Large Scale Production and Commercialization of Proteins

from Recombinant Microorganisms

Linawati Hardjito, PhD

BiologyChemistryGenetics

EngineeringStatistics

Economics

Biotechnology

Biodiversity

Process & Products Development

Natural ProductsPharmaceuticalsBiomedical probesNutraceuticalsCosmeticsFood/FeedIndustrial Chemicals

Pollution ControlBioremediationBiofiltrationBioleachingBioabsorption

Aquaculture related product

Bioprocess Engineering

Bioreactor 2000 L

Bioproses proses yang memanfaatkan organisme (khususnya mikroorganisme) untuk mengasilkan produk & proses yang bermanfaat untuk kemidupan manusia dan lingkungannyaSub-disiplin bioteknologi yang berperan merubah penemuan bioteknologi menjadi produk/proses Contoh:

• Produksi rekombinan enzim amilase dengan Saccharomyces cerevisiae dan Pichia pastoris

• Produksi rekombinan selulase, lipase dengan Escherichia coli• Produksi penisilin dengan Penicillium sp• Bioremeidasi tanah terkontaminasi minyak bumi• Produksi biopigmen pycoerythrin dengan mikroalga

Porphyrodium cruentum

BiologyChemistryGenetics

EngineeringStatistics

Economics

Biotechnology

Marine Biodiversity

Process & Products Development

Natural ProductsPharmaceuticalsBiomedical probesNutraceuticalsCosmeticsFood/FeedIndustrial Chemicals

Pollution ControlBioremediationBiofiltrationBioleachingBioabsorption

Aquaculture related product

Oganisme/ekstrakterpilih

Pengembangan & Optimasi bioprosesPemilihan media (C,N, mineral,dll)Pemilihan kondisi lingungan fisik & kimia(t,pH,salinas,cahaya,oksigen)

Proses terpilih

Perbaikan genetik Mutasi

Rekayasa genetika

Down stream processing• Pemanenan• pemurnian

Formulasi produk

product

Pengembangan budidaya

FraksinasiPemurnianKarakterisasiStruktur elucidasi

Basic researchMolecular biology High value added product

Bioprocess Engineering

Bioprocess engineering is the discipline that puts biotechnology to work

Sifat Unggul BioprocessKondisi reaksi yang ringan/ramah lingkungan

Temperatur & tekanan ruangReaksi bersifat sangat spesifik dan efektif

Enzim/mikroorganisme mengkatalisis reaksi tertentuReaksi yang kompleks dapat diupayakan menjadi satu kesatuan

Beberapa enzim/mikroorganisme bekerja bersama-sama

Menggunakan sumberdaya terbarukanPenerapan rekayasa genetika menungkinan untuk meningkatan produktiftas

Sifat lemah bioproses

Campuran produk yang kompleks : mikroba, produk, sisa nutrien Mudah terjadi kontaminasi Perlu sterilisasi dan penjagaan kondisi aseptik

Variabilitas dan ketidakstabilan Mutasi alami Mikroorganisme (enzim) tidak bisa bekerja

pada kondisi yang sangat bervariatif

Produk bioprosesBerdasarkan volume produksi dan nilai jual

Volume besar nilai rendah Volume besar nilai menengah Volume kecil nilai tinggi

Berdasarkan letak produk Intraselular Ekstraselular

Berdasarkan peran dalam metabolisme Metabolit primer Metabolit sekunder

Berdasarkan waktu produksi Growth associated Non-growth associated

Waktu (jam,hari)

Konsentrasi sel (g/L, OD600nm, jumlah sel/mL)

sel

Growth associated (metabolit primerNon Growth associated (metabolit sekunder)

Kebutuhan pengembangan bioproses

mikroorganisme nutrien ( sumber karbon, nitrogen, mineral, vitamin, oksigen, dll) Makronutrien Mikronutrien

Kondisi lingkungan yang sesuai (pH, salinitas, temperatur, tekanan)Bioreaktor (tempat kultivasi )

Penggolongan bioproses

Berdasarkan kebutuhan oksigen Aerobik & anaerobik

Berdasarkan kandungan air dalam campuran substrat : padat & cairBerdasarkan moda operasi : batch, fed-batch, continuousBerdasarkan letak pertumbuhan sel : tersuspensi & tertambat

Bioreaktor dan moda operasi bioreaktor : bejana, tabung, reaktor yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganismeJenis bioreaktor & metode kultivasi

Batch (curah) : tidak ada penambahan nutrien dan pemanenan produk atau pembuangan limbah selama proses kecuali udara (oksigen) untuk proses aerobik

Fed-batch (curah umpan) : ada penambahan nutrien selama proses tapi tidak ada pemanenan sampai /pembuangan limbah selesai

Continuous (sinambung) : ada penambahan nutrien dan pemanenan /pembuangan limbah selama proses

Bioreaktor

Batch proses

Fin =0Fout =0

F = kecepatan penambahan nutrien (medium) (ml/jam, L/jam)In = masuk, out =keluarFin= Fout = 0

Keuntungan Sederhana Relatif murah dibandingkan proses

lainnya Proses cepat

Kelemahan Produk inhibisi Substrat inhibisi

Fed-batch (curah umpan)

Fin = Fml/jam Fout =0

Vo

Vt waktu

Sel & substrat

Substrat (S)

Sel (X)

Keuntungan Produksi sel pada konsentrasi yang

tinggi (high cell density) Mengurangi substrat inhibisi

Kelemahan Produk inhibisi

Continuous (sinambung)

Fin = Fml/jam Fout =F

Vt =vo waktu

Sel & substrat

Substrat (S)

Sel (X)

Produk (P)

Keuntungan Mengurangi inhibisi produk Mengurangi inhibisi substrat Sistem pada kondisi steady state : bagus

untuk menentukan parameter kinetikKelemahan Waktu operasi lama Kemungkinan kontaminasi kompleks

Monitoring pertumbuhan dan pembentukan produk

Pertumbuhan sel Berat kering (g/L, mg/mL) Kekeruhan ( optical density) :

spektrofotometer Jumlah sel (hemositometer & mikroskop)

Sisa substrat (nutrisi) : g/L, mg/mLPembentukan produk : g/L, unit/mLKondisi lingkungan : pH, T, salinitas, Dissolved Oxygen

Kinetika Pertumbuhan dan pembentukan produk

Specific growth rate (µ): perrcepatan pertumbuhanµ mengikuti persamaan Monod atau Michaelis Menten

Untuk proses batch (curah) Nutrisi tersedia berlebih (diberikan pada saat awal proses) Nilai Ks kecil µ mendekati µ max

SS

K s

max

SS

K s

max

Yield (Y) Yx/s : sel yang dihasilkan per substrat yang

dikonsumsi (g sel/ g substrat), Δx/ Δs Yp/s : produk yang dihasilkan per substrat

yang dikonsumsi (g produk/ g substrat), Δp/Δs =Yp/x : produk yang dihasilkan per sel yang

tersedia (g produk/ g sel), Δp/ ΔX

Kinetika pada proses batch

XdtdX dt

dXX1

dtXdX

tt

t

tx

X

dtXdx

00

tXX

o

t

ln

tXX ot lnln tXX t 0lnln

tXX t 0lnln

µ

T =waktu

Ln Xt

Ln Xo

XdtdX

XYdt

dS

sx /

XYdtdP

xp /

Contoh penentuan µWaktu kultivasi

(jam)Sumber karbon laktat

(1 g/L)Sumber karbon laktat

(3g/L)Konsentrasi sel (g/L)

0 0.049 0.0422 0.106 0.1974 0.305 0.2796 0.62 0.6288 1.14 1.032

10 1.23 1.39812 1.248 1.722

laktat (1 g/L)

0

0.20.40.60.8

11.21.4

0 2 4 6 8 10 12 14

Waktu (jam)

Sel (

g/L)

laktat (1 g/L)

y = 0.403x - 2.971R2 = 0.9911

-4

-3

-2

-1

0

1

0 5 10 15

Waktu (jam)

ln X

laktat (3 g/L)

0

0.5

1

1.5

2

0 2 4 6 8 10 12 14Waktu (jam)

laktat (3 g/L)

y = 0.3781x - 2.8135R2 = 0.9418

-4

-3

-2

-1

0

1

0 5 10 15

Waktu (jam)

ln X

Kinetika pada proses continuous (sinambung)

XVFX

dtdX

XY

SSDdtdS

sxi

/

)(

DXXdtdX

F= feed rate (kecepatan umpan, ml/Jam, l/jamV= volume bioreaktor (ml, L, m3)F/V = D : dilutaion rate, nilai konstanD= µX: Sel (g/L)T ; waktu kultivasi (jam, hari)S: Substrat (g/L)P : produk (g/L)

DPXYdtdP

xp /

waktu

Sel & substrat

Substrat (S)

Sel (X) dx/dt= 0

ds/dt=0

Pada kondisi steady state

DDXXdtdX

,0

DSS

K s

max

SDDKSDSDKSSKD

s

s

s

max

max

max

DDKS s

max

Sel & substrat

Substrat (S)

Sel (X)

dx/dt= 0

Pada kondisi steady state

XY

SSDdtdS

sxi

/

)( 0

dtdS

)(

)(

/

/

SSYXD

XY

SSD

isx

sxi

XY

SSDsx

i/

)(

)(/ SSYXD

isx

Sel & substrat

Substrat (S)

Sel (X) dx/dt= 0

Pada kondisi steady state

DPXYdtdP

xp / DdtdP

,0

XYP xp /

waktu

Sel & substrat

Substrat (S)

Sel (X)

Produk (P)

Produktifitas bioreaktor sinambung

Sel (X) = X. D (g/L.jam)Sisa substrat (S) = S.D (g/L.jam)Produk (P) = P.D (g/L.jam)

DDKS s

max

SSYX isx (/

xpYXP

/

Penentuan nilai KsD (1/jam)

S (g/L)

µmax

½ µmax

Ks

Contoh kasusSuatu bioproses yang memanfaatkan mikroalga (Chlorella sp) digunakan untuk mengolah limbah industri pupuk yang mengnadung ammonium 200 mg/L dengan volume limbah yang dihasilkan adalah 75 m3/jam.

Peraturan pemerintah mengharuskan kadar ammonium dalam air buangan maksimum 5 mg/L. Bila dari hasil percobaan di laboraorium diperoleh data kinetika sebagai berikut : Yx/s =0.1 g sel/g NH4+ dan µmax = 0.5/hari

Tentukan :Berapa ukuran kolam (biorekator) yang harus dibuat supaya tidak terjadi kematian mikroalga (wash out)Berapa konsentrasi mikroalga yang dihasilkan dalam bioreaktorBerapa produktifitas mikroalga yang diperolehBila mikroalga mengnadung vitamin B1 dengan kadar 0.1 ug/gram sel, berapa produktifitas vitamin B1 yang dihasilkan

Berikut adalah data hasil percobaan di laboratorium untuk pertumbuhan mikroalga Chlorella sp.

Bila mikroalga tersebut akan digunakan untuk mengolah air dari kolam budidaya yang mengandung kadar ammonium 15 mg/L. Bila air tersebut akan diresirkulasi ke kolam dengan persyaratan bahwa kadar ammonium tidak boleh lebih dari 0.1 mg/L dengan kolam pengolah air yang tersedia memilki kapasitas 1000 m3.1.Tentukan berapa flow rate yang diperbolehkan agar air yang dihasilkan dari unit pengolah memenuhi persyaratan yang diinginkan2. Hasil percobaan laboratorium menunjukkan bahwa dari 1 gram ammonium dihasilkan 0.3 g biomasa 3. Berapa maksimum specific growth rate yang dimiliki mikroalga ?

Waktu(hari)

Kepadatan selSel/mL

1 2.5 x 105

2 3.5 x 105

3 7.5 x 105

4 2.15 x 106

5 4.90 x 106

6 5.90 x 106

7 6.05 x 106

8 5.55 x 106

Komersialisasi

Demand orientedTechnologically feasibleEconomically feasible

Investment, Payback Period, IRR, B/CSocial and environmentally feasible