Identification of Adenovirus, Influenza Virus, ParainfluenzaVirus, and Respiratory Syncytial Virus by Two Kinds of Multiplex Polymerase

Chain Reaction (PCR) and a Shell Vial Culture in Pediatric Patients with Viral Pneumonia

Jong-Han Lee, Jin-Kyong Chun, Dong Soo Kim,Yongjung Park, Jong Rak Choi and Hyon-Suk Kim

Seoul, Korea.

Yonsei Med J 51(5):761-767, 2010

VİRAL PNÖMONİLİ ÇOCUKLARDA ADENOVİRÜS, İNFLUENZA VİRÜS,

PARAİNFLUENZA VİRÜS VE RESPİRATUVAR SİNSİTYAL VİRÜSÜN İKİ

FARKLI MULTİPLEKS PCR KİTİ VE SHELL VİAL KÜLTÜRÜYLE

TANIMLANMASI

Araş.Gör.Dr.Oya AKKAYA

Prof.Dr.Bülent BAYSAL

GİRİŞ

Akut viral kökenli solunum yolu hastalıkları çocuklarda morbiditeye yol açan en sık nedenlerdir

Üst solunum yolunda sınırlanmalarına rağmen yine de alt solunum sistemi komplikasyonlarına yol açar

Bu nedenle viral infeksiyonların erken ve hızlı tanısı, virüsün yayılımının engellenmesi için önemlidir

GİRİŞ

Respiratuvar virüslerin PCR ile tespit edildiği birkaç çalışma vardır

Bu çalışmalara göre toplumsal kaynaklı ve nasokomiyal solunum sistemi infeksiyonlarından en sık IFV, HPIV, AdV ve RSV izole edilmiştir

IFV, enterovirüs ve AdV antiviral tedaviden faydalanabilecek virüslerdir

Bu çalışmanın amacı, çocuklardaki şiddetli viral pnömoni sebeplerinin 2 farklı PCR kiti kullanılarak tespit edilmesidir

GEREÇ VE YÖNTEM

ÖRNEK TOPLAMA: 2009 yılında Seul’de, 6 aylık bir periyodda, viral pnömoni

semptomları olan 220 çocuk hasta pediyatri servisine yatırıldı Fizik muayene bulguları, akciğer röntgeni, kan testleri,

sedimentasyon hızı ve CRP ile bakteriyel pnömoni ekarte edilip viral pnömoni tanısı kondu

Bu hastalardan nasofarengeal sürüntü örneği alındı Bu örnekler çalışılıncaya kadar -75˚C’de saklandı

NÜKLEİK ASİT EKSTRAKSİYONU

QIAamp viral RNA Mini Kit ( QIAGEN,Hilden, Germany ) ticari kiti kullanılarak 220 nükleik asit ekstraksiyonu yapıldı ve -70˚C’de donduruldu

Multipleks PCRSeeplex RV detection kiti

A setinde; AdV HMPV HCoV 229E/NL63 HPIV 1-2-3

B setinde; IFV A-B RSV A-B RhV HCoV OC43/HKU1

Labopass RV detection kiti

AdV HboV (bocavirüs) HCoV EnV HPIV 1-2-3 RhV RSV A-B IFV A-B

Seeplex RV detection kiti protokolü

3 µL cDNA 3 μL of 8-methoxypsoralen (MOP) solution 4 μL of 5×RV Primer 10 μL of 2×master mix.

Toplam 20 µL final solusyonu elde edilir

94C’de 30 saniye 60C’de 1.5 dakika 35 siklus 72C’de 1.5 dakika

Çoğaltılan ürünler etidyum bromürle boyanıp %2 agarose jelde yürütüldü

Her virüsün markırı ve internal kontroller de yürütüldü

Seeplex RV detection kiti protokolü

Labopass RV Detection kiti protokolü

2 farklı PCR kit protokolü kullanıldı:

95C’de 3 dakika 95C’de 1dakika 35 siklus 72C’de 1 dakika 72C’de 5 dakika bekleme ve uzama evresi

42C’de 60 dakika 95C’de 3dakika 95C’de 1 dakika 35 siklus 55C’de 1dakika 72C’de 1 dakika 72C’de 5dakika final bekleme

Bu protokol de ; HCoV, EnV, HPIV 1-2-3, RhV, RSV A-B içindir.

Çoğaltılan ürünler etidyum bromürle boyanıp %2 agarose jelde yürütüldü

VİRÜS KÜLTÜRÜ

Multipleks PCR kitleriyle pozitif sonuç veren ve AdV, IFV, HPIV ve RSV taşıyan örneklere R-Mix Ready Cells ( Diagnostic Hybrids,USA ) ticari kitinin prosedürlerine uygun olarak shell vial kültürü yapıldı

DİZİ ANALİZİ

Kültür negatif, PCR pozitif olan 10 örnek için dizi analizi yapıldı

Otomatize sekanslama analizörü olan Applied Biosystems, USA ile çalışıldı

Sonuçlar Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) verileri kullanılarak verildi

BULGULAR

BULGULAR Virüsler Seeplex RV-12 Labopass RV

AdV 14 14

HCoV 229E 5 1

HCoV OC 43 4 2

IF-A 8 2

IF-B 9 1

HMPV 22

PIV- 1 0 2

PIV- 2 0 0

PIV- 3 4 1

RhV 18 6

RSV- A 39 60

RSV-B 33

BULGULAR

Seeplex RV-12 kitinde 220 örnekte 116 pozitif bulundu(%52.7)Labopass RV kitinde ise 220 örnekte 102 pozitif bulundu (%46.4)

Seeplex RV-12 kitinde koinfeksiyon oranı 15/220 (%6.8)Labopass RV kitinde ise 13/220 (%5.9) bulundu

BULGULAR

PCR’ın pozitif verdiği 103 örneğe shell vial kültürü yapıldı ve bunların 95 tanesinde üreme görüldü (Oran %90.3)

3 örnekte ise ikişer virüs üredi 95 örneğin

15’i AdV 6’sı IFV-A 9’u IFV-B 2’si PIV 63’ü RSV çıktı

Pozitif viral kültürün Seeplex RV-12 kitine oranı 99/103=%96

Pozitif viral kültürün Labopass kitine oranı 80/103=%78

BULGULAR

103 örneğin 50’si tutarlı sonuç verdi, her 3 yöntemde de aynı virüs bulundu

53 örnekte ise sonuçlar tutarsızdı, her 3 testte de farklı sonuçlar bulundu

Bu 53 sonucun 17 tanesinde sonuç belirsizdi. Her testle farklı ve birden çok virüs bulundu

Multiplex PCR pozitif, viral kültür negatif

Multiplex PCR pozitif, viral kültür negatif olan 10 örnek için dizi analizi yapıldı

Sonuçlar PCR ile %91-100 uyumlu çıktı Sadece 1 örnek PCR’da IFV-A iken, dizi analizinde rinovirüs

çıktı

TARTIŞMA

Pediyatrik hastalarda, viral pnömoni tanısını erken koymak tedavi için önemlidir

Hem gereksiz antibiyotik kullanımından kaçınılmış olur hem de IFV, EnV, AdV gibi bazı viral infeksiyonlarda özel antiviral tedavilerden faydalanılmış olur Bu çalışma da, kliniklere bu konuda faydalı olmak için 2 multipleks

PCR kiti ve shell vial kültür yöntemi karşılaştırılmış ve hangisinin klinik olarak daha etkin olduğunu göstermek için yapılmış prospektif bir çalışmadır.

TARTIŞMA

Respiratuvar virüslerin tanısı için en yaygın kullanılan yöntemler viral kültür ve sonrasında yapılan immunfloresan boyama yöntemleridir

ELISA ise hızlıdır ama sensitivitesi daha azdır Örneğin kalitesi, virüsün tipi, çalışan kişinin teknik hataları

bu yöntemlerde önemlidir Virüslerin teşhisinde virüs kültürü hala altın standarttır ama

kültür yapımında, solunum yolu örneğinin transportu ve depolama koşulları önemlidir üremeyi etkileyen faktörlerdendir

TARTIŞMA

Choi ve ark.2006’da yaptığı bir çalışmada direkt antijen testini, viral kültürü ve multipleks PCR yöntemini karşılaştırmış ve AdV,IFV ve RSV için tespit oranını sırasıyla %28.4, 36.2, 44.8 bulmuştur

Son zamanlarda en yaygın metot ise shell vial kültürü sonrası immunfloresan boyama olmuştur

Ama bu metot kolay değildir ve rutin laboratuvarlar için uygun değildir

TARTIŞMA

PCR yöntemleri iyi yöntemlerdir ama yanlış pozitiflik ve yanlış negatiflik dezavantajları vardır

Kültürden daha hızlı ve daha sensitiftir

Ayrıca HMPV gibi kültürde üretilmeleri zor olan bazı virüsler için de bu test bir avantajdır

TARTIŞMA

Bu çalışmada 2 multipleks PCR kiti ve viral kültür arasındaki uyum oranı %49 bulundu ( 50/103)

Viral kültürü yapılabilen sadece 4 virüs vardı: IFV, RSV, AdV, PIFV

2 multipleks PCR kiti arasında da uyumsuzluk vardı Seeplex RV kitinin pozitiflik oranı, Labopass PCR kitinden

daha yüksek bulundu Buna rağmen , Labopass PCR kitinin HMPV tespit etme oranı

Seeplex RV kitinden daha yüksek bulundu 2 PCR kiti arasındaki uyumsuzluk oranı %51 bulundu (53/103)

TARTIŞMA

Multipleks PCR kitleri arasındaki bu uyumsuzluk, kitlerin limitasyonlarından kaynaklanabilir

Bu sebeplerden biri, ekstraksiyon aşamasında PCR inhibitörlerinin temizlenememesi olabilir Böylece yanlış negatif sonuç çıkmış olabilir

Bir başka sebep te, kullanılan primerin nükleotid varyasyonu nedeniyle virüsü tespit edememesi olabilir Böyle bir durum varsa direkt antijen testi ve virüs kültürü PCR’ın

yerine kullanılabilir

TARTIŞMA

Seepleks RV’de koinfeksiyon oranı %7 (15/220) iken Labopass RV’de %6(13/220) bulundu

Daha önceki çalışmalarda da, şiddetli infeksiyonlarda double-virüs infeksiyonu görülmüştür (Bu çalışmada infeksiyonun şiddeti araştırılmamıştır)

Kültür negatif ve PCR pozitif 10 vaka direkt dizi analizi metoduyla değerlendirilmiş ve bu sonuçlar PCR ile karşılaştırılmıştır

Sonuç olarak

Solunum yolu virüslerinin PCR ile tesbiti hızlı ve kolaydır

Pozitiflik oranı virüs kültüründen yüksektir

Bu nedenle klinik laboratuvarlarda solunum yolu infeksiyonlarında ilk seçenek olmalıdır

Virüs kültürü ve dizi analizi ise sadece seçilen vakalarda yapılmalıdır