Leppe-kjeve-ganespaltenesetiologi

- En oppdatert oversikt -

Sondre Sperle Engebretsen e-mail: sondre_engebretsen@yahoo.comKull H00, med.fak. UiO tlf: 952 35038

Abstract

espite substantial efforts for the better half of a century, the detailed etiology of non-syndromic orofacial clefts remains largely unknown. The objective of this paper is to

present an updated overview of the subject while introducing some essential terms and background information for the benefit of neophytes in the field of craniofacial studies.

Several genes have been investigated for a possible role in the pathogenesis of non-syndromic orofacial clefts; Some of these have been found to show association with the conditions, but none have yet proved to be decisive factors in their development. A recurring theme has been conflicting results from different studies; The main reasons for this are ethnic stratification of studied populations and the inherent complexity of the etiology itself, which is shown to contain both genetic and environmental elements.

A recent breakthrough is the identification of genes like TBX-22, PVRL-1, IRF-6 and MSX-1as the culprits behind certain clefting syndromes; This discovery is made all the more interesting by the fact that other studies have implicated these genes in the pathogenesis of non-syndromal clefts as well. Environmental influences have also been investigated, and several studies show association between orofacial clefts and alcohol, smoking or anti-epileptic drugs. Certain combinations of genes and environmental factors have been shown to increase the relative risk of clefting; Such studies will undoubtly be an important part of future research. Current knowledge enables us to sketch out important principals and signal paths in palatolabiogenesis, but a complete understanding of the molecular coordination that underpin these mechanisms remains to be established.

D

Innhold

Innledning og metodebeskrivelse........................................................................1

Palatolabiogenesen..............................................................................................2De forskjellige spaltetypene og deres utbredelse................................................7Molekylærbiologiske prinsipper i palatolabiogenesen......................................11

Leppe-kjeve-ganespaltenes genetiske etiologi..................................................14Eksogene faktorer av betydning for utviklingen av orofaciale spalter..............21Palatolabiogenesen i et molekylærbiologisk perspektiv....................................23

Diskusjon og konklusjon...................................................................................28

Referanser..........................................................................................................29Figurer og tabeller..............................................................................................33

Innledning og metodebeskrivelse

ndertegnede fattet først interesse for problematikken rundt leppe-kjeve-ganespalter ved ØNH-klinikkene i 7. semester. Lidelsene rammer barn, og de er blant våre hyppigste

kongenitale malformasjoner; Ubehandlet vil de få alvorlige konsekvenser for barnets liv og utvikling, mens intervensjon med dagens metoder på sikt vil kunne gi en tilnærmet normal hverdag. Dette er faktorer som inspirerer til engasjement.

Det viste seg raskt at det skulle bli vanskelig å finne egnet informasjon om årsaksforholdene bak disse misdannelsene; Lærebøkene var dårlig oppdaterte, kortfattede og altfor upresise, mens litteraturen forutsetter kjennskap til en del begreper som faller utenfor pensum ved medisinsk embetsstudium. Dette gjelder særlig innenfor områdene embryologi og epidemiologisk genetikk. Følgende målsetning ble således formulert for denne oppgaven:

1) Presentere en oppdatert oversikt over den rådende forståelse av de ikke-syndromiske leppe-kjeve-ganespaltenes etiologi

2) Introdusere en del sentrale begreper som gir grunnlag for forståelse av litteraturen på området

Et Medline-søk på ”cleft lip”, ”cleft palate” og ”etiology” gir over 3000 treff; For å begrense dette valgte jeg å ta utgangspunkt i oversiktsartikler og meta-analyser fra de siste ti årene. Hovedmaterialet ble således utgjort av resultatene fra det overnevnte Medline-søket i publikasjonstypene ”review” og ”meta-analysis” for tidsrommet 1995-2005. Andre publikasjonstyper ble valgt ut blant de artiklene som hovedmaterialet siterte; På bakgrunn av overnevnte målsetning ble prioritet gitt de artikler som overholdt retningslinjene fra Mitchell et al. (2002),1 ble sitert av mange andre artikler og var nyest av dato. Epidemiologiske data ble hentet fra et tilsvarende søk på ”cleft lip”, ”cleft palate” og ”epidemiology”; Bakgrunnsstoff er stort sett funnet i lærebøker.2, 3, 4, 5 Enkelte studier ble også valgt ut grunnet spesiell relevanse for norske forhold.

Mesteparten av tiden gikk med til å lese artikler, ordne dem i kategorier og lage oversikter over viktige funn, syn og påstander samt hvilke av studiene som fremholdt disse. Det viste seg raskt at motstridende resultater og påstander er et gjennomgangstema i litteraturen om leppe-kjeve-ganespaltenes etiologi; Der er sågar ikke uvanlig at forfattere av oversiktsartikler trekker forskjellige konklusjoner basert på det samme informasjonsgrunnlaget. Det fremstod således som et viktig poeng å hente informasjon direkte fra de originale artiklene i de tilfeller der disse ble utvalgt på bakgrunn av sitater fra oversiktsartikler; Dette ble gjennomført i den grad det var mulig innenfor de rammer studenttilgangen ved Rikshospitalets bibliotek og arkivet på Domus Medica ga.

U

1

Palatolabiogenesen

nsiktet og kjevene anlegges i løpet av fosterlivets annen måned som et resultat av flere koordinerte prosesser innebefattende en rekke strukturer med forskjellig embryologisk

opphav. Utviklingen fortsetter imidlertid lenge etter at de grunnleggende trekkene er anlagt; Den kan sågar ikke sies å være fullendt før etter gjennomgått pubertet. Det samme gjelder riktignok de fleste andre kroppsdeler og organsystemer, men ansiktsregionen stiller allikevel i en særklasse; Området er strukturelt komplisert, og det gjennomgår omfattende endringer i de enkelte bestanddelers relative dimensjoner samtidig som det stilles ovenfor unike funksjonelle krav som må ivaretas til tross for dette. Studiet av ansiktets, munnhulens og kjeveapparatets utvikling i løpet av det tidlige fosterliv danner grunnlaget for forståelsen av hvordan leppe-kjeve-ganespalter oppstår.

I begynnelsen av fjerde uke er embryoet omlag 4 mm langt, og anleggene til de fleste viktige organsystemene er allerede dannet (fig. 1.1). Nevralrøret er oppstått ved invaginasjon fra ektodermen, og i den kraniale enden har det utvidet seg og dannet den primitive, tredelte hjernen bestående av prosencephalon (forhjernen), mesencephalon (midthjernen) og rhombencephalon (bakhjernen). Det flate, trelagede embryoet har gjennomgått en lateral foldningsprosess omkring sin kraniokaudale akse, og som et resultat av denne prosessen dekker ektodermen nå det aller meste av den embryonale overflaten. Endodermen er med dette foldet sammen til en sylinderformet kanal som danner utgangspunktet for det primitive tarmsystemet; I kranial retning begrenses denne av den såkalte oropharyngeal-membranen, et område som ligger helt kranialt i det tidlige fosteranlegget og hvor ektoderm ligger direkte an mot endoderm. De kraniale og kaudale endene av embryoet har imidlertid vinklet seg i ventral retning, slik at hjerneanlegget blir liggende helt kranialt og oropharyngeal-membranen havner kaudalt for dette på embryoets ventralside; Prosessen kan sammenlignes med at et menneske som ligger med maksimalt ekstendert nakke bringer hodet tilbake til utgangsstillingen.

A

Ektoderm

Mesoderm

Endoderm

Oropharyngeal-membranen

Stomodeum

Fortarmen

Nevralrøret

SomitterThyroidea

Fig. 1.1 - Embryoet i begynnelsen av 4. uke.

2

I løpet av fjerde uke brytes oropharyngeal-membranen ned ogdet opprettes således kommunikasjon mellom proksimale del avfortarmen (det blivende pharynx) og innsynkningen som omgamembranen; Denne innsynkningen kalles stomodeum, og erutgangspunktet for dannelsen av den primitive munnhulen.Videre dannes det fire par laterale divertikler fra pharynx;Disse er kjent som pharyngealutposningene, og det første paretutvikler seg til å danne mellomøret samt tuba auditiva. Detandre paret danner senere i utviklingen utgangspunktet forsvelgets tonsiller. På embryoets overflate blir de såkaltegjellebuene synlige; Disse utgjøres av fire parvistorganiserte ventrolaterale utvekster, hvorav det førsteparet ofte blir referert til som mandibulærbuen daunderkjeven utgår fra dette. De resterende strukturene somutgjør ansikt og kjeveapparat utgår fra områdene som avgrenser stomodeum; En enkelt frontonasalprominens vokser frem på oversiden medialt, og bilateralt for denne utvikles to hesteskoformete nasal-primordia hvor mediale og laterale ben kalles henholdsvis nasomedial-og nasolateralprosessene. På lateralsidene av stomodeum dannes to maxillærprosesser som sammen med nasomedialprosessene spiller en sentral rolle i overkjevens utvikling.

De mesenchymale cellene som danner de overnevnte strukturer er heterogene av opphav; De gjennomgår dessuten omfattende vandringer på veien mot ventralsiden av ansiktet. Viktigst er cellene fra den såkalt nevralkammen; Disse er avledet fra ektodermen, og har sitt opphav langs de laterale kantene av området som invagineres og således danner nevralrøret. Allerede før dette har rukket å lukke seg vandrer cellene fra nevralkammen ut i embryoet langs diffust definerte migrasjonsruter, og de bidrar til dannelsen av en rekke organer og vev. Så omfattende er nevralkammens bidrag til organismen at den har blitt referert til som ”det fjerde kimlag;” Dette gjelder ikke minst for ventralsiden av hodet hvor celler fra nevralkammen danner ansiktets bindevev og skjelett, og dermed også selve substratet for den morfologiske utviklingen i regionen. Maksillærprosessene invaderes hovedsaklig av celler fra forhjernens og den kraniale midthjernens nevralkam, mens mandibulærbuene får sitt mesenchym fra nevralkammen som omgir den kaudale midthjernen og bakhjernens to første segmenter (rhombomerer). Ansiktets muskulatur har et annet opphav; Denne stammer fra somitomerene, som er fortykkede segmenter i den paraksiale mesodermen, det vil si de mesodermale områdene som ligger lengst inn mot embryoets kraniokaudale akse. Myogene celler fra somitomerene migrerer inn i gjellebuene og de forskjellige prosessene, hvor bindevevet som har blitt dannet fra nevralkammens celler synes å utøve den morfogenetisk kontroll over muskeldannelsen.

I løpet av 5. uke begynner ansiktets primordialstrukturer å vokse (fig. 1.3). Frontonasal-prominensen fortrenges av de to nasal-primordiene som beveger seg medialt inntil de møtes i midtlinjen, hvorpå nasomedialprosessene vokser sammen. De danner med dette det såkalte intermaksillær-segmentet, som senere blir forløperen til overleppens philtrum og overkjevens premaksillære segment (fig. 1.4). Mellom nasolateralprosessene og maksillærprosessenedannes en fure som strekker seg over mot de på dette tidspunkt lateralt lokaliserte øyeanleggene; Fra ektodermen i bunnen av denne furen avgår en epitelial rørstruktur som blir opphavet til tåresekkene og tårekanalene. Denne dekkes i det nasolateralprosessene og maksillærprosessene vokser sammen; Omtrent samtidig når de medialt ekspanderende maksillærprosessene frem til intermaksillær-segmentet, og overkjeven dannes deretter ved fusjon av disse strukturene. Nesens alabrusker dannes fra nasolateralprosessene.

1. gjellebue

Oropharyngeal-membranen

Fig. 1.2 – Ansiktstrekk i begynnelsen av 4. uke.

3

Frontonasalprominensen

Nasal-primordie

Maksillærprosess

MandibulærbueNasomedialprosess

Nasolateralprosess

Nasolakrimalfure

Fusjonerendenasomedialprosesser

Mandibulærbue

Maksillærprosess

Øye-primordie

Nasal-primordie

Øre-vesikkelen

Nasolakrimalfure

Alabrusk

Fig. 1.3 – Overleppen og overkjevens dannelse. Figurene viser status etter 4, 5, 5 ½, 6, 7 og 8 uker.

4

Området der sammensmeltningen skjer markeres i begynnelsen av en epitelial søm som kalles nasalfinnen, men etter noen timer penetreres denne av bindevev slik at overkjeven får en sammenhengende mesenchymal struktur (fig. 1.4). Underkjeven dannes til sammenligning på en langt enklere måte; De to mandibulærbuene vokser i medial retning og smelter til slutt sammen i midtlinjen. En stavformet bindevevsstruktur kjent som Meckel’s brusk differensieres fra nevralkam-cellene i underkjevens mesenchym, og danner således basis for den kraftige skjelettstrukturen som blir mandibula.

Munnhulen og nesekaviteten anlegges i utgangspunktet som et felles hulrom; Dannelsen av ganen fra sjette til tiende uke representerer den endelige adskillelsen av de to kavitetene. Fire strukturer inngår direkte i ganens tilblivelse; En medial palitinprosess, to laterale palitinprosesser og neseskilleveggen, septum nasalis (fig. 1.4 og 1.5).

Den mediale palitinprosessen dannes som en dorsal innvekst fra intermaksillærsegmentet og kommer til syne omkring sjette uke. Inne i prosessen utvikles en trekantet benstruktur som på dette tidspunktet kalles den primære gane; Etter fødselen danner den primære ganen sammen med ventrale del av maksilla overkjevens premaksillære komponent, og de fire øvre incisor-tennene utgår fra denne. De to laterale palatinprosessene dukker opp omtrent samtidig som den mediale palatinprosessen; De dannes som nedvekster fra veggene i munnhulen, og er i begynnelsen orienterte i kraniokaudal retning på hver side av tungen (fig. 1.5). I løpet av syvende uke løsner de fra denne posisjonen og eleveres innad slik at de blir liggende i transversalplanet. De møtes etter hvert i midtlinjen og danner sammen den sekundære gane.

Nesebor

Overleppe

Mediale palatinprosess

Laterale palatinprosess

Septum nasalis

Premaksillær-segmentet

Uvula

Foramen incicivum

Fusjonsline mellomnasomedialprosess ogmaksillærprosess

Raphe palatina

Fig. 1.4 – Ganens utvikling. Figurene viser status etter 6, 7, 9 og 30 uker.

5

Premaksillær-segmentet Alveolærprosess

Det er epitelet langs de mediale kantene av disse prosessenesom fasiliterer fusjonen; Dette området kalles oftepalatinprosessenes MEE (Medial Edge Epithelium).

Sammenføyningen av de laterale palatinprosesseneforløper i ventrodorsal retning og avsluttes såledesved dannelsen av uvula. Helt ventralt vokser delaterale palatinprosessene sammen med denmediale palatinprosessen slik at den primære ogsekundære ganen forenes til en sammenhengendestruktur som adskiller munnhulen fra nesekaviteten.I midtlinjen markeres foreningspunktet mellomdisse tre strukturene av foramen incicivum, som ertydelig i overkjeven også etter fødselen.

Fra frontonasalprominensen dannes en nedvekst somstrekker seg fra taket av nesekaviteten og ned mot delaterale palatinprosessene. Denne nedveksten er sammenhengende med den primære ganen, og blir etter hvert til neseskilleveggen. Den vokser sammen med palatinprosessene i det disse fusjoneres. Epitelet som dekker palatinprosessene og neseskilleveggen danner mens fusjonen pågår markante sømmer i sammenføyningslinjene; Disse forsvinner imidlertid rask i detepitelcellene gjennomgår apoptose, omdannes til mesenchymale celler eller migrerer ut i epitelet som dekker overflatene i munn- og nesehule. Epitelet differensieres samtidig til henholdsvis lagdelt plateepitel og ciliert søyleepitel, og med dette er munnhulen, ganen og nesekaviteten morfologisk sett ferdigstilte.

Fig. 1.5 – Den ferdige overkjeven.

Foramen incicivum

Septum nasalis

Laterale palatinprosesser

Meckel’s brusk

Øye

Tunge

Tann-annlegg

Bendannelse ioverkjeven

Fig. 1.6 – De laterale palatinprosessenes utvikling i frontalsnitt.

6

De forskjellige spaltetypeneog deres utbredelse

ed første øyekast kan det virke vanskelig å se mønsteret bak de forskjellige leppe-kjeve-ganespaltenes heterogene morfologi; Enkeltsidige, dobbeltsidige, fullstendige og

ufullstendige spalter forekommer om hverandre, ofte sammen med andre misdannelser som en del av definerte syndromer. Tidlige klassifikasjoner beskrev de kliniske variantene ufullstendig,6, 7, 8 og grunnet manglende embryologisk kunnskap ble uhensiktsmessigeanatomiske landemerker (spesielt alveolæprosessen) gjort til utgangspunkt for inndelingen. Dagens inndeling av leppe-kjeve-ganespalter har vært i bruk siden slutten av femtitallet, og bleførst foreslått av Kernahan og Stark.9 Den baserer seg på ansiktets embryologiske utvikling slik denne er beskrevet i foregående kapittel, og deler de vanlige spaltetypene i

a) Isolert leppe-kjevespalte (CL)b) Isolert ganespalte (CP)c) Leppe-kjeve-ganespalte (CLP)

Fra embryologien forstår vi at ganespalte og leppe-kjeve(gane)spalte i prinsippet er to distinkte men relaterte misdannelser; Allerede i 1942 påviste Fogh-Andersen at de to spaltetypene var genetisk forskjellige,10 og senere embryologisk forskning viste som vi har sett at den primære og sekundære gane dannes i to separate stadier.

V

Fullstendig ensidig leppe-kjevespalte Fullstendig tosidig leppe-kjevespalte

Premaksillær-segmentet

Foramen incicivum

Uvula

Fullstendig ganespalte Fullstendig tosidig leppe-kjevespaltemed fullstendig ganespalte

Fig. 2.1 – Hovedgruppene av spalter.

7

Vanlige isolerte leppe-kjevespalter oppstår ved mangelfull fusjon av maksillær- og nasomedialprosessene, og defektene følger fusjonslinjene i fig. 1.4. De er således lateralt lokaliserte og potensielt bilaterale. Mekanismen som ligger bak disse malformasjonene er ofte hypoplasi av maksillær-prosessene; Dette kommer vi tilbake til i kapittelet om genetikk. Alvorlighetsgradene varierer fra ufullstendig, ensidig leppespalte til bilateral fullstendig spalte i både overleppe og kjevekam. Ved slike misdannelser er premaksillær-segmentet fullstendig separert fra overkjeven forøvrig, og det står ofte ventralrotert slik at det peker forbi ansiktets normale konturer i profil. (Fig. 2.2 B)

Isolerte ganespalte oppstår som resultat av mangelfull sammensmeltning av de laterale palatinprosessene; Den er således lokalisert til midtlinjen av den sekundære ganen, og løper fra foramen incicivum ventralt til apikale uvula dorsalt. Da sammenføyningen av de to laterale palatinprosessene skjer i ventrodorsal retning, vil ufullstendige ganespalter nær sagt alltid begynne dorsalt som en bifid uvula og strekke seg ventralt avhengig av alvorlighetsgrad. En spesiell subtype er den okkulte eller submukøse ganespalten; Her finner man mer eller mindre fullstendige defekter i den bløte ganes mesenchym (muskler og bindevev) som dekkes av normal slimhinne. Tilstanden er således ikke umiddelbart observerbar ved inspeksjon av munnhulen, men ikke desto mindre er den viktig å oppdage da den i hovedsak medfører de samme funksjonelle begrensninger som en åpen ganespalte.

Leppe-kjeve-ganespalte beskrives enklest som en tilstand hvor begge de overnevnte malformasjoner er tilstede samtidig. En rekke forskjellige kombinasjoner er derfor mulige; Inndelingen lettes ved å beskrive leppe-kjevespalten og ganespalten separat. Da ganespalte forekommer oftere i assosiasjon med leppe-kjevespalte enn i isolert form, tror man allikevel ikke at det er full uavhengighet mellom misdannelsene; Hvorvidt ganespalter oppstår sekundært som følge av den ansiktsdefekten en leppe-kjevespalte representerer eller hvorvidt det finnes genetiske/miljømessige faktorer som disponerer for begge misdannelsene er ikke avklart.11

En hyppighetsbasert inndeling av orofaciale spaltetilstander tar ofte utgangspunkt i vanlige og mindre vanlige typer; De overnevnte variantene av leppe-kjeve-ganespalte utgjør i så måte de vanlige typene. Blant de uvanlige finner man den skrå ansiktsspalten, som på mange måter representerer en persisterende nasolakrimalfure (Fig. 1.3). Den er et resultat av manglende sammenvoksning mellom nasolateralprosessene og maksillærprosessene og strekker seg fra overleppen til mediale øyekrok. Medial leppe-kjevespalte er en annen sjelden variant; Denne misdannelsen fremkommer ved ufullstendig fusjon av nasomedialprosessene, og spalten deler således premaksillærsegment og overleppe langs midtlinjen. Da nesekammen også oppstår fra de fusjonerte nasomedialprosessene finner man varierende grad av spaltet nese assosiert med denne misdannelsen. Lateral ansiktsspalte eller makrostomi fremkommer ved hypoplasi eller manglende fusjon av maksillærprosesser eller mandibulærbuer; Resultatet er slik navnet tilsier en abnormt stor munn som i enkelte tilfeller kan strekke seg helt bakover mot ørene.

Som vi allerede har vært innom, er det også vanlig å dele orofaciale spaltetilstander i syndromiske og ikke-syndromiske tilfeller. Begrepet ikke-syndromisk er i denne sammenheng reservert for tilfeller der individet ikke har andre fysiske eller utviklingsmessige avvik ellerdet ikke foreligger kjente miljømessige eksposisjoner som disponerer for syndromutvikling.12, 13

De resterende deles vanligvis inn i Mendelske syndromer (over 300 kjente), kromosomale avvik og teratogenbetingete syndromer. I tillegg kommer de hittil uklassifiserte syndromene. Denne oppgaven omhandler i hovedsak de hyppige, ikke-syndromiske formene av orofaciale spalter; Noen utvalgte syndromer er listet opp i tab. 2.1.

8

Den ikke-syndromiske leppe-kjeve-ganespaltenes epidemiologi er vanskelig å beskrive entydig da det har vist seg problematisk å sammenligne studier gjort i forskjellige land og på forskjellige befolkningsgrupper;14 Forskjellige metoder for klassifikasjon og inklusjon/eksklusjon i studier, ulike registreringsrutiner i forskjellige land og varierende forekomst blant ulike grupper i etnisk heterogene populasjoner er de viktigste årsakene til dette. Epidemiologer har dessuten debattert hvorvidt frekvensen av leppe-kjeve-ganespalte er et utrykk for insidens, prevalens eller risiko; Som Christensen påpeker i en artikkel fra 1999 har diskusjonen omkring disse begrepene interesse utover det rent semantiske da prevalens som begrep har klare begrensninger i beskrivelsen av fødeslsdefekter;15 Det er avhengig av både gamle tilfellers overlevelse og insidens av nye tilfeller, og kan således medføre paradoksale og misvisende resultater hvis det brukes ukritisk i etiologiske vurderinger.

D) Ufullstendig ensidig leppespalte. E) Okkult ganespalte med bifid uvula.

Fig. 2.2 – Fotografier av pasienter med forskjellige spaltetyper.

A) Fullstendig tosidig leppe-kjevespalte. B) Pasienten fra A i profil. C) Fullstendig ensidig leppe-kjevespaltemed fullstendig ganespalte

9

Til tross for disse utilstrekkelighetene er det allikevel mulig å trekke felles konklusjoner basert på foreliggende etiologiske studier.14 En felles tendens er at forekomsten av CL(P) er høyere enn forekomsten av CP. I studier som skiller mellom CL og CLP er sistnevnte hyppigere enn førstnevnte. I Norge har studier vist en forekomst av CL(P) på 0.2%;16 Tilsvarende tall for andre land ligger på 0.1 – 0.2%. Norge har således relativt sett svært mange tilfeller av CL(P). Forekomsten av CP er 0.1% og gjennomsnittlig i forhold til den man finner i andre land.

En annen felles tendens er overvekt av jenter i CP-gruppen, mens CL(P)-gruppen inneholder flest gutter. Flere uavhengige studier viser dessuten at venstresidige unilaterale leppe-kjevespalter er omlag dobbelt så hyppige som høyresidige.14 Når det gjelder etnisitet er studiene mindre konklusive; Hovedtendensen synes imidlertid å være at asiater har høyest forekomst, afrikanere lavest og at kaukasiere befinner seg et sted i mellom.17 Sosioøkonmiske forhold synes også å spille inn; Det er vist lavere forekomst av orofaciale spalter i områder med høyere levestandard når man sammenligner etnisk tilsvarende populasjoner.12

Epidemiologiske studier tyder også på en vesentlig komponent av arvelighet;14 Flere uavhengige undersøkere rapporterer økt forekomst av leppe-kjeve-ganespalte hos pasienter som har slektninger med tilsvarende malformasjoner. I epidemiologiske studier beskrives arvelighet som viktigste årsaksfaktor for utvikling av CL(P) i 40-50% av tilfellene; For CP er tallet 20-25%.18 Eksperimentelle studier viser dessuten at den sekundære ganen er spesielt sensitiv for miljøpåvirkning; Alt i alt har dette fått mange til å konkludere med at arvelighet spiller hovedrollen i utviklingen av CL(P), mens miljøfaktorer er viktigere for CP.19

I Danmark er det funnetsannsynlighet for CL(P) på60%(38-82) og CP på67%(36-98) hos monozygotetvillinger.15 Dersom en forelderhadde samme type spalte varsannsynligheten 2.4%(1.62-3.42)for CL(P) og 1.53%(0.65-2.77)for CP. Dersom et søsken haddetilsvarende misdannelse varsannsynligheten 3.14%(2.58-3.77)for CL(P) og 2.89%(2.09-3.81)for CP. Tallene i parentes angir95% konfidensintervall for debetingede sannsynlighetene.Undersøkelsen ble gjort på etnær sagt komplett utvalg avspaltepasienter da Danmark harutmerkede systemer forregistrering; Den danskebefolkning var dessuten megetetnisk homogen i perioden damaterialet ble samlet inn(1952- 1987). Alt i alt gjør dettede danske dataene sværtpålitelige.

Syndrom Beskrivelse

CPX X-bundet syndrom med CP og ankyloglossi (bundet tunge). Meget variabel klinisk ekspresjon.

CL(P) med hidrotisk Ektodermal Dysplasi og syndaktyli.

Vanligste syndromiske årsak til orofacial spalte. Spyttkjertelanomalier i underleppe, CL(P) eller CP samt hypodonti.

CL(P), ektrodaktyli og ektodermal dysplasi.

CP hos over ¼ av pasientene.

Høy gane, ofte okkult eller total CP.

Engelsk forkortelse for Cardiac defects, Abnormal facies, Thymic hypoplasia, Cleft palate and Hypocalcaemia.

CL(P), anormale ører, misdannelser av hjerte og fingre samt vekstretardasjon.

Sjeldent syndrom med hypertelorisme, telecanthus og bred neserygg; Fra tid til annen assosiert med CL(P) og CP.

CLP, kardiale og genitale misdannelser

CLPED

van der Woude’s

EEC3

Apert’s

Cleidocraniell dystose

CATCH 22

Velocardiofacielt syndrom

Frontonasal dysplasi

Opitz GBBB

Tab. 2.1 – Noen syndromer assosiert med CL(P)/CP.

10

Molekylærbiologiske prinsipperi palatolabiogenesen

de foregående kapitlene er morfologiske aspekter ved ansiktets embryologi beskrevet. Dette er kunnskap som har vært kjent i mange år, og som er nyttig for å forstå hvordan

spalter oppstår; For å komme nærmere en forklaring på hvorfor disse malformasjonene utvikler seg er det imidlertid nødvendig å forstå de genetiske og molekylærbiologiske mekanismene bak de morfologiske forandringene. I dette kapittelet diskuteres i så måte noen essensielle begreper; I de påfølgende kapitlene presenteres en oppdatert oversikt over nyere etiologisk forskning, og til slutt oppsummeres kunnskapen i et forsøk på å presentere en integrert molekylærbiologisk modell for palatolabiogenesen.

Uvurderlig informasjon er fremkommet ved studier av modellorgansimer som mus, kyllinger og fruktfluen Drosophilia Melanogaster; Studier av pattedyr viser imidlertid at genene og molekylene som kontrollerer fosterutviklingen oppviser stor grad av fylogenetisk konservatisme, og at kjennskap til enklere organismers utvikling med visse forbehold kan danne basis for studiet av tilsvarende forhold hos mennesket. I det følgende benyttes standard genetisk nomenklatur; Gener/genprodukter hos lavere organsimer skrives med små bokstaver (dog med stor forbokstav), mens store bokstaver brukes dersom man beskriver gener/genprodukter hos mennesket. Videre er det vanlig praksis å skrive navnet på gener i kursiv for å lette forvirringen i de tilfeller der gen og genprodukt har samme navn.

Funksjonelt sett faller mange av forbindelsene som kontrollerer embryogenesen inn under tre hovedkategorier; De er enten transkripsjonsfaktorer, signalmolekyler eller reseptorer. Kontrollen over cellulære prosesser er ofte organisert i en form for ”kommandokjeder;” En overordnet impuls kan sette i gang flere underordnede impulser og således være ansvarlig for drastiske utviklingsmessige forandringer. En helhetlig forståelse av prosessene som kontrollerer cellulære mekanismer avhenger derfor av kjennskap til de enkelte faktorer og deres innbyrdes funksjonelle forhold; I den militære allegorien vil dette si at man må kjenne soldatenes identitet, hvilken kommandokjede de tilhører, samt deres rang i denne.

Transkripsjonsfaktorer

Transkripsjonsfaktorer er proteiner som binder seg til promotor/enhancer-sekvensen(e) på et gen. De utøver kontroll over genets ekspresjon, og dermed produksjonen av genprodukt, ved å styre transkripsjonen av mRNA fra genet. Ved å regulere flere gener samtidig kan transkripsjonsfaktorer sette i gang spesifikke mønstre av genekspresjon.

Det finnes flere klasser av beslektede transkripsjonsfaktorer; Heliks-loop-heliks-gruppeninneholder en sekvens av aminosyrer som danner to α-helikser adskilt av en sløyfe, samt et nærliggende parti aminosyrer med basiske sidekjeder. Mange av transkripsjonsfaktorene som regulerer dannelsen av muskulatur hører til i denne gruppen. I zink finger-proteinene bindes zink-atomer til kjeden av aminosyrer med jevne mellomrom slik at denne foldes til en bølge eller fingeraktige strukturer. ”Fingrene” passer inn i spesifikke regioner av DNA-spiralen, og molekyler av denne typen er blant annet deltagende i bakhjernens utvikling.

I

11

De såkalte homeodomene-proteinene er blant de viktigste av transkripsjonsfaktorene, og kjennetegnes av en veldefinert sekvens på 61 bestemte aminosyrer, det såkalte homeodomenet.I genene til homeodomene-proteinene finnes således 183 nukleotider som koder for disse aminosyrene; Denne nukleotid-sekvensen kalles homeoboksen. Den ble først oppdaget i den såkalte homeotiske gengruppen hos Drosophilia, og ble navngitt etter denne. Den homeotiske gengruppen består av 8 gener fordelt på to klynger, og styrer spesialiseringen av de ulike kroppssegmentene hos fruktfluen. Det viste seg senere at mennesket har gener med tilsvarende funksjon; De er 38 i tallet, fordelt på fire klynger, og inneholder homeobokser som er identiske med de man finner hos Drosophilia. Hos mennesker kalles disse HOX-gener, og akkurat som bananfluens homeotiske gener er de involvert i den kraniokaudale segmenteringen av embryoet. De fire klyngene betegnes HOXA, HOXB, HOXC og HOXD, og genene i hver klynge designeres tall fra 1 og oppover (HOXA-1 er første gen i første klynge av HOX-gener.) Hos både menneske og bananflue utrykkes de første homeoboks-genene i hver klynge tidligere i embryogenesen og mer kranialt i embryoet enn de påfølgende; Det dannes således en gradient av HOX-genekspresjon i kraniokaudal retning.

I ettertid er det funnet homeobokser i en rekke gener også utenfor områdene som koder for HOX-genene; Det er også observert andre konserverte sekvenser, som for eksempel T-boksen i de såkalte t-boks genene. Enkelte transkripsjonsfaktorer innholder flere slike ”standardsekvenser,” hvorav noen kan være ufullstendige.

Signalmolekyler

Signalmolekyler er som navnet tilsier forbindelser som besørger intercellulær kommunikasjon; De er blant annet nødvendige for de viktige embryonale induksjonsmekanismene. Induksjon er en prosess hvor et embryonalt vev påvirker et annet; Man sier at det første vevet induserer en forandring i det andre. Ofte er det overliggende epitel i form av ekto- eller endoderm som induserer forandringer i underliggende mesenchym, og signalmolekyler er som regel ansvarlige for det induserende signalet fra et vev til et annet. Signalmolekyler kan også ha hemmende effekt; Forskjellige enkeltsignaler og hele signalveier kan vire antagonistisk i forhold til hverandre.

Signalmolekylene er som regel proteiner, og det finnes tre viktige familier kjent som TGF-β(Transforming Growth Factor β), FGF (Fibroblast Growth Factor) og Hedgehog. TGF-α er av en annen familie, og har nære bånd til EGF (Epidermal Growth Factor). I tillegg finnes en rekke andre familier og enkeltforbindelser som ikke skal nevnes her.

TGF-β familien består av et tredvetallsmolekyler med mange forskjelligeoppgaver både under embryogenesen og idet postnatale liv. Noen av de viktigste erTGF-β1 – TGF-β5, samt BMP-1 – BMP-9(Bone Morphogenic Protein). I FGFfamilien finner vi over tyve medlemmer,hvorav de viktigste er FGF1 – FGF9.Hedgehog familien består hos mennesketav tre kjente medlemmer hvorav det ene,Sonic Hedgehog (SHH), har vist seg å haspesielt stor betydning (tab. 3.1).

Signalmolekyl Eksempler på oppgaver

TGF-α Stimulere til mitose

FGF-1 – FGF-9 Induksjon av arm- og benanlegg,bidra til kapillærdannelse

SHH Organisering og polarisering av en rekke strukturer

TFG-β1 – TFG-β5

BMP-1 – BMP-4

Mesodermal induksjon, myoblastproliferasjonBidra til dannelse av nevralplaten, differensiering av skjelettstrukturer

Tab. 3.1 – Noen viktige signalmolekyler.

12

Reseptorer

Signalmolekyler utøver sin effekt ved å binde seg til en reseptor; Reseptoren kan befinne seg på celleoverflaten eller inne i cellen avhengig av signalmolekylets kjemiske egenskaper. Det er ingen prinsipiell forskjell mellom reseptorfunksjon under embryogenesen og i det postnatale liv; Disse temaene forutsettes kjente og skal kun overfladisk berøres her.

Binding mellom signalmolekyl og ekstracellulær reseptor medfører aktivering av visse proteiner i cellen; Aktiveringen tar som regel form av at bestemte aminosyrer på det aktuelle proteinet får tilkoblet en fosfatgruppe, og enzymene som besørger dette kalles kinaser. I noen tilfeller innehar reseptorproteinet selv kinase-aktivitet; Det blir dermed i stand til direkte å aktivere de nødvendige proteiner. De fleste av respetorene til signalmolekylene som nevnes her er av denne typen. Andre reseptorer benytter seg av reaksjoner hvor det dannes sekundære intracellulære signalforbindelser; Disse ender som regel med at målproteinene aktiveres av en cytoplasmatisk kinase.

Intracellulære reseptorer fungerer ofte som transkripsjonsfaktorer, i det reseptor/ligand-komplekset får evnen til å binde seg til DNA og regulere genekspresjon.

Andre forbindelser av betydning for ansiktets embryogenese

Cellulær migrasjon og embryonal epitelial-mesenchymal transformasjon (eEMT) er viktige mekanismer i palatolabiogenesen; Den første betegner cellers forflyttning fra et område til et annet, den andre beskriver en prosess hvor epitel-celler forandrer egenskaper og antar en mesenchymal karakter. En rekke molekyler og cellulære strukturer er deltagende i disse mekanismene; Blant de viktigste er cytoskjelettet og de cellulære adhesjonsmolekylene(CAMs).

Cytoskjelettet er bygget opp av tre bestanddeler; Actin-filamenter, intermediære filamenterog mikrotubuli. Actin-filamentene fungerer som forsterkning av plasmamembranen og forankrer membranproteiner til cytoskjelettet. Intermediærfilamentene består av keratin i epiteliale celler og vimentin i mesenchym; De har til oppgave å danne et støttende ”rammeverk” for cellen. Mikrotubuli er lange, rette sylinderstrukturer som er bygget av mindre subenheter. De kan polymerisere/depolymerisere og dermed forandre lengde. Deres viktigste funksjoner er knyttet til bevegelse; Spesialiserte proteiner fungerer som molekylære ”lokomotiver” besørger blant annet transport av vesikler, organeller og kromosomer langs den mikrotubulære ”jernbanen.”

Adhesjonsmolekyler er membranbundne proteiner som gir celler evnen til å binde seg til sine omgivelser. Det finnes fire hovedgrupper: Cadheriner, immunoglobulinaktige adhesjonsmolekyler (IgCAMs), integriner og selektiner. Cadheriner inngår i adherens-forbindelsene og desmosomene som binder enkelte celler sammen, og er forankret i cytoskjelettets actin- og intermediærfilamenter. IgCAMs har strukturelt sett mye til felles med immunoglobuliner, og de deltar i flere typer celleforbindelser. Integriner medvirker i adhesjonen mellom celler, men har sin viktigste funksjon i å fasilitere kontakt mellom celler og ekstracellulærsubstans; De kan sågar mediere kommunikasjon mellom cytoskjelettet og ekstracellulærsubstansen i en slik grad at strukturene blir i stand til å påvirke hverandre. Denne mekanismen er viktig i embryogenesen, hvor mange cellers egenskaper avhenger av miljøet de befinner seg i. Selektinene finnes hovedsaklig på leukocytter og endotelceller, og har så vidt man vet ingen avgjørende betydning for palatolabiogenesen.

13

Leppe-kjeve-ganespaltenesgenetiske etiologi

om vi har sett er det gode holdepunkter for å hevde at leppe-kjeve-ganespaltens etiologiske bakgrunn har en betydelig genetisk komponent; Pålitelige epidemiologiske studier, blant

annet tvillingforsøk, viser økt forekomst av orofaciale spalter hos individer som har nære familiemedlemmer med tilsvarende malformasjoner.15 De samme forsøkene viser imidlertid også at konkordans hos dizygote tvillinger er signifikant høyere enn den man finner hos søsken forøvrig; For monozygote tvillinger er konkordansen lavere enn 100%. Det er nærliggende å tolke disse resultatene dit hen at miljøfaktorer, enten i form av intrauterine forhold, maternell ernæringsstatus eller eksogene påvirkninger, bidrar i ukjent grad til utviklingen av orofaciale misdannelser; Eksperimentelle studier tyder dessuten på at genetiske og miljømessige faktorer interagerer; Frasers klassiske forsøk viste at mus av den såkalte A/J-stammen hadde 100% risiko for å få avkom med ganespalte dersom moren ble eksponert for kortison i løpet av drektighetsperioden.20 For den andre stammen som ble undersøkt var tallet 20%. Forsøket brukes ofte i lærebøker som eksempel på interaksjon mellom genetiske og miljømessige faktorer, og mus er fremdeles viktige modeller for ikke-syndromiske orofaciale spalter.

Tradisjonelt har man beskrevet leppe-kjeve-ganespaltens arvegang med en såkalt multifaktoriell terskel-modell;21 Man forestiller seg at en rekke gener og miljøfaktorer kan disponere for tilstanden, og at klinisk ekspresjon forekommer i det summen av disposisjoner overstiger en viss terskel (Fig. 3.1). Selv om arvemønsteret synes å passe med denne modellen har den imidlertid måttet tåle kritikk i senere tid,6 og enkelte studier har foreslått en major locus-modell;22 Man antar da at det finnes ett eller flere predisponerende gener som utgjør hoveddelen av den genetiske risikoen for å utvikle tilstanden. Andre undersøkere mener ingen enkelt etiologisk modell gir en tilstrekkelig beskrivelse av de orofaciale spaltenes arvegang i forskjellige populasjoner.23

S

Terskel ▲

Ant

all i

ndiv

ider

Risiko

Generell befolkning

Tredjegrads slektninger

Førstegrads slektninger

Rammede tilfeller

Fig. 4.1 – Distribusjon av tilfeller i en multifaktoriell terskel-modell.

14

Genetiske metoder i studiet av orofaciale misdannelser

Letingen etter genetiske faktorer med betydning for utvikling av ikke-syndromisk leppe-kjeve-ganespalte hos mennesket er beheftet med en rekke potensielle vanskeligheter. Tilstandens kompleksitet er en av dem; Embryologisk kunnskap tilsier at en rekke gener er involvert i kontrollen av de kompliserte og velkoordinerte prosessene som utgjør palatolabiogenesen. Menneskelig avkom er som regel begrenset til små kull, og det er åpenbart ikke mulig å gjennomføre avlsforsøk eller manipulere genmateriale i eksperimentiellt øyemed. Påvirkning fra ikke-genetiske faktorer representerer en ekstra usikkerhet som ytterligere vanskeliggjør situasjonen.

De første spede forsøkene på å identifisere genetiske anomalier ble gjort med lysmikroskop. Ved å studere kromosomenes morfologi og sammenligne med normale forhold, ble årsaken til tilstander som Downs syndrom påvist. Synlige forandringer i kromosomenes utseende er et utrykk for drastiske endringer i arvematerialet, og tenderer som sådan til å være assosiert med store avvik fra normal fenotype; Det er derfor usannsynlig at lokaliserte tilstander som ikke-syndromisk CLP/CP skulle manifestere seg på denne måten. Den nyere tids molekylærbiologiske gjennombrudd har imidlertid resultert i at en rekke metoder av stor nytteverdi for studiet av den ikke-syndromiske leppe-kjeve-ganespaltens genetiske etiologi har blitt praktisk gjennomførbare;1 De viktigste av disse er koblings- og assosiasjonsanalyser. En annen strategi har vært applikasjonen av de samme metodene på syndromiske orofaciale spalter i den hensikt å avdekke gener eller molekylære mekanismer med betydning for ikke-syndromiske former.

Med kobling menes genetiske områders tendens til å opptre sammen etter tilfeldig rearrangering av arvematerialet; Graden av kobling er med andre ord avhengig av den fysiske avstanden mellom områdene. Ved å bruke kjente DNA-sekvenser med kjente posisjoner på de ulike kromosomene som markører er det således mulig å bestemme den omtrentlige posisjonen til et gitt gen ved å måle graden av kobling mellom genet og de kjente sekvensene. Denne prosessen kalles mapping; Området angis som kromosomnummer, arm (p: kort, q:lang) og bånd. Når genet er ukjent må slike studier baseres på familier med flere rammede medlemmer; Ved å gjennomsøke genomet og sammenligne friske og syke slektninger med statistiske modeller kan man finne områder (loci) med sannsynlig betydning for sykdomsutvikling. En variant av denne fremgangsmåten er såkalte sib-pair analyser, hvor man benytter seg av rammede søskenpar. Som metode har koblingsanalyser hatt sin klare begrensning i den utilstrekkelige tilgangen på egnede familier og ressurser til genotyping;24 De sprikende resultatene fra forskjellige studier er et utrykk for dette. Kun et område på 6p har vist konsistent kobling til ikke-syndromisk leppe-kjeve-ganespalte i flere uavhengige studier.15, 25, 26

Et beslektet begrep som ofte dukker opp i genetiske studier av orofaciale spalter er koblingsbalanse. Hvis man tenker seg to gener som hver har to alleler, vil det foreligge koblingsbalanse i en gitt populasjon dersom statistiske analyser viser at frekvensen av de mulige genotypene i det første genet er uavhengig av frekvensen av de mulige genotypene i det andre. Hvis man finner forstyrret koblingsbalanse mellom et genområde og en viss egenskap, kan dette ha flere mulige årsaker; En av de viktigste er liten fysisk avstand mellom det aktuelle locus og genet som er ansvarlig for egenskapen (altså kobling). Forskjellen mellom kobling og forstyrret koblingsbalanse kan således være vanskelig å få tak i; For vårt formål er det viktigst å huske at kobling beskriver graden av sammenheng mellom et genområde og en egenskap i en familie, mens forstyrret koblingsbalanse beskriver tilsvarende for en populasjon.

15

Koblingsanalyser gir kun grove hentydninger til regioner av genomet hvor sykdomsfremkallende gener kan residere; Det er ikke uvanlig at det aktuelle locus inneholder flere hundre kjente og ukjente gener. For å identifisere genet og mutasjonen som er ansvarlig for tilstanden man undersøker finnes det to vanlige fremgangsmåter; Den første er kjent som posisjonell kloning og innebærer at alle genene i det aktuelle området isoleres og identifiseres. Man undersøker så hvert enkelt gen for mutasjoner. Det sier seg selv at denne metoden er både kostbar og svært tidkrevende; Selektiv analyse av såkalte kandidat-gener, dvs. gener som man av en eller annen grunn mistenker for å være involvert i patogenesen, kan derfor ofte være en raskere og mer målrettet metode. Mistanker mot potensielle kandidat-gener kan oppstå på mange forskjellige grunnlag; Ofte har manipulasjon av det tilsvarende (homologe) genet hos modellorganismer resultert i en fenotype med spalte.

Assosiasjonsanalyser undersøker den statistiske sammenhengen mellom forskjellige alleler av kandidat-gener og orofaciale misdannelser i en gitt populasjon. disse metodene har flere fordeler fremfor koblingsanalyser; Det er ikke nødvendig å basere seg på familiestudier, så man kan inkludere det store flertallet av tilfeller som forekommer isolert uten rammede slektninger.27

I tillegg gjør bruken av kandidat-gener at man kan gå målrettet til verks og nyttegjøre seg det som finnes av observasjoner og relevant litteratur i utvelgelsen av disse.

En viktig familiebasert assosiasjonsanalyse er den såkalt Transmission Distortion Test(TDT); Slike tester utføres som regel på affiserte triader, dvs. rammede barn og deres foreldre. Man undersøker her transmisjonsbalansen, som tilsier at det er like stor sannsynlighet for overføring av begge alleler av en bestemt markør fra forelder til avkom. Dersom denne balansen skulle vise seg å være forstyrret hos rammede triader, tyder dette på at markøren man undersøker befinner i eller nær sykdomsgenet; Ved å benytte en markør man vet befinner seg i et bestemt kandidat-gen, kan man således undersøke dette.

Som tidligere nevnt har dyremodeller, i all hovedsak mus og kyllinger, bidratt i vesentlig grad til identifikasjon av potensielle kandidat-gener. I over ti år har man alt frem stammer av mus med spontane mutasjoner, målrettet deaktiverte gener (knockouts) eller innskutte sekvenser tilfeldig plassert i arvematerialet; Flere titalls stammer oppviser fenotyper som inkluderer spalter i leppe/kjeve eller gane, og orofaciale spalter synes således å utgjøre et hyppig endepunkt for denne typen eksperimenter.12 Man må derfor ytterligere sannsynliggjørebetydningen av gener som identifiseres på denne måten ved å lete etter andre biologiske indiserfor deres deltagelse i palatolabiogenesen; En vanlig måte å gjøre dette på er å undersøke genets ekspresjon i relevante embryonale vev under det tidsrom der kjeve eller gane dannes. Ved å designe forbindelser av fluorescerende stoffer og nukleotid-sekvenser som binder seg selektivt til mRNA transkribert fra det aktuelle genet kan genekspresjon i dag observeres.

Gen Genprodukt Referanse

Tgf-β3 Signalmolekyl Proetzel et al. (1995)

Msx-1 Transkripsjonsfaktor Satokata and Maas (1994)

Pax-9 Transkripsjonsfaktor Peters et al. (1998)

P63 Transkripsjonsfaktor Mills et al. (1999)Yang et al. (1999)

Tab. 4.1 – Utvalgte knockout-mus assosiert med spaltedannelse.

16

Gener som forårsaker syndromiske spalter

I løpet av de siste årene har det vært stor fremgang i arbeidet med å identifisere gener som er ansvarlige for mange av de syndromiske spalteformene, og det er gode holdepunkter for å hevde at denne kunnskapen kan være nyttig også i forståelsen av ikke-syndromiske tilfeller.12, 28,

29 Man regner vanligvis med at syndromisk CLP utgjør omtrent 30% av den totale forekomsten;11, 29 For CP er det mer sprikende resultater, og selv om de fleste opererer med tall rundt 20%, mener enkelte at den endelige verdien bør anses som uavklart.11 Skillet mellom syndromiske og ikke-syndromiske former er imidlertid ikke lenger like skarpt; Muligheten for variabel penetranse av syndromiske gener, ukjente modifiserende faktorer, forskjellige funksjonelle utfall ved forskjellige mutasjoner i samme gen samt risikoen for å overse mindre assosierte misdannelser gjør det sannsynlig at en del av de tilfellene vi i dag klassifiserer som enten syndromiske eller ikke-syndromiske i virkeligheten deler noe av sitt genetiske grunnlag; Som vi skal se støtter flere nyere studier denne teorien. Kunnskap om de syndromiske spaltenes etiologi vil også gi dypere innsikt i palatolabiogenesens molekylære mekanismer og som sådan bidra til en bedre forståelse av spaltedannelse i sin helhet.

TBX-22X-bundet ganespalte (CPX) er en syndrom med klassisk x-bundet arvegang. Hovertrekkene er ganespalte og ankyloglossi (bundet tunge forårsaket av misdannet frenulum), men ekspresjonen er svært variabel. Ganespalte kan i enkelte tilfeller være eneste manifestasjon av syndromet, spesielt hos kvinnelige bærere; Det sier seg selv at slike pasienter ofte har blitt feilklassifisert som ikke-syndromiske.29 Ved koblingsanalyse ble genet for tilstanden lokalisert til Xq21.37 En rekke kandidat-gener i området ble undersøkt for mutasjoner, og TBX-22 ble til slutt identifisert som ansvarlig for syndromet.38 Genets ekspresjon viste seg å være begrenset til de laterale palatinprosessene like før disse eleveres, samt tungebasis,39 hvilket stemmer godt overens med funnene ved CPX. I forsøk med kyllinger så man samme mønster,40 og siden fugler har ganespalte som en del av sin naturlige morfologi, har dette fått enkelte forfattere til å spekulere i om TBX-22 har større betydning for palatinprosessenes vekst/elevasjon enn for deres sammenføyning.29

Det kromosomale området hvor TBX-22 befinner seg sammenfaller med en region som har vist kobling til CLP i en Engelsk sib-pair studie.26 I en studie av tilfeldig utvalgte nordamerikanske og brazilianske CP-pasienter ble det funnet TBX-22 mutasjoner hos nesten 4%;30 Mange av disse pasientene hadde ikke ankyloglossi. En familie med ganespalte i fem generasjoner skal nylig ha fått påvist en mutasjon i TBX-22;29 Alt i alt virker det sannsynlig at genet kan ha betydning for utviklingen av ikke-syndromiske spalter.

Gen Type genprodukt Syndrom Mistanke om bidrag til ikke-syndromiske spalteformer

TBX-22 Transkripsjonsfaktor

Cellulært adhesjonsmolekyl

Transkripsjonsfaktor

Transkripsjonsfaktormodifisator

CPX

Transkripsjonsfaktor

PVRL-1 CLPED

Ja (26, 30, 29)

Ja (31)

IRF-6 van der Woude’s Ja (32, 33, 34)

P63 EEC3 Usikkert (35)

MSX-1 CLP and tooth agenesis Ja (36)

Tab. 4.2 – Nylig identifiserte gener og syndromene de forårsaker.

17

PVRL-1Det finnes mange syndromer som har sine grunnlag i fenomenet ektodermal dysplasi, dvs. anomalier i enkelte strukturer utviklet fra ektodermen. Et av disse er det relativt sjeldne CLPED (Cleft Lip/Palate Ectodermal Dysplasia); Det følger autosomal recessiv arvegang og karakteriseres av hidrotisk ektodermal dysplasi (ektodermal dysplasi med fungerende svettekjertler), syndaktyli (manglende separasjon av fingrene) og økt forekomst av leppe-kjeve-ganespalte. Ved hjelp av posisjonell kloning ble det funnet en mutasjon i genet PVRL-1 hos CLPED-pasienter fra Brasil, Israel og Margarita Island utenfor Venzuela;41 PVRL-1 er en forkortelse for PolioVirus Receptor Like-1, et navn genet fikk på grunn av at genproduktet oppviste enkelte homologier med proteiner som utnyttes av polioviruset. Proteinet som PVRL-1kodet for skulle imidlertid vise seg å være et cellulært adhesjonsmolekyl av IgCAM-typen; Dette ble kalt Nectin-1 og inngår sammen med E-Cadherin i adherensforbindelser mellom enkelte celler.42 I dyreforsøk er ekspresjonen av PVRL-1 lokaliser til de laterale palatinprosessenes mediale rand og til epitelet på hudoverflaten;41 Dette passer godt med den kliniske manifestasjonen av CLPED-syndromet. Det er funnet tre forskjellige mutasjoner som fører til utvikling av syndromet;28 I et forsøk fra Venezuela er det vist at heterozygote for en avdisse mutasjonene har signifikant økt risiko for ikke-syndromisk leppe-kjeve-ganespalte.31

Dersom dette funnet lar seg reprodusere i andre befolkninger, er det svært gode holdepunkter for å anse PVRL-1 mutasjoner som en risikofaktor for ikke-syndromisk spaltedannelse.

IRF-6Van der Woude’s syndrom er det vanligste av de mendelske CLP-syndromene; Det følger autosomal dominant arvegang og har lenge vært av interesse for undersøkere som arbeider med ikke-syndromiske spalter da de fleste rammede kun har mindre assosierte misdannelser. Disse består som regel av spyttkjertelanomalier i underleppen (lip pits, mukøse vesikler) og underutviklede tenner (hypodonti). Et beslektet syndrom, Poplietal Pterygium Syndrome (PPS), fremviser tilsvarende misdannelser samt forandringer i knehasene (poplietalt pterygium), syngnathi (sammenvokst over- og underkjeve), neglanomalier, syndaktyli og malformerte genitalia/urinveier. Ved koblingsanalyse ble et genetisk locus for van der Woude’s syndrom funnet på 1q;43 PPS viste kobling til samme område i en senere studie.44 Det ansvarlige genet skulle vise seg å være vanskelig å identifisere; Gjennombruddet kom da Kondo et al. fant to monozygote tvillinger der bare den ene hadde van der Woude’s syndrom; Det var heller ingen andre tilfeller i familien. Man tolket dette som en somatisk mutasjon hos den affiserte tvillingen, og ved å sammenligne genomene ble en mutasjon identifisert i et gen kjent som Interferon Regulatory Factor-6 (IRF-6).45 Dette genet befant seg som forutsett på 1q, og det ble i tillegg funnet andre mutasjoner i 45 ubeslektede familier med van der Woude’s syndrom samt 13 familier med PPS. Det har også blitt demonstrert at de to syndromene oppstår som resultat av forskjellige mutasjoner i IRF-6-genet;28 Eksperimenter på modellorganismer har påvist genets ekspresjon in områder som affiseres av de to syndromene;45 Nyere studier tyder på at genet kan spille en modifiserende rolle i utviklingen av ikke-syndromisk CLP.32, 33, 34

P63EEC er et autosomalt dominant syndrom som karakteriseres av ektrodaktyli (manglende fingre), ektodermal dysplasi og leppe-kjeve-ganespalte. Genet for tilstanden ble lokalisert til 3q27, og mutasjoner ble identifisert i p63.46 Genproduktet er homologt med den kjente tumor-supressor faktoren p58, og fungerer akkurat som denne ved å binde seg til en transkripsjonsfaktor som så aktiveres. Deaktivering av p63 hos mus er vist å føre til spaltedannelse (tab. 4.1); Det har imidlertid ikke blitt identifisert mutasjoner hos pasienter med ikke-syndromisk CLP, men det skal nevnes at kun et lite antall har blitt undersøkt hittil.35

18

MSX-1MSX-1 er homeoboks-gen som er nært beslektet med HOX-genene; Det koder således for en transkripsjonsfaktor, og det er vist sammenheng mellom tap av Msx-1 genfunksjon hos mus og orofaciale spalter (tab. 4.1). Hos mennesket ble det først påvist MSX-1 mutasjoner hos pasienter med autosomal dominant tann-agenese (manglende utvikling av tenner.)47 Genet ble knyttet opp mot spalteproblematikk hos mennesker da van der Boogaard et al. beskrev en nederlandsk familie med et syndrom karakterisert av tann-agenese og en blanding av CLP/CP.48

I en studie av 917 CLP-pasienter med forskjellig etnisk bakgrunn ble det funnet mutasjoner i MSX-1 hos 16 personer;36 Blant disse var både leppe-kjeve-ganespalte og isolert ganespalte representert, hvilket kan tyde på at genet spiller en rolle for utviklingen av begge malformasjonene; CLP-pasientene var imidlertid overtallige. Basert på denne undersøkelsen anslo forfatterne at 2% av alle ikke-syndromiske CLP-tilfeller kunne være forårsaket av en mutasjon i MSX-1. Det er imidlertid også utført enkelte koblings- og assosiasjonsanalyser hvor man ikke har funnet sammenheng mellom genet og CLP/CP, selv om flertallet av disse har vært positive.29

Andre lovende kandidat-gener for ikke-syndromiske spalter

Selv om man ennå ikke har lykkes i å identifiserer noe gen som alene utgjør et hovedbidrag til risikoen for ikke-syndromisk leppe-kjeve-ganespalte har man allikevel funnet en rekke interessante kandidat-gener. Som vi har sett er noen av disse ansvarlige for syndromiske orofacialspalter; I det følgende skal vi se nærmere på de resterende.

TGF-αAllerede i 1989 ble det funnet assosiasjon mellom signalmolekylet TGF-α og ikke-syndromisk leppe-kjeve-ganespalte;49 En rekke andre studier har imidlertid vist varierende resultater, men Mitchell kom i en meta-analyse frem til at litteraturen støtter en modifiserende rolle for TGF-α i orofacialspaltenes patogenese,50 og ekspresjonsbaserte studier peker i samme retning.51 TGF-αer som tidligere nevnt nært beslektet med EGF (Epidermal Growth Factor), og binder seg til samme reseptor som denne. EGF stimulerer dannelsen av glykosaminoglykaner i de laterale palatinprosessene; TGF-α utrykkes i palatinprosessenes mesenchym og epitel, og påvirker produksjonen av ekstracellulærsubstans. Samspillet mellom TGF-α og andre risikofaktorer for CLP vært gjenstand for en rekke studier; Det er i en norsk studie funnet 9.7 ganger økt risiko hos personer med spesielle utgaver av MSX-1 og TGF- α.52

Kromosom Gen Type genprodukt -------------------------------------------------------------------------------------Mutasjon Kobling Forstyrret koblingsbalanse Assosiasjon

2p13

1p36

14q24

2q32

4q21

19q13 CLPTM-1 Transmembranprotein √ √ √

6p23 ? ?

TGF-α

√ √ √

√ √

MTHFR

Signalmolekyl

Enzym

Signalmolekyl

Transkripsjonsfaktor

√ √

TGF-β3 √ √

SATB-2 √

ACOD-4 √Enzym

Tab. 4.3 – Kandidat-gener for ikke-syndromiske spalter og foreliggende impliserende materiale.

19

MTHFR5,10-metylentetrahydrofolat reduktase (MTHFR) er enzymet som besørger omdannelsen av 5,10-metylentetrahydrofolat til 5-metyltetrahydrofolat; Denne reaksjonen er viktig i metabolismen av B-vitaminet folsyre. Underskudd på folsyre er veletablert som en risikofaktor for utvikling av nevralrørsdefekter; Folsyre-antagonister har dessuten vist seg å øke forekomsten av orofaciale spalter,53 og flere undersøkelser har således satt seg som mål å påvise en eventuell sammenheng mellom folsyre og CLP/CP. En spesiell versjon av genet, kjent som C677T, er vist å produsere en termolabil utgave av enzymet som følgelig har nedsatt aktivitet og øker sannsynligheten for nevralrørsdefekter.54 I en studie ble det funnet at risikoen for CLP var økt 4.6 ganger hos barn av mødre med MTHFR C677T-genotypen;55 En annen studie påviste risikoøkning på 10 ganger dersom mor var bærer av dette genet og i tillegg led av folsyremangel i perioden rundt unnfangelsen.56 En norsk studie fant imidlertid lavere risiko for CLP hos barn av mødre med C677T-varianten, men en omtrentlig dobling av risikoen for CP dersom barnet selv var bærer av dette genet.57 Helhetlig sett virker det fornuftig å konkludere med at det foreligger klare tegn på MTHFR-genets deltagelse i leppe-kjeve-ganespaltenes patogenese, men at denne deltagelsens kvalitative og kvantitative natur fremdeles må anses for å være uavklart.

TGF-β3Deaktivering av genet som koder for signalmolekylet TGF-β3 hos mus fører til utvikling av en fenotype med ganespalte (tab. 4.1); Det er påvist manglende sammenvoksning av de laterale palatinprosessene hos disse musene,58 og mye tyder på at TGF-β3 medierer fusjon av palatinprosessene ved å stimulere til omdanning av epitel til mesenchym.59 TGF-β3 har av flere forfattere blitt knyttet til ikke-syndromisk leppe-kjeve-ganespalte;60 En norsk studie viste også sammenheng mellom genet og CLP, men denne assosiasjonen var svak og konfidensintervallet inneholdt sågar 1.52 En spesiell utgave av TGF-β3 ga nylig en risikoøkning for CLP på hele 16 ganger i en koreansk studie;61 To studier på japanske populasjoner var imidlertid uenige om genet var assosiert med spaltedannelse eller ikke.11 Generelt kan man si at det foreligger svært gode holdepunkter for å anta at TGF-β3 er involvert i palatogenesen, men at det er vanskelig å få noen god sammenheng ut av de mange motstridende studiene på området. Flere undersøkelser av spesifikke genutgaver kan muligens klargjøre dette i fremtiden.

Andre gener og lociSATB-2 er et gen som koder for en transkripsjonsfaktor ved navn Special AT-rich sequence Binding protein-2; Ekspresjonsanalyser har vist at genet sannsynligvis er involvert i palatogenesen.28 En studie har dokumentert forstyrrelse av dette genets funksjon hos to ubeslektede pasienter med ganespalte.62

Forstyrrelser i ACOD-4 (Acyl-COenzyme A desaturase-4) er nylig blitt funnet i en familie med leppespalte.63 Genet er lokalisert til 4q21, et område som har vist kobling til ikke-syndromisk CLP.64

CLPTM-1 (Cleft Lip and Palate Transmembrane Protein-1) ble identifisert på 19q13 hos en familie med CLP i tre generasjoner og en balansert translokasjon i dette området.65 Andre studier har tidligere funnet kobling mellom ikke-syndromisk CLP og den samme regionen.

Som vi alt har sett, viser mange uavhengige studier konsistent kobling mellom ikke-syndromisk CLP og et område på 6p23.15, 25, 26 Det har ennå ikke blitt identifisert noe kandidat-gen i denne regionen, men det virker sannsynlig at et slikt kan eksistere.

20

Eksogene faktorer av betydning forutviklingen av orofaciale spalter

1943, bare ett år etter at Fogh-Andersen leverte sin avhandling om leppe-kjeve-ganespaltenes arvegang, kunne Warkany et al. vise til forsøk på rotter der maternelle

ernæringsforstyrrelser førte til utvikling av spalter hos avkommet.66 Det er mange observasjoner som taler for en miljøkomponent i orofacialspaltenes etiologi; En av de viktigste er variasjonen i forekomst mellom områder med forskjellig levestandard. Insidensen for CLP blant innfødte filippinere er blant de høyeste i verden; Den er i flere studier beregnet til rundt 0.20%.67, 68, 69

Undersøkelser av etniske filippinere bosatt i områder med høyere levestandard, som hovedstaden Manila eller De Forente Stater, viser et fall til omkring 0,12%.70, 71, 72

Det er to hovedårsaker til at påvisning av miljøfaktorer med betydning for utviklingen av leppe-kjeve-ganespalte er et viktig forskningsområde; Den første og mest åpenbare er at man med bedre kjennskap til disse forholdene vil kunne igangsette preventive tilstak og således redusere malformasjonenes forekomst. Den andre er at slik kunnskap vil kunne gi verdifulle hint i jakten på en molekylærbiologisk forståelse av palaolabiogenesen.

Eksogene påvirkninger under embryogenesen kan generelt sett deles inn i fem kategorier: Infeksjoner, ioniserende stråling, medikamenter (lovlige og ulovlige), maternelle hormonelle forhold og maternelle ernæringsdefekter. I tillegg kommer mekanisk påvirkning av fosteret grunnet anomalier i livmor eller fosterhinnene. En rekke forbindelser og forhold fra flere av de overnevnte kategorier har gjennom tidene blitt implisert i orofacialspaltenes etiologi; Bare enkelte av disse har imidlertid vist konsistent assosiasjon i flere uavhengige studier.

TobakksrøkingSammenhengen mellom tobakksrøking og leppe-kjeve-ganespalte har vært gjenstand for en rekke undersøkelser, og resultatene har stort sett vist en svak assosiasjon i størrelsesorden 1.3-1.5 ganger økning i relativ risiko;73 Denne har imidlertid ikke alltid vært statistisk signifikant dastudiene ofte har vært for små. Wyszynski og Beaty publiserte i 1996 en meta-analyse av 11 studier fra perioden 1966-1996; De fant standariserte odds ratio på 1.29 med 95% konfidensintervall (1.18-1.42) for CLP og tilsvarende 1.32(1.09-1.60) for CP.74 Det ble også funnet holdepunkter for dose-avhengighet; Risikoen økte med graden av maternell eksposisjon ifem av de åtte studiene som kvantifiserte sigarettforbruket. En av de største studiene som er utført på området undersøkte sammenhengen mellom leppe-kjeve-ganespalte og maternell tobakksrøking hos neste fire millioner levendefødte barn i det amerikanske fødselsregsiteret;75

Det ble funnet en sammenheng som forble signifikant selv etter at dataene var justert for rase, alder og maternelle sykdommer som kunne tenkes å påvirke palatolabiogenesen. Justert odds ratio var 1.34(1.16-1.54), og stemte således godt overens med resultatene til Wyszynski og Beaty. Tilsvarende ble det også funnet signifikant doseavhengighet. Sammenhengen mellom genetisk bakgrunn og røking har også vært undersøkt; En nyere meta-analyse av fem studier konkluderte med økt risiko for CP hos barn med den såkalte Taq1 C2 varianten av TGF-αdersom moren hadde røkt.76 Det ble ikke funnet økt risiko for CLP. En norsk studie fant ingen sammenheng mellom røking, ganespalte og en annen sjelden variant av TGF-α kalt Taq1 A2.77

Andre har funnet assosiasjon med varianter av MSX-1.78

I

21

AlkoholFøtalt alkoholsyndrom er en velkjent tilstand hos barn hvis mødre har hatt et overdrevent etanolkonsum under graviditeten; Det arter seg blant annet ved en karakteristisk smal overleppe og lettere anomalier av andre strukturer i ansiktet. Teorier om at alkohol forstyrrer normal utvikling og migrasjon av cellene fra nevralkammen har vært fremsatt som en mulig forklaring på disse funnene; Flere studier har dessuten lett etter en sammenheng mellom materneltalkoholinntak og CLP/CP. Munger et al. fant doseavhengig risikoøkning for CLP etter å ha justert for sosioøkonomiske faktorer, røking, vitamintilskudd og fødselsår;79 Resultatene var imidlertid statistisk signifikante kun for de høyeste dosene. Her fant man til gjengjeld odds ratio på 4.0(1.1-15.1). I en europeisk studie fra 2000 som involverte flere spaltesentre ble det registrert sammenheng mellom CP og alkoholkonsum;80 Odds ratio var 2.28(1.02-5.09). Det ble derimot ikke funnet noen doseavhengig effekt. En norsk studie undersøkte sammenhengen mellom en variant av TGFa og alkohol, men fant ingen assosiasjon.77

FolatSom vi har sett kan administrasjon av folat-antagonister under graviditet føre til utvikling av orofaciale spalter;53 Flere studier har dessuten rapportert sammenheng mellom inntak av folsyretilskudd og redusert risiko for CLP.81, 82 Andre undersøkelser har ikke funnet noen slik assosiasjon, men mange av disse har imidlertid vært beheftet med designproblematikk.83 Det er også funnet sammenheng mellom CLP og høye maternelle verdier av homocystein;84

Homocystein metaboliseres via et folatavhengig enzym og verdiene vil således stige ved mangeltilstander. Jugessur et al. fant klar sammenheng mellom Taq1 A2 varianten av TGF-α og ganespalte hos barn av mødre som ikke hadde tatt folsyretilskudd;77 Dersom slike tilskudd var blitt brukt, var assosiasjonen marginal. Det synes også som om det kan være doseavhengighet i den eventuelle beskyttende effekten av folsyre; Man har i lengre tid undersøkt tilsetning av mindre mengder folat til matvarer i den hensikt å forebygge nevralrørsdefekter, men noen forebyggende effekt mot orofaciale spalter er ikke blitt observert som resultat av dette.85 Høyere doser er derimot vist å gi signifikant risikoreduksjon.82

AntikonvulsivaFlere studier har funnet assosiasjon mellom medikamenter med antikonvulsiv effekt og CLP; Særlig gjelder dette for Phenytoin,86 men også andre antiepileptika samt kombinasjoner av disse har vært i søkelyset. Flere forfattere har observert dobbelt så høy risiko for orofacialspalter hos barn av mødre som gjennomgikk langvarig medikamentell epilepsibehandling under svangerskapet.87, 88

Andre forbindelser og forholdNår det gjelder andre mulige miljøfaktorer med betydning for utviklingen av leppe-kjeve-ganespalter er det ingen generell konsensus. Både kortikosteroider,89 vitamin A,90 maternell hormonell ubalanse91 og diabetes mellitus92 har vært i søkelyset. Ingen har funnet holdepunker for at ett spesielt teratogen er involvert i patogenesen hos et flertall av pasientene.11

Som man kan forstå gir orofacialspaltenes tilblivelse potensiale for en rekke meget kompliserte interaksjoner mellom forskjellige miljøfaktorer, genetiske disposisjoner og kanskje også forhold underlagt tilfeldighetens lover. Palatolabiogenesens kompleksitet antyder en tilsvarende komplisert etiologi; Det faktum at spalter synes å være et hyppig endepunkt ved en rekke genetiske forstyrrelser peker i samme retning. Samspill mellom enkelte faktorer er som vi har sett blitt påvist i flere studier, og dette vil utvilsomt bli gjenstand for nye undersøkelser i fremtiden.

22

Palatolabiogenesen i etmolekylærbiologisk perspektiv

ed bakgrunn i de temaer som allerede er gjennomgått skal vi forsøke å lage oss et bilde av de molekylærgenetiske begivenheter som ender med dannelsen av gane, leppe og

kjeveapparat. Tross flere interessante resultater i den senere tids forskning er man fremdeles langt unna en fullstendig forståelse av hvordan disse prosessene koordineres på cellulært nivå; Det følgende vil således nødvendigvis bli en oversikt over tilgjengelig viten hvis primære funksjon er å integrere funn fra genetisk epidemiologiske undersøkelser og studier av modellorgansimer med embryologisk kunnskap.

Migrasjonen av celler fra nevralkammen til de forskjellige ansikts-primordiene er som vi har sett blant de tidligste og viktigste begivenhetene i palatolabiogenesen. Celler langs lateralkanten av det invaginerende nevralrøret har differensiert seg til nevralkam-epitel under induktiv påvirkning fra overliggende ektoderm; Signalmolekyler som BMP-4 og BMP-7 synes å være involvert i dette. For å bli i stand til å migrere gjennomgår nevralkam-cellene embryonal epitelial-mesenchymal transformasjon; Et program av genekspresjon igangsettes, hvilket blant annet fører til at cellulære adhesjonsmolekyler forsvinner og cytoskjelettet endres. Cellene løsner fra hverandre og bryter gjennom basalmembranen; De migrerer så langs overlappende ruter mot ventralsiden av embryoet (fig. 6.1). Deres endelige destinasjon bestemmes delvis av hvilket område i nevralkammen de stammer fra, og delvis av det ekstracellulære miljøet de utsettes for; Interaksjon med ekstracellulærsubstansens bestanddeler, og da spesielt kollagen type IV, fibronectin og laminin, medieres av integriner i cellemembranen. Høye konsentrasjoner av kondroitinsulfat i ekstracellulærsubstansen synes å hemme migrasjonen av nevralkam-celler til et område; Likeledes utgjør basalmembraner etter gjennomgått eEMT uoverkommelige hindringer som er med på å dirigere cellene i riktig retning.

M

Mandibulærbue

Maksillærprosess

ProsencephalonMesencephalon

Rhombencephalon

Fig. 6.1 – Nevralkam-cellenes migrasjonsruter.

23

Mesenchym fra nevralkammen differensieres til et utall forskjellige strukturer; Cellenes differensieringspotensiale synes i hvert fall delvis å være bestemt før de gjennomgår eEMT og begynner å migrere.93 I eksperimenter på kyllinger har man byttet ut celler fra 2. og 3. gjellebue med tilsvarende fra mandibulærbuen; Resultatet ble dannelsen av en ekstra underkjeve i disse nivåene. Slike forsøk gjenspeiler imidlertid ikke hele sannheten; Mikrotransplantasjons-eksperimenter hvor man har flyttet pharyngeal endoderm og frontonasal ektoderm til nye lokalisasjoner viser at nevralkam-cellene mottar instruksjoner fra andre vev;94, 95 Disse signalene kan påvirke både vekst og morfogenese av ansiktsprosessene, men de synes å utøve sin effekt innenfor de rammer cellenes grunnleggende programmering gir.

Ansiktsprimordienes utvekst koordineres i høy grav av interaksjoner mellom mesenchym og ektoderm; Signalmolekyler som SHH og medlemmer av FGF- og BMP-familiene er involvert i dette.59 I det hele tatt har prosessen mange likhetstrekk med tidlige stadier i dannelsen av armer og ben; På kyllinger er det vist at nevralkam-celler fra frontonasalprominens, maksillærprosesser og mandibulærbuer kan vedlikeholde den karakteristiske fortykningen av arm- og benanleggenes apikale ende som representerer hovedsenteret for induktiv interaksjon i disse strukturene. Msx-1 utrykkes i ansiktsprosessenes hurtig prolifererende mesenchym analogt med situasjonen i lemmenes anlegg; Bmp-signalisering er vist å føre til ekspresjon av både Msx-1 og det nært beslektede Msx-2.96, 97 Induktive mekanismer er også ansvarlige for utveksten av palatinprosessene; Signalmolekyler som Tfg-α og Egf er viktige for endringer i ekstracellulærsubstansen som muliggjør deres elevasjon.

Normal vekst av de forskjellige ansiktsprosessene er en forutsetning for vellykket palatolabiogenese; Like viktig er det imidlertid at fusjonsprosessene mellom disse forløper som de skal. Flere mekanismer er involvert i de cellulære forberedelsene som forutgår sammensmeltningen; Celledeling, bevegelse, endring av adhesjonsegenskaper, reorganisering av cytoskjelettet og apoptose er alle representert, og koordinert ekspresjon av mange forskjellige gener er således nødvendig.

I elektronmikroskop kan man observere en rekke forandringer i epitelet som dekker maksillærprosesser, nasomedialprosesser og palatinprosesser like før disse smelter sammen. Den første av disse er apoptose; Enkelte celler dør og blir presset ut av epitelet, sannsynligvis ved hjelp av kontraksjoner som involverer actin og myosin da slike mekanismer har blitt påvist ved tilsvarende situasjoner i andre vev (fig. 6.2).98 Denne ”uttynningen i rekkene” av epitelceller synes å være en forutsetning for normal fusjon; Mus som mangler Apaf-1, en viktig apoptotisk faktor, kommer til verden med en persisterende epitelial søm i den sekundære gane.99 Det gjenværende epitelet forandrer seg også; Cellene antar en mer avrundet form, og grensene mellom dem mister sin klare definisjon. (fig. 6.2).

Mye tyder på at Bmp-4 spiller en viktig rolle i disse prosessene; Genets ekspresjon begrenses til de områder av maksillær- og nasalprosessenes epitel som skal fusjonere i tidsrommet før sammensmeltningen finner sted.100 Hos kyllinger er ekspresjon av Bmp-7 og Bmp-2 observert i samme område, og samspill mellom de forskjellige Bmp-molekylene kan ikke utelukkes.101

Andre eksperimenter tyder på at Tgf-β3 spiller fyller en tilsvarende rolle i de laterale palatinprosessene.59 Medlemmer av Tgf-β familien, som jo inkluderer både Tgf-β3 og Bmp-molekylene, er kjent for å indusere apoptose i en rekke sammenhenger; Det virker sannsynlig at dette kan være blant deres oppgaver også i palatolabiogenesen. Effekten av disse faktorene avhenger av deres relative konsentrasjon i forhold til forbindelser med antagonistisk virkning, som f.eks. signalmolekyler fra Fgf-familien, Shh og et protein kjent som Noggin (Nog).

24

B) Maksillærprosessen har fusjonert med nasolateralprosessen C) Forstørrelse av det markerte området fra B.og skal til å smelte sammen med nasomedialprosessen. Cellene har antatt en mer avrundet form.

1 mm50 µm

NasomedialprosessNasolateralprosesss

Maksillærprosess

A) Flate epitelceller med markerte cellegrenser før formendring;Enkelte apoptotiske celler har blitt utstøtt

Fig. 6.2 – Elektronmikroskopiske bilder av kyllingfostre som demonstrerer forandringer på ansiktsprosessenes overflate før disse fusjoneres.

15 µm

Apoptotiske celler

Den tilsynelatende vilkårlige utvelgelsen av epitelceller som gjennomgår apoptose er muligens resultatet av et tilfeldighetselement i fordelingen av pro-apoptotiske faktorer og antagonister eller den cellulære responsen disse induserer.59 Det er påvist kraftig nedregulering av Nog og Shh i henholdsvis nasomedialprosesser og maksillærprosesser før disse fusjonerer,101 og man vet at balansen mellom BMP-4 og Nog har avgjørende betydning for hvorvidt celler gjennomgår eEMT eller apoptose i andre embryonale vev.102, 103 Shh har tallrike funksjoner under forskjellige omstendigheter; Foruten å fungere antagonistisk ovenfor Bmp-signalveien kjenner man eksempler på at Shh stimulerer apoptose og regulerer cellulære adhesjonsegenskaper.104, 105, 106 Det faktum at Nog ikke utrykkes i maksillærprosessene kan muligens bety at tapet av Shh sensitiviserer epitelcellene her for Bmp-4 medierte pro-apoptotiske signaler;101 En funksjon med betydning for cellulær adhesjon er heller ikke utenkelig, og kanskje bidrar Shh til begge deler.

25

IRF-6 kan ifølge nyere hypoteser utøve en hemmende påvrikning på prematur apoptose;59 En slik funksjon har blitt tilskrevet andre IRF-faktorer under andre forhold,107 og det er også vist at interferon-signalkjeder virker antagonistisk på Tgf-β systemet.108 Studier av p63 knockout-mus tyder på at genet spiller en rolle for vedlikehold av enkelte epiteliale vev, og at balansen mellom ulike isoformer er sentral i denne funksjonen.109 Noen av de sistnevnte transkriberes som følge av Bmp-påvirkning.110

Den første kontakten mellom ansiktsprosesser som skal til å fusjonere skjer i det tallrike filopodier dannes på overflaten av det nå ujevne epitelet (fig. 6.3). Disse er observert mellom maksillærprosess og nasomedial-/nasolateralprosesser, samt mellom de laterale palatinprosessenes MEE;111, 112 Tilsvarende mekanismer er også kjent fra andre situasjoner hvorto epiteliale lag smelter sammen, som f.eks. ved tilhelning av sår. Filopodier fasiliterer sannsynligvis fusjon ved å øke overflaten av cellemembranene som skal inngå kontakt og på den måten lette dannelsen av intercellulære adhesjoner. Fra eksperimenter på kyllinger vet man at mutanter som ikke danner filopodier mellom ansiktsprosessene utvikler spalter i den primære ganen.113 Hva som initierer veksten av filopodier vet man ikke, men identifikasjonen av PVRL-1 som genet bak CLPED-syndromet har ført til nye hypoteser omkring dette.59

Genproduktet Nectin-1 er som vi har sett et cellulært adhesjonsmolekyl, og eksperimenter in vitro har vist at en løselig form av dette proteinet induserer dannelse av filopodier hos andre celler som utrykker PVRL-1;114 En av de tre isoformene som dette genet koder for viser seg dessuten å være en løselig variant som er beregnet på sekresjon.115 Nectin-1 inngår også i enkelte adherens-forbindelser, og kanskje er det også involvert i den tidlige dannelsen av celleforbindelser mellom fusjonerende prosesser. En annen mulighet er at løselig Nectin-1 oppstår ved nedbrytning av adherens-forbindelser under endringen av cellulære adhesjonsegenskaper; Denne endringen ansvarlig for at epitelcellene forandrer form og mister sine distinkte avgrensninger. En slik teori ville forklare koordinasjonen mellom epitelcellenes formforandring og dannelsen av filopodier; Den ville også stemme godt overens med elektronmikroskopiske observasjoner (fig. 6.2 og fig. 6.3). Frigjøring av løselig Nectin-1 har blitt observert ved nedbrytning av cellulære adhesjoner under andre omstendigheter.116, 117

15 µm5 µm

A) Avrundede epitelceller har begynt å danne filopodier. B) Filopodier mellom nasomedial- og nasolateralprosessene.Enkelte apoptotiske celler er fanget i disse.

Fig. 6.3 – Elektronmikroskopiske bilder av kyllingfostre som viser fremvekstenav filopodier fra epitelcellene på de fusjonerende ansiktsprosessene.

26

Etter at de fusjonerende prosessene har fått kontakt, smelter cellene som dekker dem sammen til en tolaget epitelial søm. Dette er et mellomstadium i palatolabiogenesen; Mye tyder på at ansiktets vekst utøver tilstrekkelige krefter på den primære gane til at denne ville bli revet fra hverandre dersom epitelsømmen ikke erstattes av sammenhengende mesenchym.118 eEMT er den sentrale mekanismen bak denne erstatningsprosessen; Selv om enkelte celler gjennomgår apoptose og andre sannsynligvis migrerer til slimhinnene i munn- og nesehule, konverteres altsåmesteparten av epitelet til mesenchym.

Flere signalmolekyler er kjent for å indusere eEMT under andre forhold; Medlemmer av Tgf-β og Fgf familiene er blant disse, likeledes Egf. Hos mus er det vist at Tgf-β3 er nødvendig for transformasjon av de laterale palatinprosessenes MEE til mesenchym etter sammensmeltning; Ettersom dette signalmolekylet i liten grad utrykkes i prosessene som danner kjeve og overleppe, er det mulig at Bmp-4 fyller en tilsvarende funksjon her.59 I alle tilfeller fordrer de nevnte forandringene drastiske cellulære tilpasninger; En rekke gener er nødvendigvis involvert i koordineringen av disse prosessene, og fremtidige studier vil sannsynligvis avklare om noen av dem er ivolverte i orofacialspaltenes patogenese.

Mesenchym

Celler i eEMT

Epitel og epitelmed filopodium

Basalmembran

Apoptotisk celle

Celle-celle adhesjoner bygges opp eEMT fører til oppløsning Sammenhengende mesenchymog en epitelsøm dannes av epitelsømmen etter normal fusjon

Fig. 6.4 – Skjematisk fremstilling av den primære ganens dannelse.

Epitelceller oppregulerer Enkelte celler gjennomgår Svekket celle-adhesjon Filopodier induseres ogekspresjon av Bmp-4 apoptose og støtes ut fører til formendring kontakt opprettes

27

Diskusjon og konklusjon

il tross for iherdig innsats over mer enn et halvt århundre forblir de ikke-syndromiske leppe-kjeve-ganespaltenes etiologi i store trekk ukjent. Et gjennomgangstema i litteraturen

har vært inkonsistente resultater fra ulike studier; Hovedårsakene er sannsynligvis etnisk heterogenisitet i og mellom de studerte befolkningene, samt kompliserte interaksjoner mellom arv, miljø og sosioøkonomiske forhold. Orofacialspaltenes patogenese er etter all sannsynlighet multifaktoriell, men det er uenighet om hva slags modell som best beskriver den; Tradisjonelt sett har man gått ut ifra en terskel-hypotese, men mange har påpekt muligheten for at et gen eller en gengruppe hvis dysfunksjon utgjør hovedbidraget til den arvelige risikoen for å utvikle tistanden eksisterer. Noe slikt ”major locus” har imidlertid ikke blitt funnet.

Det har allikevel vært fremskritt innenfor feltet; Spesielt har genetisk-epidemiologiske studier og eksperimenter på modellorgansimer gitt resultater. En rekke potensielle kandidat-gener har blitt identifisert, og noen av disse har demonstrert assosiasjon til leppe-kjeve-ganespalte; Ingen av dem har imidlertid vist seg å utgjøre noen hovedrisiko. Tilsvarende har man påvist flere stoffer og påvirkninger som synes å bidra til patogenesen, men også her er det usannsynlig at noen disse har avgjørende betydning. Studier av relativ risiko forbundet med ulike kombinasjoner av forskjellige genutgaver og miljøpåvirkninger har vært populære den siste tiden, og alt tyder på at denne typen undersøkelser vil spille en viktig rolle i fremtiden; Slik situasjonen er i dag, ser synergistiske interaksjoner mellom flere gener og miljøfaktorer som hver for seg har mindre betydning ut til å være den viktigste årsaken til leppe-kjeve-ganespalte.

Et av de viktigste gjennombruddene den siste tiden har vært identifikasjonen av genene bak flere syndromiske spalteformer, samt erkjennelsen av at enkelte utgaver av disse viser signifikant assosiasjon med ikke-syndromiske orofacialspalter. Leppe-kjeve-ganespaltenes hyppige opptreden i forskjellige ansiktssyndromer demonstrerer deres heterogenisitet; Det store antallet kandidat-gener og tilstandenes kompliserte embryologiske bakgrunn sannsynliggjør at normal palatolabiogenese byr på en rekke anledninger for ”sabotasje”. Antageligvis er mange hittil uidentifiserte gener involvert i patogenesen; Man mangler f.eks. et passende kandidat-gen for kromosom 6p23, som har vist konsistent kobling i flere uavhengige studier på flere befolkningsgrupper.

Som vi har sett muliggjør ekspresjons-studier på modellorganismer, ekstrapolasjon fra beslektede situasjoner og in vitro eksperimenter mer eller mindre sannsynliggjorte spekulasjoner omkring samspillet mellom de viktigste kandidat-genene under palatolabiogenesen; På det nåværende tidspunkt er det dessverre ikke stort mer enn hypoteser å støtte seg til, og noen detaljert oversikt over interaksjonene mellom forskjellige transkripsjonsfaktorer, signalmolekyler og cellulære bestanddeler ligger fremdeles langt inn i fremtiden. Den ultimate forståelsen av leppe-kjeve-ganespaltenes etiologi er imidlertid uløselig knyttet opp mot disse temaene; Allikevel er det håp om at etiologisk forskning om ikke lenge vil føre til bedret genetisk rådgivning og økt forutsigbarhet for familier som rammes av orofaciale malformasjoner. Mer langsiktige mål er utviklingen av preventive tiltak, samt forbedret behandling; Selv om dagens metoder har ført til markant prognostisk bedring, betyr leppe-kjeve-ganespalter fremdeles en barndom og ungdomstid fylt med sykehus og operasjoner for omlag to av tusen norske barn.

T

28

Referanser

1: Mitchell LE, Beaty TH et al. Guidelines for the design and analysis of studies on nonsyndromic cleft lip and cleft palate in humans: Summary report from a workshop of the international consortium for oral clefts genetics. Cleft Palate Craniofac J 2002; 39(1): 93-100.

2: Carlson BM. Human embryology & developmental biology third edition. Mosby Inc. publishing 2004.3: Cochard, L. Netter’s atlas of human embryology. F. Netter 2004.4: Khoury MJ, Beaty TH. Fundamentals of genetic epidemiology. Oxford university press 1993.5: Lodish, Berk. Molecular cell biology fourth edition. W.H. Freeman & Co 2003.6: Thornthon JB, Nimer S et al. The incidence, classification, etiology and embryology of

oral clefts. Seminars in orthodontics 1996; 2(3): 162-168.7: Davis JS, Ritchie HP. Classification of congenital defects of the lip and palate. JAMA 1922; 79: 1323-1327.8: Veau V. Division: Palative, anatomie; ahirurgie, phonetique, Paris: Masson, et cie, 1931.9: Kernahan DA, Stark RB. A new classification for cleft lip and cleft palate. Plast Reconstr Surg 1958; 22(5):

435-441.10: Fogh-Andersen P. Inheritance of harelip and cleft palate. København: Nyt Nordisk Forlag - Arnold Busck;

1942.11: Spritz RA. The genetics and epigenetics of orofacial clefts. Curr Opin Pediatr 2001; 13(6): 556-560.12: Murray JC. Gene/environment causes of cleft lip and/or cleft palate. Clin Genet 2002; 61: 248-256.13: Murray JC. Face facts: Genes, environment, and clefts. Am J Hum Genet 1995; 57: 227-232.14: Derijcke A, Eerens A et al. The Incidence of oral clefts: A review. Brit J of Oral and Maxillofac Surg 1996; 34:

488-494.15: Christensen K. The 20th century Danish facial cleft population. Cleft palate Craniofac J16: Åbyholm FE. Cleft lip and palate in Norway. I. Registration, incidence and early mortality of infants with

CLP. Scand J Plast Reconstr Surg 1978; 12: 28-34.17: Vanderas AP. Incidence of cleft lip, cleft palate, and cleft lip and palate among races: A review. Cleft Palate J

1987; 24: 216-255.18: Fogh-Andersen P. Epidemiology and etiology of clefts. Birth defects 1971; 7: 50-53.19: Pratt RM. Mechanism of chemically induced cleft palate. Trends Pharmacol Scr 1983; 4: 160-162.20: Fraser FC, Fainstat TD. Production of congenital defects in the off-spring of pregnant mice treated with

cortisone; progress report. Pediatrics 1951; 8(4): 527-533.21: Fraser FC. Genetics of cleft lip and cleft palate. Am J Hum Genet 1970; 22: 336-352.22: Ray AK, Field LL et al. Nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate in West Bengal, India: Evidence

for autosomal major locus. Am J Hum Genet 1993; 52: 1006-1011.23: Bixler D. Genetics and clefting. Cleft Palate J 1981; 18: 10-18.24: Mitchell LE, Christensen K. Analysis of the recurrence patterns for nonsyndromic cleft lip with or without

cleft palate in families of 3073 Danish probands. Am J Med Genet 1996; 61(4): 371-376.25: Carinci F, Pezzetti F et al. Nonsyndromic cleft lip and palate: Evidence of linkage to a microsatellite marker

on 6p23. Am J Hum Genet 1995; 56: 337-339.26: Prescott NJ, Lees MM et al. Identification of susceptibility loci for nonsyndromic cleft lip with or without cleft

palate in a two stage genome scan of affected sib-pairs. Hum Genet 2000; 106(3): 345-350.27: Risch NJ. Searching for genetic determinants in the new millennium. Nature 200; 405(6788): 847-856.28: Wong FK, Hägg U. An update on the aetiology of orofacial clefts. Hong Kong Med J 2004; 10(5): 331-336.29: Stanier P, Moore G. Genetics of cleft lip and palate: Syndromic genes contribute to the incidence of non-

syndromic clefts. Hum Mol Genet 2004; 13(1): R73-R81.30: Marcano AC, Doudney et al. TBX-22 is a frequent cause of cleft palate. Am J Med Genet 2004; 41: 68-74.31: Sozen MA, Suzuki K et al. Mutation of PVRL-1 is associated with sporadic, non-syndromic cleft lip/palate in

northern Venezuela. Nat Genet 2001; 29: 141-142.32: Houdayer C, Bonaiti-Pellie C et al. Possible relationship between the van der Woude syndrome (vWS) locus

and nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate (NSCL/P). Am J Med Genet 2001; 104: 86-92.33: Zucchero T, Cooper M et al. IRF-6 is a major modifyer for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate.

Am J Hum Genet 2003; 73: A4.34: Prescott N, Garcia-Rodriguez C et al. Candidate genes in nonsyndromic cleft lip and palate. Am J Hum Genet

2003; 73: A727.35: Barrow LL, van Bokhoven et al. Analyses of the p63 gene i classical EEC syndrome, related syndromes and

non-syndromic orofacial clefts. J Med Genet 2002; 39: 559-566.

29

36: Jezewski P, Vieira A et al. Mutations in MSX-1 are associated with non-syndromic orofacial clefting. J Med Genet 2003; 40: 399-407.

37: Stanier P, Forbes SA et al. The localization of a gene causing X-linked cleft palate and ankyloglossia (CPX) in an Icelandic kindered is between DXS326 and DXYS1X. Genomics 1993; 17: 549-555.

38: Braybrook C, Doudney K et al. The T-box transcription factor gene TBX-22 is mutated in X-linked cleft palate and ankyloglossia. Nat Genet 2001; 29: 179-183.

39: Braybrook C, Lisgo S et al. Craniofacial expression of human and murine TBX-22 correlates with the cleft palate and ankyloglossia phenotype observed in CPX patients. Hum Mol Genet 2002; 11: 2793-2804.

40: Haening B, Schmidt C. Cloning and expression analysis of the chick ortholog TBX-22, thegene mutated in X-linked cleft palate and ankyloglossia. Mech Dev 2002; 117: 321-325.

41: Suzuki K, Hu D et al. Mutations of PVRL-1, encoding a cell-cell adhesion molecule/herpesvirus receptor, in cleft lip/palate-ectodermal dysplasia. Nat genet 2000; 25: 427-430.

42: Takahashi K, Nakanishi H et al. Nectin/PRR: An immunoglobulin-like cell adhesion molecule recruited to cadherin-based adherens junctions through interactions with Afadin, a PDZ domain-containing protein. J Cell Biol 1999; 145: 539-549.

43: Murray JC, Nishimura DY et al. Linkage of an autosomal clefting syndrome (Van der Woude) to loci on chromosome 1q. Am J Hum Genet 1990; 46: 486-491.

44: Lees MM, Windter RM et al. Poplietal pterygium syndrome: A clinical study of three families and report of linkage to the van der Woude syndrome locus on 1q32. J Med Genet 1999; 36: 888-892.

45: Kondo S, Schutte BC et al. Mutations in IRF-6 cause van der Woude and poplietal pterygium syndromes. Nat Genet 2002; 32: 285-289.

46: Celli J, Duijf P et al. Heterozygous germline mutations in the p53 homolog p63 are the cause of EEC syndrome. Cell 1999; 99: 143-153.

47: Vastardis H, Karimbux N et al. A human MSX-1 homeodomain missense mutation causes selective tooth agenesis. Nat Genet 1996; 13: 417-421.

48: Van den Boogaard MJ, Dorland M et al. MSX-1 mutation is assosiated with orofacial clefting and tooth agenesis in humans. Nat Genet 2000; 24: 342-343.

49:Ardinger HH, Buetow KH et al. Association of genetic variation of the transforming growth factor-alpha gene with cleft lip and palate. Am J Hum Genet 1989; 45: 348-353.

50: Mitchell LE. Transforming growth factor alpha locus and nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate: A reappraisal. Genet Epidemiol 1997; 14: 231-240.

51: Miettinen PJ, Chin Jr et al. Epidermal growth factor receptor function in necessary for normal craniofacial development and palate closure. Nat Genet 1999; 22(1): 69-73.

52: Jugessur A, Lie RT et al. Variants of developmental genes (TGF-α, TGF-β and MSX-1) and their associations with orofacial clefts: A case-parent triad analysis. Genet Epidemiol 2003; 24: 230-239.

53: Hernandez-Diaz S, Werler MM et al. Folic acid antagonists during pregnancy and the risk of birth defects. N Engl J Med 2000; 343: 1608–1614.

54: van der Put NM, Steegers-Theunissen RP et al. Mutated methylenetetrahydrofolate reductase as a risk factor for spina bifida. Lancet 1995; 346: 1070–1071.

55: Prescott NJ, Winter RM et al. Maternal MTHFR genotype contributes to the risk of non-syndromic cleft lip and palate. J Med Genet 2002; 39: 368-369.

56: van Roji IA, Vermiej-Keers C et al. Does the interaction between maternal folate intake and methylenetetrahydrofolate reductase polymorphisms affect the risk of cleft lip with or without cleft palate? Am J Epidemiol 2003; 157: 581-591.

57: Jugessur A, Wilcox AJ et al. Exploring the Effects of methylenetetrahydrofolate reductase gene variants C677T and A1298C on the risk of orofacial clefts in 261 Norwegian case-parent triads. Am J Epidemiol 2003; 157: 1083–1091.

58: Proetzel G, Pawlowski SA et al. Transforming growth factor-beta 3 is required for secondary palate fusion. Nat Genet 1995; 11: 409-414.

59: Cox TC. Taking it to the max: The genetic and developmental mechanisms coordinating midfacialmorphogenesis and dysmorphology. Clin Genet 2004; 65: 163-176.

60: Vieira AR, Orioli IM et al. MSX-1 and TGF-B3 contribute to clefting in South America. J Dent Res 2003; 82: 289-292.

61: Kim MH, Kim HJ et al. Transforming growth factor-beta3 gene SfaN1 polymorphism in Koereannonsyndromic cleft lip and palate patients. J Biochem Mol Biol 2003; 36: 533-527.

62: FitzPatrick DR, Carr IM et al. Identification of SATB-2 as the cleft palate gene on 2q32-q33. Hum Mol Genet 2003; 12: 2491-2501.

63: Beiraghi S, Zhou M et al. Identification and characterization of a novel gene disrupted by a pericentricinversion inv(4)(p13.1q21.1) in a family with cleft lip. Gene 2003; 309: 11-21.

30

64: Beiraghi S, Foroud T et al. Possible localization of a major gene for cleft lip and palate to 4q. Clin Genet 1994; 46: 255-256.

65: Yoshiura K, Machida J et al. Characterization of a novel gene disrupted by a balanced chromosomal translocation t(2;19)(q11.2;q13.3) in a family with cleft lip and palate. Genomics 1998; 54: 231-240.

66: Warkany J, Nelson RC et al. Congenital malformations induced in rats by maternal nutritional deficiency. Am J Dis Child 1943; 65: 882-894.

67: Murray JC, Daack-Hirsch S et al. Clinical and apidemiological studies of cleft lip and 68: Lasa CI, Manalo PD. Update on the occurrence rate of celft lip and palate. Phil J Surg Spec 1989; 44: 109-111.69: Cembrano JRJ, de Vera JS et al. Familial risk of recurrence of clefts of the lip and palate. Phil J Surg Spec

1995; 50: 37-40.70: Chung CD, Mi MP et al. Genetic epidemiology of cleft lip with or without cleft palate in the population of

Hawaii. Genet Epidemiol 1987; 4(6): 415-423.71: Croen LA, Shaw GM et al. Racial and ethnic variations in the prevalence of orofacial clefts in California, 1983-

1992. Am J Med Genet 1998; 79(1): 42-47.72: Christensen K, Schmidt MM et al. Absence of an environmental effect on the recurrence of facial-cleft defects.

New Engl J Med 1995; 333: 161-164.73: Wyszynski DF, Wu T. Use of US birth certificate data to estimate the risk of maternal cigarette smoking for

oral clefting. Cleft Palate Craniofac J 2002; 39: 188-192.74: Wyszynski DF, Beaty TH. Review of the role of potential teratogenes in the origin of human nonsyndromic

clefting. Teratology 1996; 53: 309-317.75: Chung KC, Kowalski CP et al. Maternal cigarette smoking during pregnancy and the risk of having a child with

cleft lip/palate. J Plast Reconstr Surg 2000; 105(2): 485-491.76: Zeiger JS, Beaty TH. Oral clefts, maternal smoking and TGFA: A meta-analysis of gene-environment

interaction. Cleft Palate Craniofac J 2005; 42(1): 58-63.77: Jugessur A, Lie RT et al. Cleft palate, transforming growth factor alpha gene variants and maternal exposures:

Assessing gene-environment interactions in case-parent triads. Genet Epidemiol 2003; 25: 367-374.78: Beaty TH, Hetmanski JB et al. Testing candidate genes for non-syndromic oral clefts using a case-parent trio

design. Genet Epidemiol 2002; 22: 1-11.79: Munger RG, Romiti PA et al. Maternal alcohol use and the risk of orofacial cleft birth defects. Teratology

1996; 54: 27-33.80: Lorente C, Cordier S et al. Tobacco and alcohol use during pregnancy end risk of oral clefts. Occupational

exposure and congenital malformation working group. Am J Public Health 2000; 90: 415-419.81: Shaw GM, Nelson V et al. Maternal periconceptional vitamins: Interactions with selected factors and

congenital anomalies? Epidemiology 2002; 13: 625-630.82: Tolarova M, Harris J. Reduced occurrence of orofacial clefts after supplementation with high-dose folic acid

and multivitamins. Teratology 1995; 51: 71-78.83: Hartridge T, Illing HM et al. The role of folic acid in oral clefting. Brit J Orthodontics 1999; 26: 115-120.84: Wong WY, Eskes TK et al. Nonsyndromic orofacial clefts: Association with maternal hyperhomocysteinemia.

Teratology 1999; 60: 253-257.85: Ray JG, Meier C et al. Association between folic acid fortification and congenital orofacial clefts. J Pediatr

2003; 143: 805-807.86: Azarbayjani F, Danielsson BR: Phenytoin-induced cleft lip and palate: Evidence for embryonic cardiac

bradyarrhythmia due to inhibition of delayed recftifier K+ channels resulting in hypoxia-reoxygenation damage. Teratology 2001; 63: 152-160.

87: Hill L, Murphy M et al. Maternal drug histories and congenital malformations: Limb reduction defects and oral clefts. J Epidemiol Community Health 1988; 42: 1-7.

88: Wyszynski DF, Beaty TH. Review of the role of potential teratogenes in the origin of human nonsyndromicoral clefts. Teratology 1996; 53: 309-317.

89: Park-Wyllie L, Mazzotta P et al.: Birth defects after maternal exposure to corticosteroids: Prospective cohort study and meta-analysis of epidemiological studies. Teratology 2000; 62: 385-392.

90: Horie S, Yasuda M: Alterations in palatal ruga patterns in Jc1:ICR mouse fetuses from dams treated with all-trans-retinoic acid. Hiroshima J Med Sci 2001; 50: 17-25.

91: Aberg A, Westbom L et al: Congenital malformations among infants whose mothers had gestational diabetes or preexisting diabetes. Early Hum Dev 2001; 61: 85-95.

92: James WH: Are oral clefts a consequence of maternal hormone imbalance? Evidence from the sex ratios of sibs of probands. Teratology 2000; 62: 342-345.

93: Schneider RA, Helms JA. The cellular and molecular origins of beak morphology. Science 2003: 299(5606): 565-568.

94: Couly G, Creuzet S et al. Interactions between Hox-negative cephalic neural crest cells and the foregut endoderm in patterning the facial skeleton in the vertebrate head. Development 2002: 129(4): 1061-1073.

31

95: Hu D, Marcucio RS et al. A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development 2003: 130(9): 1749-1758.

96: Richman JM, Lee SH. About face: Signals and genes controlling jaw patterning and identity in vertebrates. Bioessays 2003; 25(6): 554-568.

97: Francis-West PH, Robson L et al. Craniofacial development: The tissue and molecular interactions that control development of the head. Adv anat Ebryol Cell Biol 2003; 169: 1-138.

98: Rosenblatt J, Raff MC et al. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbours to extrude it by and actin- and myosin-dependent mechanism. Curr Biol 2001; 11(23): 1847-1857.

99: Cecconi F, Alvarez-Bolado G et al. Apaf-1 (CED-4 homolog) regulates programmed cell death in mammalian development. Cell 1998; 94(6): 727-737.

100: Gong SG, Guo C. Bmp4 gene is expressed at the putative site of fusion in the midfacial region. Differentiation 2003; 71(3): 228-236.

101: Ashique AM, Fu K et al. Endogenous bone morphogenetic proteins regulate outgrowth and epithelial survival during avian lip fusion. Development 2002; 129(19): 4647-4660.

102: Smith A, Graham A. Restricting Bmp-4 mediated apoptosis in hindbrain neural crest. Dev Dyn 2001; 220(3): 276-283.

103: Sela-Donenfeld D, Kalcheim C. Regulation of the onset of neural crest migration by coordinated activity of BMP4 and Noggin in the dorsal neural tube. Development 1999; 126(21): 4749-4762.

104: Yu M, Wu P et al. The morphogenesis of feathers. Nature 2002; 420(6913): 308-312.105: Testaz S, Jarov A et al. Sonic hedgehog restricts adhesion and migration of neural crest cells independently of

the Patched- Smoothened-Gli signaling pathway. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98(22): 12521-12526.106: Jarov A, Williams KP et al. A dual role for Sonic hedgehog in regulating adhesion and differentiation of

neuroepithelial cells. Dev Biol 2003; 261(2): 520-536.107: Chapman RS, Duff EK et al. A novel role for IRF-1 as a suppressor of apoptosis. Oncogene 2000; 19(54):

6386-6391.108: Eroshkin A, Mushegian A. Conserved transactivation domain shared by interferon regulatory factors and Smad

morphogens. J Mol Med 1999; 77(5): 403-405.109: van Bokhoven H, Brunner HG. Splitting p63. Am J Hum Genet 2002; 71(1): 1-13.110: Bakkers J, Hild M et al. Zebrafish DeltaNp63 is a direct target of Bmp signaling and encodes a transcriptional

repressor blocking neural specification in the ventral ectoderm. Dev Cell 2002; 2(5): 617-27.111: Millicovsky G, Johnston MC. Active role of embryonic facial epithelium: New evidence of cellular events in

morphogenesis. J Embryol Exp Morphol 1981; 63: 53-66.112: Martinez-Alvarez C, Bonelli R et al. Bulging medial edge epithelial cells and palatal fusion. Int J Dev Biol

2000; 44(3): 331-335.113: Yee GW, Abbott UK. Facial development in normal and mutant chick embryos. I. Scanning electron

microscopy of primary palate formation. J Exp Zool 1978; 206(3): 307–321.114: Kawakatsu T, Shimizu et al. Trans-interactions of nectins induce formation of filopodia and lamellipodia

through the respective activation of Cdc42 and Rac small G proteins. J Biol Chem 2002; 277(52): 50749-50755.

115: Lopez M, Cocchi F et al. Novel, soluble isoform of the herpes simplex virus (HSV) receptor nectin-1 (or PRR1-HIgR-HveC) modulates positively and negatively susceptibility to HSV infection. J Virol 2001; 75(12): 5684-5691.

116: Kim DY, Ingano LA et al. Nectin-1alpha, an immunoglobulin-like receptor involved in the formation of synapses, is a substrate for presenilin/gamma-secretase-like cleavage. J Biol Chem 2002; 277(51): 49976-49981.

117: Tanaka Y, Irie K et al. Ectodomain shedding of nectin-1alpha by SF/HGF and TPA in MDCK cells. BiochemBiophys Res Commun 2002; 299(3): 472-478.

118: Diewert VM, Wang KY. Recent advances in primary palate and midface morphogenesis research. Crit Rev Oral Biol Med 1992; 4(1): 111-130.

32

Figurer og tabeller

Fig. 1.1-1.6: Modifisert fra Carlson BM. Human embryology & developmental biology third edition. Mosby Inc. publishing 2004.

Fig. 2.1: Modifisert fra Carlson BM. Human embryology & developmental biology third edition. Mosby Inc. publishing 2004.

Fig. 2.2 A,B,C: Carlson BM. Human embryology & developmental biology third edition. Mosby Inc. publishing 2004.

Fig. 2.2 D: Schutte BC, Murray JC. The many faces and factors of orrofacial clefts. Hum Mol Genet 1999; 8(10): 1853-1859.

Fig. 2.2 E: Google billedsøk på ”bifid uvula photography.”Fig. 4.1: Egenprodusert, basert på figur fra Thornthon JB, Nimer S et al. The incidence, classification,

etiology and embryology of oral clefts. Seminars in orthodontics 1996; 2(3): 162-168.Fig. 6.1: Modifisert fra Carlson BM. Human embryology & developmental biology third edition. Mosby

Inc. publishing 2004.Fig. 6.2-6.4: Modifisert fra Cox TC. Taking it to the max: The genetic and developmental mechanisms

coordinating midfacial morphogenesis and dysmorphology. Clin Genet 2004; 65: 163-176.

Tab. 2.1: Egenprodusert, basert på informasjon i hovedteksten.Tab. 3.1: Egenprodusert, basert på informasjon i hovedteksten.Tab. 4.1: Modifisert fra Cobourne, MT. The complex genetics of cleft lip and palate. Eur J

Orthodontics 2004; 26(1): 7-16.Tab. 4.2: Basert på informasjon i artiklene tabellen angir.Tab. 4.3: Modifisert fra Wong FK, Hägg U. An update on the aetiology of orofacial clefts.Hong

Kong Med J 2004; 10(5): 331-336.

33