registration].

3) Inserire le impostazioni desiderate in accordo alla configurazione del sistema

che dovrà essere resgistrato. Vedere la sezione “3.7.1 Impostazione dei sistemi

HPLC” per maggiori dettagli. Modificare le impotsazioni e confermare con il

pulsante [OK].

3.7.1 Impostazione dei sistemi HPLC I punti che devono essere impostati nella finestra di dialogo [HPLC System Registration] Dialog

sono elencati nella tabella seguente.

HPLC System Name Nome del sistema HPLC. Evitare di utilizzare lo stesso nome

per altri sistemi utilizzati dallo stesso programma ChromaNAV.

Selected LC-NetII/ADC Specificare il “MAC address” dell’interfaccia LC-NetII/ADC

designata al controllo del sistema HPLC ed all’acquisizione del

segnale cromatografico.

Una volta assegnato il “MAC address”, l’indirizzo IP

dell’interfaccia verrà visualizzato nel campo sottostante “IP

Address”.

Sampling Interval Permette di inserire l’intervallo di campionamento del segnale

cromatografico. Tutti I canali devono avere lo stesso intervallo

di acquisizione.

Data Channel Settings Attivare I canali dell’interfaccia che verranno utilizzati dal

sistema HPLC, quindi impostare il loro fondo scala nel campo

[Full Scale]. Se l’unità di misura della scala è settata in uV, non

��

���$��

è necessario impostarla . ( Come default il fondo scala sarà

1.000.000uV )

Se devono essere utilizzate altre unità di misura, modificare le

impostazioni del campo [Full Scale] e [Unit]. Il fondo scala dei

canali è di 1.000.000uV. Se l’operatore intende utilizzare altre

unità di misura, modificare il valore di fondo scala..

Esempio: Se utilizziamo un rivelatore UV detector dove il

valore del fondo scala dell’uscita analogica è di 1.0V = 1.0AU e

l’operatore vuole utilizzare AU come unità di misura, sezionare:

Full Scale: 1

Unit: AU

Start Mode Normalmente viene selezionata l’opzione [LC-NET II/ADC

(Start On Injection)] dal menu a tendina. L’avvio

dell’acquisizione del segnale cromatografico avverrà nel

momento in cui l’interfaccia riceve il segnale dell’iniezione.

Solo nel caso si utilizzi un rivelatore PDA e nessun altro

modulo HPLC è utilizzato, selezionare l’opzione [PDA Only

(Start On Injection)]. In questo caso, non è necessario impostare

[Selected LC-Net II/ADC], [Sampling Interval], e [Data

Channel Settings]. Gli altri moduli sono inattivi e nessun altro

modulo potrà essere selezionato fatta eccezione per il rivelatore

PDA. Le altre opzioni disponibili come [LC-Net II/ADC

(Timed Start)] e [PDA Only (Timed Start)] vengono utilizzate

per applicazioni spaciali come i sistemi di estrazione

supercritica (SFE). In questo caso i dati verranno acquisiti in

continuo senza bisogno del segnale di iniezione.

HPLC Devices Attivare i moduli HPLC che compongono il sistema

cromatografico che verrà utlizzato, selezionando il nome del

modello. Il nome del modello può essere trascurato, tuttavia, se

viene impostato in modo corretto, il programma ChromNAV

imposterà automaticamente il valore dei parametri in accordo al

modulo selezionato. Ogni modulo no attivato in questa tabella,

non può essere controllato dal programma.

��

���&��

�--�����)��--�����)��--�����)��--�����)�IIII����

Se non viene visualizzato l’indirizzo IP e l’interfaccia LC-Net II/ADC è

collegata e accesa, provare a resettare l’interfaccia spegnendola e

riaccendendola di nuovo, o controllare l’impostazione degli indirizzi

IP della scheda di rete utilizzata.

3.7.2 Modifica delle impostazioni del sistemi HPLC Modifica delle impostazioni dei sistemi HPLC.

Vedere la sezione “3.7 Impostazioni dei sistemi��� � “ per maggiori dettagli relativi alla

registrazione del sistema HPLC.

�--�����)��--�����)��--�����)��--�����)�IIII����

Se vengono commessi errori nelle impostazioni dei sistemi HPLC, il

sistema non verrà controllato ed il dato non sarà acquisito. Quando è

necessario modificare le impostazioni, utilizzare accuratemante

questa procedura.

Procedura

1) Dalla finestra [Control Center], cliccare sul pulsante [Management Tools] e

successivamente sull’icona [HPLC System].

Figura 3-13 Impostazione dei sistemi HPLC

��

���+��

2) Le icone dei sistemi HPLC registrati compaiono sul lato destro dello schermo, con

il destro del mouse selezionare il sistema da modificare e selezionare l’opzione

[Edit] dal menu di popup. Comparirà la seguente finestra di dialogo: [HPLC

System Settins].

Figura 3-14 fienstra [HPLC System Settings].

Modificare le impostazioni come riportato nella sezione “3.7.1 Impostazione dei sistemi

HPLC”. Infine confermare le modifiche cliccando il pulsante [OK].

�--�����)��--�����)��--�����)��--�����)�IIII����

Una volta impostata l’opzione “Start Mode”, questa non potrà più

essere modificata. Per cambiare lo Start Mode, il sistema HPLC

deve essere rimosso e creato un nuovo sistema, quindi registrato

con l’opzione Sart Mode desiderata.

3.7.3 Impostazioni diagnostiche “Device Diagnosis” Ogni sistema HPLC produce le proprie informazioni diagnostiche. In questa sezione

l’operatore può definire quali informazioni dovranno essere fornite. Il valore standard ed I livelli

di AVVISO (Warning Level), possono essere inseriti per ogni punto.

I Valori del Warning Level e le operazioni conseguenti sono riportate di seguito. Tutte le

informazioni diagnostiche possono essere riviste e controllate attraverso l’opzione “Diagnosis

View”.

��

���.��

Ignore L’informazione verrà visualizzata, ma nessun altra operazione verrà eseguita.

Warning Nel caso il valore dell’operazione ecceda il valore standard impostato,

l’informazione verrà registrata nella sezione Application Log.

Error Quando l’operazione eccede il valore standard impostato, l’analisi viene fermata

al completamento dell’acquisizione in corso. Quando accade questo, verrà

visualizzato un messaggio di errore nella barra di stato e l’evento verrà registrato

nella sezione Application Log.

Procedura

1) Dalla fienstra [Control Center], cliccare sul pulsante [Management Tools] e

successivamente sull’icona [HPLC System].

Figura 3-15 Impostazion i dei sistemi HPLC

2) Le icone dei sistemi HPLC registrati compariranno nella parte in alto a destra

dello schermo. Cliccare con il destro del mousesull’icna del sistema e selezionare

l’opzione [Set Device Diagnosis] dal menu di popup. Successivamente comparirà

la finestra di dialogo [Set Device Diagnosis].

��

���/��

Figura 3-16 Finestra di dialogo Setting Device Diagnosis.

3) I moduli registrati ed i punti diagnostici verranno visualizzati in questa finestra.

Inserire le impostazioni desiderate come valori standard [Standard Value] e livelli

di AVVISO [Warning Level].

4) Modificare le impostazioni e confermare con il pulsante [OK]. Se clicchiamo sul

pulsante [Default], tutti i valori standard verranno riporati alle condizioni di

origine impostate dal costruttore.

%����������%����������%����������%��������������

I valori di default sono valori convenienti per l’operatore. E’

consigliabile avviare il sistema con I valori di default,

successivamente quando l’operatore avrà familiarizzato con il

sistema, potrà inserire valori personalizzati.

�--�����)��--�����)��--�����)��--�����)�IIII����

Se la temperatura del forno colonne è impostata per cambiare

durante la corsa cromatografica nel Metodo di Controllo, impostare

[Ignore] nella sezione [Temperature Deviation] o inserire un valore

più alto per le impostazioni standard, per evitare segnalazioni di

errore indesiderate. Il valore di variazione della temperatura

[Temperature Deviation] è calcolato sottraendo la temperatura

minima registrata da quella massima.

��

���0��

3.8 Controlli sulle Librerie Spettrali “Spectral Library”

Dalla finestra [Control Center], cliccare sul pulsante [Management Tools] successivamente

sull’icona [Spectral Library], comparirà la finestra seguente:

Procedura

1) Dalla finestra [Control Center], cliccare sul pulsante [Management Tools] e

successivanete sull’icona [Spectra Library]. Nella parte in alto a destra compare la

sezione [Spectral Libray].

Figura 3-17 Sezione Spectral Library

3.9 Opzione System Log View

Dalla fienstra [Control Center] Window, cliccare sul pulsante [Management Tools] e

successivamente sull’icona [System Log View], compare la sezione System Log.

System Log

Icons Vengono utilizzate icone differenti per rappresentare diversi tipo di

messaggio. rappresenta un informazione normale. rappresenta

un informazine relativa ad un messaggio di AVVISO rappresenta un errore del sistema.

Date Visualizza la data e l’ora relativa all’evento registrato.

Message Visualizza il contenuto (messaggio) dell’evento registrato.

User Visualizza il nome dell’utente.

System Visualizza il nome del sistema HPLC relativo all’evento registrato.

��

���2��

Nel caso si sia entrati in Analysis Mode, questo box rimarrà in bianco.

Computer Name Visualizza il nome del computer relativo all’evento registrato.

Procedura:

1) Dalla finestra [Control Center], cliccare sul pulsante [Management Tools] e

successivamente sull’icona [System Log View]. Compare la videata [System Log] sulla

parte in alto a destra del monitor.

Figura 3-18 Sezione System Log.

3.10 Opzione Application Log View

Dalla finestra [Control Center], cliccare sul pulsante [Management Tools] e successivamente

sull’icona [Application Log View]. Compare la finestra [Application Log].

Application Log

Icons Vengono utilizzate icone differenti per rappresentare diversi tipo di

messaggio. rappresenta un informazione normale. rappresenta

un informazine relativa ad un messaggio di AVVISO rappresenta un errore del sistema.

Date Visualizza la data e l’ora relativa all’evento registrato.

Message Visualizza il contenuto (messaggio) dell’evento registrato.

User Visualizza il nome dell’utente.

System Visualizza il nome del sistema HPLC relativo all’evento registrato. Nel

��

��$5��

caso si sia entrati in Analysis Mode, questo box rimarrà in bianco

Computer Name Visualizza il nome del computer relativo all’evento registrato.

Procedura:

1) Dalla finestra [Control Center], cliccare sul pulsante [Management Tools] e

successivamente sull’icona [Application Log View]. Le icone relative ai progetti

compariranno sulla parte in alto a destra. Cliccare sul Progetto desiderato per visualizzare

i log registrati.

Figura 3-19 Opzione Applicatioin Log View

3.11 Opzione System Information

Dalla fienstra [Control Center], cliccare sul pulsante [Management Tools] e successivamente

sull’icona [System Info.]. Le informazioni relative ai files installati del programma

ChromNAV verranno visualizzate come “System Information”.

Filename Visualizza I nomi dei file relativi ai componenti installati.

Version Visualizza la versione # dei file installati.

Size Visualizza la dimensione dei file installati.

Update Date Visualizza la data e l’ora degli aggiornamenti installati.

��

��$���

Procedura

1) Dalla finestra [Control Center], cliccare sul pulsante [Management Tools] e

successivamente sull’icona [System Info.].

Figura 3-20 Opzione System Information

%���(�������%���(�������%���(�������%���(�����������

Se alcuni files sono persi, verranno visualizzati in rosso.

3.12 Opzione System Policy

Dalla finestra [Control Center], cliccare sul pulsante [Management Tools] e successivamente

sull’icona [System Policy]. Questa sezione consente di impostare le regole di inserimento e

durata della password.

Password Expired Inserire il periodo di validità della password in giorni. Il sistema

controlla il periodo di durata quando l’utente è connesso.

Password Length Consente di inserire il limite minimo di caratteri da utilizzare per

l’inserimento della password. Anche dopo che il numero verrà

cambiato, le password registrate in precedenza rimarranno valide.

��

��$���

Procedura

1) Dalla finestra [Control Center], cliccare sul pulsante [Management Tools] e

successivamente sull’icona [System Policy].

Figura 3-21 Opzione System Policy

2) Cliccare sulla linea del punto che si intende impostare, comparirà il box di

dialogo: [System Policy].

Figura 3-22 Finestra di dialogo System Policy

3) Cambiare le impostazioni e confermare la selezione premendo il pulsante

[OK].

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��$$��

4 Cosa sono i Progetti (Project) Nel programma ChromNAV, i Progetti sono utilizzati per l’acquisizione dei dati e la loro

elaborazione. Quando apriamo il programma, dalla finestra [ChromNAV], il Progetto da

utilizzare deve essere selezionato.

Il Progetto rappresenta un’unità di lavoro. Tutte le informazioni come i metodi e i dati

acquisiti ed eleborati sono immagazzinate nel Progetto. Tutto il lavoro può essere svolto da un

singolo Progetto, tuttavia, si raccomanda di creare Progetti multipli in accordo alla natura

dell’analisi.

Vedere la sezione “4.1 Come utilizzare un Progetto”.

Un Progetto contiene le seguenti informazioni:

1) Cromatogrammi incluso le informazioni diagnostiche.

2) Varie tipologie di Metodi.

3) Curve di Calibrazione (queste sono contenute nei Metodi di Calibrazione).

4) Preferenze

La struttura di un Progetto può essere rappresentata come segue:

Figura 4-1 Struttura del Progetto

I files creati in un Progetto non possono essere assegnati ad un altro Progetto.

%����������%����������%����������%��������������

Considerando che i files creati in un determinato Progetto non

possono essere utilizzati da un Progetto differente, si raccomanda di

condividere lo stesso Progetto tra vari utilizzatori che potranno

utilizzare di conseguenza gli stessi metodi di lavoro. In pratica il

Progetto identifica il tipo di Analisi da eseguire condivisa dagli utenti

facente parte dello stesso gruppo di lavoro.

��

��$&��

Lo stesso Progetto può essere utilizzato su più sistemi HPLC. Se si utilizza un singolo PC per

controllare più sistemi cromatografici, e lo stesso Progetto deve essere applicato alle analisi di

piuù sistemi, non è necessario creare Progetti separati.

4.1 Come utilizzare un Progetto

In questa sezione, viene descritta la strada migliore per utilizzare un Progetto.

4.1.1 Classificazione dei Progetti per tipo di Applicazione Nel programma ChromNAV, il Progetto è considerato un unità di lavolro. Per questa ragione

la strada comune per classificare i Progetti è per tipo di Applicazione.

Gli utilizzatori possono condividere i metodi e gli altri dati nel caso venga utilizzato lo stesso

Progetto. Questo è conveniente nel caso che più utilizzatori esguono la stessa analisi. Come

conseguenza lo stesso Progetto può essere utilizzato in diverse finestre di [ChromNAV], dati

precedenti possono essere ricanalizzati mentre si acquisiscono nuovi cromatogrammi. Nel caso i

Progetti vengano classificati per Utente, non sarà possibile condividere i Metodi ed altri dati,

anche nel caso utenti diversi effetuino la stessa analisi.

%����������%����������%����������%��������������

In questo caso, i Progetti possono essere riorganizzati nella sezione

[ Project Manager] per condividere metodi e dati cromatografici.

4.1.2 Classificazione dei Progetti per Utilizzatore Questo tipo di classificazione, può essere conveniente quando gli utilizzatori hanno un lavoro

ben definito e differente tra loro.

In questo caso, l’utilizzatore non può far riferimento ad altri metodi e dati contenuti in un

altro Progetto, e conseguentemente non potrà confrontare i propri dati rispetto ad altri acquisiti

con Progetti differenti.

%����������%����������%����������%��������������

Rogetti diversi possono essere aperti in diverse finestre di

[ChromNAV].

4.1.3 Classificazione dei Progetti per settimana/mese Nel caso si analizzi un elevata quantità di campioni, una grande quantità di dati verrà accumulata

in un piccolo periodo di tempo. In questo vaso potrebbe essere conveniente classificare i Progetti per

settimana o mese in modo da manipolare agevolmente un agrande quantità di dati.

��

��$+��

�--�����)��--�����)��--�����)��--�����)�IIII����

Se i Progetti vengono classificati per settimana o mese, non è

possibile confrontare i dati acquisiti in precedenza con il vecchio

Progetto con i dati acquisiti dal Progetto attuale.

%������%������%������%��������������������������

Diversi Progetti possono essere aperti in differenti finestre di

[ChromNAV].

E’ raccomandabile classificare i Progetti su un ampio periodo di tempo. Nel sistemi di

acquisizione convenzionali, l’operatore deve selezionare la cartella per immagazzinare i dati in

modo che questi possono essere ritrovati in modo agevole quando richiesto. Nel programma

ChromNAV, viene offerta una via più semplice per trovare i dati memorizzati. In ChromNAV, i

dati misurati comprendono il dato cromatografico di tutti i canali utilizzati , tutti i canali

PDA e tutti i dati vengono legati alla Sequenza di Analisi effettuata.

4.2 Come creare un Progetto

E’ possibile creare un nuovo Progetto dalla finestra Control Center. Per maggiori dettagli,

vedere la sezione “3.4 :�")��������;��������������.”

4.3 Apertura di un Progetto

Quando apriamo la finestra di [ChromNAV], un Progetto di lavoro deve essere selezionato.

Nella finestra [Control Center], cliccare sul pulsante [ChromNAV], e successivamente

sull’icona [Start ChromNAV], quindi fare un doppio clic sull’icona del sistema HPLC o

selezionare [Start in Ana. Mode], infine compare la finestra di dialogo per la selezione del

Progetto [Open Project] prima di arrivare alla fienstra di programma [ChromNAV].

��

��$.��

Figura 4-2 Finestra di dialogo [Open Project]

Nella finestra di dialogo, possono essere visualizzati i Progetti utilizzati di recente

selezionado la cartella [Recently Used Projects] o tutti i Progetti disponibili selezionando la

cartella [All Available Projects] (nel caso sia installata l’opzione ChromNAV GPC, avremo a

disposizione anche la cartella [All GPC Projects] ). Selezionare il Progetto che dovremo

utilizzare e cliccare sul pulsante [Open] o fare un doppio clic sul nome del Progetto.

4.4 Impostazione del Progetto

Utilizzando l’opzione Project Manager, i files relativi ai metodi e le sequenze eseguite

possono essere importati. L’opzione Project Manager può essere avviata dalla finestra

[Control Center].

4.4.1 Avvio dell’opzione Project Manager Dalla finestra [Control Center], cliccare sul pulsante [ChromNAV] e successivamente

sull’icona [Project View], o cliccare su [Management Tools] e successivamente sull’icona

[Project]. Cliccare sull’icona situata nella barra degli strumenti, quindi compare la fienstra

[Project Manager].

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Figura 4-3 Fienstra [Project Manager]

4.4.2 Apertura di un Progetto Andare sul menu [File] > [Project] e selezionare l’opzione [Open] o cliccare sull’icona

per selezionare il Progetto, successivamente compare la finestra di dialogo [Open

Project]. Selezionare il Progetto da utilizzare e clicacre sul pulsante [Open]. Verranno

visualizzati la lista dei Metodi e delle Sequenze di Analisi eseguite e contenute nel Progetto

selezionato.

%����������%����������%����������%��������������

In questa sezione con la parola “Method” si intendono vari files di

impostazione contenuti in ChromNAV.

4.4.3 Apertura del Progetto di Riferimento “Reference Project” Andare sul menu [File] Menu > [Reference Project] e selezionare [Open] o cliccare sull’icona

per scegliere il Progetto di riferimento [Reference Project], quindi comparirà la finestra

di dialogo [Open Reference Project].

Selezionare il Progetto che dovrà essere utilizzato e cliccare sul pulsante [Open]. Verrà

��

��$0��

visualizzato un elenco relativo ai metodi ed alle sequenze di analisi eseguite, contenuti nel

Progetto di riferimento.

4.4.4 Importazione di un Metodo Mentre apriamo un Progetto o un Progetto di rferimento, selezionare un Progetto o una

sequenza esguita nella finestra Reference Project, an dare sul menu [File] > selezionare

[Import] o cliccare sull’icona nella barra degli strumenti per importare il metodo

selezionato selezionato o una sequenza di analisi.

4.4.5 Cancellazione di un Metodo o di una sequenza di analisi Dall’elenco Project, selezionare un metodo o un file di una sequenza eseguita, andare sul

menu [File] > [Remove] o cliccare sull’icona , successivamente selezionare il metodo o la

sequenza che dovrà essere cancellata.

�--�����)��--�����)��--�����)��--�����)�IIII����

Una volta che un Metodo o una sequenza sono stati cancellati, non

sarà possibile in nessun modo recuperli.

4.4.6 Cambio del nome di un Metodo Dall’elenco Project, selezionare il nome del Metodo da rinominare, quindi selezionare dal

menu [File] > [Rename].

4.4.7 Importazione di un cromatogramma E’ possibile importare dati cromatografici in formato ASCII, AIA, Jasco-Borwin, e

Jasco-PDA.

Andare sul menu [File] > [Import Chromatogram], o cliccare sull’icona , quindi

selezionare l’opzione [Select Data Type]. Selezionare il tipo di dato e successivamente il file

da importare. Inserire Sequence Archive e premere il pulsante [Import].

4.4.8 Chiusura del Progetto Andare sul menu [File] > [Close All Projects] per chiudere i Progetti aperti. Se ci sono

alcuni Progeti di riferimento aperti, anch’essi verranno chiusi.

4.4.9 Uscita dall’opzione Project Manager Dalla finestra [Project Manager], andare sul menu [File] > [Exit] per uscire dall’opzione.

��

��$2��

5 ESEMPIO DI MISURA Questo capitolo descrive la strada più semplice per utilizzare il programma ChromNAV.

Preparazione della misura Avvio programma. Impostazioni necessarie.

Esecuzione della sequenza Avvio della misura dopo aver inserito i parametri

richiesti.

Apertura dei cromatogrammi Aprire i cromatogrammi acquisiti.

Integrazione dei picchi Come impostare i parametri richiesti per l’integrazione.

Identificazione dei picchi Come impostare i parametri per l’identificazione dei

picchi.

Analisi quantitativa Procedure richieste per l’analisi quantitative,

acquisizione degli standards, integrazione picchi,

identificazione picchi, costruzione della curva di

calibrazione e quantificazione dei campioni incogniti.

���!�(��*���*�������!�(��*���*�������!�(��*���*�������!�(��*���*����������������� A%��*��(��%��!�))��%����-�!���������J�K�"�((�4�!��

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5.1 Preparazione della misura

La procedura per ma misura e l’analisi quantitative è la seguente:

1) Condizionamento del sistema

2) Esecuzione della sequenza di acquisizione

3) Esecuzione ricalcolo e sequenza (quando i parametri di ricalcolo e quantificazione

non sono già stati inseriti nella sequenza di acquisizione)

4)

Per eseguire la fase di condizionamento ed equilibratura della colonna, l’utiizzatore dovrà

inserire il Metodo di Controllo. Per maggiori dettagli vedere la sezione “Errore. L'origine

riferimento non è stata trovata. Impostazione del Metodo di Controllo”. Vedere inoltre la

sezione “Errore. L'origine riferimento non è stata trovata. Avvio della visualizzazione” per

dare inizio alla fase di condizionamento.

I dettagli relativi ai parametri da inserire nella Sequenza di Acquisizione, vedere la sezione

“5.2.1 Come impostare una� �'%��)�� *�� ��'%�(�)�����”. Come avviare una Sequenza,

vedere la sezione “5.2 Come esguire una��'%��)��*����'%�(�)�����”.

Quindi vedere la sezione “5.4.7 Come creare una Sequenza di ricalcolo e la sua esecuzione”

��

��&5��

per eseguire i calcoli sui dati acquisiti.

%����������%����������%����������%��������������

I dettagli relative alle procedure per eseguire misure e calcoli

quiantitativi sono descritti nella sezione “5.4 Verifica del MNetodo

Quantitativo”.

5.1.1 Impostazione del Metodo di Controllo Dal menu File della finestra Acquisition, selezionare l’opzione [Method Editor] > [Control

Method], o in laternativa cliccare sull’icona , successivamente compare la finestra di

dialogo [Control Method Editor]:

�Figura 5-1 Finestra di dialogo [Control Method Editor] .

Come prima impostazione inserire il tempo del metodo nel campo [Method Time]. Il

parametro Method Time indica la durata del metodo di controllo. Normalmente indica il tempo

tra un iniezione e quella successiva.

Nella tabella Configuration, nella cartella [General], attivare con il simbolo di spunta, i

moduli che dovranno essere controllati da questo Metodo. Una volta attivati i moduli

desiderati, comparirà la cartella relativa a fianco della cartella [General].

Quindi, inserire le condizioni di analisi per ogni singolo modulo cromatografico come il

[Flow Rate] per la pompa [Pump], [Wavelength] per il rivelatore [UV] ecc..

��

��&���

Al termine delle impostazioni del Metodo, cliccare sull’icona della barra strumenti della

finestra [Control Method Editor]. Quindi compare la finestra di dialogo [Save As Control

Method].

Premendo il pulsante della barra strumenti della finestra [Control Method Editor] verrà

chiusa la finestra di dialogo.

5.1.2 Avvio della visualizzazione Dal menu [RUN] della fienstra Acquisition, selezionare l’opzione [Baseline Monitor], o

cliccare sull’icona , successivamente compare la finestra di dialogo [Baseline Monitor]:

Figura 5-2 Finestra di dialogo [Baseline Monitor]

I parametric da impostare sono i seguenti:

Control Method Metdo di Controllo da utilizzare durante la

visualizzazione della linea di base. La corsa

verrà eseguita alle condizioni iniziali impostate

nel metodo.

X-axis Scale Valore del fondo scala dell’asse X durante la fase

di visualizzazione della line adi base. Il valore

massimo inpostabile è di 180 min.

Premere il pulsante [OK] per avviare la visualizzazione.

Una volta avviata la procedura, lo stato del sistema HPLC, la linea di base, la linea di base del

rivelatore PDA (nel caso sia presente) verranno visualizzati a video nelle rispettive finestre

[System Monitor], [Chromatogram Monitor] e [PDA Monitor].

5.2 Come esguire una Sequenza di Acquisizione.

Nel programma ChromNAV, ogni misura deve essere avviata dalla finestra [Acquisition

Sequence].

L’acquisizione della Sequenza può avvenire da [Acquisition Queue]. Nella finestra

��

��&���

Navigation in [Acquisition], cliccare su [Acquisition Queue].

Dopo l’avvio di ChromNAV non viene visualizzato nulla nella fienstra [Acquisition Queue].

Andare sul menu [File] Menu > [Acquisition Sequence] e selezionare [Open] o cliccare

sull’icona della barra strumenti per aprire la finestra [Acquisition Sequence] che è già stata

impostata, quindi eseguirla.

5.2.1 Come impostare una Sequenza di Acquisizione. Dal menu File della finestra Acquisition, selezionare [Method Editor] > [Acquisition

Sequence Editor], o cliccare sull’icona , successivamente compare la finestra di dialogo

[Acquisition Sequence Editor].

Figura 5-3 Finestra di dialogo [Acquisition Sequence Editor].

In questo esempio, verranno analizzati 4 campioni diversi utilizzando lo stesso Metodo di

Controllo per la loro acquisizione.

Inserire tutti i punti necessary nella finestra di dialogo [Acquisition Sequence Editor]. Una

linea della tabella corrisponde ad un campione misurato. Conseguentemente sarà necessario

occupare 4 linee della tabella per la misura dei 4 campioni.

��

��&$��

Seguire la procedura sotto riportata:

Colonna [Type] Dalla lista selezionare [UNK] .

Colonna [Vial#] Specificare il numero del vial# che contiene il campione

da iniettare.

Colonna [Volume] Inserire il Volume di iniezione espresso in uL.

Colonna [Run Name] Nome del cromatogramma misurato.

Colonna [Acq. Time] Inserire il tempo di durata dell’acquisizione.

Colonna [Control] Assegnare il file creato in precedenza come Metodo di

Acquisizione.

�Figura 5-4 Esempio della Sequenza di Acquisizione creata con la procedura sopra descritta.

Al termine delle impostazioni della Sequanza di Acquisizione, cliccare sull’icona della

barra strumenti della fienstra [Acquisition Sequence Editor]. Successivamente compare la

fienstra di dialogo [Save As Acquisition Sequence].

Premendo sull’icona della barra strumenti della finestra [Acquisition Sequence Editor]

verrà chiusa la fienstra di dialogo.

5.2.2 Avvio della Sequenza di Acquisizione

Dal menu [Run] selezionare l’opzione [Run] o cliccare sull’icona . La Sequenza di

Acquisizione può essere avviata anche se la visualizzazione della linea di base è in corso.

�--�����)��--�����)��--�����)��--�����)�IIII����

La sequenza di Acquisizione non può essere avviata durante la fase di

impostazione dei parametri. L’inizio della Sequenza può avvenire solo al

termine della programmazione e solo dopo averla salvata.

Anche nel caso di un sistema manuale di iniezione o di un campionatore non controllato da

ChromNAV, selezionare l’opzione [Run] del menu [Run] o cliccare sull’icona per

avviare il processo di acquisizione. In questo caso la Sequenza di Acquisizione non verrà

avviata fino a quando non verrà inviato il segnale di iniezione.

��

��&&��

�--�����)��--�����)��--�����)��--�����)�IIII����

Nel caso si utilizzi un sistema di iniezione manuale o un campionatore non

controllato da ChromNAV, sarà possibile eseguire l’iniezione del campione

successivo solo dopo che l’acquisizione in corso sia stata terminata e il

tempo del Metodo di controllo sia giunto al termine, e quindi il sistema si

trovi nello stato di READY.

5.2.3 Visualizzazione dello stato della corsa Ogni linea della Sequenza di Acquisizione viusalizza lo stato della corsa utilizzando un

codice a colori.

1) La linea prima della corsa corrente sarà di colore Verde.

2) La linea del campione in preparazione sarà di colore Giallo.

3) La linea del campione attualmente in corsa sarà di colore Rosso.

4) La linea della corsa già completata sarà di colore Grigio Chiaro.

5) La line di un campione annullato sarà di colore Grigio Scuro.

5.2.4 Come riavviare la stessa Sequenza di Acquisizione Al termine della Sequenza il colore di tutte le linee sarà grigio. Per riavviare la stessa

Sequenza di Acquisizione (riniettare gli stessi campioni appena analizzati) selezionare l’opzione

[Reset] dal menu [Run], o ciccare sul pulsante . Successivamente il colore di tutte le linee

tornerà verde e pronto per la partenza di una nuova sequenza.

Quando viene ripetuta la stessa Sequenza di Acquisizione, il nome della corsa (Run Name)

non richiede di essere cambiato. Per maggiori dettagli vedere la sezione “1.4 Acquisizione ed

Esecuzione di una Sequenza� “.

%����������%����������%����������%��������������

Per arrestare l’eluizione del solvente, dal menu [Run] selezionare

l’opzione [Pump Stop], o cliccare sul pulsante , dopo che la

sessione di anlisi è stata completata.

��

��&+��

5.3 Operazioni di base per l’analisi dei risultati

5.3.1 Come aprire un cromatogramma I cromatogrammi possono essere aperti esclusivamente dalla finestra [Analysis]. Dalla

finestra [Analysis], andare sul menu [File] > [Open Chromatogram], o cliccare sul pulsante

, successivamente compare la finestra di dialogo [Open Chromatogram]:

Figura 5-5 Finestra di dialogo [Open Chromatogram]

Per aprire un cromatogramma:

1) Selezionare dalla lista il file di interesse relativo ad una sequenza di

acquisizione eseguita [Executed Sequence File], come visualizzato in Figura

5.6.

Figura 5-6 Selezione della Sequenza contenente i cromatogrammi da elaborare

2) Selezionare il cromatogramma desiderato dalla lista [Injection File]

��

��&.��

rappresentata in Figura 5.7.

Figura 5-7 Selezione del Cromatogramma

3) Cliccare sul pulsante [Open].

Ogni lista cambierà lo stile di visualizzazione quando premiamo i seguenti pulsanti:

Visualizza come icone.

Visualizza come lista semplice.

Visualizza nel dettaglio la lista includendo i nomi dei files, le date di aggiornamento e

altre informazioni.

Visualizzazione della lista ad albero.

E’ possibile aprire più cromatogrammi contemporaneamente. Quando viene aperto un

cromatogramma, il suo nome appare nella finestra Navigation nella sezione [Loaded

Chromatograms].

Come rimuovere un cromatogramma

Cliccare con il destroy del mouse sulla lista [Injection File], verrà visualizzato il menu

[Remove]. Utilizzare questo menu per rimuovere i cromatogrammi.

�--�����)��--�����)��--�����)��--�����)�����

Una volta rimosso un cromatogramma, non potrà più essere

utilizzato.

��

��&/��

%����������%����������%����������%��������������

Utilizzando [Project Manager], I cromatogrammi ed I Metodi

contenuti in un Progetto possono essere rimossi. Prima della

rimozione è possibile fare una copia di backup del Progetto. Quando

dobbiamo rimuovere un Progetto che potrebbe servire in futuro, per

guadagnare spazio sul disco, è consigliabile utilizzare la funzione

[Project Manager].

5.3.2 Come aprire più cromatogrammi Nel programma ChromNAV, è possibile aprire contemporaneamente più cromatogrammi.

Quando i cromatogrammi sono aperti, il loro nome appare nella finestra Navigation, nella

sezione [Loaded Injections].

�Figura 5-8 Cromatogrammi aperti

Il nome di un cromatogramma visualizzato in grossetto indica che è il cromatogramma attivo.

Vedere la sezione “5.3.3 Cromatogrammi Attivi”. I cromatogrammi ched sono stati processati o

elaborate, ma non ancora salvati, presenteranno il nome con il simbolo * come suffisso.

Cliccando con il destro del mouse sul nome del file verrà visualizzato il menu seguente di

popup:

Close Chromatogram Chiude i cromatogrammi.

Properties Visualizza le proprietà dei cromatogrammi.

Edit Sample Information Permette di inserire informazioni sul campione. E’ possibile

inserire le seguenti informazioni.

[Sample Name]

[Quantitation Factor]

[ISTD #1 - #16]

[Description] Da qui è possibile inserire la concentrazione dello standard

interno dopo la misura, o modificare le informazioni inserite e

��

��&0��

legate alla corsa cromatografica.

Description Permette di inserire commenti al cromatogramma.

Additional Information Permette di inserire informazioni aggiuntive al

cromatrogramma, come la copmposizione del solvente, il nome

della colonna ecc… E’ permesso ogni tipo di carattere.

Un codice “return” può essere inserito premendo i tasti [Ctrl] +

[Enter].

Edit Channel Name Permette di inserire il nome del canale sul cromatogramma.

Cliccare con il destro del mouse sulla sequenza di acquisizione eseguita, verrà visualizzato il

menu di popup che comprende l’opzione [Properties]. Se selezioniamo l’opzione [Properties],

verranno visualizzate le informazioni relative alla sequenza selezionata.

5.3.3 Cormatogrammi Attivi Con il programma ChromNAV, è possibile aprire contemporaneamente più cromatogrammi.

Tra quelli aperti è’ possibile rendere attivo un cromatogramma. Il cromatogramma attivo può

essere riprocessato e vengono visualizzate le informazioni sui picchi.

Figura 5-9 Cromatogramma Attivo

Nella sezione [Loaded Chromatograms] della finestra Navigation, il cromatogramma attivo è

visualizzato in grossetto.

Per selezionare un altro cromatogramma come attivo, fare un doppio clic del mouse sul suo

nome nella sezione [Loaded Chromatograms].

5.3.4 Impostazione del Metodo di calcolo ed identificazione dei picchi Per inegrare I picchi è necessario creare un Metodo di integrazione. Il Metdo di integrazione

comprende i parametri per determinare in modo corretto i limiti di integrazione del picco, come

considerare la linea di base durante la fase di integrazione del dato.

Quando si crea un Metodo di integrazione, può essere necessario verificare che il Metodo

creato operi correttamente sugli standard a diversa concentrazione e sui campioni incogniti.

Potrebbe essere necessario creare più metodi per ogni canale quando si opera con diversi

��

��&2��

rivelatori. Se necessario, è possibile utilizzare Metodi di integrazione differenti per i

cromatogrammi a diversa concentrazione.

Procedura

Aprire il cromatogramma selezionato. E’ conveniente avere tutti i cromatogrammi di interesse

aperti, per verificare che il Metodo soddisfi i requisiti di integrazione.

1) Selezionare dal menu [File] Menu > [Method Editor], quindi selezionare [Peak

Processing Method], o cliccare sull’icona , comparirà la finestra di dialogo

[Peak Processing Method Editor]. Verrà visualizzato il cromatogramma attivo.

Attraverso l’opzione a tendina [Channel(s)] sarà possibile visualizzare canali

differenti quando disponibili.

�Figura 5-10 Finestra di dialogo [Peak Processing Method Editor]

�E ��*� ��������"���������(������((��������!�������(%!�"%!(����� � ��

%���((�-����������"����!:�������)�����*���"���#�������%���������

"�����������"�(����J��*�����(%!�����(����-�(%�!�))����(%!����������������

��

��+5��

�Figura 5-11 finestra di dialogo [Peak Processing Method Editor]

3) Se il calcolo dell’integrazione non è soddisfacente, modificare i parametri e

cliccare nuovamente sul pulsante .

4) Se al contrario, i risultati soddisfano le attese, cliccare sul pulsante o

sul pulsante .

5) Per verificare se i parametri impostati siano applicabili anche a gli altri canali,

ca, cambiare il canale attraverso l’opzione [Channel(s)], quindi cliccare sul

pulsante . Nel caso i parametri soddisfino i requisiti di una corretta

integrazione per tutti i canali, salvare il set di parametri. In caso contrario

trovare I parametric corretti e salvarli con un nome differente, possibilmente che

ricordi il canali a cui sono applicati.

6) Clicare sul pulsante ed uscire dalla finestra di dialogo [Peak Processing

Method Editor] .

7) Andare nella sezione [Loaded Chromatograms] della finestra Navigation, e

cambiare il cromatogramma attivo.

��

��+���

8) Selezionare l’opzione [Peak Find] dal menu [Process], o cliccare sull’icona

. Successivamente compare la finestra di dialogo [Peak Processing].

Figura 5-12 Finestra di dialogo [Peak Processing]

9) Nella lista [Peak Find], cliccare sul campo [Peak Processing Method] di ogni

canale visualizzato, sulla destra verrà visualizzato il pulsante […]. Cliccare sul

pulsante e selezionare il Metodo di integrazione desiderato e preparato

precedentemente. Se non abbiamo assegnato nessun metodo di integrazione al

canale, il cromatogramma corrispondente non potrà essere integrato. In questo

esempio, il nostro interesse è focalizzato unicamente all’integrazione, quindi gli

altri parametri presenti non verranno impostati. Cliccare sul pulsante [Run] della

sezione [Peak Find].

10) Successivamente verranno visualizzati i risultati ottenuti dall’integrazione.

Controllare i risultati, e nel caso siano soddisfacenti, rendere attivo il

cromatogramma successivoi ed applicare la stessa procedura. Nel caso i risultati

non soddisfino i requisiti di integrazione desiderati, tornare al punto 2), e

modificare i parametri nel Metdo di integrazione.

11) Ripetere quanto sopra fino ad ottenere risultati soddisfacenti.

��

��+���

5.3.5 Come creare la Tabella di Identificazione ed identificare i picchi Una volta creato il Metodo di Integrazione, è necessario creare la Tabella di identificazione

dei picchi. Nella Tabella di Identificazione, è necessario specificare il nome ed il tempo di

ritenzione del picco (tR).

Procedura

1) Andare sul menu [File] > [Method Editor], e selezionare [Peak ID Table], o

cliccare sul pulsante , successivamente compare la finestra di dialogo

[Peak ID Table Editor]. Nella finestra verrà visualizzato il cromatogramma

attivo. Attraverso l’opzione [Channel(s)] sarà possibile visualizzare gli altri

canali presenti.

�Figura 5-13 Finestra di dialogo [Peak ID Table Editor]

2) Cliccare sul pulsante . Then, la lista dei picchi integrati verrà verrà caricata

in tabella. A questo punto, i picchi non hanno un nome; perciò il loro nome

appare come “Peak-xxx”. xxx indica un numero a 3 digit.

3) Se l’operatore intende usare i picchi rilevati sui vari canali, cambiare il canale

visualizzato a premere nuovamente il pulsante . Successivamente i picchi

integrati nel canale verranno aggiunti in tabella.

��

��+$��

4) Inserire il nome dei picchi integrati sul cromatogramma. Lo stesso nome del

picco può essere assegnato a più picchi di diversi canali. Natutralmente, nomi

diversi possono essere assegnati a picchi di canali differenti con lo stesso

tempo di ritenzione.

5) Al termine dell’inserimento, cliccare sul pulsante o .

6) Cliccare sul pulsante per uscire dalla finestra di dialogo [Peak ID Table

Editor].

7) Nella sezione Loaded Chromatograms], cambiare il cromatogramma attivo.

8) Selezionare l’opzione [Peak Find] dal menu [Process], o cliccare sul pulsante

. Comparirà la fienstra di dialogo [Peak Processing].

Figura 5-14 Finestra di dialogo [Peak Processing]

9) Cliccare sul pulsante […] del campo [Peak ID Table] per selezionare la tabella

di identificazione dei picchi. In questo esempio, noi siamo interessati solo

all’identificazione dei picchi, quindi gli altri parametri non verranno impostati.

Cliccare sul pulsante [Run] del campo [Peak Identification].

10) Successivamente verrà visualizzato il risultato relativo all’identificazione dei

picchi. Controllare i risultati, e se i risultati sono soddisfacenti , rendere attivo

��

��+&��

un altro cromatogramma e ripetere di nuovo la procedura. Se i risultati non sono

soddisfacenti, tornare al punto 2), e modificare I parametri della tabella di

identificazione.

11) Ripetere l’operazione fino a quando I risultati non soddisfino I requisiti

desiderati.

5.4 Come costruire un Metodo Quantitativo

Nella sezione precedente, abbiamo appreso come richiamare un cromatogramma, come

integrarlo ed identificare i picchi. In questa sezione apprenderemo come eseguire

automaticamente l’analisi quantitativa utilizzando le conoscenze acquisite nella sezione

precedente.

Per dare inizio ad una sessione di analisi quantitativa, è necessario aver creato

precedentemente un appropriato Metodo di Integrazione, una Tabella di Identificazione dei

picchi ed un Metodo di Calibrazione.

Per verificare ogni Metodo, nella sezione [Type] della Sequenza di Acquisizione dobbiamo

inserire la definizione UNK. Vedere la sezione “ 5.1 Preparazione per la misura”, per maggiori

dettagli.

Il diagramma di flusso relativo alla procedura di misura, creazione della curva di calibrazione

e quantificazione è visualizzato di seguito.

��

��++��

Figura 5-15 Costruzione del Metodo Quantitivo

%����������%����������%����������%��������������

Quando viene utilizzato un dato cromatografico proveniente dal

rivelatore PDA per scopi quantitativi, utilizzare uno dei canali virtauli,

corrispondente ad una specifiuca lunghezza d’onda.

��

��+.��

5.4.1 Cambiare il Type a UNK e misura del campione Per verificare il Metodo, deve essere creato un cromatogramma di riferimento. In order to

verify methods, reference chromatograms need to be created. Comunque, non è richiesto nessun

Data Processing Method per crearlo. Notare che se nel campo [Type] della sequenza di

acquisizione assegnamo l’opzione STDx, l’operatore non può creare cromatogrammi a meno

che non vengano assegnati un Peak Processing Method ed una Tabella di identificazione dei

picchi. Perciò per esaminare un Metodo, l’opzione [Type] deve essere selezionata su UNK

anche per i campioni utilizzati come standard di calibrazione.

������������������������

Durante l’esame del Metodo, l’opzione [Type] deve essere impostat

su UNK quando non abbiamo un metodo di Data Processing

applicabile.

Esempio

Per creare 3 cromatogrammi, due di loro sono a concentrazione nota e uno incognito, la

Sequenza di Acquisizione dovrà essere impostata come segue:

Figura 5-16 Un esempio di una sequenza di Acquisizione

Salvare la Sequenza con il nome desiderato e successivamente aprire l’[Acquisition Queue] in

[Acquisition] e avviare il processo.

Inserimento delle informzioni nella calibrazione con standard interno

La concentrazione dello standard interno aggiunto deve essere inserita nella finestra di

dialogo [Acquisition Sequence], quando si deve eseguire un analisi quantitativa con standard

interno.

��

��+/��

Figura 5-17 finestra di dialogo [Acquisition Sequence]

Inserire il nome del campione nella colonna [Sample Name] ed inserire 1 nella colonna

[Quantitation Factor].

Nella colonna [ISTD#n], inserire la concentrazione dello standard interno. Possono essere

aggiunti al campione fino ad un massimo di 16 standard inerni. In questo caso, ogni standard è

utilizzato in due canali differenti; il numeto totale degli standard è 2. Perciò, se un campione

contiene 2 standard interni e utilizza due canali differenti, il numero totale degli stanard diventa

4. In questo modo, le informazioni del campione in questo esempio saranno inserite come

segue:

Figura 5-18 Esempio di informazioni del campione

Nell’esempio rioportato , [ISTD#1] e [ISTD#3], [ISTD#2] e [ISTD#4] sono lo stesso

standard interno. Quelli pari sono utilizzati su 2 canali differenti, e dovranno essere inseriti in

due posizioni diverse.

5.4.2 Come costruire un Peak Processing Method Costruzione di un Peak Processing Method.

5.4.3 Come creare la Tabella di indentifacazione dei picchi Una volta che il Peak Processing Method è stato creato, si deve creare una Tabella di

identificazione dei picchi. Vedere la sezione “5.3.5 Creazione della Tabella di idenficazione e

identificazione dei Picchi”.

��

��+0��

Come creare la Tabella di identifiazione dei picchi per il Metodo dello standard interno

Per eseguire il Metodo dello standard interno, selezionare [Internal] dal menu a tendina.

Successivamente compare la colonna [ISTD] nella tabella di identificazione dei picchi.

Attivare con il simbolo spunta i box dei componenti relativi agli standard interni, ed

assegnare il numero. Per gli altri componenti, specificare quale standard interno dovrà essere

utilizzato per la loro quantificazione attraverso il numero che lo identifica.

Quando ogni standard è utilizzato per 2 canali differenti, il numero totale degli standard è 2.

Perciò, quando un campione contiene 2 standard interni ed utilizza 2 canali differenti, la tabella

di identificazione diventa come quella sotto rappresentata:

Figura 5-19 Esempio di tabella di identificazione picchi per il Metodo dello standard interno

5.4.4 Come creare un Metodo di Calibrazione Una volta creata la Tabella di identificazione, è necessario creare un Metodo di Calibrazione.

Un Metodo di Calibrazione comprende il numero dei campioni standard per la curva di

calibrazione, la concentrazione dei loro componenti, l’unità di misura della concentrazione, la

formula per il calcolo quantitativo, come considerare l’origine degli assi della curva, il peso, la

funzione utilizzata nei calcoli (area/altezza) ed il coefficiente di correlazione della curva

calcolata.

Procedura

1) Andare sul menu [File] > [Method Editor], e selezionare [Calibration Method],

o cliccare sul pulsante , comparirà la finestra di dialogo [Calibration

Method Editor].

��

��+2��

�Figura 5-20 Finestra di dialogo [Calibration Method Editor]

Cliccare sul pulsante per caricare la Tabella di identificazione dei picchi. Selezionare in

questa sezione il file creato al paragrafo “5.4.3 Come creare la Tabella�*����*���� ���)�����*���

"���#�”,. Il nome dei picchi inserito nella Tabella di identificazione verrà caricato

automaticamente in tabella.

2) Inserire il numero degli standard nel campo [# of STDs], e la concentrazione per

ogni picco identificato, l’unità di misura, la formula da utilizzare per la

costruzione della curva ecc.. L’operatore può inserire questi parametri per ogni

canale cliccando sulle cartelle di selezione dei canali [CH-1] – [CH-16]. Se

selezioniamo la cartella [ALL], tutti i nomi dei picchi verranno assegnati a tutti i

canali. Quando più canali sono aperti, se una concentrazione di un componente

viene inserita o modificata, la cncentrazione del picco verrà cambiata

autoimaticamente su tutti i canali.

3) Dopo aver creato il Metodo di Calibrazione, salvarlo cliccando sul pulsante

.

5.4.5 Come creare un Report di Stampa Non è obbligatorio creare un Report di stampa: il Report viene utilizzato in automatico per

stampare i cromatogrammi, le curve di calibrazione ecc.. Il report di stampa creato verrà incluso

��

��.5��

nel metodo di ripromesso dati: Data Processing Method. In questo esempio, è stato creato un

formato di stampa per i cromatogrammi.

Procedura

1) Andare sul menu [File] > [Method Editor], e selezionare l’opzione [Report

Style], o cliccare sul pulsante , comparirà la finestra [Report Style].

Figura 5-21 Finestra [Report Style]

2) Cliccare sul pulsante [Chromatogram] dalla lista degli oggetti disponibili nella

fienstra Navigation. Fare un doppio clic sulle icone (cromatogramma),

(informazioni del cromatogramma), ed infine (Tabella Picchi).

Successivamente i punti selezionati, comparirranno come immagine nel report

che stiamo creando.

3) Ottimizzare la dimensione e la loro posizione come desiderato.

��

��.���

Figura 5-22 Esempio di Report di Stampa

4) Dopo aver creato il formato di stampa, salvarlo cliccando sul pulsante .

5.4.6 Come creare un Metodo di Riprocesso dati: Data Processing Method Per creare la curva di calibrazione utilizzando una Sequenza di Ricalcolo, dobbiamo creare un

Metodo di riporcesso dati: Data Processing method. Utilizzando il Metodo di Riprocesso dati,

i picchi verranno integrati e i risultati potranno essere stampati automaticamente.

Procedura

1) Andare sul menu [File] > [Method Editor], e selezionare l’opzione [Data

Processing Method], o cliccare sul pulsante , comparirà la finestra di

dialogo [Data Processing Method Editor].

��

��.���

Figura 5-23 Finestra di dialogo [Data Processing Method Editor]

2) Selezionare l’opzione [Peak Find] dal menu a tendina [Process], ed impostare il

canale ed i parametri in modo corretto. Per esempio, se il dato cromatografico

dovrà essere processato sul canale 1 e 2, utilizzando rispettivamente i metodi

Pmth1 e Pmth2, le impostazioni saranno come sotto indicato:

Figura 5-24 Esempio 1 di un Metdo di riprocesso dati

�%����%����%����%�������

Nel caso sia stato creato uno Report di stampa come riportato nella

sezione “5.4.5 Come creare un Report di Stampa”, e si desideri

ottenere la stampa in automatico dei risultati, assegnare l’opzione

[Print Report] nella colonna [Process] ed impostare il canale ed i

parametri in modo appropriato. Nell’esempoio sotto riportato

verranno processati i cromatogrammi dei canali 1 e 2, ed utilizzato

per la stampa di entrambi i canali il Report chiamato Style1.

�Figura 5-25 Esempio 2 di Metodo di riprocesso dati

3) Infine cliccare sul pulsante per salvare il Data Processing Method.

��

��.$��

5.4.7 Come creare ed eseguire per la prima volta una Sequenza di Ricalcolo Se un cromatogramma è stato acquisito come [UNK] (nella sezione type) e dovrà essere

trattato come uno standard di calibrazione, dovremo applicare una Sequenza di Ricalcolo

[Recalculation Sequence] per modificare le assegnazioni precedenti. Nell’esempio riportato nei

paragrafi precedenti abbiamo acquisito 2 cromatogrammi di campioni a diversa concentrazione

definiti come incogniti. Se vogliamo utilizzarli per la costruzione della curva di calibrazione,

questi due croamtogrammi dovranno essere convertiti come Standard, prima di creare la

Sequenza di Ricalcolo.

Procedura

1) Nella finestra Navigation, selezionare l’opzione [Recalc. Sequence].

�Figura 5-26 Finestra [Recalc. Sequence]

2) Selezionare l’opzione [Open Executed Sequence] dal menu [File], o cliccare sul

pulsante . Si aprirà la finestra di dialogo [Open Executed Sequence File].

Selezionare la Sequenza eseguita e cliccare sul pulsante [Open]. Il contenuto del file

comparirà nella finestra [Recalc. Sequence].

3) Selezionare la linea UNK sample e rimuoverla.

4) Cambiare l’assegnazione della colonna Change the [Type] a [STD1] e [STD2],

ed assegnare [ID Table], [Calib Method] e [Process] che abbiamo creato nelle

sezioni “5.4.3 Come creare la Tabella�*����*���� ���)�����*���"���#�”, “5.4.4

Come creare un�� ���*��*����!�4��)����”, e “5.4.6 Come creare un Metodo�*��

��"����((�� *���I� ����� �����((���� � ��#�*” per entrambi gli standard di

��

��.&��

calibrazione [STD1] e [STD2] (la prima e la seconda linea). Nella colonna

[Mode] nella prima linea selezioniamo l’opzione [New] mentre nella colonna

[Mode] della seconda linea selezioniamo l’opzione [Add].

5) Avviare la sequenza di ricalcolo selezionando l’opzione [Run Recalculation] dal

menu [Recalc. Sequence], o cliccare sul pulsante . Verrà eseguita la

sequenza di ricalcolo.

Figura 5-27 Esempio 1 della Sequenza di ricalcolo

�%����%����%����%�������

Se abbiamo inserito l’opzione[Print Report] nel metodo di

ripromesso, il report di stampa verrà prodotto in automatico.

Figura 5-28 Esempio del Report di stampa

��

��.+��

5.4.8 Verifica della Curva di Calibrazione In questa sezione, esamineremo la curva di calibrazione create dalla sequenza di ricalcolo.

Se incontreremo problemi con la curva di calibrazione creata ed il Metodo richiede modifiche,

es. i parametri di integrazione non sono appropriati, tornare alla sezione “5.4.2 Come costruire

un Peak������((����� ��#�*”, e seguire la procedura per inserire parametric correti.

Per vedere la curva di calibrazione create, andare sul menu [File] > [Method Editor], e

selzionare [Calibration Method], o cliccare sul pulsante , verrà visualizzata la finestra di

dialogo [Calibration Method Editor]. Selezionare quindi il Metrodo di Calibrazione che

intendiamo visualizzare cliccando sul pulsante . Selezionare il [Calib. Test] creato nella

sezione “5.4.7 Come creare ed eseguire per la prima�-�!���%����'%��)��*��“.

�Figura 5-29 Finestra [Calibration Method Editor] e viualizzazione della curva di calibrazione

Nella fienstra [Calibration Method Editor], le impostazioni delle colonne [Type], [Zero] e

[Weight] possono essere cambiate. E’ possibile inoltre, ricreare la curva eliminando dalla

calibrazione alcuni punti. Se l’operatore desidera ricreare la curva di calibrazione modificando

alcuni parametri inseriti nel [Calibration Method], tornare alla sezione “5.4.4 Come creare un�

� ���*��*����!�4��)����”, e ripetere la procedura.

��

��..��

5.4.9 Come creare una Sequenza di ricalcolo e la sua seconda esecuzione Una volta che la curva di calibrazione è stata create e verificata, siamo pronti per quantificare

campioni incogniti. Nell’esempio seguente utilizzaremo per il calcolo I campioni acquisiti in

precedenza.

Procedura

1) Dalla finestra , selezionare l’opzione [Recalc. Sequence].

2) Dal menu [File] selezionare [Open Executed Sequence], o cliccare sul pulsante

. Comparirà la finestra [Open Executed Sequence File].

Selezionare la sequenza eseguita, e cliccare successivamente sul pulsante [Open]. Il

contenuto del file comparirà nella finestra [Recalc. Sequence].

3) Considerando che vogliamo quantificare campioni sconosciuti, rimuovere

l’opzione STD dalle linee come è stato creato nella sezione “5.4.7 Come creare

ed eseguire per la prima�-�!���%����'%��)��*��Ricalcolo”.

4) Come [ID Table], [Calib Method] e [Process], selezionare quelli creati nelle

sezioni “5.4.3 Come creare la Tabella�*����*���� ���)�����*���"���#�“, “5.4.4

Come creare un�� ���*��*����!�4��)����”, e “5.4.6 Come creare un Metodo�*��

��"����((��*���I� ����������((����� ��#�*”. Lasciare in bianco la colonna

[Mode].

5) Avvire la seuenza di ricalcolo selezionando [Run Recalculation] dal menu

[Recalc. Sequence], o cliccare sul pulsante . Il ricalcolo verrà eseguito.

Figura 5-30 Esempio 2 di Sequenza di ricalcolo

Una volta ricalcolati i campioni incogniti, verificare i risultati ottenuti. Se i risultati non sono

soddisfacenti, tornare al punto appropriato ed iserire le modifiche opportune.

Per visualizzare i risultati del ricalcolo, aprire i cromatogrammi di inetresse. Le informazioni

sui picchi [Peak Information] verranno visualizzate nella fienstra in basso sotto al

cromatogramma.

Verificare le aree e gli altri risultati quantitativi, assicurandosi che nel campo [Warning] non

siano riportate annotazioni. La presenza di queste annotazioni indica che la curva di calibrazione

va rivista.

��

��./��

Calibration Curve Significa che il coefficiente di regressione ottenuto per la curva di

calibrazione è più basso del valore specificato come criterio di

accettazione nel [Calibration Method].

Extrapolation Significa che il valore calcolato è stato ottenuto per estrappolazione

matematica ed il livello di concentrazione non è presente come punto di

calibrazione.

Se i valori quantitativi ottenuti manifestano variazioni anomale, il Metodo di integrazione

deve essere rivisto.

5.4.10 Acquisizione di una Sequenza nelle analisi di routine Fino ad ora, abbiamo creato i metodi richiesti nell’analisi quantitativa. Questi metodi possono

essere inseriti ed utilizati da una Sequenza di Acquisizione per le analisi di routine.

Utilizzando i Metodi creati nelle sezioni precedenti, iniettare 2 standard a differente

concentrazione e in sequenza 10 campioni incogniti. Di conseguenza il contenuto della

Sequenza di Acuisizione sarà il seguente:

Figura 5-31 Esempio di una sequenza per analisi di routine

�--�����)��--�����)��--�����)��--�����)�����

Dopo aver eseguito Sequenze di Acquisizione ininterrotte per lunghi

periodi (es. 48 ore), si raccomanda di uscire da ChromNAV, chiudere

il programma e riavviarlo nuovamente, prima di dare inizio ad una

nuova Sequenza di Acquisizione. Durante la fase di uscita, il

programma ChromNAV riorganizza il contenuto dei files e dei

Metodi, preparandoli per una nuova sessione di analisi.

��

��.0��

5.5 Analisi dei dati PDA

Nel caso il sistema abbia un rivelatore PDA, i dati prodotti possono essere analizzati in

diversi modi. Le modalità di analisi dei dati PDA sono descritte in questa sezione.

5.5.1 Apertura del cromatogramma

Vedere la sezione “5.3.1 Come aprire�%���������������” per I dettagli di come aprire un

cromatogramma. I dati PDA possono essere visualizzati nelle sezioni dedicate della sezione

Analysis.

5.5.2 Analisi degli spettri Nella sezione dedicata alla visualizzazione dei dati PDA sulla finestra mappa In the

[Contour+Chrom+Spec], cliccare con il destro del mouse e selezionare l’opzione [XY Cursor]

dal menu di popup, successivamente comparirà il cursore XY. Trascinare il cursore XY lungo

l’asse X (asse relative al tempo di eluizione) e cliccando sul tempo desiderato verrà visualizzato

lo spettro corrispondebte al tempo di ritenzione selezionato. Allo stesso modo trascinando il

cursore XY lungo l’asse Y (asse delle lunghezze d’onda) e cliccado dulla lunghezza d’onda di

interesse, verrà visualizzato il cromatogramma corrispondente.

Figura 5-32 Visualizzazione dello spettro

Nell’area di visualizzazione dello spettro, cliccare con il destro del mouse e selezionare

[Send to Spectra Manager] dal menu di popup. Successivamente verrà visualizzata la finestra

��

��.2��

[Spectra Analysis] e lo spettro estratto al tempo di ritenzione selezionato.

Figura 5-33 Finestra [Spectra Analysis]

L’opzione [Spectra Analysis] è una parte della piattaforma JASCO’s Spectra Manager. Nella

finestra [Spectra Analysis], è possibile eseguire sugli spettri, vari tipi di analisi. Per maggiori

dettagli, vedere il manulae di istruzioni del programma Spectra Manager.

5.5.3 Visualizzazione tridimenzionale Nella visualizzazione [3D] della sezione PDA, il dato viene visualizzato in formato

tridimensionale.

Figura 5-34 Visualizzazione tridimensionale del dato PDA

��

��/5��

Tenere premuto il pulsante del mouse e trascinarlo, per ruotare la visualizzazione

tridimensionale.

5.5.4 Comparazione delle mappe Nella visualizzazione [Two Contours], è possibile visualizzare 2 mappe per la comparazione.

Il dato attivo è raffigurato nella fienstra in basso.

Nella fienstra in alto, l’operatore può selezionare, dal menu di popup l’opzione [Open

Chromatogram] per confrontare un dato con la mappa relative al cromatogramma attivo.

Figura 5-35 Confronto tra mappe

5.5.5 Rapporto tra cromatogrammi Nella visualizzazione [Ratio Chromatogram], è possibile viusalizzare 3 cromatogrammi per la

loro comparazione. Dal menu di popup selezionare l’opzione [Select Chromatogram], comparirà

la finestra di dialogo [Add Ratio Chromatogram].

Figura 5-35a Finestra di dialogo [Add Ratio Chromatogram]

��

��/���

Selezionare le 2 lunghezze d’onda relative ai cromatogrammi di cui si desidera il rapporto.

Nella finestra centrale verrà visualizzato il cromatogramma dividendo, in basso il il

cromatogramma divisore, e nella fienstra in alto il riusltato del rapporto.

Figura 5-36 Rapporto tra cromatogrammi

5.5.6 Visualizzazione On-Peak Spectra Nella visualizzazione [On Peak Spectra] avremo 3 finestra in lato per la visualizzazione degli

spettri ed una in basso dove verrà visualizzato il cromaogramma attivo in esame.

Cliccare sulla finestra dove l’operatore intende visualizzare lo spettro, il colore della stessa

cambierà, indicando che da questo momento è la finestra attiva. Nella finestra in basso, con il

destro del mouse, selezionare l’opzione [Add Spectra] dal menu di popup, Successivamente sul

cromatogramma, comparirà un cursore verticale. Tenendo premuto il pulsante sinistro del mouse

muovere il cursore sul picco di cui si intende visualizzare lo spettro, e confermare premendo la

barra spaziatrice della tastiera. Comparirà lo spetro corrispondente, nella fienstra in alto

selezionata in precedenza.

��

��/���

Figure 5-37 Esempio della fuznione On-Peak Spectra

5.5.7 Ricerca dello spettro in libreria

Come creare una libreria spettrale

Andare sul manu [File] > [Spectral Library], e selzionare [Edit], successivamente compare la

fienstra di dialogo [Spectral Library].

Figura 5-37a Finestra di dialogo [Spectra Library]

Cliccare sull’icona [Create Spectrum Library] per creare una nuova libreria.

��

��/$��

Figura 5-38b Finestra di dialogo [Create Spectra Library]

Inserire il nome della nuova libreria ed un eventuale commento relativo al contenuto e confermare con il

pulsante [OK].

Figura 5-38c Finestra di dialogo [Spectra Library] dopo aver creato la nuova libreria

Nella finestra relativa allo spettro da inserire, cliccare con il destro del mouse, e selezionare

[Add to Library] dal menu di popup, successivamente compare la finestra di dialogo [Spectral

Library].

Selezionare con un clic del mouse il nome della libreria, nel quale intendiamo inserire lo

spettro, quindi cliccare sul pulsante [Add] per visualizzare la fienstra di dialogo [Add

Spectrum].

��

��/&��

Figura 5-39 Finestra di dialogo [Add Spectrum]

Cliccare sull’icona per confermare la registrazione dello spettro in libreria.

Ricerca spettrale in Libreria

Nella barra strrumenti del programma [ChromNAV], cliccare sull’icona per visualizzare

la finestra di dialogo [Spectral Search Parameter].

Figura 5-40 Finestra di dialogo [Spectral Search Parameter]

��

��/+��

Selezionare su quail librerie effettuare la ricerca, inserendo il sibolo di spunta, dall’elenco

delle librerie disponibili [Available Libraries]. Inserire i valori appropriati per i parametri di

ricerca [Correlation Threshold] e [Max. No. of Candidates], e salvare il metodo di ricerca con

un nome desiderato.

Dalla finestra in cui è raffigurato lo spettro da sottoporre a ricerca, cliccare il destroy del

mouse e selezionare [Library Search] dal menu di popup, comparirà la finestra di dialogo [Open

Spectral Search Method].

Figura 5-40a Finestra di dialogo [Open Spectrum Search Method]

Selezionare il nome del metodo di ricerca desiderato, e confermare la selezione con il

pulsante [Open]. Verranno visualizzati i risultati della ricerca nella finestra [Search Result].

�Figura 5-41 Finestra di dialogo [Search Result]

��

��/.��

5.5.8 Calcolo della Purezza di un picco

Nella barra degli strumenti di [ChromNAV], cliccare sull’icona per visualizzare la

finestra di dialogo [Peak Purity Method Editor].

Figura 5-42 Finestra di dialogo [Peak Purity Method Editor]

Nella sezione [Spectra Applied for Purity Calculation], selezionare i parametric per il calcolo

di purezza tra le opzioni disponibili nella sezione [Front & Tail Spectra] o l’opzione [Whole

Spectra], e salvare il metodo di calcolo della purezza.

Nella barra strumenti della visualizzazione PDA, cliccare sul pulsante per

visualizzare la finestra di dialogo [Open Peak Purity Method].

Figura 5-43a Finestra di dialogo [Open Purity Method]

Selezionare il nome del metodo desiderato, e confermare con il pulsnate [Open] per

visualizzare i risultati del calcolo di purezza.

��

��//��

Figura 5-44 Risultati del calcolo di purezza del picco

5.6 Metodi di calcolo della distribuzione dei pesi molecolari (pacchetto opzionale

GPC-Addon)

Nelle sezioni precedenti abbiamo appreso come richiamare un dato per integrare ed I

dentificare i picchi cromatografici. In questa sezione, apprenderemo come eseguire in

automatico il calcolo di distribuzione dei pesi molecolari, utilizzando le conoscenze acquisite

nelle sezioni precedenti.

Per effettuare questo tipo di valutazione vedremo come avviare una nuova analisi, creare un

Metodo di integrazione ed una tabella di identificazione ed infine il metodo di calcolo di

distribuzione dei pesi molecolari.

Per verificare ogni Metodo, la colonna [Type] della Sequenza di Acquisizione deve essere

impostata come UNK. Per maggiori dettagli relativi ai parametri necessari vedere la sezione

“5.6.1 Cambiare il Type selezinado UNK e misura dei campioni”.

Di seguito troveremo raffigurato il diagramma di flusso relativo alla procedura di misura,

creazione della curva di calibrazione , ed il calcolo di distribuzione dei pesi molecolari.

��

��/0��

Figure 5-45 Flowchart for Verifying MW Calculation Methods

%����������%����������%����������%��������������

Nel caso si debba utilizzare un cromatogramma prodotto dal

rivelatore PDA, per il calcolo di distribuzione dei pesi molecolari,

utilizzare uno dei canali virtuali disponibili.

��

��/2��

5.6.1 Come cambiare il Type in UNK e misura del campione Per creare un metodo l’operatore deve prima iniettare campioni standard e campioni

incogniti. Per acquisire i campioni sopra indicate, non è necessario nessun Data Processing

Method. Per queste acquisizioni la colonna [Type] della Sequenza di acquisizione deve essere

impostat come: UNK.

�%��%�!�))�)�����%��%�!�))�)�����%��%�!�))�)�����%��%�!�))�)��������

Nel calcolo di distribuzione dei pesi molecolari, sia gli standard che i

campioni devono essere definiti come [Type] = [UNK].

Esempio

Per creare 4 cromatogrammi, 3 standards e 1 come campione incognito, preparare la

Sequenza di Acquisizione come segue:

Figura 5-46 Esempio di impostazione della Sequenza di Acquisizione

Salvare la Sequenza di Acquisizione, quindi aprire l’ [Acquisition Queue] nella sezione

[Acquisition] ed avviare l’acquisizione.

5.6.2 Come verificare il Peak Processing Method Rivedere la sezione relativa al Peak Processing Method. Sezione “5.3.4 Impostazione del

Metodo di calcolo ed identificazione�*���"���#�� � ”.

5.6.3 Creare la Tabella di Identificazione dei picchi Una volta che abbiamo creato il Peak Processing Method, dobbiamo creare la tabella di

identificazione dei picchi. Vedere la sezione “5.3.5 Come creare la Tabella di Identificazione ed�

identificare i picchi�”.

5.6.4 Creazione del MW Calculation Method (Metodo di calcolo della distribuzione del

peso molecolare) Una volta che la tabella di identificazione di picchi, potremo creare il MW Calculation

Method. Il Metodo MW Calculation Method include la curva di calibrazione, il nome dei picchi

ed il loro peso molecolare.

��

��05��

Procedura

1) Andare sul menu [File] > [Method Editor], quindi selezionare [MW Calculation

Method], o cliccare sull’icona , successivamente comparirà la finestra di

dialogo [MW Calculation Method].

�Figura 5-47 Finestra di dialogo [MW Calculation Method]

2) Nel campo [Calibration Curve] nella cartella [MW Calculation Curve],

selezionare l’equazione per il calcolo della curva di calibrazione. Inserire tutti i

nomi dei picchi nella tabella di identificazione ed il loro peso molecolare, nella

sezione M.W. Calibration Table.

3) Una volta inseriti i parametri richiesti, cliccare sull’icona per salvare le

impostazioni.

5.6.5 Come creare Report di Stampa Non è obbligatorio creare un Report di Stampa; It is not mandatory to create a Report Style;

Tuttavia, un Report di Stampa viene prontamente utilizato in automatico stampando i

cromatogrammi, le curve di calibrazione, ecc.. Un report di stampa creato dall’operatore potrà

��

��0���

essere incluso nel Data Processing Method. Nell’esempio seguente, verrà creato un Report di

Stampa per la stampa dei cromatogrammi.

Procedura

1) Andare sul menu [File] > [Method Editor], quindi selezionare l’opzione

[Report Style], o cliccare sul pulsante , comparà la finestra di dialogo

[Report Style].

Figura 5-48 Finestra [Report Style]

2) Cliccare sul pulsante [Chromatogram] dalla lista [Style Objects]. Fare un doppio

clic sull’icona (cromatogramma), sull’icona (Informazioni sul

cromatogramma), ed infine sull’icona (Tabella picchi). Successivamente

gli oggetti selezionti compariranno come immagine nell’anteprima del Report di

Stampa che stiamo creando.

3) Regolare la dimensione e la posizione delle immagini, in modo che non vi siano

sovrapposizioni.

��

��0���

Figura 5-49 Esempio di Report di Stampa

4) Una volta creato il Rpeort di Stampa, cliccare sull’icona per salvarlo.

5.6.6 Creazione del Data Processing Method per costruire la Curva di distribuzione dei

pesi Molecolari. Creare un Data Processing Method per integrare ed identificare i picchi, per creare una curva

di calibrazione MW, per stampare automaticamente i report. E’ necessario creare il Data

Processing Method in modo da creare in automatico la curva di calibrazione MW. Per creare

una Curva di calibrazione MW utilizzando standard multipli, è necessario creare 2 Data

Processing Methods.

Procedura

1) Andare sul menu [File] > [Method Editor], quindi selezionare [Data Processing

Method], o cliccare sull’icona , comparirà la fienstra di dialogo [Data

Processing Method Editor].

��

��0$��

Figura 5-50 Finestra di dialogo [Data Processing Method Editor]

2) Selezionare l’opzione [Peak Find] dalla lista [Process], ed impostare il numero

del canale ed i parametri adeguati, rispettivamente nelle colonne Channel a

Parameters. Per esempio, quando il dato cromatografico deve essere processato

è nel canale 1 e vogliamo utilizzare il metodo di integrazione (Peak Processing

Method): Pmth1, le impostazioni saranno le seguenti:

Figura 5-51 Esempio 1 Data Processing Method

3) Selezionare quindi dalla colonna [Process] l’opzione [New Calibration Curve],

ed imposare il canale 1 ed i parametri desiderati. Per esempio se vogliamo

procesare un dato cromatografico del canale 1 ed utilizzare il metodo di calcolo

MW chiamato Gmth1, le impostazioni saranno le seguenti:

Figura 5-52 Esempio 2 Data Processing Method

����%��%�!�))�)����%��%�!�))�)����%��%�!�))�)����%��%�!�))�)��������

Se abbiamo creato un Report di stampa come indicato nella sezione

“5.6.5 Come creare Report di Stampa”, assegnare l’opzione [Print

Report] nella colonna [Process] ed imposare il canale ed i parametri

in modo appropriato. Per esempio, quando il cromatogramma

processato è nel canale 1 e vogliamo stamparlo con il Report

chiamato Report Style Style1, le impostazioni saranno le seguienti:

��

��0&��

Figura 5-53 Esempio 3 Data Processing Method

4) Clicare sull’icona per salvare le impostazioni inserite.

5) Creare un altro Data Processing Method utilizzando lo stesso appena costruito.

Nella colonna [Process] alla linea 2 dovremo cambiare l’opzione [New

Calibration Curve] con [Add to Calibration Curve].

Figure 5-54 Example 4 of Data Processing Method

6) Cliccare sull’icona per salvare il metodo.

%����������%����������%����������%��������������

Il Metodo di Calcolo MW comprende la nuova Curva di distribuzione

MW. Se viene eseguito un Data Processing Method, che comprenda

l’opzione [New Calibration Curve] nella colonna [Process], La

Curva di Calibrazione MW verrà rimpiazzata con quella nuova. Se

viene esguito un Data Processing Method, che comprenda l’opzione

[Add to Calibration Curve] nella colonna [Process], I nuovi punti di

calibrazione verranno aggiunti alla Curva di Calibrazione MW

esistente.

5.6.7 Come creare una Sequenza di Ricalcolo e la sua prima esecuzione Per creare una curva di calibrazione MW utilizzando cromatogrammi esistenti, utilizzare

l’opzione [Recalculation Sequence]. Nell’esempio “5.6.1 Come cambiare il Type in UNK e

misura�*�!� ���"����”, sono stati iniettati 3 cromatogrammi di standard. Per questa ragione

questi cromatogrammi devo essere ricalcolati prima di ricreare la Sequenza di Ricalcolo.

��

��0+��

Procedura

1) Dalla Finestra Navigation, selezionare [Recalc. Sequence].

Figura 5-55 [Recalc. Sequence]

2) Selezionare [Open Sequence Archive] dal menu [File], o cliccare sul pulsante

. Successivamente compare la finestra di dialogo [Open Executed Sequence

File].

Selezionare il file relativo alla sequenza eseguita nella sezione “5.6.1 Come

cambiare il Type in UNK e misura� *�!� ���"����”, e successivamete

confermare la selezione cliccando sul pulsante [Open]. Il contenuto del file

verrà caricato automaticamente nella Sequenza di Ricalcolo [Recalc.

Sequence].

3) Selezionare e rimuovere UNK dai campioni che verranno utlizzati per la

costruzione della curva di calibrazione.

4) Per tutti i campioni modificare il [Type] selezionando [UNK], ed assegnando

loro la corrispondente tabella di identificazione [ID Table] ed il metodo di

integrazione [Process] creato nella sezione “5.4.3 Come creare la Tabella� *��

��*���� ���)�����*���"���#�”, e “5.4.6 Creazione del Data Processing Method

per costruire la��%�-��*��*�(���4%)�����*���"�(����!���!����”. Nella colonna

[Process], assegnare il file creato al punto 4) della sezione “5.6.6 Creazione del

��

��0.��

Data Processing Method per costruire la� �%�-�� *�� *�(���4%)����� *��� "�(��

��!���!����” Alla linea 1 e quello creato al punto 6) of “5.4.6 Creazione del

Data Processing Method per costruire la� �%�-�� *�� *�(���4%)����� *��� "�(��

��!���!����” Slls linea 2. I campi [Calib. Method] e [Mode] dovranno essere

lasciati in bianco.

5) Dal menu [Recalc. Sequence] selezionare l’opzione [Run Recalculation], o

cliccare sul pulsante . Il ricalcolo della sequenza verrà eseguito.

Figura 5-56 Esempio 1 della Sequenza di Ricalcolo

�%����%����%����%�������

Nel caso abbiamo assegnato la stampa di un Report come descritto

in sezione “5.4.6 Come creare un Metodo di Riprocesso dati: Data

Processing Method”, il report verrà stampato automaticamente al

termine della sequenza di ricalcolo.

�Figura 5-57 Esempio di Report di Stampa

��

��0/��

5.6.8 Verifica della Curva di Distribuzione dei Pesi Molecolari In questo capito verificheremo la curva di calibrazione MW creata nella sequenza di ricalcolo.

Se troveremo problemi con la nuova curva create verificare i parametri inseriti nel metodo di

processo del dato. Tornare alla sezione “5.4.2 Come costruire un Peak������((����� ��#�*”, e

seguire la procedura per inserire parametri appropriate, che soddisfino le condizioni per un

integrazione ed identificazione corretta dei picchi.

Per rivedere la Curva di Calibrazione MW Calibration Curve, andare sul menu [File] >

[Method Editor], quindi selezionare l’opzione [MW Calculation Method], o cliccare sul

pulsante , per visualizzare la finestra di dialogo [MW Calculation Method]. I parametri di

calcolo MW possono essere rivisti cliccando sull’icona .

�Figura 5-58 Finestra di dialogo [MW Calculation Parameter] rafigurante la Curva MW

��

��00��

5.6.9 Come editare i parametri di calcolo MW

����%��%�!�))�)����%��%�!�))�)����%��%�!�))�)����%��%�!�))�)��������

Ci sono 2 modi per eseguire il calcolo di distrubuzione dei pesi

molecolari: il primo in automatico [Automatic] il secondo in manuale

[Manual]. La modalità automatica è semplice da impostare, ma il

Peak Processing Method deve trovare il range corretto di calcolo, in

caso contrario il calcolo fallirà. Nel caso il Peak Processing Method

non trovi il range corretto per il calcolo, l’operatore dovrà utilizzare la

modalità manuale [Manual]. La modalità manuale richiede

impostazioni più complesse, ma risulta più duttile in quanto

l’operatore può specificare il range di calcolo desiderato.

Dopo aver verificato che la curva di distribuzione dei pesi molecolari sia stata, chiudere il

metodo MW Calculation Method, ed attivare il cromatogramma relativo al campione

incognito ,isurato nella sezione “5.6.1 Come cambiare il Type in UNK e misura�*�!����"����”.

Quindi aprire il Metodo di calcolo precedentemente preparato MW Calculation Method.

Seelzionare l’opzione [Calculation Parameter] dalla finestra MW Calculation Method ed

inserire I parametric richiesti.

Nel caso si utilizzi per il calcolo la modalità automatica [Automatic]

Procedura

1) Andare sul menu [File] > [Method Editors] e selezionare [MW Calculation

Method] o cliccare sull’icona per aprire la finestra di dialogo [MW

Calculation Method]. Aprire il Metodo creato nella sezione “5.4.4 Come creare

un�� ���*��*����!�4��)����”.

��

��02��

�Figura 5-59 Finestra di dialogo [M.W. Calculation Parameter]

2) Introdurre i parametri necessari al calcolo MW nella sezione [Calculation

Parameter]. Impostare [Automatic] nel campo [Calc. Mode] e [Area] nel campo

[Calc. Method]. In Tabella nella colonna [tR] Column, introdurre il tempo di

ritenzione del picco che deve essere sottoposto al calcolo, facendo riferimento al

cromatogramma raffigurato nella parte alta della finestra di dialogo. Introdurre i

parametri appropriati nelle colonne [Division] e [Value].

3) Al termine dell’introduzione, cliccare sull’icona per sovrascrivere le

impostazioni.

Nel caso si utilizzi per il calcolo la modalità manuale [Manual]

Procedura

1) Andare sul menu [File] > [Method Editor], e selezionare l’opzione [MW

Calculation Method], o cliccare sull’icona , successivamente comparirà la

finestra di dialogo [MW Calculation Method]. Aprire il metodo creato nella

sezione “5.4.4 Come creare un�� ���*��*����!�4��)����”

��

��25��

Figura 5-60 Finestra di dialogo [MW Calculation Parameter]

2) Inserire i parametri necessari al calcolo nella sezione [Calculation Parameter].

Impostare su [Manual] il campo [Calc. Mode] e [Area] nel campo [Calc.

Method]. Inserire il punto di inizio e fine del range di calcolo e il range della

linea di base utilizzando conme riferimento i tempi riportati sul cromatogramma

raffigurato nella parte alta della finestra di dialogo. Inserire i parametri

appropriati nei campi [Division], [Value] e [Polarity].

%����������%����������%����������%��������������

Cliccare sula prima linea della Tabella raffigurata, e selezionare [Set

Calculate Range] per viusalizzare il cursore verticale sul

cromatogramma. Muovere i cursore sul cromatogramma fino al punto

dove si intende selezionare il punto di inizione del calcolo [Calculation

Start] selezionare il punto e cliccare con il sinitro del mouse per inserire

il tempo di inizio. Mupver eil cursore nuovamente sul cromatogramma,

fino a selezionare il punto di fine del calcolo [Calculation End], quindi

cliccare con il sinistro del moiuse per confermare il tempo selezionato.

Fatto questo il cursore scompare automaticamente.

Allo stesso modo, selezionare l’opzione [Set Baseline Range],

inserendo successivamente il punto di inizio [Baseline Start] e di fine

[Baseline End] della linea di base.

��

��2���

3) Al termine dell’inserimento dei parametri, cliccare sull’icona per

sovrascrivere le impostazioni.

5.6.10 Come creare un secondo Report di stampa Non è obbligatorio creare un un Report di Stampa; tuttavia andrà creato se si vuole ottenere la

stampa in automatico della curva di distribuzione MW, dei risultati del calcolo di distribuzione

ecc.. Il Report di stampa verrà inserito nel Data Processing Method. In questo esempio, verrà

creato un report per stampare i risultati del calcolo di distribuzione dei pesi molecolari.

Procedura

1) Seleionare il menu [File] > [Method Editor], e quindi l’opzione [Report Style],

o cliccare sull’icona , comparirà la fienstra di dialogo [Report Style].

Figura 5-61 Finestra [Report Style]

2) Cliccare sul pulsante [GPC] dalla lista [Style Objects]. Selezionare con un

doppio clic del mouse l’oggetto (GPC Calib. Curve Plot per la stampa

��

��2���

della curva di distribuzione MW), quindi su (GPC Calc. Parameter

Table), ed infine (GPC MW Calc. Result Table). Gli oggetti selezionati

compariranno nel Report di stampa in costruzione.

3) Regolare se neecessario la dimensione e la posizione degli oggetti in modo da

non avere sovrapposizioni.

Figura 5-62 Esempio del report di Stampa

4) Dopo aver creato il Report di stampa, cliccare sull’icona e salvarlo su

disco.

5.6.11 Come creare un Data Processing Method per il calcolo di distribuzione dei pesi

molecolari Come creare un Data Processing Method relative al calcolo MW, ed ottenere la stampa

automatica dei risultati.

��

��2$��

Procedura

1) Selezionare il menu [File] > [Method Editor], quindi [Data Processing Method],

o cliccare sull’icona , comparirà la finestra di dialogo [Data Processing

Method Editor].

�Figura 5-63 Finestra di dialogo [Data Processsing Method Editor]

2) Dalla colonna [Process] selezionare l’opzione [Peak Find], quindi inserire il

canale ed i parametri di integrazione desiderati. Per esempio, se il dato

cromatografico che deve essere processato è sul canale 1 e vogliamo utilizzare i

parametri di integrazione chiamati Pmth, le impostazioni da eseguire sono le

seguenti:

Figura 5-64 Esempio 5 Impostazioni del Data Processing Method

%������%������%������%��������������������������

Quando per il calcolo utilizziamo la modalità in manuale [Manual],

non è necessario inserire l’opzione [Peak Find] nel Data Processing

Method.

3) Nella colonna [Process] inserire l’opzione [Calculate], ed inserire il canale ed il

nome del metodo di calcolo MW. Per esempio, quando il dato cromatografico

che deve essere processato è nel canale 1 e vogliamo utilizzare il metodo Gmth

per il calcolo di distribuzione dei pesi molecolari, le impostazioni saranno le

seguenti:

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Figura 5-65 Esempio 6 Impostazioni del Data Processing Method

�%��%�!�))�)�����%��%�!�))�)�����%��%�!�))�)�����%��%�!�))�)��������

Se abbiamo creato un Report di Stampa come riportato in sezione

“5.6.10 Come creare un secondo Report di stampa”, asseganre il

report creato selezionando l’opzione [Print Report] nella colonna

[Process], quindi specificare in modo opportuno il canale [Channel]

ed i parametri da utilizzare [Parameters]. Per esempio, quando il

dato cromatografico che si intende processare è nel canale 1 e

vogliamo utilizzare iul Report chiamato Report Style Style2, le

impostazioni inserite saranno le seguenti:

Figura 5-66 Esempio 7 Impostazioni del Data Processing Method

4) Infine cliccare sull’icona per salvare le impostazioni.

5.6.12 Come creare una sequenza di ricalcolo e la sua seconda esecuzione Una volta impostato il Metodo di calcolo MW ed il Data Processing Method è stato

completato, siamo pronti per eseguire il calcolo di distribuzione dei pesi molecolari su campioni

incogniti. In questo esempio, utilizzeremo i risultati dei campioni incognito ottenuti nella

sezione “5.6.1 Come cambiare il Type in UNK e misura�*�!����"����”. In questo esempio, c’è

solo un Cromatogramma come campione incognito. Per questa ragione non è necessario

utilizzare la Sequenza di ricalcolo per eseguire i calcoli della distribuzione MW. Tuutavia, la

utilizzeremo ugualmente a scopo didattico.

Procedura

1) Nella finestra principale di Navigazione, selezionare l’opzione [Recalc.

Sequence].

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��2+��

2) Dal menu File selezionare l’opzione [Open Sequence Archive], o cliccare

sull’icona . Successivamente si aprirà la finestra di dialogo [Open

Executed Sequence File].

Selezionare il file relative alla sequenza desiderata misurata nella sezione “5.6.1

Come cambiare il Type in UNK e misura�*�!����"����”, quindi cliccare su

pulsante [Open]. Successivamente il contenuto del file comparirà nella

Sequenza di ricalcolo [Recalc. Sequence].

3) Considerando che siamo interessati unicamente al calcolo MW sul campione

incognito, rimuovere le righe relative agli standards.

Cambiare il [Type] a [UNK]. Assegnare i file creati nelle sezioni precedenti

“5.6.11 Come creare un Data Processing Method per� �!� ��!��!�� *��

*�(���4%)����� *��� "�(�� ��!���!���”. Lasciare invariata la tabella di

identificazione [ID Table], [Calib. Method], e [Mode] blank.

4) Selezionare dal menu [Recalc. Sequence] l’opzione [Run Recalculation], o

cliccare sull’icona . La sequenza di ricalcolo verrà eseguita.

Figura 5-67 Esempio 2 Sequenza di ricalcolo

5.6.13 Verifica della Curva di distribuzione dei pesi molecolari Dopo che il risultato del calcolo di distribuzione verrà visualizzato, procedere alla verifica dei

dati ottenuti. Se i risultati non sono soddisfacenti, tornare al punto opportuno precedente e

procedere di nuovo.

Per visualizzare i risultati calcolati, aprire il cromatogramma di interesse, quindi selezionare

la visualizzazione [MW Calc. Result] dalla finestra [Analysis], nell’angolo in alto a sinistra del

Cromatogramma relativo al campione incognito, MW Calibration Curve, nell’angolo in alto a

destra; verranno visualizzati la Curva di distribuzione dei pesi molecolari, e nella parte in

basso, i risultati ottenuti.

Verificare la media dei pesi molecolari, e gli altri risultati ottenuti, asicurandosi che non vi sia

nulla di evidanziato nella colonna [Warning]. Se troviamo delle annotazioni nella colonna

[Warning] (vedi tabella sotto), il Metodo di Calibrazione deve essere rivisto.

��

��2.��

Extrapolation Indica che il risultato calcolato è fuori dalla curva di calibrazione ed è

frutto di un estrappolazione matematica.

Out of Range Nel calcolo di divisione, il valore di LogMi eccede 10, risultando di

conseguenza fuori dal range di calcolo.

Figura 5-68 Visualizzazione dei risultati MW calcolati

5.6.14 Sequenza di Acquisizione per analisi di routine Fino ad ora, abbiamo creato i metodi rischiesti per il calcolo diu distribuzione dei pesi

molecolari. Ora creeremo una Sequenza di Acquisizione atta ad eseguire analisi di routine.

Utilizzando i Metodi creati nelle sezioni precedenti, iniettare 3 standards con diverso valore

di peso molecolare e successivamente 10 campioni incogniti su cui effettuare il calcolo di

distribuzione. Il contenuto della Sequenza di Acquisizione sarà il seguente:

��

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Figura 5-69 Esempio di Sequenza di Acquisizione per analisi di routine

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��20��

JASCO Corporation 2967-5, Ishikawa-machi, Hachioji-shi

TOKYO, JAPAN

Printed and translated in Italy by Jasco Europe Srl – Stefano Zanfi


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