Kuda Laut-Sel MCF.pdf

TESIS

ELUSIDASI STRUKTUR SENYAWA AKTIF KUDA LAUT (Hippocampus trimaculatus Leach.) TERHADAP SEL MCF-7

Oleh:

DENNY SATRIA NIM 127014009

PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN 2014

Universitas Sumatera Utara


TESIS

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh

gelar Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara

Oleh: DENNY SATRIA NIM 127014009

PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN

2014


LEMBAR PERSETUJUAN TESIS


Oleh: DENNY SATRIA NIM 127014009

Medan, Maret 2014 Menyetujui: Komisi Pembimbing, Komisi Penguji, Dr. M. Pandapotan Nasution, MPS., Apt. Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt. NIP 194908111976031001 NIP 195103261978022001 Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed. Dr. Ginda Haro, M.Sc., Apt. NIP 196602091992031003 NIP 195108161980031002 Dr. M. Pandapotan Nasution, MPS., Apt. NIP 194908111976031001 Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed. NIP 196602091992031003 Mengetahui: Disahkan Oleh: Ketua Program Studi, Dekan, Prof. Dr. Karsono, Apt. Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt. NIP 195409091982011001 NIP 195311281983031002


PENGESAHAN TESIS

Nama Mahasiswa : Denny Satria

Nomor Induk Mahasiswa : 127014009

Program Studi : Magister Farmasi

Judul Tesis : Elusidasi Struktur Senyawa Aktif Kuda Laut

(Hippocampus trimaculatus Leach.) Terhadap

Sel MCF-7.

Telah diuji dan dinyatakan LULUS di depan Tim Penguji pada hari Rabu tanggal

dua belas bulan Februari tahun dua ribu empat belas.

Mengesahkan:

Tim Penguji Tesis

Ketua Tim Penguji Tesis : Dr. M. Pandapotan Nasution, MPS., Apt.

Anggota Tim Penguji : Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M. Biomed.

Prof. Dr. Rosidah, M. Si., Apt.

Dr. Ginda Haro, M.Sc., Apt.


SURAT PERNYATAAN

Saya yang bertanda tangan dibawah ini:

Nama Mahasiswa : Denny Satria

Nomor Induk Mahasiswa : 127014009

Program Studi : Magister Farmasi

Judul Tesis : Elusidasi Struktur Senyawa Aktif Kuda Laut

(Hippocampus trimaculatus Leach.) Terhadap

Sel MCF-7

Dengan ini menyatakan bahwa tesis yang saya buat adalah hasil karya saya

sendiri, bukan plagiat, dan apabila dikemudian hari diketahui tesis saya tersebut

plagiat karena kesalahan saya sendiri, maka saya bersedia diberi sanksi apapun

oleh Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi USU. Saya tidak akan

menuntut pihak manapun atas perbuatan saya tersebut.

Demikianlah surat pernyataan ini saya perbuat dengan sebenarnya dalam keadaan

sehat.

Medan, Maret 2014 Yang membuat pernyataan,

Denny Satria NIM 127014009


KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang Maha Kuasa yang telah

melimpahkan rahmat, karunia, dan RidhoNya, sehingga penulis dapat

menyelesaikan tesis yang berjudul “Elusidasi Struktur Senyawa Aktif Kuda Laut

(Hippocampus trimaculatus Leach.) Terhadap Sel MCF-7”. Tesis ini diajukan

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister farmasi pada Fakultas

Farmasi Universita Sumatera Utara. Shalawat dan salam kepada Rasulullah SAW.

Selama menyelesaikan penelitian dan tesis ini penulis telah banyak mendapatkan

bantuan dan dorongan dari berbagai pihak, baik moril maupun materil. Untuk itu

penulis ingin menghaturkan penghargaan dan terima kasih yang tiada terhingga

kepada:

1. Rektor Universitas Sumatera Utara, Bapak Prof. Dr. dr. Syahril Pasaribu,

DTMH&H., M.Sc., (CTM)., Sp.A(K)., atas kesempatan dan fasilitas yang

diberikan kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan Program

Magister.

2. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Bapak Prof. Dr.

Sumadio Hadisahputra, Apt., yang telah menyediakan fasilitas dan

kesempatan bagi penulis menjadi mahasiswa Program Studi Magister Farmasi

Fakultas Farmasi.

3. Ketua Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi Universitas

Sumatera Utara, Bapak Prof. Dr. Karsono, Apt., yang telah menyediakan

fasilitas bagi penulis selama menjadi mahasiswa Program Studi Magister

Farmasi Fakultas Farmasi.


4. Bapak Dr. M. Pandapotan Nasution, MPS., Apt., selaku Pembimbing I yang

tiada hentinya membimbing, mengarahkan, memberikan dorongan dan

semangat dengan penuh kesabaran sehingga penulis terpacu untuk

menyelesaikan penelitian dan penyelesaian tesis ini.

5. Bapak Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed., selaku Pembimbing II yang

tiada hentinya membimbing, mengarahkan, memberi saran dan dorongan

dengan penuh kesabaran selama penulis menjalani penelitian dan penyelesaian

tesis ini.

6. Ibu Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt., dan bapak Dr. Ginda Haro, M.Sc., Apt.,

sebagai penguji.

7. Ibu Dra. Suwarti Aris, M.Si., Apt., Kepala Laboratorium Farmakognosi

beserta staf.

8. Bapak Prof. dr. Supargiyono, DTM&H., S.U., Ph.D., Sp.Park., Kepala

Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada

beserta staf.

9. Bapak Prof. Dr. rer. nat. Effendy De Lux Putra, S.U., Apt., Kepala

Laboratorium Penelitian beserta staf.

10. Bapak dan Ibu Staff Pengajar Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara

yang telah mendidik penulis selama perkuliahan.

Penulis juga tidak lupa mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang

tulus kepada orang tua, Ayahanda dan Ibunda tercinta Syamsul Bahri dan Ade

Irma Syuryani, dan kakak tersayang Rahmawati atas doa dan dukungan baik moril

maupun materil, serta adik-adik tersayang, Alwan Husein, Fauzi dan Alfalah atas

doa, dorongan dan semangat dalam penyelesaian tesis ini. Kepada kakak dan


abang Abdi Wira Septama, M.Sc., Puji Lestari M.Si., Apt., Vonna Aulianshah,

S.Farm., Apt., Mainal Furqan, S.Si., Apt., dan Fitri Yanti, S.Farm., Apt., Ramses

Alfredo, S.Farm., Apt, Hendra, Adhli, Faisal, Nevi terima kasih atas motivasinya

dan semua pihak yang selalu memberi semangat, saran, dan nasehat.

Penulis menyadari bahwa tesis ini masih banyak kekurangannya, oleh

karena itu sangat diharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dari

semua pihak guna perbaikan tesis ini. Akhir kata penulis berharap semoga tesis ini

bermanfaat bagi ilmu pengetahuan khususnya bidang farmasi.

Medan, Maret 2014

Penulis,

Denny Satria NIM 127014009



ABSTRAK

Indonesia adalah bagian dari wilayah Indopasifik, yang merupakan salah satu pusat keanekaragaman biota laut yang terbesar di dunia. Kuda laut (Hippocampus trimaculatus Leach.) adalah sejenis ikan laut dan termasuk kedalam familia Syngnathidae dan banyak digunakan sebagai obat kuat, penguat saraf dan pengobatan kanker payudara. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengetahui aktivitas serta mekanisme isolat yang diperoleh dari fraksi n-heksana kuda laut terhadap sel MCF-7.

Ekstraksi kuda laut dilakukan dengan cara maserasi dan fraksinasi ekstrak etanol dengan ekstraksi cair-cair (ECC). Fraksinasi terhadap fraksi paling aktif dilakukan dengan kromatografi cair vakum (KCV) menggunakan fase gerak n-heksana: etilasetat secara landaian, kemudian dilanjutkan dengan kromatografi kolom dengan fase gerak n-heksana: etilasetat secara landaian. Penentuan struktur isolat dilakukan dengan spektrofotometri UV dan IR, spektrometri massa dan NMR. Pengujian aktivitas sitotoksisitas dilakukan terhadap fraksi dan isolat terhadap sel MCF-7 dengan metode MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazolium bromida]. Pengujian penghambatan terhadap siklus sel menggunakan flow cytometer dan dilakukan imunositokimia terhadap ekspresi siklin D 1 dan kaspase 9 terhadap sel MCF-7.

Pengolahan data untuk penentuan nilai IC50 menggunakan analisis probit pada program SPSS 19. Hasil uji sitotoksisitas menunjukkan bahwa fraksi KL I IC50 122.391,863 µg/ml, KL II IC50 45,392 µg/ml, KL III IC50 144,774 µg/ml, KL IV IC50 285,723 µg/ml, KLV IC50 214,890 µg/ml dan doksorubisin 7,875 µg/ml. Hasil pengujian sitotoksisitas larutan uji dari isolat dari fraksi KCV KL II terhadap sel MCF-7 memberikan nilai IC50 22,082 µg/ml terhadap sel MCF-7. Isolat dikarakterisasi dengan spektroskopi UV, FT-IR, HRMS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, NMR-2D (COSY, NOESY, HMBC dan HSQC). Dari hasil karakterisasi menggunakan Spektrofotometer UV diperoleh spektrum dengan puncak absorpsi maksimum pada panjang gelombang 205,8 nm dan spektrum infra merah menunjukkan adanya gugus OH pada bilangan gelombang 3387 cm-1, -CH alifatis (pada CH3) pada 2939,52 cm-1, C=C pada 1589,34 cm-1, CH2 pada 1450,47 cm-1, CH3 pada 1373,32 cm-1, C-O pada 1049,28 cm-1; spektrum 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, (COSY, HMBC dan HSQC) menunjukkan bahwa isolat mempunyai 27 atom karbon yang terdiri dari 5 CH3, 11 CH2, 8 CH dan 3 atom karbon kuarterner dengan gugus fungsi siklis, alkil, hidroksi dan ena non konjugasi dan spektrum HRMS menunjukkan berat molekul 386,3543 (C27H46

O, berat molekul perhitungan 386,3551). Berdasarkan hasil karakterisasi isolat dapat disimpulkan bahwa isolat KL 1 adalah cholest-5-en-3β-ol (kolesterol). Isolat menunjukkan peningkatan pada fase sub G1 pada siklus sel, menghambat ekspresi siklin D 1 dan meningkatkan ekspresi kaspase 9 pada imunositokimia terhadap sel MCF-7.

Kata kunci : kuda laut, isolasi, sitotoksisitas, sel MCF-7, metode MTT.


ELUCIDATION STRUCTURE OF ACTIVE COMPOUND SEA HORSE (Hippocampus trimaculatus Leach.) ON MCF-7 CELL LINE

ABSTRACT

Indonesia is a part of Indopasifik region, which is one of the centers of

diversity of marine life and biggest in the world

Sea horse extraction carried out with maceration and fractination with liquid-liquid extraction (LLE). Fractionation to the most active fraction with vaccume liquid chromatography (VLC) using gradient eluent n-hexane: ethylacetate, continue with column chromatography using gradient eluent n-hexane: ethylacetate. structure determination of isolate using UV and IR spectrophotometer, mass spectrometer and NMR. Cytotoxicity activity assay of fractions and isolate of sea horse on MCF-7 cell using MTT method [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide]. Inhibition examination of cell cycle using flowcytometer and immunocytochemistry of cyclin D 1 and caspase 9 expression on MCF-7 cell line.

. Sea horse (Hippocampus trimaculatus Leach.) is kind of sea fish and include in Syngnathidae family, much have been used as afrodisiac, nerve tonic and breast cancer treatment. This research have a purpose to isolation and know the activity and the mechanism isolate from n-hexane fraction sea horse on MCF-7 cell line.

Data processing for determination of IC50 values using probit analysis in SPSS 19. The result of cytotoxicity assay show KL I fraction IC50 122391.863 µg/ml, KL II IC50 45.392 µg/ml, KL III IC50 144.774 µg/ml, KL IV IC50 285.723 µg/ml, KL V IC50 214.890 µg/ml and doxorubicin 7.875 µg/ml. The result of cytotoxicity assay isolate from KL II fraction show IC50 22.082 µg/ml on MCF-7 cell line. Isolate characterized with UV and IR spectrophotometer, HRMS and 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, NMR-2D (COSY, NOESY, HMBC and HSQC). From the characterization result using UV spectrophotometer obtainable spectrum with maximum absorbstion peak at wave length 205.8 nm and from infra red spectrum show OH group at wave number 3387 cm-1, -CH aliphatic (on CH3) at 2939.52 cm-1, C=C at 1589.34 cm-1, CH2 at 1450.47 cm-1, CH3 at 1373.32 cm-1, C-O at 1049.28 cm-1; spectrum 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, (COSY, NOESY, HMBC dan HSQC) shows isolate have 27 carbon consisting of 5 CH3, 11 CH2, 8 CH and 3 quartener carbon with functional group cyclics, alkyl, hydroxyl and ena non conjugated and HRMS spectrum show molecular weight 386.3543 (C27H46

O, molecular weight calculation 386,3551). Based on the result of characterization of isolate it can be concluded isolate KL 1 is cholest-5-en-3β-ol (cholesterol). Isolate can increase at sub G1 phase on cell cycle, inhibition cyclin D 1 expression and increase caspase 9 expression at immunocytochemistry on MCF-7 cell line.

Keywords: Sea horse, isolation, cytotoxicity, MCF-7 cell line, MTT method


DAFTAR ISI

Halaman

JUDUL ................................................................................................. i

LEMBAR PENGESAHAN ................................................................. iii

PENGESAHAN TESIS ....................................................................... iv

SURAT PERNYATAAN .................................................................... v

KATA PENGANTAR ......................................................................... vi

ABSTRAK ........................................................................................... ix

ABSTRACT ......................................................................................... x

DAFTAR ISI ........................................................................................ xi

DAFTAR TABEL ................................................................................ xvii

DAFTAR GAMBAR ........................................................................... xviii

DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................ xxii

BAB I PENDAHULUAN .................................................................... 1

1.1 Latar Belakang .................................................................. 1

1.2 Perumusan Masalah .......................................................... 4

1.3 Hipotesis ........................................................................... 5

1.4 Tujuan Penelitian ............................................................... 5

1.5 Manfaat Penelitian ............................................................. 5

1.6 Kerangka Pikir Penelitian .................................................. 6

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ......................................................... 7

2.1 Uraian Hewan .................................................................... 7

2.1.1 Habitat ...................................................................... 7


2.1.2 Sistematika Hewan ................................................... 7

2.1.3 Morfologi Hewan ..................................................... 8

2.1.4 Kandungan Kimia ..................................................... 8

2.1.5 Kegunaan (khasiat) kuda laut ................................... 9

2.2 Kanker ............................................................................... 9

2.2.1 Karsinogenesis .......................................................... 12

2.2.2 Kanker payudara ....................................................... 15

2.2.3 Sel MCF-7 ................................................................. 19

2.2.4 P-glikoprotein ........................................................... 20

2.2.5 Siklus sel ................................................................... 23

2.2.6 Doksorubisin ............................................................. 26

2.2.7 Uji sitotoksik menggunakan metode MTT ............... 28

2.2.8 Flow cytometry ......................................................... 29

2.3 Ekstraksi ............................................................................ 31

2.3.1 Ekstraksi cair-cair ..................................................... 36

2.4 Kromatografi ...................................................................... 37

2.4.1 Kromatografi lapis tipis ............................................ 37

2.4.2 Kromatografi lapis tipis preparatif ........................... 39

2.4.3 Kromatografi lapis tipis dua arah .............................. 40

2.4.4 Kromatografi kolom .................................................. 41

2.4.5 Kromatografi cair vakum ........................................... 41

2.5 Spektrofotometri Ultraviolet .............................................. 42

2.6 Spektrofotometri Inframerah ............................................. 43

2.7 Spektrometri Massa ........................................................... 44


2.8 Spektrometri Resonansi Magnetik Inti (Nuclear Magnetic

Resonance).......................................................................... 45

BAB III METODE PENELITIAN ...................................................... 46

3.1 Alat dan Bahan ................................................................... 46

3.1.1 Alat ........................................................................... 46

3.1.2 Bahan ........................................................................ 47

3.2 Pengumpulan dan Pengolahan Sampel .............................. 47

3.2.1 Pengambilan sampel ................................................. 47

3.2.2 Identifikasi hewan kuda laut ..................................... 47

3.2.3 Pembuatan sampel .................................................... 48

3.3 Pembuatan Ekstrak ............................................................ 48

3.3.1 Pembuatan fraksi-fraksi dari ekstrak etanol ............. 48

3.4 Sterilisasi Alat dan Bahan................................................... 49

3.5 Pembuatan Media .............................................................. 49

3.5.1 Pembuatan media Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ..................................................................... 49

3.5.2 Pembuatan media kultur lengkap (MK) ................... 50

3.6 Penumbuhan Sel MCF-7 .................................................... 50

3.6.1 Penumbuhan sel ......................................................... 50

3.6.2 Subkultur sel ............................................................. 51

3.6.3 Panen sel MCF-7 ...................................................... 51

3.6.4 Penghitungan sel ........................................................ 51

3.7 Pembuatan Larutan Uji ...................................................... 52

3.7.1 Pembuatan seri konsentrasi larutan uji ..................... 52


3.8 Uji Antikanker .................................................................... 53

3.8.1 Uji Sitotoksik ............................................................ 53

3.8.2 Penghambatan pada Siklus sel (Cell Cycle) .............. 53

3.8.3 Selectivity Index ........................................................ 54

3.8.4 Analisis Ekspresi kaspase 9 dan siklin D 1 dengan Imunositokimia ......................................................... 55

3.9 Analisis Hasil ...................................................................... 56

3.10 Analisis Fraksi n-heksana dan Kloroform secara KLT .... 56

3.11 Fraksinasi Fraksi n-heksana dan Kloroform dengan KCV (Kromatografi Cair Vakum) .................................. 57

3.12 Analisis KLT Hasil KCV ................................................ 57

3.13 Isolasi Senyawa Hasil Fraksinasi secara Kromatografi Kolom ............................................................................... 57

3.14 Analisis Eluat (hasil fraksinasi kolom) dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ..................................... 58

3.15 Uji Kemurnian Isolat ....................................................... 58

3.16 Karakterisasi Isolat .......................................................... 59

3.16.1 Karakterisasi Isolat secara Spektrofotometri UV ... 59

3.16.2 Karakterisasi Isolat secara Spektrofotometri IR ..... 59

3.16.3 Karakterisasi Isolat secara Spektrometri Massa ..... 60

3.16.4 Karakterisasi Isolat dengan Spektroskopi NMR (Nuclear Magnetic Resonance) .............................. 60

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................. 61

4.1 Hasil Identifikasi Hewan ................................................... 61

4.2 Hasil Ekstraksi ................................................................... 61

4.3 Hasil Uji Sitotoksisitas Fraksi n-heksana, Fraksi KCV dan Isolat Kuda Laut terhadap Sel MCF-7 ......................... 61


4.4 Hasil Uji Sitotoksisitas Isolat Kuda Laut terhadap Sel Vero dan Selectivity Index (SI) ........................................... 63

4.5 Hasil Uji Penghambatan Siklus Sel dengan Flowcytometer .................................................................... 64

4.6 Hasil Analisi Ekspresi kaspase 9 dan siklin D1 dengan Imunositokimia ................................................................... 67

4.7 Hasil Analisis Fraksi n-heksana dengan Cara Kromatografi Lapis Tipis (KLT) .............................. 70

4.8 Hasil Pemisahan Fraksi n-heksana dengan Kromatografi Cair Vakum (KCV) ........................................................... 71

4.9 Hasil Pemisahan Fraksi n-heksana dengan Kromatografi Kolom ................................................................................ 72

4.10 Hasil Analisi KLT dari Hasil Pemisahan dengan Kolom Kromatografi ................................................................... 73

4.11 Hasil Analisi KLT Isolat .................................................. 74

4.12 Hasil Pemeriksaan Kemurnian dengan Kromatografi Lapis Tipis Dua Arah ...................................................... 74

4.13 Hasil Karakterisasi Isolat KL I dengan Spektrofotometer Sinar Ultra Violet ............................... 75

4.14 Hasil Karakterisasi Isolat KL I dengan Spektrofotometer Infra Merah ......................................... 76

4.15 Spektrum NMR Karbon-13 ............................................. 78

4.16 Spektrum NMR Proton .................................................... 86

4.17 Spektrum DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) ..................................................... 91

4.18 Spektrum Massa (HRMS) ............................................... 93

4.19 Spektrum HSQC (1H-13

Connectivity) ................................................................... 95 C Heteronuclear Single Quantum

4.20 Spektrum HMBC (1H-13

Connectivity) ................................................................... 99 C Heteronuclear Multiple Bond

4.21 Spektrum COSY (1H-1H Homonuclear Correlation


Spectroscopy) .................................................................. 102

4.22 Spektrum NOESY (1H-1

Spectroscopy) .................................................................. 103 H Nuclear Overhouser Effect

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .............................................. 108

5.1 Kesimpulan ........................................................................ 108

5.2 Saran .................................................................................. 108

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................... 109

LAMPIRAN ........................................................................................ 118


DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 4.1 Persentase akumulasi pada tiap fase dalam siklus sel ......... 64

Tabel 4.2 Harga Rf hasil KLT fraksi n-heksana kuda laut .................. 70

Tabel 4.3 Interpretasi spektrum IR isolat terhadap serapan dan bilangan gelombang ............................................................ 76

Tabel 4.4 Korelasi frekuensi C-O dengan stereokimia ........................ 77

Tabel 4.5 Data pergeseran kimia spektrum 13

KL I ..................................................................................... 79 C-NMR dari isolat

Tabel 4.6 Perbandingan data 13

literatur ............................................................................... 85 C-NMR hasil penelitian dan data

Tabel 4.7 Data karbon CH2, CH dan CH3

dari isolat KL I ................. 92

Tabel 4.8 Data 13

Tabel 4.9 Perhitungan berat molekul isolat KL I berdasarkan berat

C-NMR dan DEPT isolat KL I ................................ 93

atom penyusunnya .............................................................. 94


DAFTAR GAMBAR Halaman

Gambar 1.1 Diagram kerangka pikir penelitian ............................... 6 Gambar 2.1 Morfologi hewan kuda laut .......................................... 8

Gambar 2.2 Multitahap karsinogenesis ........................................... 14

Gambar 2.3 Metastasis sel kanker melalui pembuluh limfoid ........ 15

Gambar 2.4 Kanker payudara .......................................................... 18

Gambar 2.5 Mekanisme pemompaan oleh Pgp ............................... 22

Gambar 2.6 Checkpoints siklus sel .................................................. 25

Gambar 2.7 Reduksi MTT menjadi formazan .................................. 28

Gambar 4.1 Hasil flow cytometer sel MCF-7 dengan pemberian doksorubisin dan isolat KL I ....................................... 41

Gambar 4.2 Histogram siklus sel MCF-7 yang menunjukkan sedikit sel yang mengalami agregat (double cell) ditunjukkan oleh tanda panah ....................................... 67

Gambar 4.3 Ekspresi kaspase 9 dan siklin D 1 pada sel MCF-7 yang diberi doksorubisin dan isolat KL I ..................... 68

Gambar 4.4 Kromatogram hasil analisis fraksi n-heksana dengan KLT ............................................................................. 70

Gambar 4.5 Bagan kerja KCV dan kromatografi kolom .................. 72

Gambar 4.6 Bagan kerja fraksinasi dengan kolom kromatografi .... 73

Gambar 4.7 Kromatogram uji kemurnian dengan empat jenis fase gerak yang berbeda ...................................................... 74

Gambar 4.8 Kromatogram KLT dua arah isolat KL I ...................... 75

Gambar 4.9 Spektrum ultraviolet isolat KL I ................................... 75

Gambar 4.10 Spektrum infra merah isolat KL I ................................. 76

Gambar 4.11 Orientasi gugus OH yang mempunyai orientasi β-ekuatorial .................................................................. 78


Gambar 4.12 Spektrum 13

Gambar 4.13 Spektrum

C-NMR isolat KL I .................................. 79

13

(71,8205 - 121,7245 ppm) ............................................ 80 C-NMR isolat KL I



C-NMR isolat KL I (42,3222 ppm) .......... 80

13

(11,8559 – 19,3919 ppm) ............................................. 81 C-NMR isolat KL I


(21,0842 – 24,2902 ppm) ............................................ 81 C-NMR isolat KL I


(28,0107 – 31,9074 ppm) ........................................... 82 C-NMR isolat KL I






(50,1360 – 56,7684 ppm) ............................................. 84 C-NMR isolat KL I

Gambar 4.21 Spektrum dari pelarut CDCl3


(77,0002 ppm) ............. 85

1


H-NMR isolat KL I .................................... 86

1


H-NMR isolat KL I (1,0264 ppm) ............. 87

1

gugus metil ................................................................... 87 H-NMR isolat KL I yang menunjukkan


(metin) .......................................................................... 88

H-NMR isolat KL I cirri atom C-3

Gambar 4.26 Orientasi gugus OH pada atom C-3.............................. 88

Gambar 4.27 Kedudukan gugus OH pada atom C menempati posisi β-ekuatorial ....................................................... 90


Gambar 4.29 Spektrum DEPT dari isolat KL I ................................. 91

H-NMR cirri atom C-6 .............................. 90


Gambar 4.30 Spektrum DEPT isolat KL I (11,8585 – 42,2971 ppm) ............................................. 92

Gambar 4.31 Spektrum DEPT isolat KL I (50,1378- 121,7262 ppm) ............................................. 93

Gambar 4.32 Spektrum massa (HRMS) dari isolat KL I ................... 94

Gambar 4.33 Spektrum HSQC senyawa isolat KL I (C-3; H-3 dan C-6; H-6) ...................................................................... 95

Gambar 4.34 Spektrum HSQC senyawa isolat KL I (C-21; H-21, C-19; H-19 dan C-26; H-26) ....................................... 96

Gambar 4.35 Spektrum HSQC senyawa isolat KL I (C-4; H-4) ....... 96

Gambar 4.36 Spektrum HSQC senyawa isolat KL I (C-18; H-18, C-21; H-21 dan C-19; H-19) ....................................... 97

Gambar 4.37 Spektrum HSQC senyawa isolat KL I (C-7;H-7, C-24; H-24, C-9; H-9, C-17; H-17, C-1; H-1 dan C-12;H-12 ..................................................................... 97

Gambar 4.38 Spektrum HMBC isolat KL I ...................................... 99

Gambar 4.39 Interaksi antara H-1 dengan C-5 dan C-9 .................... 99

Gambar 4.40 Interaksi antara H-12 dengan C-14 dan C-17 .............. 100

Gambar 4.41 Interaksi antara atom H-22 dengan C-21, C-24, C-20 dengan C-21 dan C-24 dan C-17 dengan C-21 ........... 100

Gambar 4.42 Interaksi antara H-24 dengan C-26, C-27, H-26 dengan C-27 dan H-25 dengan C-26 dan C-27 ........... 101

Gambar 4.43 Interaksi proton dan karbon ......................................... 101

Gambar 4.44 Spektrum COSY isolat KL I (H-3; H-2; H-4 dan H-6; H-7........................................................................ 102

Gambar 4.45 Spektrum COSY isolat KL I (H-3; dan H-2; H-4) ...... 103

Gambar 4.46 Spektrum NOESY isolat KL I ...................................... 104

Gambar 4.47 Spektrum NOESY isolat KL I (H-9; H-7, H-9; H-12, H-11; H-19, H-15; H-12 dan H-15; H-16 .................... 104


Gambar 4.48 Hubungan antara masing-masing proton dengan NOE ............................................................................. 105

Gambar 4.49 Senyawa cholest-5en-3β-ol (kolesterol) ...................... 105

Gambar 4.50 Kedudukan atom H pada atom C-3 ............................. 106

Gambar 4.51 Pembuktian bahwa gugus OH tidak berkedudukan α .. 106

Gambar 4.52 Pola pemecahan anak puncak jika gugus OH berkedudukan α ........................................................... 107


DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1 Hasil identifikasi hewan kuda laut .............................. 118

Lampiran 2 Simplisia kuda laut ...................................................... 119

Lampiran 3 Bagan kerja pembuatan ekstrak etanol ........................ 120

Lampiran 4 Bagan fraksinasi ekstrak etanol kuda laut ................... 121

Lampiran 5 Perhitungan persen sel hidup sel MCF-7...................... 122

Lampiran 6 Perhitungan persen sel hidup sel Vero ........................ 125

Lampiran 7 Perhitungan IC50

Lampiran 8 Bagan pembuatan media RPMI ................................... 135

dengan analisa probit SPSS 19 ........ 126

Lampiran 9 Bagan pembuatan media kultur lengkap ..................... 136

Lampiran 10 Bagan penumbuhan sel MCF-7 .................................... 137

Lampiran 11 Bagan panel sel MCF-7 ............................................... 138

Lampiran 12 Bagan penghitungan sel ............................................... 139

Lampiran 13 Bagan pembuatan larutan uji ....................................... 139

Lampiran 14 Bagan pengujian sitotoksik .......................................... 140

Lampiran 15 Bagan pengujian penghambatan pada siklus sel ......... 141

Lampiran 16 Bagan analisis ekspresi kaspase 9 dan siklin D 1 dengan Imunositokimia ................................................ 142

Lampiran 17 Spektrum HRMS isolat KL I ....................................... 143

Lampiran 18 Sel MCF-7 dibawah mikroskop ................................... 145

Lampiran 19 Kristal formazan dan sel Vero dibawah mikroskop .... 146

Lampiran 20 Mikroskop inverted, elisa reader, flowcytometer, laminar air flow dan inkubator CO2

............................ 147


Date post:	01-Feb-2016
Category:	Documents
Upload:	raja-ramadiansyah
View:	224 times
Download:	0 times

Kuda Laut-Sel MCF.pdf

Documents