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Université Cadi Ayyad Faculté Des Sciences
Semlalia-Marrakech
Département de Chimie
Master de chimie moléculaire
ELECTROPHORESE ET ANALYSE
MEDICALE
Préparer par :
AIT KHOUYA Ahmed
BENAISSA Idir
Encadrer par :
Pr A. BENYAICH
L’ELECTROPHORESE ET ANALYSE MEDICALE 2014/2015
1
Table de matières :
INTRODUCTION ---------------------------------------------------------------------- 3
I ° HISTOIRE --------------------------------------------------------------------------- 4
II ° DÉFINITION ET PRINCIPE ÉLECTROPHORÈSE : ------------------------ 5
II-1 ° DÉFINITION ------------------------------------------------------------------ 5
II-2 ° PRINCIPE --------------------------------------------------------------------- 5
III ° LES DIFFÉRENTS TYPES D’ÉLECTROPHORÈSE ----------------------- 6
III-1 ° Sur supports liquide ou ‘’ électrophorèse en veine liquide ‘’ ---------- 6
III-2 ° Sur supports poreux ou ‘’ électrophorèse de zone ‘’ -------------------- 6
III-2-a ° Electrophorèse sur papier ---------------------------------------------- 7
III-2-b ° Electrophorèse Sur Acétate de cellulose ----------------------------- 7
III-2-c ° Electrophorèse sur gel -------------------------------------------------- 8
c-i ° Sur gel d’agarose. --------------------------------------------------------- 8
c-ii ° Sur gel de polyacrylamide ----------------------------------------------- 9
c-iii ° Électrophorèse en champ pulsé -------------------------------------- 11
c-iv ° Electrophorèse bidimensionnelle ------------------------------------ 11
IV ° LES APPLICATIONS DE L’ELECTROPHORESE : --------------------- 13
IV-1 ° SEPARATION DES ACIDES AMINES PAR ELECTROPHORESE : 13
IV-2 ° Electrophorèse des protéines (protéines sériques comme exemple) : 13
IV-2-a ° Détection d'anomalies immunitaires : ------------------------------ 14
a-i ° Sérum humain normal : ------------------------------------------------- 14
a-ii ° Sérums pathologiques -------------------------------------------------- 15
IV-3 ° Électrophorèse de l’ADN (sur gel d'agarose) : ------------------------ 16
CONCLUSION ------------------------------------------------------------------------ 18
REFERENCE : ------------------------------------------------------------------------ 19
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Listes des figures :
fig1 : appareillage d’electrophorese ---------------------------------------------------------------------------------------------- 6
fig2 : appareillage pour electrophorese sur papier ----------------------------------------------------------------------------- 7
fig3 : cuve remplie de tampon et transformateur utilises pour l'electrophorese en gel d'agarose ---------------------- 9
fig4 : le profil electrophoretique du serum humain normal et son analyse densitometrique. ------------------------- 15
fig5 : le profil electrophoretique du serum humaine pathologique et son analyse densitometrique. --------------- 16
L’ELECTROPHORESE ET ANALYSE MEDICALE 2014/2015
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INTRODUCTION
L'électrophorèse est une technique biochimique de séparation fondée sur le fait que des
molécules portant des charges électriques différentes migrent à des vitesses différentes
lorsqu'elles sont placées dans un champ électrique.
On va traiter dans ce rapport les raisons qu'ont fondé sur se découvrir et son évolution
pendant le temps, et aussi on va miser en points sur les différentes techniques de
l'électrophorèse
D'ailleurs l'électrophorèse est utilisée dans majorité des domaine à savoir la biologie,
l'industrie et la médecine...
Dans notre travail on s'intéresse à l’utilisation de l’électrophorèse dans le domaine médical.
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I ° HISTOIRE
Cette technique a été imaginée en 1892 par S.E. Linder et H. Picton qui sont inspirés
des travaux d’Hermann Von Helmholtz sur l’électro-osmose. En effet, ce dernier constata
qu’il était possible de déplacer des particules chargées sous l’effet d’un champ électrique.
Chronologie de la mise au point de l’électrophorèse :
En 1937, Arne Wilhelm Kaurin Tiselius, met au point la première électrophorèse:
l'électrophorèse libre. Cette technique lui a permis de séparer les protéines du sérum sanguin
en appliquant un champ électrique. La solution est placée dans un tube en U de section carrée
afin de réaliser des mesures optiques au travers du tube. Il a pu ainsi obtenir sur le pôle + des
protéines de charge très négative comme l'albumine et sur le pôle - des protéines de charge
plus positive comme les globulines.
Cette technique ne permet toutefois pas de séparer totalement les protéines. Il est
néanmoins possible de mettre en évidence les frontières formées par des méthodes optiques
comme la fluorescence, l'absorption des UV ou l'indice de réfraction.
En 1939, P. König et D Von Klobusitzky ont séparé avec succès les composants du venin
de serpent en élaborant la technique d'électrophorèse sur papier
En 1952, Pierre Grabar élabore, en collaboration avec C.A.Williams, une méthode
connue sous le nom d'analyse immuno-électrophorétique, qui permet d'analyser de manière
précise des mélanges très complexes d'antigènes. Dès la première application de cette
méthode à l'analyse du sérum sanguin humain, il parvient à déceler dans le sérum plus de 30
constituants indépendants, alors que l'électrophorèse en veine liquide ou sur papier ne
permettait d'isoler que 5 ou 6 groupes de protéines. La méthode est rapidement utilisée dans
de nombreux laboratoires médicaux pour des besoins de diagnostiques.
En 1955, O. Smithies utilise les gels d’amidon pour séparer les protéines sériques par
électrophorèse.
En 1957, Joachim Kohn sépare les différents phénotypes de l’hémoglobine en élaborant
la technique d'électrophorèse sur membrane d'acétate de cellulose.
En 1959, Raymond et Weintroub introduisent les gels de polyacrylamide, meilleure
séparation des protéines par électrophorèse (au gel d’amidon).
En 1969, Beber et Osborn introduisent l'agent dénaturant SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)
pour séparer les différentes sous-unités protéiques.
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En 1975, O’ Farell développe les gels bidimensionnels (focalisation isoélectrique, SDS-
PAGE), séparation de plus de 1000 protéines sur un même gel.
En 1984, Schwartz et Cantor développent l’électrophorèse en champ pulsé : séparation
de très grosses molécules d’ADN
II ° DÉFINITION ET PRINCIPE ÉLECTROPHORÈSE :
II-1 ° DÉFINITION
L’électrophorèse est une méthode de séparation des molécules chargées électriquement.
On a une séparation puis on a une caractérisation ou une purification de molécules d’intérêts.
Le terme « électrophorèse » décrit la migration de particules chargées sous l’influence d’un
champ électrique. Le préfixe « électro » fait référence à l’électricité et la racine « phorèse »
vient du grec phoros, qui signifie « porter d’un côté à l’autre ».
Cette méthode s’applique principalement à la biochimie et à la biologie moléculaire et on
a une séparation des protéines et des acides nucléiques.
II-2 ° PRINCIPE
Son principe consiste à avoir une migration de molécules chargées (perte de neutralité
électrique) dissoutes ou en suspension dans un solvant, sous l’effet d’un champ électrique.
Un champ électrique est produit par un générateur de courant continu. Le support du
champ est un tampon conduisant le courant d’un pôle à l’autre.
Les caractéristiques propres des molécules et les conditions de l’électrophorèse implique
des vitesses de migration des ions qui est différentes et une séparation les unes des autres (les
anioniques migrent vers l’anode (+) et les cationiques vers la cathode (-).
Les molécules à séparer sont déposées sur un support dont chaque extrémité est en contact
avec une solution tampon. Dans chaque solution tampon se trouve une électrode. Les
électrodes sont reliées à un générateur de courant.
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Fig1 : appareillage d’électrophorèse
L'électrophorèse permet de traiter simultanément plusieurs échantillons en même temps.
La séparation est fine.
III ° LES DIFFÉRENTS TYPES D’ÉLECTROPHORÈSE
Selon le support on distingue deux types d’électrophorèse :
III-1 ° Sur supports liquide ou ‘’ électrophorèse en veine liquide ‘’
Le champ électrique est fourni par un générateur de courant continu. Le support de ce
champ est constitué par une solution tampon de pH et de concentration convenables dont les
ions conduisent le courant d'un pôle à un autre. Ce support peut être liquide : on parle alors
d'électrophorèse en veine liquide (mise au point par Tiselius en 1937).
Inconvénients : Elle nécessite un appareillage coûteux, une mise en œuvre longue et
délicate, mais encore elle ne permet pas de distinguer, d'isoler, ni de caractériser les fractions
protéiques autrement que par leur mobilité.
III-2 ° Sur supports poreux ou ‘’ électrophorèse de zone ‘’
On à différents support d’électrophorèse de zones :
• Sur Papier
• Sur Acétate de cellulose
• Semi solide (gel)
On a plusieurs types d’électrophorèse sur gel :
• Sur gel d’agarose.
• Électrophorèse en champ pulsé.
• Sur gel de polyacrylamide.
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• Electrophorèse bidimensionnelle.
Le support poreux doit être homogène et le plus inerte possible.
III-2-a ° Electrophorèse sur papier
Habituellement employé dans un montage horizontal, plus rarement vertical, il servait
surtout à séparer des acides aminés ou d'autres petites molécules chargées. Le dépôt et la
migration des échantillons se font en surface. Puis détermination du point isoélectrique d’un
acide aminé. On a une mesure de mobilité par détermination de mobilité d’un acide aminé à
différent pH et on a la relation suivante.
Mobilité= k. (pH-pHi) / Masse molaire
Inconvénient: La présence de charges sur la cellulose qui constitue le papier interfère un
peu avec la migration. Il est de moins en moins utilisé sauf, quelques fois, pour la séparation
des acides aminés sous très haut voltage.
Fig2 : appareillage pour Electrophorèse sur papier
III-2-b ° Electrophorèse Sur Acétate de cellulose
On dépose quelques microlitres de la solution à étudier (mélanges d'enzymes, de protéines
sériques ou d'autres substances chargées) sous forme d'une ligne mince sur le support imbibé
de tampon. On le soumet ensuite à une électrophorèse ; l'intensité du courant est voisine de 2
mA par centimètre de largeur du support.
Au bout de quelques heures, la feuille est séchée. Les différentes fractions sont révélées
par des colorants spécifiques, qui permettent de caractériser, par exemple, les protéines, les
glycoprotéines, les lipoprotéines. Quant aux enzymes, on peut les révéler en utilisant leur
activité spécifique sur des substrats convenablement choisis.
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III-2-c ° Electrophorèse sur gel
Sous l'action d'un champ électrique, E, une protéine se déplace avec une vitesse(v)
proportionnelle aux champs:
V = µ E, avec µ appelée 'mobilité électro phorétique' µ = v / E (1) avec : µ en cm2.s-
1.volt-1, v en cm.s-1 et E en volt.cm-1
Le champ électrique (E) crée entre 2 électrodes, exerce une force, F, sur une protéine que
l'on suppose sphérique et de charge q; F = q E
Les forces de frottement, F', dues à la viscosité (eta) vont s'opposer à la migration de la
protéine et la freiner;
Donc, la mobilité d'une particule migrant dans un champ uniforme dépend de 3 facteurs :
q, (eta) et r.
Elle est proportionnelle à sa charge (q), inversement proportionnelle au coefficient de
viscosité du milieu (eta) et son rayon (r).
c-i ° Sur gel d’agarose.
L'électrophorèse en gel d'agarose est une technique de base au laboratoire de biologie
moléculaire. Elle est utilisée
• Soit à des fins analytiques: pour séparer et identifier des fragments d'ADN, pour
déterminer leur taille, pour en estimer la quantité,
• Soit à des fins préparatoires, pour purifier un fragment d'ADN de taille connue.
La taille des fragments qu'il est possible de séparer est comprise entre 0,2 et 50 kb.
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Les fragments d'ADN sont facilement détectés sur le gel grâce à un colorant fluorescent, le
bromure d'éthidium (BEI). On peut ainsi visualiser en lumière UV des quantités très faibles
d'ADN (de l'ordre de 5-10 ng).
L'électrophorèse en gel d'agarose est donc une technique très sensible; elle est de plus
rapide et simple à mettre en œuvre.
L'agarose est un polyoside hautement purifié extrait de l'agar. Ce polymère linéaire est
constitué de la répétition d'un motif de type diholoside.
L'agarose est une poudre blanche qui se dissout dans l'eau à ébullition. La solution
d'agarose reste à l'état liquide tant que la température est supérieure à 40-45 °C (surfusion)
Quand la température devient inférieure à 40°C, la solution se solidifie en un gel stable qui ne
font pas tant que la température reste inférieure à 100 °C.
La réticulation d'un gel dépend de sa concentration en agarose: la taille des pores est
d'autant plus petite que la concentration de l'agarose dans le gel est plus élevée. On utilise le
plus souvent des concentrations allant de 0,4 à 2% (masse/volume).
Fig3 : Cuve remplie de tampon et transformateur utilisés pour l'électrophorèse en gel d'agarose
c-ii ° Sur gel de polyacrylamide
C'est une méthode très fine de séparation par simple électrophorèse sur support. Est
réalisée en conditions dénaturantes en présence de SDS qui est un agent dénaturant. Le SDS
est du sodium dodécyl sulfate qui a pour formule :
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Si on applique un champ électrique à une solution contenant des protéines, la Vitesse de
migration dépend de :
• La charge nette
• la forme
• la taille
Remarque
Révélation des protéines séparées présentant un gel par coloration avec comme colorant
possible :
• le bleu noir naphtol
• le nitrate d'argent (qui est plus sensible)
• le bleu de Coomassie
• des colorants fluorescents (SYPRO)
Ex : Gel coloré au bleu de Coomassie
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On a une visualisation de protéines spécifiques dans le gel en utilisant des anticorps
spécifiques marqués. On utilise alors la technique de western Blot
c-iii ° Électrophorèse en champ pulsé
La technique d'électrophorèse classique en gel d'agarose ou de polyacrylamide permet de
séparer des fragments d'ADN suivant leur taille. Sur ces gels constitués d'un réseau
désorganisé de longues fibres, on dépose l'ADN dont les molécules sont chargées
négativement. Soumises à un champ électrique, elles migrent vers le pôle. Celles qui sont plus
petites que les mailles du réseau de fibres sont très peu freinées et migrent rapidement, tandis
que les molécules plus grandes sont ralenties. Le pouvoir résolutif de l'électrophorèse est
excellent pour des fragments d'ADN dont la taille est inférieure à 50 000 paires de bases (50
kilobases ou kb), mais, au−delà de cette taille, les fragments d'ADN ne sont plus séparés. Par
exemple, l'ADN du bactériophage A (50 kb) et l'ADN des chromosomes de levure (de 500 à 2
000 kb) ne seront pas séparés par électrophorèse classique. L'électrophorèse en champ
électrique pulsé a permis de résoudre ce problème, en utilisant un champ électrique discontinu
ou bien en modifiant périodiquement la direction du champ. Dans ces conditions, le temps
mis par la molécule d'ADN pour se positionner dépend de sa longueur. Ainsi, une molécule
d'ADN très longue (2 000 kb) passera plus de temps à se réorienter qu'à se déplacer, tandis
qu'une plus petite molécule (200 kb) passera plus de temps à migrer. Le repérage des
fragments, après leur positionnement, fait appel à la technique d'hybridation moléculaire.
c-iv ° Electrophorèse bidimensionnelle
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Lorsqu'il est existé des bandes protéiques très proches, on a un chevauchement. Par les
méthodes unidimensionnelles la résolution et bon pour moins de 50 protéines. Grâce à
l'électrophorèse bidimensionnelle, on combine deux modes de séparation différents. La
résolution peut être appliquée pour plus de 1000 protéines différentes.
DIMENSION 1
Séparation des protéines en fonction de la charge par Focalisation Isoélectrique (FIE) La
charge nette d’une protéine varie avec le pH. A pHi : charge nette nulle. Valeur de pHi
spécifique d’une protéine, qui ne migre plus dans un champ électrique On réalise une
électrophorèse dans un tube étroit de gel polyacrylamide où un gradient de pH est établi. On
soumet alors à un fort courant électrique
Les protéines migrent vers la position du gradient = pHi et s’y immobilisent.
DIMENSION 2
Séparation en fonction de la taille des protéines : SDS-PAGE Le gel étroit de protéines
séparées par FIE est soumis à une SDS-PAGE dans une direction perpendiculaire.
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IV ° LES APPLICATIONS DE L’ELECTROPHORESE :
Cette technique est applicable dans déverses domaines à savoir l’industrie et le domaine
médicale qui largement utilisée soit pour la séparation et l’analyse des substances chargées
sous l’effet d’un champ électrique, on limite que à ces applications dans l’analyse médicale.
On citera trois principales applications de l’électrophorèse qui sont :
La séparation des acides aminés.
La séparation des protéines.
La séparation des fragments d’ADN.
Veillons chaque cas en détaille.
IV-1 ° SEPARATION DES ACIDES AMINES PAR
ELECTROPHORESE :
Chaque acide aminé caractérisé par une valeur de pH isoélectrique, pHi auquel les acides
aminés sont électriquement neutres. En dehors de ce " point isoélectrique " les acides aminés
sont globalement chargés et migrent sous l'effet d'un champ électrique. Ainsi, en travaillant à
un pH fixé (dans une solution tampon), on peut séparer différents acides aminés par
électrophorèse.
Lorsque des acides aminés sont placés dans un champ électrique, ils migrent vers
l'électrode de polarité opposée, les molécules neutres ne migrant pas. Ainsi :
Quand pH > pHi, l'acide aminé a une charge globale négative : il migre vers
l'électrode positive (anode).
Quand pH < pHi, l'acide aminé a une charge globale positive : il migre vers
l'électrode négative (cathode).
Quand pH=pHi, l'acide aminé est sous la forme zwitterion (neutre) : il ne migre pas
et reste au point de départ.
IV-2 ° Electrophorèse des protéines (protéines sériques comme
exemple) :
Les protéines sériques sont des protéines contenues dans le sérum ou le plasma sanguin.
Les protéines sériques jouent différentes fonctions de transport, de défense de l'organisme.
L'électrophorèse est l'examen biologique qui consiste à séparer ces protéines en fractions afin
de les identifier et de les quantifier. Cette analyse permettra alors de diagnostiquer certaines
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pathologies liées à une altération du système immunitaire, comme des syndromes
inflammatoires ou certains cancers, ou des proliférations ou déficits anormaux de certaines
d'entre-elles. Electrophorèse de liquides biologiques est utilisée également en immunologie,
notamment pour confirmer le diagnostic de certaines atteintes du système immunitaire, en
particulier celles concernant l'immunité humorale.
IV-2-a ° Détection d'anomalies immunitaires :
a-i ° Sérum humain normal :
Les globulines sériques ont été nommées par Tiselius en 1950 d'après leur vitesse de
migration électrophorétique par rapport à l'albumine qui migre le plus rapidement et présente
la concentration la plus élevée. On distingue ainsi les alphas (1 et 2), bêta (1 et 2) et gamma
globulines dans l'ordre des vitesses de migration décroissantes.
Les anticorps présents dans le sérum migrent à des vitesses différentes selon leur nature.
Les IgA migrent avec les fractions alpha 2 ou bêta 1, les IgM avec la fraction gamma rapide et
les IgG avec la fraction gamma lente.
une analyse de la densité optique des bandes (l’intensité de la coloration est donc
proportionnelle à la concentration de protéines) et on obtient les spectres suivant :
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Fig4 : Le profil électrophorétique du sérum humain normal et son analyse densitométrique.
Ce profil servira de référence pour interpréter les résultats des électrophorèses des divers
patients.
a-ii ° Sérums pathologiques
Dans le but d'identifier la nature de leur pathologie, on a soumis à l'électrophorèse le
sérum de deux patients atteints de dysfonctionnements du système immunitaire.
Outre le sérum des deux patients (pistes 2 et 3), on a également soumis à l'électrophorèse
deux échantillons de sérum normal (pistes 1 et 5) ainsi qu'un échantillon d'immunoglobulines
pour servir de référence (piste 4).
Les résultats obtenus et le profil densitométrique des pistes sont présentés ci-dessous.
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Fig5 : Le profil électrophorétique du Sérum humaine pathologique et son analyse
densitométrique.
L'examen visuel des profils électrophorétiques complété par l'analyse densitométrique
permet d'identifier certaines anomalies :
L'individu 2 présente un sérum particulièrement concentré en immunoglobulines
mais les autres protéines sériques présentent une concentration inférieure à la
normale.
Inversement, le sérum de l'individu 3 est dépourvu de gamma globulines tandis que
les autres bandes sont normales.
Dans le premier cas, il s'agit d'une hypergammaglobulinémie tandis que dans le second, il
s'agit d'une agammaglobulinémie.
IV-3 ° Électrophorèse de l’ADN (sur gel d'agarose) :
L'électrophorèse sur gel est une technique clé dans la biologie moderne. Il est utilisé pour
séparer les fragments d'ADN de tailles différentes. Tout d'abord, un gel est coulé à partir
d'agarose - une forme très pure de la gélose, qui est obtenu à partir d'algues. A une extrémité
de la plaque de gel existe plusieurs petits puits, constitués par les dents d'un peigne qui a été
placé dans le gel avant qu'il réglée. Une solution tampon est versée sur le gel, de sorte qu'il
remplisse les puits et entre en contact avec les électrodes à chaque extrémité du gel. Ions dans
la solution tampon conduire l'électricité. Les fragments d'ADN sont mélangés avec une petite
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quantité de colorant de charge. Ce colorant est dissous dans une solution dense de sucre, de
sorte que, lorsqu'il est ajouté aux puits, on coule au fond, en prenant l'ADN avec elle.
Un potentiel électrique est appliqué à travers le gel. Groupes phosphates donnent des
fragments d'ADN d'une charge électrique négative, de sorte que l'ADN migre à travers le gel
vers l'électrode positive. De petits fragments se déplacent rapidement à travers le gel poreux
gros fragments se déplacent plus lentement. De cette manière, les fragments d'ADN sont
séparés selon leur taille. Le colorant de chargement se déplace également à travers le gel, de
sorte que la progression de l'électrophorèse peut être vue.
Les fragments d'ADN sont facilement détectés sur le gel grâce à un colorant fluorescent, le
bromure d'éthidium (BEI). On peut ainsi visualiser en lumière UV des quantités très faibles
d'ADN (de l'ordre de 5-10 ng).
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Conclusion
L’électrophorèse est une méthode d’analyse fondée sur la migration des espèces chargées
sous l’effet d’un champ électrique, elle s’applique dans divers domaines tels que l’industrie,
biologie et médecine….
Selon la nature de support on distingue plusieurs types d’électrophorèse : l’électrophorèse
en viens liquide et électrophorèse sur support poreux.
Actuellement l’électrophorèse est la technique la plus utilisée pour séparer, purifier et
caractériser les acides aminés, les protéines et les fragments d’ADN…
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Référence :
http://www.universalis.fr/encyclopedie/electrophorese/3-electrophorese-de-zone-sur-support/
http://www.takween.com/techniques/05_Electrophorese.html
http://fdanieau.free.fr/cours/bts/A1/bcm/chapitre5/ELECTROPHORESE.pdf(gel d’agarose)
Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophorèses for the
Séparations of DNA Fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923, doi:10.3791/3923 (2012).
http://www.jove.com/video/3923/lectrophorse-sur-gel-dagarose-pour-la-sparation-de-
fragments-dadn?language=French
Jean-Luc GUESDON, « ÉLECTROPHORÈSE EN CHAMP PULSÉ », Encyclopédie
http://www.universalis.fr/encyclopedie/electrophorese-en-champ-pulse/
http://www.gnis-pedagogie.org/biotechnologie-biologie-visualisation-fragment-adn.html#
