7/27/2019 Jurnal Internasional (Original Version)

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B i o c h e m . J . ( 1 9 6 8 ) 1 1 0 , 6 1 7P r i n t e d i n G r e a t B r i t a i n

The C a t a l a s e - H y d r o g e n P e r o x i d e SystemKINETICS OF CATALATIC ACTION AT HIGH SUBSTRATE CONCENTRATIONS

By PETER JONES ANm A . SUGGETTD e p a r t m e n t o f P h y 8 i c a l C h e m i 8 t r y , U n i v e r a i t y o f N e w c a a t l e u p o n T y n e , NEl 7RU( R e c e i v e d 4 J u l y 1 9 6 8 )

1 . A r e - e x a m i n a t i o n o f t h e c a t a l a s e - h y d r o g e n p e r o x i d e r e a c t i o n a t h i g h s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n s , by u s i n g t h e q u e n c h e d - f l o w t e c h n i q u e , r e v e a l s a more c o m p l e xk i n e t i c b e h a v i o u r t h a n t h a t p r e v i o u s l y r e p o r t e d . At c o n s t a n t r e a c t i o n t i m e t h ec a t a l a t i c p r o c e s s o b e y s M i c h a e l i s - M e n t e n k i n e t i c s , b u t t h e a p p a r e n t M i c h a e l i sc o n s t a n t i s m a r k e d l y t i m e - d e p e n d e n t , w h e r e a s t h e c o n v e n t i o n a l c a t a l a s e a c t i v i t yi s i n d e p e n d e n t o f t i m e . 2 . The k i n e t i c s o f t h e t i m e e f f e c t ' w e r e a n a l y s e d and i t i ss u g g e s t e d t h a t t h e e f f e c t d e r i v e s f r o m t h e f o r m a t i o n o f an i n a c t i v e s p e c i e s ( t h o u g h tt o b e c a t a l a s e Compound I I ) . The p r o c e s s s h o w s M i c h a e l i s - M e n t e n k i n e t i c s , w i t ha M i c h a e l i s c o n s t a n t e q u a l t o t h a t f o r t h e c a t a l a t i c r e a c t i o n i n t h e l i m i t o f z e r or e a c t i o n t i m e . 3 . I t h a s b e e n c o n f i r m e d t h a t c e r t a i n b u f f e r c o m p o n e n t s h a v e markedi n h i b i t o r y e f f e c t s o n t h e c a t a l a t i c r e a c t i o n and t h a t , i n u n b u f f e r e d s y s t e m s , c a t a l a t i ca c t i v i t y i s s u b s t a n t i a l l y i n d e p e n d e n t o f p H i n t h e r a n g e 4 - 7 - 1 0 - 5 .

T wo d i f f e r e n t t e c h n i q u e s have been u s e d by pre-v i o u s w o r k e r s t o s t u d y t h e k i n e t i c s o f c a t a l a t i ca c t i o n a t h i g h s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s ( u p t oa b o u t 5 m - h y d r o g e n p e r o x i d e ) . O g u r a ( 1 9 5 5 ) u s e dt h e t w o - m i x e r q u e n c h e d - f l o w t e c h n i q u e , w i t hr e a c t i o n t i m e s i n t h e r ange 0 - 1 - 0 - 4 s e c . and a v e r yh i g h enzyme c o n c e n t r a t i o n ( 0 - 1 2 i m ) . He r e p o r t e dt h a t t h e r e a c t i o n o b e y e d M i c h a e l i s - M e n t e n k i n e t i c s .G e o r g e ( 1 9 4 7 , 1 9 4 9 ) u s e d a manometric me th od a n ds t u d i e d t h e v a r i a t i o n w i t h time o f t h e r a t e s o foxygen e v o l u t i o n from r e a c t i o n s o l u t i o n s overs e v e r a l m i n u t e s , w i t h a v e r y l o w enzyme c o n c e n -t r a t i o n . He r e p o r t e d t h a t t h e r e a c t i o n r a t e f e l lf r o m an i n i t i a l l y h i g h v a l u e ( a c - a c t i v i t y ) t o a s t e a d yl o w e r v a l u e ( - a c t i v i t y ) i n a b o u t 5 m i n . I n t h e l a t t e rp h a s e t h e r e a c t i o n showed a r e v e r s i b l e i n h i b i t i o n a ts u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s g r e a t e r than 0 - 0 7 m . J o n e s Wynne-Jones ( 1 9 6 2 ) p r o p o s e d a mechanism t h a twas f o r m a l l y s u c c e s s f u l i n r e c o n c i l i n g t h e s e a p -p a r e n t l y d i s c o r d a n t r e s u l t s , a l t h o u g h q u a n t i t a t i v ed i f f e r e n c e s r e m a i n e d . B o n n i c h s e n , Chance T h e o r e l l ( 1 9 4 7 ) p o i n t e d o u t t h a t t h e enzyme pr e p-a r a t i o n s u s e d by G e o r g e ( 1 9 4 7 ) a p p e a r e d t o havev e r y low a c t i v i t i e s . From our r e c e n t a n a l y s i s( J o n e s S u g g e t t , 1 9 6 8 a ) t h e v a l i d a s s a y o f c a t a l a s ea c t i v i t y a t v e r y l o w c a t a l a s e c o n c e n t r a t i o n s pre-s e n t s s e v e r e d i f f i c u l t i e s , a l t h o u g h t h i s work a l s os u g g e s t s t h a t thermal d e a c t i v a t i o n o f c a t a l a s e mayhave b e e n s u b s t a n t i a l i n G e o r g e s ( 1 9 4 7 ) s o l u t i o n s .I n t h e p r e s e n t p a p e r we examine t h e a p p l i c a t i o no f t h e q u e n c h e d - f l o w t e c h n i q u e t o t h e s t u d y o fc a t a l a s e a c t i o n . On e a s p e c t o f t h i s t e c h n i q u e , w h i c hi s o f i m p o r t a n c e i n t h e p r e s e n t c o n t e x t , i s t h a t , i n a t w o - m i x e r a p p a r a t u s , t h e r e a c t i o n t a k e s p l a c e

u n d e r e s s e n t i a l l y a d i a b a t i c c o n d i t i o n s . The e n -t h a l p y o f d e c o m p o s i t i o n o f h y d r o g e n p e r o x i d e i n t ow a t e r and oxygen i s - 2 3 - 5 k c a l . m o l e - 1 , s o t h a t ,when t h e h y d r o g e n p e r o x i d e c o n c e n t r a t i o n o f as o l u t i o n c h a n g e s by 1 m o l e 1 . - 1 a s a r e s u l t o f d e -c o m p o s i t i o n o c c u r r i n g u n d e r a d i a b a t i c c o n d i t i o n s ,t h e t e m p e r a t u r e o f t h e s o l u t i o n ( a s s u m i n g a s p e c i f i ch e a t o f u n i t y ) i n c r e a s e s by 2 3 . 5 0 . E x a m i n a t i o n o ft h e e x p e r i m e n t s o f O g u r a ( 1 9 5 5 ) s u g g e s t s t h a t t h i sf a c t o r was n o t a p p r e c i a t e d ; t h u s i n t h i s work ac a t a l a s e c o n c e n t r a t i o n o f 0- 1 2 i n m was u s e d w i t h ani n i t i a l h y d r o g e n p e r o x i d e c o n c e n t r a t i o n o f 5m anda r e a c t i o n t i m e o f 0 - 4 s e c . , w h i c h u n d e r a d i a b a t i cc o n d i t i o n s would l e a d t o a temperature r i s e o f a b o u t4 0 . We h a v e c o n f i r m e d e x p e r i m e n t a l l y t h a t tem-p e r a t u r e c h a n g e s c o r r e s p o n d i n g t o n e a r - a d i a b a t i cc o n d i t i o n s o c c u r i n e x p e r i m e n t s u s i n g t h e q u e n c h e d -f l o w t e c h n i q u e .A s y s t e m a t i c k i n e t i c s t u d y o f c a t a l a t i c a c t i o n a th i g h s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s r e q u i r e s b o t h m a x i -m al p r e c i s i o n i n t h e e s t i m a t i o n o f e x t e n t o f r e a c t i o nand i s o t h e r m a l c o n d i t i o n s . A l t h o u g h t h e s e twof a c t o r s a r e i n o p p o s i t i o n i n t h e q u e n c h e d - f l o w t e c h -n i q u e , i t i s p o s s i b l e , b e c a u s e o f t h e l o w a c t i v a t i o nenergy o f c a t a l a s e a c t i o n , t o d e v i s e an a c c e p t a b l ec o m p r o m i s e p r o c e d u r e . I n t h e p r e s e n t paper wer e p o r t an i n v e s t i g a t i o n o f t h e k i n e t i c s o f b a c t e r i a lc a t a l a s e a c t i o n a t h i g h s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s b yt h e q u e n c h e d - f l o w m e t h o d . I n our e x p e r i m e n t s ac h a n g e o f 0- l m o l e 1 . - 1 was t a k e n a s t h e m a x i m u ma l l o w a b l e e x t e n t o f h y d r o g e n p e r o x i d e d e c o m p o s i -t i o n . T h i s p r o c e d u r e c o n t r o l s t h e m a x i m u m i n -c r e a s e i n t h e a v e r a g e r e a c t i o n t e m p e r a t u r e from t h et h e r m o s t a t v a l u e t o a b o u t 1 0 .

6 1 7

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P . JONES AND A . SUGGETTMATERIALS AND METHODS

T h e p r e p a r a t i o n o f b a c t e r i a l c a t a l a s e a n d o t h e r m a t e r i a l sf o r t h i s w o r k a n d t h e a n a l y t i c a l p r o c e d u r e s e m p l o y e d h a v eb e e n d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( J o n e s S u g g e t t , 1 9 6 8 a ) . I n t h e t w o - m i x e r q u e n c h e d - f l o w a p p a r a t u s t h e r a t e o f f l o wc o u l d b e v a r i e d t o g i v e r e a c t i o n t i m e s b e t w e e n 0 - 2 a n d0 - 5 s e c . T h e s y r i n g e s c o n t a i n i n g r e a c t a n t s a n d q u e n c h i n ga g e n t ( 2 - 5 M - H 2 S O 4 ) w e r e s u r r o u n d e d b y a t h e r m o s t a t i c a l l yc o n t r o l l e d w a t e r j a c k e t a n d t h e f l o w s y s t e m was c o n t a i n e di n a n a i r t h e r m o s t a t .The k i n e t i c e x p e r i m e n t s y i e l d v a l u e s o f H 2 0 2 c o n c e n t r a -t i o n a s a f u n c t i o n o f t i m e . I n a n a l y s i n g t h e s e r e s u l t s i t i sn e c e s s a r y e i t h e r t o u s e s o m e m e t h o d o f d i f f e r e n t i a t i o n o f t h ep r i m a r y d a t a , s o t h a t d i f f e r e n t i a l r a t e l a w s m a y b e u s e d , o rt o u s e a n i n t e g r a t e d r a t e l a w ( e . g . f o r m e a s u r e m e n t s a t l o ws u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s a n i n t e g r a t e d f i r s t - o r d e r r a t e l a wi s e m p l o y e d ( B o n n i c h s e n e t a l . 1 9 4 7 ; J o n e s S u g g e t t ,1 9 6 8 a ) ) . W e h a v e c o m p a r e d o u r e x p e r i m e n t a l d a t a w i t h t h ei n t e g r a t e d M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n i n t h e f o r m :

A l n [ P ] k 3 A t [ E o ] 1A [ P ] Km A [ P ] Km

0

1-2- IL-3

-4( 1 )

a m o d i f i e d f o r m o f t h e e q u a t i o n u s e d b y Kremer ( 1 9 6 5 ) .[ E o ] r e p r e s e n t s t h e s t o i c h e i o m e t r i c e n z y m e c o n c e n t r a t i o n ,a n d [ P ] t h e i n i t i a l H 2 0 2 c o n c e n t r a t i o n .I n t h e q u e n c h e d - f l o w t e c h n i q u e i t i s n e c e s s a r y t o make u pt h e c a t a l a s e r e a c t i o n s o l u t i o n i n b u f f e r o f t h e a p p r o p r i a t ec o m p o s i t i o n a n d pH b e f o r e a d d i t i o n o f s u b s t r a t e . I t wa st h e r e f o r e t o b e e x p e c t e d t h a t t h e c a t a l a s e ' a c t i v i t y ' d e t e r -m i n e d b y t h e q u e n c h e d - f l o w p r o c e d u r e [ g i v e n b y k 3 I K mf r o m p l o t s a c c o r d i n g t o e q n . ( 1 ) i f M i c h a e l i s - M e n t e n k i n e t i c sa r e o b e y e d ] w o u l d c o r r e s p o n d t o t h e q u a n t i t y k o a s d e f i n e db y J o n e s S u g g e t t ( 1 9 6 8 a ) , r a t h e r t h a n t o t h e a c t i v i t y( k B ) a s m e a s u r e d b y t h e c o n v e n t i o n a l a s s a y p r o c e d u r e( B o n n i c h s e n e t a l . 1 9 4 7 ; J o n e s S u g g e t t , 1 9 6 8 a ) .I n o u r e x p e r i m e n t s i t was p o s s i b l e t o u s e c a t a l a s e c o n -c e n t r a t i o n s o f a b o u t 1 0 n M . C a t a l a s e r e a c t a n t s o l u t i o n s o ft h e s e c o n c e n t r a t i o n s m a y b e p r e p a r e d f r o m s t o c k s o l u t i o n sa n d s t o r e d f o r s e v e r a l d a y s n e a r 0 0 w i t h o u t d e c r e a s e i n a c -t i v i t y a r i s i n g f r o m t h e r m a l d e a c t i v a t i o n ( J o n e s S u g g e t t ,1 9 6 8 a ) .RESULTS

The r e s u l t s o f our e x p e r i m e n t s s h o w a c o n s i d -e r a b l y m o r e c o m p l e x k i n e t i c b e h a v i o u r t h a n t h a tr e p o r t e d by O g u r a ( 1 9 5 5 ) . The t y p e o f c o m p l e x i t yo b s e r v e d i s i l l u s t r a t e d i n F i g . 1 , w h e r e d a t a f r o me x p e r i m e n t s i n p o t a s s i u m d i h y d r o g e n p h o s p h a t e -d i s o d i u m h y d r o g e n p h o s p h a t e b u f f e r , pH7, a t 2 0 0a r e p l o t t e d a c c o r d i n g t o e q n . ( 1 ) . The i n i t i a l h y d r o -gen p e r o x i d e c o n c e n t r a t i o n s were 0 - 3 0 , 0 - 4 1 , 0 - 5 9and 0 - 7 4 M and t h e c o r r e s p o n d i n g e nz yme c o n c e n -t r a t i o n s were 1 6 - 9 , 1 4 - 4 , 1 1 - 8 and 8-5nM r e s p e c t i v e l y .Four r e a c t i o n t i m e s b e t w e e n 0 - 2 and 0 - 5 s e c . wereu s e d f o r e a c h s e t o f i n i t i a l c o n d i t i o n s . For e a c hr e a c t i o n t i m e t h e p o i n t s l i e o n a s t r a i g h t l i n e . How-e v e r , t h e p o i n t s f o r d i f f e r e n t r e a c t i o n t i m e s a r e notc o l l i n e a r , b u t y i e l d f o u r s e p a r a t e l i n e s t h a t arep a r a l l e l and s e p a r a t e d by d i s t a n c e s p r o p o r t i o n a lt o t h e d i f f e r e n c e i n r e a c t i o n t i m e . F o r s i m p l e

3 4 5 6-1 0 8 A t [ E ] / A [ P ]

7 8 9 1 0

F i g . 1 . I n t e g r a t e d M i c h a e l i s - M e n t e n p l o t f o r p H 7 - 0 a t 2 0 .o , E x p e r i m e n t a l p o i n t s ; l d a t a e x t r a p o l a t e d t o z e r o t i m e .

M i c h a e l i s - M e n t e n k i n e t i c b e h a v i o u r a l l 1 6 e x p e r i -m e n t a l p o i n t s s h o u l d b e c o l l i n e a r .The d i r e c t i o n o f t h i s t i m e e f f e c t ' c o r r e s p o n d s t o ad e a c t i v a t i o n o f c a t a l a s e w i t h i n c r e a s i n g r e a c t i o nt i m e . I n terms o f e q n . ( 1 ) t h e r e s u l t s i m p l y t h a t t h ea p p a r e n t M i c h a e l i s c o n s t a n t f o r t h e r e a c t i o n i s t i m e -d e p e n d e n t ( 0 - 9 6 M w i t h a r e a c t i o n t i m e o f 0 - 2 s e c . ,0 - 8 1 M w i t h 0 - S 5 s e c . ) , a l t h o u g h t h e c a t a l a s e a c t i v i t y ,k 3 I K m , i s i n d e p e n d e n t o f t i m e . By e x t r a p o l a t i o n o ft h e d a t a f o r e a c h i n i t i a l h y d r o g e n p e r o x i d e c o n c e n -t r a t i o n we o b t a i n t h e M i c h a e l i s - M e n t e n k i n e t i c b e -h a v i o u r o f c a t a l a s e i n t h e l i m i t o f z e r o r e a c t i o n t i m e( s q u a r e s and s o l i d l i n e i n F i g . 1 ) . From t h e e x t r a -p o l a t e d d a t a t h e M i c h a e l i s - M e n t e n p a r a m e t e r so b t a i n e d i n p h o s p h a t e b u f f e r , pH 7 , a t 2 0 0 a r eK O = 1- M and k 3 / K m = 6 - 6 1 x 1 0 7 M - 1 s e c . - 1 . Thel a t t e r v a l u e compares w i t h k o = 6 - 6 2 x 107X- 1 s e c . - 1o b t a i n e d by a s s a y a t l o w s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n( J o n e s S u g g e t t , 1 9 6 8 a ) w i t h t h e s a m e c a t a l a s ep r e p a r a t i o n . From s t u d i e s o f t h e e f f e c t o f t e m p e r a -t u r e v a r i a t i o n ( 1 3 0 t o 3 0 0 ) , K wa s f o u n d t o b e i n d e -p e n d e n t o f t e m p e r a t u r e . The t e m p e r a t u r e c o e f f i -c i e n t o f k 3 I K m c o r r e s p o n d e d t o a n a c t i v a t i o n e n e r g yo f 0 - 9 0 + 0 - 0 5 k c a l . m o l e - 1 , w h i c h compares w i t h t h ev a l u e o f 1 - 0 1 + 0 - 0 6 k c a l . m o l e - 1 r e p o r t e d w i t h l o ws u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s .From measurements i n o t h e r b u f f e r s ( c i t r i c a c i d -d i s o d i u m h y d r o g e n p h o s p h a t e , p H 4 - 6 5 , p o t a s s i u md i h y d r o g e n p h o s p h a t e - d i s o d i u m h y d r o g e n p h o s -p h a t e , p H 8 - 2 5 , and b o r a x - s o d i u m c a r b o n a t e ,p H 9 - 4 5 ) K wa s f o u n d t o b e i n d e p e n d e n t o f b u f f e r

6 1 8 1 9 6 8

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CATALASE AT HIGH SUBSTRATE CONCENTRATIONS

5 l 6 6 7 8 9 1 0 1 1pHF i g . 2 . D e p e n d e n c e o f k o o n p H a t 2 0 . F i l l e d y m b o I s r e f e rt o q u e n c h e d - f l o w d a t a , o p e n s y m b o l s t o l o w - c o n c e n t r a t i o nd a t a ( J o n e s ; S u g g e t t , 1 9 6 8 a ) a n d b r o k e n s y m b o l s t oq u e n c h e d - f l o w d a t a i n v i r t u a l l y u n b u f f e r e d s y s t e m s ;O 3 i n d i c a t e s p o i n t s c o m mont o t h e f i r s t t w o t y p e s o f m e a s u r e .ment ( i n K H 2 P 0 4 - N a 2 H P 0 4 b u f f e r s ) . 0 , C i t r i c a c i d -N a 2 H P 0 4 b u f f e r s ; , , b o r a x r - N a 2 C O 3 b u f f e r s .

0 )

4 :

2

II0 2 3 4l | [ P ] ( M - 1 )F i g . 3 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n [ E ] / v a n d 1 / [ P ] ( L i n e w e a v e r -B u r k p l o t ) f o r t h e ' t i m e - e f f e c t ' d a t a d e r i v e d f r o m F i g . 1 .

c o m p o s i t i o n and pH, b u t t h e v a l u e s o f k 3 / K mc h a n g e d i n t h e same m anner a s f o u n d i n k o d e t e r -m i n a t i o n s a t l o w s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s . The twos e t s o f d a t a a r e c o m p a r e d i n F i g . 2 . A l s o shown i nF i g . 2 a r e v a l ue s o f k 3 / K m o b t a i n e d f r o m q u e n c h e d -f l o w e x p e r i m e n t s w i t h e s s e n t i a l l y u n b u f f e r e d s o l u -t i o n s . I n t h e s e m e a s u r e m e n t s t h e p H wa s a d j u s t e dby a d d i n g s m a l l amounts o f e i t h e r O - l M - h y d r o -c h l o r i c a c i d o r 0 - l M - s o d i u m h y d r o x i d e t o a c a t a l a s er e a c t a n t s o l u t i o n i n d i l u t e p h o s p h a t e b u f f e r . Ther e s u l t s c o n f i r m t h e i d e a t h a t t h e r e a r e s u b s t a n t i a ls p e c i f i c e f f e c t s o f some b u f f e r c o m p o n e n t s on c a t a -l a s e a c t i v i t y i f t h e enzyme i s e q u i l i b r a t e d w i t hb u f f e r b e f o r e a d d i t i o n o f s u b s t r a t e . I n t h e u n b u f -f e r e d s y s t e m s t h e a c t i v i t y i s a l m o s t i n d e p e n d e n t o fpH i n t h e r a n g e 4 - 7 - 1 0 - 5 . The s h a r p f a l l i n a c t i v i t yf o u n d a t a b o u t p 1 1 h a s a l m o s t u n i v e r s a l l y b e e na c c e p t e d a s b e i n g t h e r e s u l t o f an i r r e v e r s i b l e , o rp a r t i a l l y r e v e r s i b l e , d e n a t u r a t i o n . O g u r a s ( 1 9 5 5 )s u g g e s t i o n t h a t an a p p a r e n t pH e f f e c t on c a t a l a s ea c t i v i t y i n b o r a x - s o d i u m c a r b o n a t e and c i t r a t e b u f -f e r s wa s d u e t o n o n - c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n by H+and OH- i o n s i s n o t c o n f i r m e d by t h e a b o v e r e s u l t s .By u s i n g t h e e x t r a p o l a t e d M i c h a e l i s - M e n t e nc a t a l a t i c k i n e t i c d a t a a s a b a s e l i n e i t i s p o s s i b l e t oa n a l y s e t h e t i m e e f f e c t ' a s a phenomenon t h a ta r i s e s f r o m a d e c r e a s e w i t h t i m e o f t h e c o n c e n t r a t i o no f a c t i v e c a t a l a s e . The d e c r e a s e i n a c t i v e enzymec o n c e n t r a t i o n , A [ E a ] wa s c a l c u l a t e d f r o m :

A[Ea] = IEo][ P ] o b s . ( 2 )[ E ] A P ] c a 1 c . ( 2w h e r e [ E o ] i s t h e s t o i c h e i o m e t r i c c a t a l a s e c o n c e n -t r a t i o n and A [ P ] c a I c . i s t h e c h a n g e i n s u b s t r a t e c o n -c e n t r a t i o n p r e d i c t e d b y t h e z e r o - r e a c t i o n - t i m e

M i c h a e l i s - M e n t e n c u r v e . The v e l o c i t y o f t h e t i m e -e f f e c t ' d e a c t i v a t i o n p r o c e s s i s t h e n v * = - d [ E a ] / d t ,o r f o r s m a l l r e a c t i o n t i m e v * = -/ [ E a ] / A t . Thek i n e t i c d a t a o b t a i n e d i n t h i s wa y s h o w e d t h a t t h e' t i m e - e f f e c t ' r e a c t i o n i t s e l f f o l l o w s M i c h a e l i s - M e n -t e n k i n e t i c s , i . e . :

k * [ E ] [ P ]Km+ [ P ] ( 3 )F i g . 3 i l l u s t r a t e s t h e d a t a o b t a i n e d i n p h o s p h a t eb u f f e r , p H 7 , a t 2 0 p l o t t e d a c c o r d i n g t o t h eL i n e w e a v e r - B u r k p r o c e d u r e . T h i s g r a p h y i e l d sK . * = ( 1 - 1 + 0 - 2 5 ) M and k * = 0 . 6 5 + 0 . l s e c . - l . Fromt h e e x p e r i m e n t s i n o t h e r c o n d i t i o n s i t wa s f o u n dt h a t k * a n d K* were i n d e p e n d e n t o f p H , and t h et e m p e r a t u r e c o e f f i c i e n t o f k * / K * c o r r e s p o n d s t o a na c t i v a t i o n e n e r g y o f 1 0 + 2 k c a l . m o l e - 1 . An i n -t e r e s t i n g and p o s s i b l y i m p o r t a n t r e s u l t o f t h i sa n a l y s i s i s t h a t , w i t h i n t h e e x p e r i m e n t a l e r r o r ,K =K M *

DISCUSSIONThe e x c e l l e n t a g r e e m e n t b e t w e e n o u r v a l u e KOand t h a t r e p o r t e d by O g u r a ( 1 9 5 5 ) s eem s a t f i r s ts i g h t r e m a r k a b l e , i n v i e w o f t h e c o n s i d e r a t i o n s p r e -s e n t e d a b o v e , a l t h o u g h t h i s i s t o s o m e e x t e n t e x -p l a i n e d by t h e i n s e n s i t i v i t y o f K t o t e m p e r a t u r ec h a n g e s . O g u r a ( 1 9 5 5 ) u s e d d i f f e r e n t i a l k i n e t i cp l o t s i n a n a l y s i n g h i s r e s u l t s and t h i s p r o c e d u r en e c e s s a r i l y i n v o l v e s a d i f f e r e n t i a t i o n o f t h e p r i m a r ye x p e r i m e n t a l d a t a . The i l l u s t r a t i v e z e r o - o r d e r p l o ts h o w n by O g u r a ( 1 9 5 5 , F i g . 2 ) c o u l d n o t a p p l y ,e x c e p t by f o r t u i t o u s c a n c e l l a t i o n o f e f f e c t s , u n d e r

a l l c o n d i t i o n s , and i t seems l i k e l y t h a t t h e r e a c t i o n

V o l . 1 1 0 6 1 9

7/27/2019 Jurnal Internasional (Original Version)

4/4

6 2 0 P . JONES AND A . SUGGETT 1 9 6 8v e l o c i t y wa s o b t a i n e d by t a k i n g t h e i n i t i a l s l o p e o fp l o t s o f e x t e n t o f r e a c t i o n a g a i n s t t i m e . S u c h ap r o c e d u r e w o u l d e x t r a p o l a t e o u t t h e t h e r m a l e f f e c tand b e e x p e c t e d t o l e a d t o a Km v a l u e c o m p a r a b l ew i t h K O a s d e t e r m i n e d i n o u r e x p e r i m e n t s . I tw o u l d a l s o o b s c u r e t h e e f f e c t o f t i m e on t h e k i n e t i cp a r a m e t e r s o f t h e r e a c t i o n .I n t h e a n a l y s i s o f t h e k i n e t i c s o f c a t a l a s e a c t i o ng i v e n by J o n e s W y n n e - J o n e s ( 1 9 6 2 ) i t wa s s u g -g e s t e d t h a t t h e d i f f e r e n c e i n k i n e t i c f o r m r e p o r t e dby O g u r a ( 1 9 5 5 ) and G e o r g e ( 1 9 4 9 ) a r o s e b e c a u s et h e q u e n c h e d - f l o w work o f t h e f o r m e r r e f e r r e d t o a p s e u d o - s t e a d y s t a t e i n w h i c h r e v e r s i b l e d e a c t i v a -t i o n p r o c e s s e s had n o t p r o c e e d e d a p p r e c i a b l y ,w h e r e a s t h e l a t t e r r e s u l t s ( i n t h e , - a c t i v i t y p h a s e )r e f e r r e d t o a s t e a d y s t a t e ' w i t h r e s p e c t t o t h e s ed e a c t i v a t i o n p r o c e s s e s . A d i f f i c u l t y w i t h t h e modelp r e s e n t e d wa s t h a t t h e M i c h a e l i s c o n s t a n t s o b t a i n e df r o m t h e two s e t s o f d a t a d i f f e r e d s u b s t a n t i a l l y .The p r e s e n t work s h o w s t h a t c a t a l a s e a c t i o n c a n -n o t b e s t u d i e d d i r e c t l y i n t h e a b s e n c e o f d e a c t i v a -t i o n p h e n o m e n a , b e c a u s e c a t a l a t i c a c t i o n and t h e' t i m e - e f f e c t ' d e a c t i v a t i o n phenomenon a r e s i m i l a ri n k i n e t i c f o r m , s o t h a t t h e l a t t e r p r o c e s s i s s i g n i f i -c a n t a t a l l f i n i t e r e a c t i o n t i m e s . N e v e r t h e l e s s t h ee f f e c t s o f d e a c t i v a t i o n m a y b e s e n s i b l y e x t r a -p o l a t e d o u t and t h e k i n e t i c d a t a f o r t h e t i m e e f f e c t 'show an a p p a r e n t d e c r e a s e i n t h e r e a c t i o n M i c h a e l i sc o n s t a n t w i t h r e a c t i o n t i m e . P r o j e c t i o n o f t h e' t i m e - e f f e c t ' d a t a f r o m t h e p r e s e n t s t u d y t o t h et i m e - s c a l e u s e d by G e o r g e ( 1 9 4 9 ) s u g g e s t s t h a t t h i se f f e c t c a n a c c o u n t f o r t h e d i s c r e p a n c y i n M i c h a e l i sc o n s t a n t b e t w e e n t h e r e s u l t s o f O g u r a ( 1 9 5 5 )(Km= 1 -M) ( a n d o u r own v a l u e f o r K = 1 1 M ) andt h a t o b t a i n e d f r o m G e o r g e s ( 1 9 4 9 ) d a t a ( 0 . 0 3 M ) .C i r c u m s t a n t i a l e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t t h e t i m ee f f e c t ' p r o b a b l y a r i s e s f r o m t h e a c c u m u l a t i o n o fc a t a l a s e Compound I I . A f t e r c a t a l a s e a n d h y d r o g e np e r o x i d e h a v e b e e n mixed and t h e r e a c t i o n h a s b e e na l l o w e d t o s u b s i d e t h e s p e c t r u m o f Compound I I i so b s e r v e d ( J o n e s , P a i n S u g g e t t , 1 9 6 8 ) , and Com-p o u n d I I h a s b e e n shown ( C h a n c e , 1 9 4 9 ) t o b ec a t a l a t i c a l l y i n a c t i v e . The k i n e t i c s o f Compound I If o r m a t i o n ( a b o v e v e r y l o w p e r o x i d e c o n c e n t r a -t i o n s ; C h a n c e , 1 9 4 9 ) a r e s i m i l a r t o t h e k i n e t i c s o ft h e t i m e e f f e c t ' .To d e s c r i b e t h e a s p e c t s o f c a t a l a s e a c t i o ns t u d i e d i n t h i s work we t h e r e f o r e s u g g e s t t h em o d e l shown i n S c h e m e 1 , w h e r e EP and EP a r et h e p r i m a r y and s e c o n d a r y c o m p l e x e s p r o p o s e d byJ o n e s W y n n e - J o n e s ( 1 9 6 2 ) ( i . e . Compound I i sa m i x t u r e o f EP and E P ) . At s h o r t r e a c t i o nt i m e s t h e a moun t o f Compound I I f o r m a t i o ni s s m a l l and we m a k e t h e a p p r o x i m a t i o nA[Compound I I ] / A t t = d [ C o m p o u n d I I ] / d t s o t h a t[ C o m p o u n d I I ] = k 5 [ E P ' ] [ P ] A t . A s s u m i n g a s t e a d ys t a t e f o r t h e i n t e r m e d i a t e s EP and EP y i e l d s t h er a t e e q u a t i o n :

i s . ... ^ ' . .P r o d u c t sEE+P EP .EPk ,

Compound 1 1S c h e m e 1 .

d [ P ] k ' [ E o ] [ P ]d t Km+ [ P ]

w h e r e : k 1 k 2 k 4k 1 k 4 + k l k 5 + k l k 3 k 5 A t ( 5 )and

K = k 2 k 4 + k 2 k 5 + k 3 k 5 + k 3 k 4 + k l k 3 ( 6 )K m - k l k 4 + k 1 k 5 + k 1 k 3 k 5 A tAn e x p r e s s i o n o f t h e same form a s e q n . ( 6 ) a p p l i e s t ot h e r a t e o f f o r m a t i o n o f Compound I I w i t h t h e sameK i n , b u t w i t h a c o n s t a n t k t h a t d i f f e r s f r o m k ' i nt h a t k 5 r e p l a c e s k 4 i n t h e numerator o f e q n . ( 5 ) . Thust h i s s c h e m e f u l f i l s t h e t h r e e r e q u i r e m e n t s o f t h ep r e s e n t e x p e r i m e n t a l w o r k : ( i ) Km i s t i m e - d e p e n -d e n t ; ( i i ) k / K m i s t i m e - i n d e p e n d e n t ; ( i i i ) t h e sameKm v a l u e i s o b t a i n e d f o r t h e t i m e e f f e c t ' and t h ec a t a l a t i c r e a c t i o n . A l t h o u g h t h i s scheme i s f o r m a l l ys a t i s f a c t o r y i t i s u n l i k e l y t h a t i t a f f o r d s a c o m p l e t ed e s c r i p t i o n o f t h e p r o c e s s , s i n c e t h e f o r m a t i o n o fCompound I I i n v o l v e s a m a j o r d i s r u p t i o n o f t h ec a t a l a s e m o l e c u l e ( J o n e s e t a l . 1 9 6 8 ) . A d e t a i l e dd i s c u s s i o n o f t h i s p o i n t i s p r e s e n t e d i n t h e n e x tp a p e r ( J o n e s S u g g e t t , 1 9 6 8 b ) .W e a r e i n d e b t e d t o P r o f e s s o r J . B a d d i l e y , F . R . S . , f o rm a k i n g a v a i l a b l e f a c i l i t i e s f o r g r o w t h a n d m a n i p u l a t i o n o fb a c t e r i a i n t h e S c i e n c e R e s e a r c h C o u n c i l M i c r o b i o l o g i c a lC h e m i s t r y R e s e a r c h U n i t L a b o r a t o r i e s , a n d t o Dr A . L .D a v i s o n f o r a s s i s t a n c e w i t h m i c r o b i o l o g i c a l w o r k . e a l s ot h a n k t h e S c i e n c e R e s e a r c h C o u n c i l f o r a s t u d e n t s h i p a n dt h e U n i v e r s i t y o f N e w c a s t l e u p o n T y n e f o r a S i r J a m e sK n o t t F e l l o w s h i p b o t h t o A . S . ) .

REFERENCESB o n n i c h s e n , R . K . , C h a n c e , B . T h e o r e l l , H . ( 1 9 4 7 ) . A c t ac h e m . 8 c a n d . 1 , 6 8 5 .C h a n c e , B . ( 1 9 4 9 ) . J . b i o l . C h e m . 1 7 9 , 1 3 4 1 .G e o r g e , P . ( 1 9 4 7 ) . N a t u r e , L o n d . , 1 6 0 , 4 1 .G e o r g e , P . ( 1 9 4 9 ) . B i o c h e m . J . 4 4 , 1 9 7 .J o n e s , P . , P a i n , R . H . S u g g e t t , A . ( 1 9 6 8 ) . N a t u r e , L o n d . ,2 1 7 , 1 0 5 0 .J o n e s , P . S u g g e t t , A . ( 1 9 6 8 a ) . B i o c h e m . J . 1 0 8 , 8 3 3 .J o n e s , P . S u g g e t t , A . ( 1 9 6 8 b ) . B i o c h e m . J . 1 1 0 , 6 2 1 .J o n e s , P . W y n n e - J o n e s , W. F . K . ( 1 9 6 2 ) . T r a n s . F a r a d a yS o c . 5 8 , 1 1 4 8 .K r e m e r , M . L . ( 1 9 6 5 ) . T r a n s . F a r a d a y S o c . 6 1 , 1 4 5 3 .O g u r a , Y . ( 1 9 5 5 ) . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y 8 . 5 7 , 2 8 8 .