LEPTOSPIROSE

DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

Z O O N O S E S E A D M I N I S T R A Ç Ã O S A N I T Á R I A E M S A Ú D E P Ú B L I C A

1. PESQUISA DIRETA DE ESPIROQUETA

• Urina / Soro / LCR

• Visualização de espiroquetas – lâmina – microscópio de

campo escuro (objetivas: 10x e 20x)

• Resultado:

• Soro: encontrar uma ou mais espiroquetas características

por morfologia e movimentos: ESPIROQUETEMIA

• Não encontrar espiroquetas: AUSÊNCIA DE

ESPIROQUETEMIA NA AMOSTRA ANALISADA

• Urina: ESPIROQUETÚRIA / AUSÊNCIA DE

ESPIROQUETÚRIA

2. SOROLOGIA PARA LEPTOSPIROSE TRIAGEM

TESTE DA SOROAGLUTINAÇÃOMICROSCÓPICA (MAT)

SOROAGLUTINAÇÃO

• Leptospiras (antígeno) sofrem aglutinação na presença dos

anticorpos no soro

Negativo Positivo

MATERIAL

• Microplaca = 96 poços

• Luvas / jaleco

• Lâmina de vidro

• Micropipetas (mono e multicanal)

• Ponteiras

• Tubos de vidro (tampa) – diluição soro e cultura

• Descarte: hipoclorito sódio 5% ou pinho-sol 1:256

MATERIAL

• Cultura de leptospiras (sorovares)

• Bateria de culturas da OMS + isolados locais (antígenos)

• Meio de cultura líquido: EMJH

• Solução salina fisiológica (0,85%)

• Soros a testar

• Ex: bateria de cultura

• Sorogrupo: Grippotyphosa / Sorovares: grippotyphosa (8)

• Sorogrupo: Icterohaemorragie / Sorovares: copenhagi (10A);

lai (10G)

MATERIAL

• Controles Positivos e negativos

• Controle positivo: soro positivo (Acs contra leptospira) mais de

um sorovar

• Controle negativo interno (sem soro) – 20µL Ag + 20µL sol. salina

• Microscópio de campo escuro (objetivas 10x, 20x e 40x)

• Estufa 30ºC

PONTO DE CORTE POR ESPÉCIE

• Considerar reação positiva na sorologia de triagem (título)

• Humano e caninos domiciliados: 1/25

• Sinais: 2 a 3 dpi médico

• Dono do cão – visualiza início dos sinais clínicos

• Bovinos: 1/100

• Aborto – ajuda veterinário (tempo maior – produção maior de Acs)

• Janela imunológica – tempo que o sistema imune necessita para produzir

Acs em nível suficiente para ser detectado

SOROVARES - OMS

• Usar um sorovar de cada sorogrupo (no mínimo)

• Sorovares locais

• Sorovares de mesmo sorogrupo: determinantes

antigênicos comuns reação cruzada entre sorovares

• Também pode ocorrer reação cruzada entre

sorogrupos diferentes

CULTURA DE SOROVARESDE LEPTOSPIRA

• Tubo com cultura de leptospiras (meio líquido EMJH)

• Olhar contra a luz – contaminação

• Densidade (quantidade de leptospiras)

• 1 gota lâmina: MCE – contagem (verificar o nº lept. por campo, se

há auto-aglutinação)

• Repique semanal: 10% volume para outro tubo

2 a 3 dias (30°C)

• Usar como antígeno no teste: 7 a 14 dias no meio

PREPARO DA MICROPLACA

• Poços da primeira linha (A) – colocar o controle

negativo interno do teste (antígeno = cultura de

leptospira e solução salina)

• 20 µL Ag + 20 µL sol.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A Ag

1

Ag

2

Ag

3

Ag

4

B

C

D

E

F

G

H

Linha A: colocar o Ag diluído em salina (diferentes sorovares em cada poço)

20 µL sol. salina + 20 µL do AgCONTROLE NEGATIVO INTERNO (sem soro)

PREPARO DO SORO A SER TESTADO

• Diluição do soro – sempre a metade do ponto de corte da leitura

do resultado.

• Humano ou cão domiciliado: diluição do soro adicionado à

microplaca: 1: 12,5

• Bovino: 1: 50

• Quando se adiciona o Ag, volume final no poço da microplaca

dobra, e assim, a diluição também dobra (1:25 e 1:100)

DILUIÇÃO DO SORO A TESTAR

• Primeiro faz a diluição inicial 1:5

• 100 µL do soro em 400 µL de solução salina

100 µL do soro teste 400 µL salina

Soro diluído 1:5

DILUIÇÃO DO SORO A TESTAR• Em seguida, faz a segunda diluição: a partir da diluição 1:5.

• A segunda diluição é metade do valor da diluição de leitura no teste

• Ex: Leitura 1:25 Diluição do soro: 1:12,5 (Humano, cão)

Diluição 1:12,5400 µL do soro diluído 1:5 +

600µL salina

Soro diluído 1:5

DILUIÇÃO DO SORO A TESTAR

• Segunda diluição: a partir da diluição 1:5

• Leitura 1:100 Diluição do soro: 1:50 (bovino)

Diluição 1:50200 µL do soro diluído 1:5 +

1800 µL salinaSoro diluído 1:5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A Ag

1

Ag

2

Ag

3

Ag

4

B

C

D

E

F

G

H

CONTROLE NEGATIVO INTERNO (sem soro)

Cada linha B até H: Soro a testarB = soro do bovino 1C = soro do bovino 2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A Ag

1

Ag

2

Ag

3

Ag

4

B

C

D

E

F

G

H

CONTROLE NEGATIVO INTERNO (sem soro)

Cada linha B até H: Soro a testarB = soro do bovino 1C = soro do bovino 2

• Agitar a placa agitador de placa para homogeneizar

• Incubar em estufa a 30ºC por 1 a 3 horas

LEITURA DOS RESULTADOS APÓS INCUBAÇÃO

• Agitar a placa agitador de placas

• Estufa 30°C por 1 a duas horas

• Leitura dos resultados: microscópio de campo escuro

– visualizar se há aglutinação (Ag + Acs – soro)

LEITURA DO RESULTADO EM MICROSCÓPIO DE CAMPO ESCURO

1ª gota – controle negativo interno (sem soro) = Ag com leptospiras livres

Verificar se não há aglutinação nas leptospiras do antígeno (auto-aglutinação)Comparar o controle negativo interno com os soros a testar

1 gota (3 a 5 µL) – placaObjetiva de 10 xTempo de leitura não > 1,5 hora

Soros a testar

• Reação positiva para aglutinação: redução maior que 50% das leptospiras vivas (livres)

• Aglutinação em mais de 50% • Redução da densidade do Ag = aglutinação

Negativo Positivo

Soro (anticorpos) + antígeno (leptospiras)

RESULTADO

• Resultado: não é o título final do soro do bovino!

• Informa apenas: reação positiva ou negativa (título é fixo no teste) para um sorovar

• Teste de triagem: indica a presença de Acs no soro, mas não necessariamente a presença da doença

• Soros reagentes na triagem sorologia / titulação

3. TESTE DA SOROAGLUTINAÇÃO

MICROSCÓPICA

TITULAÇÃO

TITULAÇÃO

• Testar o soro com sorovares que apresentaram reação positiva (aglutinação) no teste de triagem

• Usar apenas os sorovares que reagiram com o soro teste na sorologia de triagem

• Diluição seriada nos soros a testar (diluições dobradas)

• Indica a titulação real do animal/pessoa

TITULAÇÃO

• Soro humano

• 1:25

• 1:50

• 1:100

• 1:200

• 1:400

• 1:800

• 1:1600

Soro bovino

1:100

1:200

1:400

1:800

1:1.600

1:3.200

1:6.400

MONTAGEM DA MICROPLACA

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A Ag 1 Ag

2

Ag

3

Ag

4

B 1:25

C 1:50

D 1:100

E 1:200

F 1:400

G 1:800

H 1:1600

CONTROLE NEGATIVO INTERNO (sem soro)

Em cada pocinho da primeira linha (por coluna) Antígeno ( 20µL de sol. Salina + : 20µL do Ag) = controle negativo interno

Cada coluna (B até H): um soro a testar para cada sorovar (Ag)Cada linha é uma diluição do soro teste (diluições seriadas)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A Ag 1 Ag

2

Ag

3

Ag

4

B 1:25

C 1:50

D 1:100

E 1:200

F 1:400

G 1:800

H 1:1600

CONTROLE NEGATIVO (sem soro)

Em cada pocinho da primeira linha (por coluna) Antígeno ( 20µL de sol. Salina + : 20µL do Ag)

1º: Cada coluna (C até H): 20µL de sol. Salina2º: Poço B: 40 µL do soro diluído 1:12,5 (sem salina)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A Ag 1 Ag

2

Ag

3

Ag

4

B 1:25

C 1:50

D 1:100

E 1:200

F 1:400

G 1:800

H 1:1600

Diluição seriada do soro teste:20 µL soro 1:12,5 (B) Poço C (1:25) Poço D (1:50) Poço E (1:100) Poço F (1:200) Poço G (1:400) Poço H (1:800) desprezar 20 µL finais

Adicionar 20 µL do Ag (cultura de sorovar de leptospira mantido em tubo de vidro com meio de cultura EMJH) em cada poço com soro dobro o volume contido no poço dobro a diluição alcança o título de leitura do soro

LEITURA DOS RESULTADOS

• Agitar a placa agitador de placas

• Estufa 30°C por 1 a duas horas

• Leitura

• Microscópio de campo escuro – visualizar se há

aglutinação (Ag + Acs – soro)

LEITURA DO RESULTADO EM MICROSCÓPIO DE CAMPO ESCURO

1ª gota – controle negativo (sem soro)

Cultura de leptospiras

Se não há aglutinaçãoComparar com os soros a testar

1 gota (3 a 5 µL) – placaObjetiva de 10 x ou 20XTempo de leitura não > 1,5 hora

Soros a testar

1:25

1:50

1:100

1:200

1:400

1:800

1:1600

RESULTADOS• Fechar diagnóstico: Clínica + Epidemiológico + Título

• Bovino: Aborto + Roedores/Aguada + título > 1:400

• Sorovar infectante: título mais alto

• 2 sorovares com mesmo título: resultado positivo para os dois títulos

(reação cruzada ou infecção pelo 2)

• Diluir mais o soro descobrir qual desses 2 sorovares é infectante

(título mais alto)

• Ou infecção por um sorovar não existente na bateria

RESULTADOS

• Diferenciar sorovar: estudos epidemiológicos ou vacinação

• Para clínica não interessa: tratamento é o mesmo

• Título vacinal: bovino até 6 meses pós vacinação

• Título 1:400

• Perguntar: quando foi a vacinação, para quais sorovares

• Sem clínica nem evidência epidemiológica = vacinal

RESULTADOS

• Título vacinal: bovino até 6 meses pós vacinação

• Título 1:400

• Tem clínica + epidemiológico

• Título alto de sorovar diferente do encontrado na

vacina doença

RESULTADOS

• Ideal é fazer diagnóstico sorológico populacional

• Amostra representativa:

• Animais que abortaram (3-4 dias após aborto – queda imunidade –

sem Acs) + outras categorias

• Títulos altos e baixos

• Vaca aborto + > 1:400 infectado (não precisa novo teste)

• 1:100 (início ou fim infecção0 7-10 dias (PI: 2-14 dias, média 7 d)

nova coleta soroconversão