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© Ministerio de Salud
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Jr. Cápac Yupanqui 1400, Jesús María Telf. 471-3254 I Fax: 471-7443 Lima, Perú, 1997
Diseño e impresión: Art. Lautrec S.R. Ltda.
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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNOSTICO HISTOPATOLOGICO
COMITE DE REDACCION: Dra. Cecilia Morón Cortijo T.M. María Elena MUfloz Zamlbrano Dra. Myriam Yasuda Espinoza COMITE EDITOR: Dr. Alfonso Zavaleta Martínez-Vargas Dr. César Cabezas Sánchez Dr. Carlos Carrillo Parodi Dr. Jaime Chang Neyra
MINISTERIO DE SALUD ALTA DIRECCION Dr. Marino Costa Bauer Ministro Dr. Alejandro Aguinaga Recuento Viceministro INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Dr. Carlos Carrillo Parodi Jefe CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PUBLICA Dr. César Cabezas Sánchez Director General
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PERFIL DE LOS AUTORES Dra. Cecilia Morón Cortijo Médico Cirujano, Especialista en Patología y Laboratorio Clínico Jefe de la División de Patología y Patología Clínica, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA, T.M. María Elena Muñoz Zambrano Tecnólogo Médico División de Patología y Patología Clínica, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA Docente, Facultad de Tecnología Médica, Universidad Nacional Mayor de San Marcos
Dra. Myriam Yasuda Espinoza Médico Cirujano, Especialista en Patología Clínica Jefe de Laboratorio de Patología Clínica, División de Patología y Patología Clínica Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA. PERFIL DE LOS EDITORES Dr. Alfonso Zavaleta Martínez- Vargas Médico Cirujano, Doctor en Farmacología Director General, Centro Nacional de Control de Calidad, INS, MINSA. Profesor Principal, Sección Farmacología, Departamento Académico de Ciencias Fisiológicas, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia Miembro, Instituto de Medicina Tropical "Alexander Von Humbolt", Universidad Peruana Cayetano Heredia.
Dr. César Cabezas Sánchez Médico Cirujano, Master en Medicina Especialista en Enfermedades Infecciosas y Tropicales Director General, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA. Profesor invitado de Medicina Tropical, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Dr. Carlos Carrillo Parodi Médico Cirujano, Doctor en Medicina Profesor Principal, Departamento Académico de Microbiología, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Jefe, Instituto Nacional de Salud.
Dr. Jaime Chang Neyra Médico Cirujano, Master of Science in Community Health in Developing Countries Director Ejecutivo de Certificación y Garantía de la Calidad, Centro Nacional de Control de Calidad, Instituto Nacional de Salud, MINSA. Investigador, Instituto de Medicina Tropical "Alexander Von Humbolt", Universidad Peruana Cayetano Heredia. La edición de este Manual se efectuó en el marco del Convenio de Cooperación suscrito entre el Instituto Nacional de Salud y la Universidad Peruana Cayetano Heredia. B Comité Editor agradece al Dr. Jorge Barnaby Rodríguez, por la revisión y los comentarios efectuados a esta obra.
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INDICE
Presentación ............................................................................................................................................. 7 Resolución Jefatural ................................................................................................................................. 8 CAPITULO I Introducción ............................................................................................................................................. 9 CAPITULO II Normas de Bioseguridad .......................................................................................................................... 10 CAPITULO III Obtención de Muestras ............................................................................................................................. 13 CAPITULO IV Fijación y Envío de Muestras ................................................................................................................... 15 CAPITULO V Deshidratación, Aclaramiento, Inclusión ................................................................................................. 17 CAPITULO VI Corte ......................................................................................................................................................... 23 CAPITULO VII Tinción ..................................................................................................................................................... 26 CAPITULO VIII Diagnóstico Citológico............................................................................................................................. 28 CAPITULO IX Coloraciones especiales............................................................................................................................ 31 CAPITULO X Inmunohistoquímica ................................................................................................................................. 33 CAPITULO XI Bibliografía............................................................................................................................................... 36 CAPITULO XII (Anexos)................................................................................................................................................... 37 Anexo 1: Fijadores ................................................................................................................................... 38 Anexo 2: Coloraciones Rutinarias............................................................................................................ 39 Anexo 3: Coloraciones Especiales ........................................................................................................... 41 Anexo 4: Soluciones en lnmunohistoquímica .......................................................................................... 49 Anexo 5: Solicitud de Examen Histopatológico....................................................................................... 50
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PRESENTACION
Los métodos histopatológicos continúan siendo herramientas importantes para el diagnóstico de enfermedades transmisibles y no transmisibles.
Gracias al desarrollo de nuevas técnicas, se ha incrementado la capacidad de detectar la presencia
en las muestras de diferentes tejidos de: agentes patógenos, de antígenos y anticuerpos, y de cambios en los tejidos y sus componentes. Entre las áreas en las que el avance ha sido más significativo podemos mencionar, como ejemplo, a la inmunohistoquímica.
Para el mejor aprovechamiento de estas herramientas diagnósticas, se requiere de la obtención y
preparación adecuadas de las muestras antes de su examen. Por esto, con el objeto de contribuir a mejorar la calidad del diagnóstico histopatológico en los laboratorios de los servicios de salud, el Instituto Nacional de Salud pone a disposición de la comunidad técnico científica nacional el "Manual de Procedimientos de Laboratorio para el Diagnóstico Histopatológico", que esperamos constituya una herramienta de consulta básica en la Red Nacional de Laboratorios de Salud.
EL COMITE EDITOR
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CAPITULO I
INTRODUCCION
La técnica para el diagnóstico histopatológico comprende la preparación de los tejidos para su estudio microscópico, sometiéndolos a una serie de procesos: fijación, deshidratación, aclaramiento, inclusión, corte y tinción. El manual está elaborado con una aproximación simple y práctica, de tal manera que su contenido sea fácilmente accesible al personal que labora en laboratorios de Patología. El principal objetivo del manual es uniformizar la metodología empleada en el procesamiento del tejido, desde que la muestra es enviada al Laboratorio de Patología, hasta obtener el producto final en la mesa del patólogo. Esperamos, asimismo, que sirva de una guía base, que pueda ser enriquecida en el tiempo con nuevos aportes. El manual está dividido en las siguientes secciones: - Bioseguridad: Fundamental en el manejo y funcionamiento de todo laboratorio. Señalaremos los
principales factores de riesgo ocupacional en el laboratorio de Patología, y cómo contrarrestarlos de la mejor manera.
- Procesamiento de la muestra, desde su obtención hasta la tinción. - Diagnóstico citológico: será abordado en forma breve. Secciones especiales: Coloraciones especiales e inmunohistoquímica.
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CAPITULO II
BIOSEGURIDAD
Bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas mínimas para proteger la salud y seguridad del personal que trabaja en el laboratorio frente a diferentes riesgos biológicos. 2.1 FACTORES DE RIESGO OCUPACIONAL
Estos se pueden agrupar en varias categorías: 2.1.1 Físicos
- Mecánicos: Cuchillas de micrótomo rotatorio, criostato. - Térmicos: Estufas, mecheros. - Radiación: Microscopio de luz ultravioleta
2.1.2 Químicos - Colorantes: Estas sustancias por la naturaleza de su estructura son tóxicas e irritantes para los
ojos, sistema respiratorio y piel; algunas de ellas pueden ser explosivas y otras son potencialmente cancerígenas. Ejemplo: Hematoxilina, Acido pícrico, etc.
- Reactivos: a) Acidos: Los accidentes más frecuentes son las proyecciones de ácidos sobre las manos, ojos y
cara. b) Alcalis: En forma sólida o en solución. Ejemplo: Hidróxido de sodio. c) Solventes orgánicos: Xilol, potencialmente cancerígeno; Eter, produce depresión del sistema
nervioso. d) Gaseosos: Formol (solución saturada de gas formaldehído en agua, aproximadamente 40% de
gas en peso), es irritante para las fosas nasales y puede provocar dermatitis. 2.1.3 Biológicos: - Parásitos - Bactérias - Virus - Hongos 2.1.4 Ergonómicos: - Instalaciones físicas de la Institución - Diseño inadecuado de Laboratorio - Ventilación inadecuada. 2.2 PROGRAMA DE SEGURIDAD
La seguridad es fundamental en el manejo y funcionamiento de todo laboratorio. El personal de laboratorio debe estar consciente sobre los riesgos presentes y conocer cómo hacerles frente.
2.2.1 Consideraciones generales
Un ambiente confortable y seguro provee una sensación de seguridad y reduce la aprehensión respecto a la manipulación de espécimenes, reactivos o equipos. Todo el personal debe estar consciente de los riesgos y saber como prevenirlos. Para incrementar el conocimiento y la experiencia al respecto, es necesario contar con:
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a) Manual de Procedimientos operativos, donde consten todas las funciones del Laboratorio,
procedimientos, equipos y productos químicos dentro de cada laboratorio. b) Manual de Seguridad: Debe cubrir requerimientos de seguridad específicos y directivas para cada
unidad del laboratorio. Es responsabilidad de la Jefatura del Departamento el manejo sin riesgo de un Laboratorio, y elaboración de éste manual.
c) Entrenamiento en Seguridad: El tener los dos manuales previos no va a evitar los accidentes. Informaciones que sean actualizadas, relevantes, deben de darse periódicamente; asimismo deben acompañar la introducción de nuevos procedimientos, químicos, reactivos, o agentes infecciosos.
Se deben programar (al menos anualmente) capacitaciones a los trabajadores en temas como resucitación cardiopulmonar y primeros auxilios.
2.2.2 Consideraciones sobre el factor de riesgo químico
Los factores de riesgo químico pueden disminuir teniendo en cuenta las siguientes medidas generales de prevención:
a) Uso de señales de peligro y rótulos: Todos los reactivos deben estar rotulados, señalando las
precauciones a tener en cuenta. b) Empleo de ropa de protección: Guantes protectores, mandiles, protectores raciales o gafas
protectoras y mascarilla. c) Manejo de químicos: Colocar los recipientes que contienen químicos peligrosos en su sitio y
mantener el área de trabajo organizada y limpia. Esto reducirá los derrames accidentales y roturas. Con sustancias peligrosas como el xilol, evitar el contacto directo en lo posible; usar pinzas para introducir láminas en el xilol.
d) Almacenaje de inflamables: Se recomienda que los reactivos inflamables sean colocados en posición fácilmente accesible y lo más cercano al piso.
e) Eliminación de químicos: El método de eliminación (incineración, dilución, eliminación por el sistema de drenaje, autoclave) depende del tipo de químico y sus especificaciones.
2.2.3 Consideraciones sobre el factor de riesgo biológico
Todas las muestras son potencialmente infecciosas, y es prudente, por tanto, manejar estos materiales en forma tal que permita reducir razonablemente la exposición del personal a los patógenos. a) Implementos de protección: - Todo el personal que manipula muestras fijadas debe usar mandil y guantes. - Usar guantes dobles, protectores faciales o gafas y mascarilla, aquellos que manipulan o
disecan especímenes no fijados. b) Manejo de especímenes:
- Los espécimenes deben ser colocados en recipientes a prueba de derrames o en bolsas plásticas seguras. Si el recipiente primario está contaminado por fuera, debe colocarse en un contenedor secundario seguro, antes de transportarlo al laboratorio.
- La hoja de solicitud de examen debe mantenerse no contaminada, si ocurriera, debe ser descartada y reemplazada.
- Los tejidos deben ser fijados lo más pronto posible. Si se va a retener especímenes no fijados,
deben ser colocados en bolsas plásticas dobles y guardarlos en el refrigerador y rotulados como material peligroso. .
- Los extendidos vaginales, improntas y extendidos de fluidos corporales deben considerarse contaminados hasta que sean fijados (con alcohol corriente, o una solución de alcohol-éter) o hasta que sean teñidos y montados en la lámina.
- Los fluidos corporales usados para preparar extendidos o block cells son extremadamente peligrosos. Mientras se decantan o fraccionan gran cantidad de fluidos, se debe usar doble par
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de guantes, mandilones, y protector facial. Si el riesgo de dispersión de gotas es alto, realizar el procedimiento en cabina de seguridad biológica para contener cualquier fluido dispersado.
c) Descontaminación:
- La mesa de trabajo debe ser lavada con detergente, enjuagar con agua, limpiar con tela remojada en lejía al 10% o 1% u otro germicida y finalmente enjuagar con agua.
- Lavar el instrumental con detergente, enjuagar con agua y descontaminar con lejía al 10% u
otro germicida. Una exposición de \O minutos es suficiente. - Toda la ropa e implementos descartables contaminados deben colocarse en recipiente de
seguridad para ser autoclavados antes de su eliminación. Si es ropa: toallas, reusables, deben colocarse en bolsas plásticas y enviarlas a la lavandería de la Institución.
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CAPITULO III
OBTENCION DE LA MUESTRA
El estudio anatomopatológico se lleva a cabo en muestras obtenidas por biopsia, especímenes quirúrgicos o especímenes de necropsias (post mortem). La biopsia es un fragmento de tejido que se extrae de un área representativa de una lesión, y que nos brinda información histológica para el diagnóstico. Puede ser obtenida de cualquier órgano mediante diversos procedimientos, muchos de ellos realizados únicamente por personal médico especializado, como endoscopías, broncoscopías, legrados uterinos, etc. La biopsia de piel es la de más fácil acceso, pudiendo ser realizada por personal paramédico; asimismo la toma de muestras post-mortem. 3.1 BIOPSIA DE PIEL
3.1.1 Técnica para la toma de muestra
Las técnicas más comunes para la obtención de muestras de piel son: sacabocado (punch), biopsia por excisión y biopsia por incisión. Lo primero es realizar una buena asepsia y anestesia, cualquiera que sea la técnica a emplear. En lo posible debe seleccionarse un área sana, y otra con la lesión. Una vez seleccionada la lesión o el área a ser biopsiada, se realiza la asepsia con agua y jabón, seguido de un antiséptico. Se aisla la zona con gasas estériles (campos). Se infiltra con anestésico. Inmediatamente después de obtenida la muestra, debe ser colocada en un fijador para evitar que se seque o que se inicie el proceso de degradación del tejido (autólisis).
3.1.2 Biopsia por sacabocado (punch):
El sacabocado es un instrumento que consta de un mango cilíndrico que tiene en uno de sus extremos una cuchilla circular con un diámetro fijo.
- Tomar el sacabocado entre los dedos índice, medio y pulgar, presionar firmemente perpendicularmente a la epidermis y girar secuencialmente en el mismo sentido y sentido contrario a las manecillas del reloj hasta obtener la profundidad deseada.
- Retirar el sacabocado. - Con una aguja hipodérmica se engancha y tracciona hacia arriba la biopsia cilíndrica,
seccionándola en su porción más inferior con bisturí o tijera. - Colocar la biopsia en el fijador INMEDIATAMENTE. - Presionar la herida con gasa por 5 minutos para controlar el sangrado. - Dejar la herida cubierta con venda adhesiva o apósitos.
3.1.3 Biopsia por Excisión:
Es la resección de toda la lesión para el estudio anatomopatológico. Está indicada cuando la lesión es bien delimitada y mide menos de 1 cm de diámetro. La incisión quirúrgica se realiza con hoja de bisturí.Debe incluir un margen de piel sana. Se hace un corte perpendicular a la epidermis. El eje mayor de la biopsia debe seguir el sentido de los pliegues cutáneos. Inmediatamente se coloca la biopsia en fijador. La sutura se realiza con seda o nylon 4/0 ó 5/0.
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3.1.4 Biopsia por Incisión:
Es la resección de una parte de la lesión. Se realiza cuando la lesión es de gran tamaño. Con una hoja de bisturí se realiza la incisión en forma de cuña o fusiforme, perpendicular a la epidermis. Inmediatamente se coloca la biopsia en el fijador. La sutura se realiza con seda o nylon 4/0 ó 5/0.
3.2 ESPECIMENES POST MORTEM
Es necesario que se obtenga lo más pronto posible después del fallecimiento, pero si es inevitable el retraso, el cadáver debe ser colocado en refrigeración (a 4° C). Las muestras post mortem pueden dar información al patólogo hasta 12 horas después del fallecimiento, pero cuanto menos tiempo transcurra, el diagnóstico será más confiable. Como ilustración nos referiremos a la técnica de la Incisión para obtención de tejido hepático post mortem: − Con un bisturí o cuchilla corriente hacer incisión oblicua de aproximadamente 7 cm partiendo
de la línea media clavicular derecha, debajo del reborde costal y continuando hacia abajo ya la derecha. Luego profundizar la incisión hasta encontrar el hígado.
− A continuación sujetar el hígado con pinzas y realizar un corle para obtener fragmentos de
3x3cm aproximadamente. − Para fijar los fragmentos hay que adelgazarlos, y estos preferiblemente no deben ser mayores de
5 mm de grosor. − Colocar en fijador (formal al 10%). Si la muestra va a ser procesada por técnicas
inmunohistoquímicas, debe utilizarse formal neutro.
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CAPITULO IV
FIJACION Y ENVIO DE MUESTRAS
En cuanto se extirpa un tejido del organismo o se priva de su irrigación, éste empieza a descomponerse, lo cual es una consecuencia de la falta de oxígeno y metabolitos esenciales, de la acumulación de CO2 y otros productos del metabolismo celular y de la acción de diversas enzimas (autólisis). Para preservar el estado natural de los tejidos es indispensable detener cuanto antes estos procesos de descomposición. Para este propósito, debe colocarse el tejido en un volumen adecuado de una solución fijadora, lo más pronto posible después de la extirpación. 4.1 FIJACION
Es el proceso mediante el cual los elementos constitutivos de los tejidos son tejidos, en cuanto a su estado físico y parcialmente también en su estado químico, de manera que puedan resistir el tratamiento sucesivo con varios reactivos sin distorsión importante de sus estructuras o descomposición. En condiciones ideales un fijador debe penetrar rápidamente al tejido, su acción debe ser inmediata, y debe causar una pérdida y alteración química y física mínima de las células y sus componentes. La mayoría de fijadores producen cierto endurecimiento tisular, facilitando así el corte; pero generalmente este efecto endurecedor es reforzado por la acción de alcoholes, que son empleados durante el proceso de deshidratación (ver Capítulo V). Los fijadores también aumentan, por lo general, la diferenciación óptica de las estructuras tisulares, y reducen el riesgo de infección en las personas que manejan los tejidos. 4.1.1 Principios Generales de Fijación de las Muestras
a) Cantidad de Fijador: Debe ser aproximadamente 10 a 20 veces el volumen de la muestra, así por ejemplo:
Muestra de 0,5 x 0,5 cm: 6 a 10 mL
Muestra de 0,5 x 1 cm: 10 a 15 mL
Muestra de 2 x 1 cm: 20 a 40 mL
Muestra de 2 x 2 cm: 40 a 80 mL
h) Deben colocarse en frascos preferentemente de plástico, de boca lo suficientemente ancha para que el tejido pueda ser extraído del frasco sin dificultad. Una vez que el tejido está fijado se endurece, y si el frasco es muy pequeño, en relación al volumen de la muestra, surgen dificultades al intentar extraerlo del frasco.
c) El fijador empleado rutinariamente en Patología es el formol al 10% en solución acuosa o
en solución acuosa tamponada (formol neutro) (ver Anexo 1), pero existen otros que mencionaremos para su conocimiento: Fijador de Zenker: Es un fijador de sales mercuriales. Tienden a mejorar la tinción de núcleos y el tejido conjuntivo. Preserva mejor los detalles para fotografías. Fijador de Bouin: Es un fijador derivado del ácido pícrico. Es uno de los mejores fijadores para el estudio del glucógeno y que penetra rápidamente al tejido.
d) Tempo de Fijación: Varía según el fijador que se utilice y el tamaño de la muestra. Con el
fijador de uso común, el formol al 10%, las biopsias pequeñas pueden tomar 6 horas
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aproximadamente en fijarse. Las muestras grandes toman aproximadamente 24 horas. Se pueden dejar en el líquido fijador por más tiempo, pero si los tejidos van a ser sometidos a procedimientos especiales como Inmunohistoquímica, requieren idealmente un tiempo de fijación máximo de 24 horas. (Ver Capítulo X).
4.2 ENVIO DE MUESTRAS
Todos los espécimenes para examen histopatológico deben ser remitidos con su ficha de envío de muestra correctamente llenada. (ver Anexo 5). El recipiente conteniendo la biopsia debe ser rotulado claramente con el nombre del paciente, la naturaleza del espécimen, (hígado, pulmón, etc.). El recipiente se tapa herméticamente, se sella con esparadrapo, y se coloca en una caja de cartón, protegiendo el frasco para evitar roturas, si es de vidrio rellenar con papel, espuma plástica. No necesita refrigeración. Las muestras deben remitirse en frascos con fijador. (ver 4.1.) Son criterios para rechazar una muestra para estudio anatomo-patológico:
- Recipiente del espécimen sin rotular. - Discrepancia entre la ficha de envío de muestra y el rótulo del recipiente. - Inadecuada o insuficiente información en la ficha de envío de muestra. - Inadecuado envío.
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CAPITULO V
DESHIDRATACION, ACLARAMIENTO E INCLUSION
5.1 MANEJO AUTOMATICO DE LOS TEJIDOS
En la actualidad el proceso de deshidratación, aclaramiento, y la preparación para la inclusión de los tejidos se llevan a cabo con alguno de los aparatos automáticos de que se dispone en el mercado. Se trata en general de un huso central giratorio que lleva en el extremo del brazo horizontal una canastilla. Un sistema de relojería eléctrico hace girar una tarjeta circular con muescas, en cuya circunferencia se desliza un "diente" equilibrado por un resorte. El número de muescas o perforaciones es de acuerdo al esquema de tiempo deseado: Cuando el diente cae dentro de una muesca echa a andar un motor que eleva el huso central, el cual por efecto de un tomillo fijo gira automáticamente y la canastilla baja en la solución. Un pequeño movimiento vertical repetido del brazo lateral que eleva la canastilla agita continuamente ésta dentro de la solución. Finalmente, dos recipientes o vasos metálicos contienen la parafina que se mantiene a una temperatura constante, de aproximadamente 56° C, por efecto de termostatos dentro de las paredes de los recipientes (Fig. 2a). Existen también en el mercado procesadores automáticos con reloj digital, sistema que reemplaza la tarjeta circular con muescas descrita anteriormente. (Fig. 2b)
5.2 ESQUEMAS DE TIEMPO PARA LA DESHIDRATACION, ACLARAMIENTO E INCLUSION EN PARAFINA
El tejido (biopsia o pieza quirúrgica) a ser procesado es descrito en sus características macroscópicas por el médico patólogo, luego de lo cual procede a tomar cortes representativos de la lesión y lo introduce en cápsulas o canastillas metálicas para que a continuación sea sometido al proceso de deshidratación, aclaramiento e inclusión.
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Podemos dar el siguiente ejemplo de un esquema de 12 horas automatizado:
Alcohol etílico corriente 1 hora Alcohol etílico corriente 1 hora Alcohol etílico corriente 1 hora Alcohol etílico absoluto 1 hora Alcohol etílico absoluto 1 hora Alcohol etílico absoluto 1 hora Xilol 1 hora Xilol 1 hora Xilol 1 hora
Paralina 1 hora Paralina 2 horas
Este procesamiento de tejidos también se puede realizar en forma manual. Un esquema acortado que nos da resultados aceptables en el método manual es:
Alcohol etílico corriente 45 a 60 minutos Alcohol etílico corriente 45 a 60 minutos Alcohol etílico corriente 45 a 60 minutos Alcohol etílico absoluto 45 a 60 minutos Alcohol etílico absoluto 45 a 60 minutos Alcohol etílico absoluto 45 a 60 minutos Xilol 45 a 60 minutos
Xilol 45 a 60 minutos Parafina 45 a 60 minutos Parafina 45 a 60 minutos
En el tercer alcohol absoluto se puede interrumpir el procedimiento y dejar los tejidos en él hasta el día siguiente. Los resultados con el método manual no son tan óptimos como con el equipo automatizado, sobre todo por la falta del movimiento vertical que agita continuamente las sustancias químicas y los tejidos. Pero realizando secciones finas de los tejidos, y procesando pocos tejidos por vez (ejemplo 4 secciones de 2xl cm en un frasco con 100 mL de alcohol), se puede parcialmente
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subsanar la falta de un equipo automatizado.
5.3 DESHIDRATACION
- Los tejidos contienen grandes cantidades de agua que debe ser eliminada y reemplazada por parafina. Este proceso se denomina deshidratación.
- El mejor agente para ello es el alcohol etílico.
- La deshidratación se logra mejor utilizando alcoholes de menor a mayor concentración.
No es aconsejable el paso directo del tejido del formol al alcohol concentrado ya que provoca distorsión del tejido.
- Los alcoholes deben ser renovados dependiendo de la frecuencia de uso y de la cantidad
de tejidos introducidos en ellos; se descarta el primer recipiente de alcohol y el segundo queda como primero; en el último se coloca de nuevo alcohol absoluto.
- El volumen de alcohol debe ser aproximadamente 10 veces el volumen del tejido a
deshidratar.
5.4 ACLARAMIENTO (Desalcoholización)
Permite que el alcohol de los tejidos sea reemplazado por un líquido que disuelva la parafina con la cual el tejido va a ser impregnado. Además, muchas de estas sustancias tienen la propiedad de volver transparentes los tejidos. También se utiliza para la desalcoholización de los cortes teñidos, antes de montarlos en Bálsamo de Canadá o Permount u otro. - El solvente de parafina más usado es el Xilol. - El volumen mínimo debe ser 10 veces el volumen del tejido. - Nunca debe dejarse los tejidos en Xilol más de 3 horas; si no es difícil hacer los cortes. - Cuando la deshidratación no es completa, el xilol toma un aspecto lechoso cuando se le añade el
tejido. - Otros agentes aclarantes son: Tolueno, Cloroformo, Aceite de cedro, entre otros.
5.5 INCLUSIÓN
Comprende la impregnación de los tejidos con un medio que llene todas las cavidades naturales, y que proporcione la consistencia firme necesaria para hacer cortes bien delgados sin provocar distorsión.
- La inclusión en parafina es la más usada y más simple. - Un sustituto de la parafina es el Paraplast® (combinación de parafina con polímeros
plásticos). - El volumen del medio de impregnación debe ser aproximadamente 25 veces mayor que el
volumen del tejido.
5.5.1 Moldes para Bloques
Son de varios tipos: a) "L" de inclusión: Consiste en dos piezas en forma de L de material pesado tipo bronce, que
descansan sobre una base metálica plana. b) Moldes plásticos para inclusión: Consiste en una base de plástico o de acero inoxidable dentro
de la cual se incluye la pieza tisular. Luego se pone encima un molde de plástico que se llena de parafina, dándole mayor soporte al bloque.
c) Centro de Inclusión: Son unidades multifuncionales usualmente equipadas con dispensador de parafina, porta espécimenes, platillo caliente para orientar el espécimen en la parafina derretida y platillo frío para transformar la parafina en un bloque sólido después que el espécimen ha
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sido orientado.
5.5.2 Técnica
- Se recomienda un punto de fusión para la parafina entre 54 y 58° C. - Mantener la parafina líquida en el recipiente final de parafina del procesador automático,
el cual se pasa a la mesa de trabajo. - Se coge una cápsula metálica que contiene el tejido procesado. Se extrae el tejido de la
cápsula y se coloca en el molde para hacer bloques llenos con parafina derretida. La cara del tejido donde se quieren hacer los cortes se coloca hacia abajo, y los tejidos deben orientarse cuidadosamente para que el plano de corte sea el deseado (ver 5.5.3 orientación del espécimen).
- Una vez que los tejidos han sido incluidos así, y en cuanto la parafina se solidificó en parte, los moldes se colocan en un recipiente con hielo por 30 minutos o toda la noche, lo cual reduce la tendencia de algunas parafinas a cristalizarse y permite obtener bloques de consistencia firme y uniforme.
- Retirar el molde, quedando el bloque de tejido parafinizado listo para cortar. 5.5.3 Orientación del Espécimen
El técnico debe revisar minuciosamente cada uno de los fragmentos de tejido, analizar su estructura y decidir cómo colocar el tejido en el bloque. Es por tanto, necesario tener un conocimiento básico de la estructura tisular macroscópica y anatomía, se recomienda siempre la comunicación con el patólogo. a) Consideraciones generales
- Las secciones de tejido son incluidas perfectamente planas para poder obtener una sección completa (ver Figura 3).
- La orientación debe ser tal que la resistencia que el tejido ofrece a la cuchilla vaya desde la menor hacia la mayor cantidad conforme el bloque es seccionado. Esto produce secciones más lisas. (Ver Figura 4)
- Estructuras tubulares: Como vasos deferentes, trompas de Falopio, arterias, deben incluirse de tal modo que la cuchilla corte a través del lumen. La cuchilla debe cortar perpendicularmente al eje mayor del tubo (ver Figura 5).
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- Superficie epitelial: Tejidos con superficie epitelial como piel, intestino y vesícula, deben
colocarse de modo que el plano de sección atraviese todas las capas del tejido. La superficie epitelial debe ir arriba del bloque, de tal modo que se corte al final, así se minimiza la compresión, rasgaduras y cortes en las capas subcutáneas (ver Figura 6).
- Múltiples espécimenes: Deben colocares lado a lado, con espacio entre ellos. Si se colocan
uno encima del otro hay mayor posibilidad que el tejido inferior distorsione al superior (ver figura 7).
- Estructuras quísticas: Los quistes disecados tienen forma de media luna. El quiste debe ser
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incluido con la superficie de corte hacia abajo, de tal forma que la cuchilla corte a través de todas las capas de la pared quística (ver figura 8).
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CAPITULO VI
CORTE DE LOS TEJIDOS
6.1 CUCHILLAS DE MICROTOMOS
La selección de la cuchilla de micrótomo (de acero inoxidable, diamante, vidrio, o cuchilla descartable) depende de la estructura del espécimen a ser seccionado y el medio usado para la inclusión. - Cuchillas de acero inoxidable: Para cortar parafina. La longitud de las cuchillas varía de 110 mm a
250 mm. - Descartables: Excelentes para cortes en parafina. Existen disponibles en diversos tamaños y
grosores. El porta cuchillas descartables debe mantenerse limpio y bien lubricado, para que la cuchilla esté segura.
- Diamante o vidrio: Para espécimenes incluidos en resinas, pues tienen filos más gruesos.
6.2 AFILADO DE LAS CUCHILLAS
Puede hacerse a mano o a máquina, de acuerdo a procedimientos internacionales recomendados. 6.2.1 A mano
Se hace utilizando una de éstas dos formas: - Con piedra de afilar: Es una piedra natural o superficie dura para afilar un cuchillo u otro
instrumento cortante. Utilizan aceite como lubricante. - Con placa de vidrio: Se usa con polvo abrasivo.
6.2.2 Afiladores automáticos 6.3 MICROTOMOS
6.3.1 Tipos de micrótomos
- Rotatorio: El más usado, donde el bloque se mueve. La cuchilla se ubica con el filo hacia arriba (Fig. 9)
- De deslizamiento: La cuchilla es la que se mueve, es particularmente útil cuando se seccionan grandes bloques (ejemplo: cortes de pulmón entero).
6.3.2 Grosor del corte
- El grosor ideal es de 3 a 4 micras. Esto reduce la superposición de núcleos.
6.3.3 Orientación del bloque
- Debe ser correctamente ubicado en el micrótomo, para obtener preparaciones de la superficie entera, libre de líneas, pliegues, o distorsión celular.
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6.3.4 Sección del bloque
Antes de seccionar el bloque, examinarlo y establecer cómo debe ser colocado en el sujetador de bloque del micrótomo. Una vez que el bloque está seguro en el sujetador, iniciar el corte grueso, avanzando repetidamente el bloque manualmente obteniendo cortes, detenerse cuando la superficie del bloque entera es expuesta. Enfriar la cuchilla y el bloque brevemente con un cubo de hielo. Luego se procede a hacer cortes finos sucesivos que forman una "cinta" de tejido, para lo cual la manija debe ponerse a velocidad lenta. Colocar el corte fino en la superficie del baño de flotación.
6.3.5 Flotación
El baño de flotación debe ser calentado a pocos grados bajo el punto de fusión de la parafina. El uso de agua destilada en el baño ayuda a eliminar burbujas (puede usarse agua de caño) (ver 6.3.7). La cinta de tejido es puesta gradualmente en el baño de flotación para eliminar arrugas y aire atrapado. Los cortes son luego puestos en láminas limpias ya rotuladas con el código del tejido. Son secadas verticalmente en el secador de láminas a temperatura de 37 a 40° C de un día para otro o a 58°C en estufa por 20 a 30 minutos.
6.3.6 Adhesivos para tejidos
El adhesivo más usado es la gelatina. También se utiliza albúmina bovina. Se coloca una capa de albúmina sobre la lámina en que se recoge el tejido del baño de flotación.
6.3.7 Preparación de agua de caño para el baño de flotación:
Acido clorhídrico al 1% ................................................. 20,0 mL Agua de caño.............................................................. 4000,0 mL
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Agregar lentamente ácido al agua. Llevar la solución a ebullición. Enfriar y agregar al baño de flotación conforme se necesite. El hervido remueve el CO2 del agua, reduciendo la formación de burbujas de aire. El ácido clorhídrico al 1% previene la precipitación de sales minerales que ocurre luego que el CO2 ha hervido.
6.4 DIFICULTADES EN LA REALlZACION DE LOS CORTES
6.4.1 Dificultades que provienen de mala fijación
- Bloques blandos que al cortarse pueden quebrarse, por fijación incompleta. - Bloques duros, que pueden hacer vibrar la cuchilla, produciendo en el corte líneas paralelas al filo de la cuchilla, o dando cortes alternativamente gruesos y finos. Esto por fijación prolongada en fijadores como Zenker o Bouin.
6.4.2 Dificultades que provienen de defectuosa deshidratación, aclaramiento o inclusión
- Si el tejido ha sido insuficientemente deshidratado, el aclarador se vuelve lechoso. El aclaramiento y la impregnación con parafina no puede completarse, resultando un bloque blando. Si esto ocurre se puede remediar volviendo a tratar el tejido con alcohol absoluto. - El aclaramiento insuficiente hace que el tejido aparezca opaco o nebuloso, haciendo muy difícil el corte. Si el tejido ya ha sido incluido en bloques, estos deben ser regresados al baño de parafina hasta que se fundan completamente y pueda regresarse al aclarador para continuar el proceso.
- La impregnación insuficiente puede producir un bloque "húmedo" que tiende a desmoronarse. La impregnación prolongada endurece demasiado el tejido y lo encoge más.
6.4.3 Dificultades que provienen del tejido
- Para tejidos grasos es mejor hacer cortes más delgados con el bisturí (2 mm). - Hay ciertos tejidos que suelen endurecerse mucho como el cervix. Se obtienen mejores
resultados si se reemplaza los agentes deshidratantes y aclaradores por tetrahidrofurano.
6.4.4 Dificultades que provienen de la cuchilla
- Si la cuchilla no se fija bien al micrótomo, puede saltar, especialmente al cortar tejidos duros.
- Si la cuchilla se ladea demasiado, se raspa más de lo que se corta y puede ser imposible
obtener un corte.
- Se producen cortes de grosor irregular por mal ajuste del sujetador del bloque.
- Una cuchilla roma no puede producir buenos cortes. Las dentaciones o pequeñas melladuras en el filo de la cuchilla rayan o raspan los cortes en la dirección del movimiento. Si la cuchilla no está bien afilada puede ser difícil obtener "cintas" de tejido. Un borde romo produce distorsión y compresión del corte y aumenta cualquier tendencia a formación de pliegues.
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CAPITULO VII
TINCION Y MONTAJE
7.1 TlNCION
La tinción de los cortes histológicos permite estudiar y conocer las características físicas de los tejidos y las relaciones entre las células que los constituyen.
Se efectúa generalmente usando mezclas de sustancias químicas denominadas colorantes. Los colorantes utilizados se pueden clasificar como ácidos, básicos o neutros. Los componentes de los tejidos que se tiñen fácilmente con colorantes básicos se denominan basófilos; reciben el nombre de acidófilos aquellos que se unen a colorantes ácidos. El azul de toluidina y el azul de metileno son ejemplos de colorantes básicos, así como la hematoxilina. Los componentes más importantes de los tejidos que reaccionan con los colorantes básicos son las nucleoproteinas y los glucosaminoglicanos ácidos, debido a los grupos ácidos ionizables que contienen. Colorantes ácidos tales como el Orange G, la Eosina y la Fucsina ácida tiñen principalmente los componentes básicos de las proteínas citoplasmáticas.
7.1.1 Tinción con Hematoxilina y Eosina (H-E) Existen dos procedimientos de Hematoxilina que son los más usados: a) Método de Harris:
Es un método regresivo, pues tiñe todas las estructuras (núcleo, citoplasma, tejido conectivo, etc.) y es seguido por una decoloración controlada y "azuleamiento" para llegar al óptimo resultado de tinción nuclear.
Procedimiento:
- Xilol 5 minutos (2 baños). - Alcohol absoluto 5 minutos - Alcohol corriente 5 minutos (2 baños). - Agua de caño. - Hematoxilina 3 minutos. - Agua de caño. - Alcohol acido 1% 1 o 2 segundos - Agua amoniacal 30 segundos. - Agua de caño. - Eosina 2 minutos. - Alcohol corriente 5 minutos (dos baños). - Alcohol absoluto 5 minutos. - Xilol 5 minutos (2 baños). - Montaje.
Resultados: Núcleo ........................................................................…………………………………....azul Citoplasma .................................................................…………………………………….rosado-rojo Otras estructuras tisulares ..........................................…………………………………….rosado-rojo
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b) Método de Mayer:
Es un método progresivo que tiñe sólo el núcleo. La coloración prosigue hasta lograr la intensidad deseada de coloración. Un mejoramiento del color azul se logra lavando las láminas en agua de caño. Procedimiento:
- Xilol 5 minutos (2 baños). - Alcohol absoluto 5 minutos. - Alcohol corriente 5 minutos (2 baños). - Agua de caño. - Hematoxilina 15 minutos. - Agua de caño 15 minutos. - Agua destilada. - Alcohol corriente 2 minutos. - Eosina 2 minutos. - Alcohol corriente 2 minutos (2 baños). - Alcohol absoluto 2 minutos. - Xilol 2 minutos (2 baños). - Montaje. Resultados: Núcleo……………………………………………………………………………………azul Citoplasma .................................................................…………………………………..rosado-rojo Otros tejidos ...............................................................…………………………………..rosado-rojo
7.2 MONTAJE
El paso final en la preparación de una lámina es cubrir la porción que contiene el tejido con una laminilla. Esto hace a la lamina permanente y permite el examen microscópico. Para fijar la laminilla se pueden usar medios de 3 tipos: a) Resinas naturales:
Bálsamo de Canadá: Fue el estándar en el pasado, pero toma mucho tiempo en secar.
b) Resinas sintéticas: Actualmente las más usadas. Entre ellas tenemos el Permount, Cytoseal , etc. c) Medios acuosos: Se usa cuando los colorantes o estructuras son destruidas o alteradas por
deshidratación o aclaramiento. Entre éstos tenemos gelatina de glicerina y medio de montaje de alcohol polivinil.
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CAPITULO VIII
DIAGNOSTICO CITOLOGICO
La citología exfoliativa consiste en estudiar el frotis de células descamadas (exfoliadas), principalmente de zonas como cervix uterino, vagina, bronquios; también se aplica a las células de orina, LCR, y fluidos corporales (peritoneal, pleural, pericárdico). También son útiles los frotis de material obtenido por pun-ción y aspiración de ciertos tumores (mama, hígado, etc.). 8.1 FIJACION DEL FROTIS
- El mejor fijador es el alcohol-éter (volúmenes iguales de alcohol etílico corriente y éter). Otros prefieren usar alcohol etílico corriente solamente. - Se coloca el fijador en un frasco Coplin. - Existen otros fijadores en spray (Cytospray, Spraycite). - Como regla general, los frotis no se deben dejar secar pues se altera la morfología de las células
(degeneran). En cuanto estén listos y mientras estén húmedos todavía, se ponen en el fijador por 15 minutos.
8.2 IDENTIFICACION DEL FROTIS
Una vez fijado, el frotis debe rotularse la lámina con el nombre del paciente, la naturaleza del frotis y fecha. Para ello son ideales las láminas con un extremo despulido, en donde se puede escribir con lápiz ordinario. Si no se cuenta con ellas, adosar con un clip un papel a la lámina con estos datos.
8.3 ENVIO DE LAMINAS CON FROTIS
- Existen en el mercado fijadores de recubrimiento bajo la forma de aerosoles: Cytospray®, Spray-cyte®, Cyto-fix®. Contienen como fijador alcohol o alcohol-eter mas una pequeña proporción de polietileno o propilenglicol como recubridor.
- Se pueden fijar en un recipiente en la siguiente solución por 30 minutos: 100 volúmenes de alcohol etílico al 95%, 100 volúmenes de eter etílico. y I a 5 volúmenes de propilenglicol. Antes de la tinción, los frotis deben pasarse por 2 baños de alcohol-eter por 1 a 2 minutos cada vez, para quitar la cubierta protectora de alcohol superior polimerizado que podría contaminar la hematoxilina.
- Otro método de preparación para el envío de muestras de frotis consiste en tijar el frotis, tratar con alcohol absoluto y xilol, y montar la lámina, y dejar secar. El laboratorio que recibe la muestra quita el cubreobjetos remojando la preparación en xilol toda la noche.
8.4 OBTENCION DE MUESTRAS Y PREPARACION DE FROTIS
8.4.1 Ginecológicas
a) Cervicovaginal: - Con una espátula se raspa ligeramente las paredes laterales del tercio superior de la vagina y el ectocérvix; con cepillo citológico el endocérvix. - Extender uniformemente y en frotis delgado sobre la lámina. - Fijar inmediatamente. - No usar formol.
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b) Endometrial : Existen dos métodos más usados: - Aspirado. - Cepillado endometrial.
8.4.2 Broncopulmonares
a) Esputo: - Colectar el espécimen en un recipiente de boca ancha con tapa. - Los espécimenes se colectan en 3 días consecutivos preferiblemente temprano en la mañana.
- Instruir al paciente en aclarar primero la garganta y descartar la saliva o secreción postnasal. Luego pedirle que inspire profundamente y tosa. La saliva no sirve para diagnóstico.
- Evitar colectar muestra durante o inmediatamente post ingesta. - La muestra debe ser enviada inmediatamente al laboratorio o ser refrigerada.
- Si el espécimen va a demorar en llegar al laboratorio, es preferible preparar y enviar los frotis fijados. Se busca de preferencia el material sospechoso como restos sanguinolentos y fragmentos tisulares. Fijar inmediatamente con alcohol etílico corriente o con Cylospray® (fijador de recubrimiento) y enviar.
b) Muestras obtenidas por broncoscopías:
- Se prepara el frotis directamente de la superficie de las zonas sospechosas y se fijan inmediatamente en alcohol etílico corriente.
- Los lavados y cepillados bronquiales deben ser colectados en tubos y centrifugados, luego preparar los frotis con los sedimentos sobre un portaobjetos tratado con albúmina. Fijar en alcohol etílico corriente inmediatamente.
8.4.3 Líquidos corporales (Derrames): Pleural, peritoneal, pericárdico, sinovial.
- Es indispensable estudiar pronto estos líquidos pues las células que contienen degeneran
rápidamente. - Colectar la muestra en un recipiente con tapa y llevar inmediatamente al laboratorio. No es
necesario agregar fijador. - Si el volumen de la muestra es considerable, dejar sedimentar en el refrigerador por 30 a 60
minutos. Sacar y desechar el líquido con excepción de los últimos 100 a 200 mL que se centrifugan; se preparan frotis con los sedimentos en láminas tratadas con albúmina, y se fijan inmediatamente.
- Si el espécimen va a demorar en llegar al laboratorio, es preferible enviar el frotis fijado.
Centrifugar la muestra y hacer el extendido con el sedimento. Fijar inmediatamente en alcohol etílico.
8.4.4 Exceso de sangre:
- Se puede destruir los glóbulos rojos antes de la fijación añadiendo ácido acético concentrado a razón de 2 a 5 mL por 100 mL de muestra.
8.4.5 Tinción del frotis:
a) Papanicolaou: Es la técnica más empleada. Para la preparación de reactivos (ver Anexo 2).
Procedimiento:
- Fijador (alcohol éter).
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- Alcohol corriente 1 minuto (2 baños). - Agua de caño. - Hematoxilina Harris 4 minutos. - Agua de caño. - Agua amoniacal 30 segundos - Agua de caño. - Alcohol corriente l minuto (2 baños). - OG6 2 a 4 minutos. - Alcohol corriente l minuto (2 baños). - EA36 2 a 4 minutos. - Alcohol corriente 1 minuto (2 baños). - Alcohol absoluto 1 minuto (2 baños). - Xilol 1 minuto (2 baños). - Montaje.
b) Hematoxilina-Eosina: Siguiendo los mismos pasos que para la tinción de tejidos. Da resultados
satisfactorios para el diagnóstico de cáncer.
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CAPITULO IX
COLORACIONES ESPECIALES
9.1 PARA MICROORGANISMOS
Las técnicas de coloraciones especiales que demuestran organismos infecciosos en cortes de parafina son de gran utilidad diagnóstica para el patólogo. 9.1.1 Bacterias
La mayoría de bacterias son visibles en H-E usando el lente de inmersión. a) Bacterias Gram (-) y Gram (+):
Los colorantes utilizados en la técnica de Gram son siempre colorantes básicos, que se fijan por un extremo de sus moléculas a las proteínas, y por el otro extremo al yodo, formándose así un complejo yodo-colorante-proteína. En el caso de elementos y microorganismos Gram positivos éste complejo no se disuelve en alcohol. Los pasos básicos involucrados en la mayoría de tinciones Gram son: 1. Tinción primaria (Cristal Violeta). Lavar. 2. Yodo: Fija el colorante primario en los organismos Gram (+). Lavar. 3. Decolorar con acetona. Los gérmenes Gram (+) van a retener su color. Lavar. 4. Tinción de contraste. (Fucsina básica). Lavar. 5. Diferenciar con solución de Gallego. Los gérmenes Gram (-) van a retener su color. Lavar. 6. Diferenciar con solución de ácido pícrico - acetona. 7. Usar solución acetona/xilol y xilol para deshidratar y aclarar.
b) Bacterias alcohol ácido resistentes:
Se incluyen las Microbacterias y Nocardia asteroides. Se emplea la coloración de Ziehl-Neelsen.
Algunas bacterias. como el Mycobacterium tuberculosis, son relativamente difíciles de teñir; pero después de que fijan un colorante potente, con intervención del calor, resisten a la decoloración por ácido. Esta característica se debe a la presencia de lípidos en la estructura del microorganismo. Un procedimiento general para ésta coloración es el siguiente: l. Posterior a la desparafinización, teñir con Fucsina. Lavar. 2. Decolorar. Los organismos alcohol ácido resistentes mantienen su color rojo y el
background es claro 3. Tinción contraste con azul de metileno. Nota: Si es muy oscuro el contraste, los
organismos no serán visibles. Una tinción muy suave no demostrará adecuadamente los componentes tisulares.
4. Deshidratar, aclarar, y montar. 9.1.2 Hongos Se utilizan las coloraciones de Grocott nitrato de plata metenamina, que colorea la pared de los hongos de negro, y de Peryodic Acid Schiff (PAS), que la colorea rojo a púrpura. La coloración de Grocott es una modificación del método de Gomori con nitrato de plata-metenamina. Se diferencia en que Grocott incuba por una hora los cortes en plata-metenamina a 60° C. Los grupos
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aldehído quedan expuestos por oxidación con ácido crómico y pueden reducir la metenamina-nitrato de plata en solución alcalina. La pared del hongo es argirofílica, tomando la coloración negruzca con ésta reacción. En la coloración de PAS, el ácido peryódico (HIO4) oxida los azúcares que poseen los grupos hidroxilo libres, apareciendo una fórmula de tipo dialdehído. Esta fórmula, debido a la oxidación de la glucosa por el HIO4, produce una intensa reacción con el reactivo de Schiff, y lo mismo ocurre con otros azúcares como galactosa, manosa entre otros. Como regla general la intensidad de la reacción es proporcional al contenido de estos azúcares en la sustancia estudiada. Las cápsulas de los hongos contienen mucopolisacáridos neutros que son positivos al PAS.
9.1.3 Parásitos
- Los parásitos maláricos pueden ser vistos con Giemsa. - Pneumocystis carinii se puede apreciar con Grocott. - Otros platelmintos y nemátodes pueden verse con H-E, Giemsa, PAS.
9.2 PARA TEJIDO CONECTIVO
El tejido conectivo está constituido por células y fibras extracelulares inmersas en una sustancia de fondo.
- Células: Fibroblastos, adipocitos, mastocitos, etc. - Fibras: Colágeno, elastina, reticulina. - Colágeno es la fibra predominante y es fácilmente demostrable con coloración H-E. La
coloración Tricrómica de Masson es útil en diferenciar el colágeno del músculo y otros elementos.
- Reticulina es una libra argirofílica que se tiñe con solución de plata.
9.3 PARA CARBOHIDRATOS
La técnica más usada para la demostración de carbohidratos es el PAS (Peryodic acid Schift). Para detalles sobre las técnicas de las coloraciones mencionadas (ver anexo 3)
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CAPITULO X
INMUNOHISTOQUIMICA
La creciente popularidad y demanda por la identificación inmunohistoquímica de sustancias específicas han abierto una nueva era en la histopatología. La Inmunohistoquimica es el uso de anticuerpos seleccionados precisamente para identificar (marcar) antígenos específicos. Son extremadamente sensibles y pueden detectar cantidades muy pequeñas de una sustancia. 10.1 ANTIGENOS y ANTICUERPOS
Antígeno es la molécula que, cuando se introduce en el cuerpo, estimula una respuesta inmune (producción de anticuerpos). En Inmunohistoquímica, el antígeno es la sustancia que estamos tratando de demostrar. Anticuerpo es una proteína sérica (inmunoglobulina) que se produce en respuesta a sustancias específicas (antígenos). Su propósito es contraatacar o neutralizar el efecto del antígeno. Se produce la unión del antígeno y anticuerpo en combinación con una enzima que precipita un cromógeno, facilitando la visualización de la reacción inmune.
10.2 METO DOS
10.2.1 Directo Un marcador visual, fluorescente o enzimático es químicamente unido al anticuerpo primario. El anticuerpo primario es el anticuerpo que está dirigido contra el antígeno que queremos demostrar. 10.2.2 Indirecto El marcador visual se une a un anticuerpo secundario. El tejido es primero expuesto al anticuerpo primario y luego al anticuerpo secundario, el cual es dirigido contra el anticuerpo primario y se unirá con éste. 10.2.3 Peroxidasa-antiperoxidasa (PAP) Utiliza un anticuerpo primario, anticuerpo secundario, y un antianticuerpo unido a una enzima peroxidasa (Complejo PAP). El anticuerpo secundario es producido en especies diferentes del complejo primario y PAP, y el anticuerpo primario y el complejo PAP son producidos de la misma especie. El anticuerpo secundario entonces. actúa como “puente” o “ligante”. 10.2.4 Complejo Avidina-Biotina (ABC) Utiliza un anticuerpo primario, anticuerpo secundario que está químicamente unido a la vitamina Biotina y un complejo de la glicoproteina. Avidina unida a Biotina y peroxidasa. Avidina tiene la habilidad de unirse no inmunológicamente a 4 moléculas de Biotina, lo que determina la excelente sensibilidad de éste método.
10.3 REACCIONES DEL SUSTRATO
Las enzimas son catalizadores que actúan sobre un sustrato para acelerar su conversión a un producto. La peroxidasa usada en inmunohistoquímica reacciona con peróxido de hidrogeno, en presencia de electrón donante, para formar una molécula coloreada. La enzima no se depleta y puede continuar catalizando la reacción formando muchas moléculas coloreadas.
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Ejemplos de donadores de electrones son: 3,3 Diaminobencidina, -3,3 Diamino bencidina tetrahidrocloruro (DAB), produce un color marrón en el producto final y es montado con medio resinoso de montaje. -3 Amino 9 etilcarbazol (AEC) produce un color rojo en el producto final y debe ser montado con medio acuoso.
10.4 REACTIVIDAD INESPECIFICA
Existen dos fuentes de reactividad inespecífica: - Anticuerpos primarios o secundarios: Pueden unirse a elementos tisulares altamente cargados
como tejido conectivo, resultando en una reacción y tinción positiva en sitios distintos al que contiene el antígeno primario. Estos sitios pueden "llenarse" previamente a la tinción, con proteínas de sueros no inmunes, previniendo la unión del anticuerpo secundario al tejido.
- Actividad de peroxidasa endógena: La mayoría de tejidos contienen peroxidasa, que actúa de la misma forma que el reactivo de peroxidasa que se une al antígeno. Esta actividad generalmente se localiza en áreas conteniendo grandes números de células sanguíneas. Esto puede inhibirse tratando los tejidos con H2O2 al 3% en solución de metanol (10 mL H2O2 al 30% + 90 mL metanol absoluto), por 30 minutos previos a la tinción.
10.5 FIJACION
El fijador de elección es formal neutro al 10% fresco. (pH 7,0-7,6). El tejido debe ser expuesto al fijador solo el tiempo necesario para obtener buena preservación y morfología. El tiempo ideal de fijación es menos de 24 horas. La sobrefijación puede causar formación de uniones aldehído en exceso que "enmascaran" los sitios de unión antigénica y previenen la unión del anticuerpo primario al antígeno. Algunos métodos usados para liberar estos sitios de unión son la digestión con enzimas proteolíticas (tripsina o pepsina), o sumergir la lámina con el tejido en buffer citrato y llevar al horno microondas para hervido.
10.6 PROCESAMIENTO
Los procedimientos rutinarios en parafina se adecúan a la inmunohistoquímica. NO se debe permitir temperaturas mayores de 60°C, pues el exceso de calor puede destruir los antígenos y la morfología celular.
10.7 ADHESIVO PARA CORTES
Debido a los numerosos pasos y constante manipuleo los cortes frecuentemente se desprenden de la lámina. Existen para ello adhesivos comerciales disponibles. Hay que pretratar las láminas con pegamentos como Silane A-174, como sigue: - Colocar la lámina nueva no usada en un soporte de tinción. - Agitar las láminas en agua jabonosa tibia por algunos minutos. - Lavar todo residuo de jabón de las láminas con un chorro de agua de caño y luego con agua
destilada. - Enjuagar en alcohol etílico absoluto y secar al aire. - Sumergir la porción de lámina a usar en solución acuosa fresca de Silane. Secar el pegamento
de la parte posterior de la lámina con tela limpia. - Secar al aire las láminas y guardarlas en cajas hasta su uso.
10.8 CORTE (MICROTOMO)
Se cortan tejidos en parafina a 4-5 micras de espesor y se ponen a flotar en baño de agua destilada a 42°C. Recoger secciones con láminas pretratadas y secar horizontalmente a 37°C toda la noche o pueden secarse a 60°C por 30 minutos, con cuidado de no sobrecalentar las láminas.
10.9 CONTROLES
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Deben procesarse también controles positivos (+) y negativos (-) con cada grupo de láminas durante el proceso de tinción. - Control (-): Suero no inmune normal en lugar del anticuerpo primario. - Control (+): Láminas que se sabe contienen el antígeno en prueba y que han dado resultado
positivo en el pasado. - La siguiente tabla muestra las láminas a ser teñidas, solución a usar y resultados esperados
para una prueba válida.
10.10 PROCEDIMIENTO Método Complejo Avidina-Biotina
- Deparafinizar e hidratar hasta agua destilada. - Bloquear actividad de peroxidasa endógena con Hp2-metanol al 3% por 30 minutos. - Lavar x 2 en agua destilada, l minuto cada vez. - Colocar en solución salina de buffer fosfato (PBS) por 2 minutos. - Colocar suero normal de la misma especie en el cual el anticuerpo biotinilado es producido por
30 minutos. Escurrir pero no enjuagar láminas - Agregar solución de anticuerpo primario por 1 hora (o incubación toda la noche). - Lavar en PBS por 5 minutos. - Agregar solución de anticuerpo biotinilado secundario por 45 minutos. - Lavar con PBS por 5 minutos. - Colocar la solución ABC (avidin biotin complex) por 45 minutos. - Lavar con PBS por 5minutos. - Agregar el DAB (solución sustrato) por 10 minutos. - Lavar con agua destilada. - Colorear con hematoxilina Mayer por 5 minutos. - Lavar en agua de caño por 10 minutos. - Deshidratar y aclarar. Montar con medio resinoso.
Para preparación de soluciones ver Anexo 4.
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CAPITULO XI
BIBLIOGRAFIA
1. Lynch,M. (1972) Métodos de Laboratorio. 2da Edición. Nueva Editorial Interamericana, S.A. 1522 págs. 2. Náquira, C., Guillén, A., Palacios R., Guevara, M., Guerra, H. (1995). Manual de procedimientos de
Laboratorio para la obtención y envío de muestras (I) (Zavaleta, A., Cabezas, C., Chavez, J., Eds.) Ministerio de Salud. Instituto Nacional de Salud, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública. Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública. Serie de Normas Técnicas N°15, Lima, Art. Lautrec, 98 págs.
3. Laboratory Methods in Histotechnology. (1992) Washington D.C. Armed Forces Institute of
Pathology. Washington D.C. 274 págs. 4. Bauer.S., Alpert, L., Di Salvo A., Favero M., et al.( 1990) Protection of Laboratory workers from
Infectious Disease Transmitted by blood, body fIuids and tissue. NCCLS. 19 (1): 16 - 20. 5. Bourne, J. (1983). Handbook of Inmunoperoxidase Staining Methods. Santa Barbara, Dako
Corporation. 41 págs. 6. Organización Mundial de la Salud. (1994). Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. 2da Ed. Ginebra. Organización Mundial de la Salud. 149 págs. 7. Guillén, A., Beltrán, M., Quispe, N., Valverde, A., Zavaleta, A. (1997). Manual de Normas de
Bioseguridad. (Zavaleta, A., Cabezas, C., Carrillo, C., Chang, J., Eds.) 2da Ed. Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública. Serie de Normas técnicas N°18, Lima, Art Lautrec, 61 págs.
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CAPITULO XII (ANEXOS)
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ANEXO 1 FIJADORES
l. Formol al 10%
Formaldehido al 37%.....................................................................……………………100 mL Agua...............................................................................................…………………….900 mL
2. Formol Tamponado
Formaldehido al 37%…………………………………………………………………100,0 mL Agua destilada…………………………………………………………………………900,0 rnL Fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4)………………………………………………..4,0 g Fosfato de sodio di básico (Na2HPO4)……………………………………………………6,5 g
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ANEXO 2 COLORACIONES RUTINARIAS
l. Hematoxilina de Mayer
1.1 Reactivos:
Alumbre de Amonio o Potasio…………………………………………………50,0 g Agua destilada……………………………………………………………….1000,0 mL Cristales de hematoxilina………………………………………………………..1,0 g Yodato de Sodio…………………………………………………………………0,2 g Acido cítrico……………………………………………………………………..1,0 g Hidrato de cloral……………………………………………………………… 50,0 g
1.2 Procedimiento
- Disolver la Hematoxilina en agua destilada agitando fuertemente. - Agregar yodato de sodio para "madurar" la solución. - Agregar alumbre de amonio o potasio y agitar hasta disolución completa. - Añadir también ácido cítrico en ese momento. - Añadir hidrato de cloral como preservante.
1.3 Tiempo de conservación de la solución: 3 a 6 meses.
2. Hematoxilina de Harris
2.1 Reactivos
Hematoxilina……………………………………………………………………….5,0 g Alcohol etílico absoluto………………………………………………………… 50,0 mL Alumbre de potasio o amonio……………………………………………………100,0 g Agua destilada…………………………………………………………………..1000,0 mL Oxido mercúrico (rojo)……………………………………………………………...2,5 g Acido acético glacial……………………………………………………………….40,0 mL
2.2 Procedimiento
- Disolver el alumbre de potasio o amonio en agua destilada, calentando y agitando. Se lleva a 60º C
- Añadir solución de Hematoxilina en alcohol absoluto y llevar rápidamente a ebullición. - Cuando empiece a hervir se saca del fuego y se agrega óxido mercúrico, mezclar por
rotación. - Si se obtiene un color púrpura intenso, la solución está suficientemente madura. Si no,
prolongar le ebullición por 1 a 3 minutos más, después de añadir el óxido mercúrico. - Un vez fría la absolución, añadir ácido glacial y filtrar antes del uso.
2.3 Tiempo de conservación: 6 meses a 1 año.
3. Eosina
3.1 Eosina stock:
Eosina I, soluble en agua ......................................................................................... 1,0 g Agua destilada .......................................................................................................... 100,0 mL
40
3.2 Eosina-Floxina:
Brindar el mayor rango de contraste, rosado a rojo brillante. El citoplasma se tiñe de rosado, y el colágeno y músculo se tiñen de rojo brillante.
3.2.1 Combinar:
Eosina stock.............................................................................................................. 100,0 mL Solución Floxina (1 g en 100 mL) ............................................................................ 10,0 mL Alcohol etílico 95%.................................................................................................. 780,0 mL Acido acético glacial .................................................................................................... 4,0 mL
4. Tinción de Papanicolaou
4.1 Hematoxilina de Harris: la solución diluida se cambia cada 1 a 3 semana según el número de preparciones estudiadas. 4.2 Orangc c;(J (OG6):
Anaranjado G (Solución al 0,5% -1% en alcohol 95% ................................................................................... 100,000 mL Acido fosfotungstico ................................................................................................ 0,015 mL
4.3 EA 36 (o EA 50):
Verde claro SF amarillento (0,14% en alcohol 95%)…….…………………………45,0.. mL Pardo y de Bismarck (0,5% en alcohol 95%)…..…………………………………...10,0.. mL Amarillento de eosina (0,55% en alcohol 95%)……………………………………..45,0. mL Acido fosfotungstico ………………………………………………………………….0,2 g Solución acuosa saturada de carbonato de....…………………………………………...l .gota
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ANEXO 3
COLORACIONES ESPECIALES 1. Giemsa
1.1 Soluciones:
a) Solución – Eosina azur II
- Colocar semillas de vidrio estériles en botella de 1000mL ámbar - Agregar:
• Eosina Azur II……………………………………….....1,3 g • Glicerina……………………………………………...80,0 mL
- Calentar a 56°C por 2 horas. Mezclar y enfriar. - Agregar:
• Alcohol metílico absoluto……………………………170,0 mL • Acetona………………………………………………170,0 mL
b) Solución May-Grunwald
May-Grunwald……………………………………………………………………0, 15 mL Alcohol metílico absoluto………………………………………………………290,00 mL Acetona... ... ……………………………………………………………………290,00 mL
c) Solución Giemsa stock
- Combinar las dos soluciones previas (1: I vol:vol) d) Solución de agua acética (pH 4,7)
Acido acético glacial…………………………………………………………………1 gota Agua destilada……………………………………………………………………1000 mL
e) Solución trabajo Giemsa
Solución Giemsa stock……………………………………………………………..10 mL Solución de agua acética…………………………………………………………...50 mL
1.2 Procedimiento:
- Desparafinizar e hidratar hasta agua - Teñir con solución giemsa fresca por 1 hora - Deshidratar en 3 cambios de alcohol absoluto - Pasar por 3 cambios de xilol - Montar con medio resinoso
1.3 Resultados:
Citoplasma. ..........................................................................................................................rosado Núcleo ......................................................................................................................................azul Glóbulos rojos ..........................................................................................................................rojo Bacterias...................................................................................................................................azul
2. Ziehl-Neelsen
2.1 Soluciones:
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a) Solución Ziehl-Neelsen Carbol-Fucsina Cristales de fenol ......……………………………………………………………………2,5 mL Alcohol etílico absoluto ......……………………………………………………………..5,0 mL Fucsina básica ......... ……………………………………………………………………….0,5 g Agua destilada......……………………………………………………………………...50,0 mL Filtrar antes de usar b) Solución alcohol ácida 1% Acido clorhídrico ............................................................................................................. 1,0 mL Alcohol etílico corriente (70%).......……………………………………………………99,0 mL c) Solución Azul de Metileno stock Azul de metileno......... …………………………………………………………………….1,4 g Alcohol etílico 95% ......………………………………………………………………100,0 mL d) Solución Azul de Metileno de trabajo Azul de metileno stock………………………………………………………………10 .......mL Agua corriente……………………………………………………………………….90 .......mL
2.2 Procedimiento:
- Desparafinizar e hidratar a agua. - Agregar solución de Ziehl Neelsen Carbol Fucsina a la lámina y calentar con el mechero
hasta que solución en la lámina humee. - Repetir por 3 veces. Enfriar. - Lavar con agua. - Decolorar con solución alcohol ácido 1% hasta que las secciones estén de color rosado
pálido. - Lavar con agua por 8 minutos. - Contrastar con azul de metileno (solución de trabajo). Las secciones deben verse azul pálido.
- Lavar con agua de caño. - Deshidratar y aclarar. - Montar con medio resinoso.
2.3 Resultados:
Bacilos alcohol ácido resistentes……………………………………………………….rojo brillante Glóbulos rojos………………………………………………………………………naranja amarillo Otros elementos tisulares……………………………………………………………………......azul
3. Gram
3.1 Soluciones
a) Solución cristal violeta 1% Cristal Violeta .. ……………………………………………………………………………1,0 g Agua destilada………………………………………………………………................100,0 mL
b) Solución Fucsina básica 1 %:
Fucsina básica……………………………………………………………………………1,0 g
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Agua destilada……………………………………………………………………........100,0 mL
c) Solución yodo de Gram:
yodo………………………………………………………………………………………1,0 g Yoduro de Potasio………………………………………………………………………..2,0 g Agua destilada…………………………………………………………… ………….. 300,0 mL
d) Solución de diferenciación de Gallego:
Formol 37%…………………………………………………………………………..…2,0 mL Acido acético glacial…………………………………………………………………….1,0 mL Agua destilada…………………………………………………………………………100.0mL
e) Solución ácido pícrico-Acetona:
Acido pícrico………………………………………………………………………………..1,0g Acetona………………………………………………………………………………...100,0 mL
t) Solución Acetona-Xilol Partes iguales de acetona y xilol.
3.2 Procedimiento:
- Desparafinizar e hidratar hasta agua. - Colocar en cristal Violeta 1% por 1 minuto. - Lavar con agua de caño. - Colocar en solución yodo de Gram por 1 minuto. - Lavar con agua de caño. - Decolorar en acetona hasta que el background sea claro. - Lavar con agua de caño. - Colocar en solución de Fucsina básica 1% por 5 minutos. - Lavar con agua de caño. - Colocar en solución de diferenciación Gallego por 2 cambios, 1 minuto cada uno. - Lavar. - Transferir a plato de tinción. - Tratar con acetona por 30 segundos. - Colocar en solución de Acido pícrico-acetona por 2 a 3 minutos. - Colocar en solución acetona-xilol por 2 veces. - Aclarar en xilol por 2 veces. Montar.
3.3 Resultados
Bacterias Gram (+) .............................................................................................................. azul Bacterias Gram (-) ................................................................................................................rojo Background....................................................................................................................amarillo
4. Plata Metenamina de Grocott
4. I Soluciones
a) Acido crómico 4%:
Acido crómico ……………………………………………………………………….……4,0 g
44
Agua destilada………………………………………………………………………….100,0 mL
b) Nitrato de plata 5%: Nitrato de plata……………………………………………………………………………5,0 g Agua destilada………………………………………………………………………….100,0 mL
e) Tiosulfato de sodio 5%;
Tiosulfato de sodio………………………………………………………………………..5,0 g Agua destilada………………………………………………………………………….100,0 mL
d) Metenamina 3%:
Metenamina……………………………………………………………………………….3,0 g Agua destilada……………………………………………………………………….…100,0 mL
e) Borax 5%
Borax……………………………………………………………………………………...5,0 g Agua destilada………………………………………………………………………….100,0 mL
f) Solución stock Nitrato Plata-Metenamina:
Nitrato de Plata 5%……………………………………………………………………….5,0 mL Metenamina 3%………………………………………………………………………..100,0 mL
g) Solución de trabajo Nitrato plata-metenamina:
Solución stock Nitrato de Plata-Metenamina…………………………………………...25,0 mL Borax 5%…………………………………………………………………………………2,0 mL Agua destilada…………………………………………………………………………...25,0 mL Preparar fresco previo al uso. No usar si está turbio.
h) Bisulfito de Sodio 1 %:
Bisulfito sodio.......…………………………………………………………………………..1,0 g Agua destilada………………………………………………………………………….100,0 mL
i) Cloruro de Oro 0,1%:
Solución Cloruro de Oro 1% .............................................................................................. 10,0 mL Agua destilada .................................................................................................................... 90,0 mL
j) Verde claro 0,2% stock:
Verde claro SF ..........................................................................................................................0,2 g Agua destilada ................................................................................................................... 100,0mL Acido acético glacial.............................................................................................................. 0,2mL
k) Verde claro solución de trabajo
Verde claro stock ................................................................................................................... 10 mL Agua destilada ....................................................................................................................... 50 mL
4.2 Procedimiento
- Desparafinizar e hidratar a agua.
45
- Colocar en ácido crómico 4% por l hora. - Lavar con agua de caño. - Colocar en solución bisulfito de sodio por l minuto. - Lavar con agua de caño 5 a 10 minutos. Luego 3 a 4 veces por agua - destilada. - Colocar en solución de trabajo Nitrato Plata-Metenamina en horno a 60° por 60 minutos.
* - Lavar por 6 en agua destilada. - Colocar en solución cloruro de oro por 2 a 5 minutos. Lavar en agua destilada. - Colocar en solución tiosulfato sodio por 2 a 5 minutos. Lavar en agua de caño. - Contrastar con solución de trabajo de verde claro por 30 a 45 segundos. - Deshidratar y aclarar. Montar.
4.3 Resultados:
Hongos ........................................................................................................Bien marcados en negro Mucina .............................................................................................................................. gris negro Micelios e hiras ............................................................................................................... gris rosado Background............................................................................................................................. Verde
5. Acido Peryódico Schiff (PAS)
5.1 Soluciones
a) Solución Acido peryódico 0.5%: Acido periódico......................................................................................................................... 0,5 g Agua destilada....................................................................................................................100,0 mL b) Solución Acido clorhídrico 1 N: Acido clorhídrico P.A. 37%.................................................................................................83,5 mL Agua destilada....................................................................................................................916,5 mL
c) Reactivo de Coleman Schiff: Fucsina básica ........................................................................................................................... 1,0 g Agua destilada a 60°C........................................................................................................200,0 mL
- Llevar a ebullición. - Enfriar y agregar:
Acido clorhídrico 1N .........................................................................................................10,0 mL - Dejar 24 horas y agregar: Carbón activado ...................................................................................................................... 0,5 g
Agitar por l minuto, filtrar hasta que la solución sea incolora. Guardar en refrigeradora.
5.2 Procedimiento
- Desparafinizar e hidratar hasta agua. - Agregar Solución Acido peryódico por 5 minutos. Lavar con agua destilada. - Colocar el reactivo de Coleman Schiff por 15 minutos. - Lavar en agua de caño tibia por 10 minutos. - Contrastar con Hematoxilina Mayer por 15 minutos o Harris por 6 minutos. - Lavar en agua de caño por 15 minutos. - Deshidratar y aclarar. Montar.
5.3 Resultados:
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Glicógeno, mucina, algunas membranas basales………………………………………………………………...rojo a púrpura Hongos……………………………………………………………………………..rojo a púrpura Núcleo………………………………………………………………………………………..Azul
6. Tricrómica de Masson
6.1 Soluciones
a) Solución de trabajo Hematoxilina férrica (Weigert):
Solución A stock: Hematoxilina............................................................................................................................. 1,0 g Alcohol etílico 95% ...........................................................................................................100,0 mL Solución B stock: Cloruro férrico 29% .................................................................................................................. 4,0 g Agua destilada......................................................................................................................95,0 mL Acido clorhídrico concentrado...........................................................................................100,0 mL Es reusable por 2 semanas.
b) Solución Biebrich Escarlata-Fucsina Acida: Biebrich escarlata 1% acuosa...............................................................................................90,0 mL Fucsina ácida 1% acuosa......................................................................................................10,0 mL Acido acético glacial..............................................................................................................1,0 mL
c) Solución Fosfomolíbdico-Acido fosfotúngstico: Acido fosfomolíbdico ............................................................................................................... 5,0 g Acido fosfotúngstico ................................................................................................................. 5,0 g Agua destilada....................................................................................................................200,0 mL
d) SOlllciáll a:1I1 allililla: Al.u I ani li na ........................................................................................................................... 2,5 g Acido acético glacial..............................................................................................................2,0 mL Agua destilada....................................................................................................................100,0 mL
e) Solución Acido acético 1 %: Acido acético glacial..............................................................................................................1,0 mL Agua destilada......................................................................................................................99,0 mL
6.2 Procedimiento
- Desparatinizar e hidratar a agua destilada. - Teñir con solución Hematoxilina férrica por 10 minutos. - Lavar en agua de caño por 10 minutos. Enjuagar en agua destilada. - Teñir con solución fucsina ácida-Biebrich escarlata por 15 minutos. - Guardar la solución. Enjuagar en agua destilada. - Diferenciar con solución Acido fosfomolíbdico-fosfotúngstico por 15 minutos. - Contrastar con solución azul anilina por 5 a 10 minutos o solución verde claro por l
minuto. Guardar la solución. Enjuagar en agua destilada. - Si se usa azul anilina, diferenciar con agua acética 1 % por 3 a 5 minutos. - Si se usa verde claro, diferenciar con solución de ácido fosfotúngstico 5% por 15 minutos. - Deshidratar y aclarar. Montar.
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6.3 Resultados:
Núcleo...................................................................................................................................... negro Músculo, citoplasma, queratina...................................................................................................rojo Colágeno ........................................................................................................................azul o verde
7. Coloración de Van Gieson para fibras colágenas
7.1 Soluciones
a) Hematoxilina Férrica de Weigert (Ver 6.1) h) Solución de Picrofitcsin{{ de \;(11/ Gicso/l
Fucsina ácida (C.I. 42685)
solución acuosa 1%................................................................................................................2,5 mL Solución acuosa saturada de ácido pícrico (C.I. 10305) ................................................................................................... 97.5 mL
7.2 Procedimiento
- Desparafinar, hidratar y enjuagar con agua destilada. - Colorear en solución de hematoxilina de Weigerth por 10 minutos. - Lavar con agua destilada. - Contracolorear en solución de Van Gieson por I a 3 minutos. - Deshidratar y aclarar. Montar en Permount o balsamo. Añadir 3 gotas de solución alcohólica
saturada con ácido pícrico para cada 50mL de xilol usado como aclarador. - Montar en xilol acidificado. - Esto intensifica el fondo y evita que las secciones se decoloren.
7.3 Resultados
Colágeno .....................................................................................................................................rojo Músculo, epitelio cornificado...............................................................................................amarillo Núcleo........................................................................................................................... azul o negro
8. Coloración de Gomori para reticulina
8.1 Soluciones
a) Solución de plata amoniacal:
Para 10 mL de solución de nitrato de plata al 10% y 2,0 a 2,5 mL de una solución acuosa de hidróxido de potasio al 10%, añadir agua amoniacal al 26 al 28%, gota a gota, hasta que el precipitado resultante desaparezca sin dificultad al agitar la solución. Llevar la solución con agua destilada hasta dos veces su volumen. Usar vidrio limpio de ácido.
b) Solución de Permanganato de Potasio: Solución de permanganato de Potasio....................................................................................... 0,5 g Agua destilada....................................................................................................................100,0 mL
c) Solución de Metabisulfito de Potasio: Metabisulfito de Potasio............................................................................................................ 2,0 g Agua destilada....................................................................................................................100,0 mL
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d) Solución de sulfato de amonio férrico: Sulfato de amonio férrico.......................................................................................................... 2,0 g Agua destilada....................................................................................................................100,0 mL
e) Solución de formol: Solución de formaldehído ....................................................................................................20,0 mL Agua destilada......................................................................................................................80,0 mL
t) Solución de Cloruro de Oro: Solución stock de Cloruro de Oro........................................................................................20,0 mL Agua destilada......................................................................................................................80,0 mL g) Solución de tiosulfito de sodio:
Tiosulfito de sodio .................................................................................................................... 2,0 g Agua destilada....................................................................................................................100,0 mL
8.2 Procedimiento
- Desparafinar e hidratar hasta agua corriente. - Oxidar en solución acuosa de permanganato de potasio al 0,5% por l minuto. - Lavar en agua corriente por 2 minutos. - Diferenciar con solución acuosa de metabisulfito de potasio por l minuto. - Lavar en agua corriente por 2 minutos. - Sensibilizar en solución de sulfato de amonio férrico al 2% por un minuto. - Lavar cn agua corriente por 2 minutos; seguido con 2 cambios de agua destilada por 30
segundos cada vez. - Impregnar en la solución de plata por un minuto. - Enjuagar en agua destilada por 20 segundos. - Reducir por 3 minutos en formol al 20%. - Lavar en agua corriente por 3 minutos. - Tonificar en solución de cloruro de oro al 0,2% por 10 minutos. - Usar vaso de Coplin. - Enjuagar en agua destilada. - Reducir la tonificación en una solución de metabisulfito de Potasio al 2% por 1minuto. - Fijar en solución de tiosulfato de sodio al 2% por 1 minuto. - Lavar en agua corriente por 2 minutos. - Deshidratar y montar en Permount.
8.3 Resultados:
Fibras reticulares ...................................................................................................................... negro
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ANEXO 4
SOLUCIONES EN INMUNOHISTOQUIMICA
1. Peróxido de Hidrógeno 3% en Metanol:
Solución peróxido hidrógeno 30%.........................................................................................3,0 mL Metanol absoluto..................................................................................................................97,0 mL
Preparar solución diariamente.
2. Buffer PBS (Fosfato Buffer Salino) pH 7,3 - 7,4
Fosfato de potasio di básico en cristales ................................................................................. 8,50 g Cloruro de Sodio ..................................................................................................................... 7,20 g Fosfato de Sodio monobásico ................................................................................................. 1,32 g Agua destilada................................................................................................................1000,00 mL
3. Diaminobencidina (DAB)
3' 3 Diaminobencidina .............................................................................................................. 0,1 g PBS ....................................................................................................................................200,0 mL Peróxido de Hidrógeno 30% ..................................................................................................0,2 mL
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Esta publicación se término de imprimir en Diciembre de 1997 en los
Talleres Gráficos de Art. Lautrec S.R.Ltda. Av. Paseo de la República 731 - Lima 13
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