8/3/2019 Leroy F. Liu, Luke Perkocha, Richard Calendar and James C. Wang- Knotted DNA from bacteriophage capsids

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P r o c . N a t L A c a d . S c i . U S AV o l . 7 8 , N o . 9 , p p . 5 4 9 8 - 5 5 0 2 , S e p t e m b e r 1 9 8 1B i o c h e m i s t r y

K n o t t e d DNA f r o m b a c t e r i o p h a g e c a p s i d s( b a c t e r i o p h a g e P 2 / D N A p a c k a g i n g / D N A t o p o i s o m e r a s e s )

L E R O Y F . L I u * , LUKE P E R K O C H A t , RICHARD C A L E N D A R t , AND JAMES C . WANGt* D e p a r t m e n t o f P h y s i o l o g i c a l C h e m i s t r y , J o h n s H o p k i n s M e d i c a l S c h o o l , B a l t i m o r e , M a r y l a n d 2 1 2 0 5 ; t D e p a r t m e n t o f M o l e c u l a r B i o l o g y , U n i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a ,B e r k e l e y , C a l i f o r n i a 9 4 7 2 0 ; Me B i o l o g i c a l L a b o r a t o r i e s , H a r v a r d U n i v e r s i t y , C a m b r i d g e , M a s s a c h u s e t t s 0 2 1 3 8C o m m u n i c a t e d b y R o b e r t L . B a l d w i n , J u n e 9 , 1 9 8 1A B S T R A C T T h e m a j o r i t y o f t h e DNA p r e p a r e d f r o m t a i l l e s sc a p s i d s o f b a c t e r i o p h a g e P 2 b y t h e p h e n o l e x t r a c t i o n p r o c e d u r ec o n s i s t s o f m o n o m e r i c r i n g s t h a t h a v e t h e i r c o h e s i v e e n d s j o i n e d .E l e c t r o n m i c r o s c o p i c a n d u l t r a c e n t r i f u g a l s t u d i e s i n d i c a t e t h a tt h e s e m o l e c u l e s h a v e a c o m p l e x s t r u c t u r e t h a t i s t o p o l o g i c a l l y k n o t -t e d ; t h e y h a v e a m o r e c o m p a c t a p p e a r a n c e a n d a h i g h e r s e d i -m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t w h e n c o m p a r e d w i t h r e g u l a r n i c k e d P 2DNA r i n g s . L i n e a r i z a t i o n o f t h e s e r i n g s b y t h e r m a l d i s s o c i a t i o no r r e p a i r o f t h e c o h e s i v e e n d s b y DNA p o l y m e r a s e I i n t h e p r e s -e n c e o f a l l f o u r d e o x y n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e s g i v e s m o l e c u l e s t h a ta r e i n d i s t i n g u i s h a b l e f r o m n o r m a l P 2 D NA t h a t h a s b e e n s i m i l a r l yt r e a t e d . T h e k n o t t e d n a t u r e o f t h e m a j o r i t y o f P 2 h e a d D NA i sf u r t h e r s u p p o r t e d b y a n a l y z i n g t h e p r o d u c t s w h e n t h e s e m o l e c u l e sa r e t r e a t e d w i t h l i g a s e a n d t h e l i g a s e - t r e a t e d m o l e c u l e s a r e s u b -s e q u e n t l y n i c k e d r a n d o m l y w i t h D N a s e I . T h e d a t a a r e c o n s i s t e n tw i t h t h e n o t i o n t h a t , i f s u c h a m o l e c u l e i s f i r s t c o n v e r t e d t o a f o r mt h a t c o n t a i n s o n l y o n e s i n g l e - c h a i n s c i s s i o n p e r m o l e c u l e , s t r a n ds e p a r a t i o n g i v e s a l i n e a r s t r a n d a n d a h i g h l y k n o t t e d s i n g l e -s t r a n d e d r i n g . T h e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e D NA p a c k a g e d i n t a i l -l e s s P 2 c a p s i d s i s a r r a n g e d i n a w a y t h a t l e a d s t o t h e f o r m a t i o n o fa c o m p l e x k n o t w h e n t h e e n d s j o i n . I n a n i n t a c t p h a g e p a r t i c l e , t h ea n c h o r i n g o f o n e t e r m i n u s o f t h e D NA t o t h e h e a d - p r o x i m a l e n do f t h e t a i l [ C h a t t o r a j , D . K . & I n m a n , R . B . ( 1 9 7 4 ) J . M o L B i o L8 7 , 1 1 - 2 2 ] p r e s u m a b l y d i m i n i s h e s o r p r e v e n t s t h i s k i n d o f j o i n i n g .T h e n o v e l k n o t t e d D NA c a n b e u s e d t o a s s a y t y p e I I DNA t o p o -i s o m e r a s e s t h a t b r e a k a n d r e j o i n D NA i n a d o u b l e - s t r a n d e df a s h i o n .M a t u r e P 2 p h a g e D NA c o n s i s t s o f d o u b l e - s t r a n d e d m o l e c u l e s3 3 k i l o b a s e s l o n g ( 1 , 2 ) w i t h 1 9 - b a s e c o h e s i v e e n d s ( 3 , 4 ) t h a ta l l o w t h e f o r m a t i o n o f c i r c u l a r a n d c o n c a t e m e r i c m o l e c u l e s i ns o l u t i o n ( 1 , 2 ) . P 2 p h a g e p r e p a r a t i o n s t y p i c a l l y c o n t a i n e q u a lp r o p o r t i o n s o f v i a b l e p h a g e p a r t i c l e s a n d t a i l l e s s D N A - c o n t a i n -i n g c a p s i d s ( h e a d s ) ( 5 ) . T h e t w o c o h e s i v e e n d s o f t h e P 2 DNAi n t h e m a t u r e p h a g e a r e n o t h y d r o g e n b o n d e d a n d a r e a s y m -m e t r i c a l l y o r i e n t e d w i t h t h e l e f t e n d a n c h o r e d o n t h e h e a d -p r o x i m a l e n d o f t h e t a i l ( 6 ) . W h e n D NA i s e x t r a c t e d f r o m a c o n -c e n t r a t e d p r e p a r a t i o n o f m a t u r e P 2 p h a g e , a v i s c o u s s o l u t i o ni s o b t a i n e d , d u e t o t h e f o r m a t i o n o f h y d r o g e n - b o n d e d c o n c a -t e m e r s v i a p a i r i n g o f t h e c o h e s i v e e n d s ( 1 ) . We o b s e r v e d , h o w -e v e r , t h a t D NA e x t r a c t e d f r o m c o n c e n t r a t e d P 2 h e a d s i s m u c hl e s s v i s c o u s t h a n t h e c o r r e s p o n d i n g D NA f r o m m a t u r e p h a g ep a r t i c l e s . I n t h i s c o m m u n i c a t i o n , w e p r e s e n t e v i d e n c e t h a t t h eD NA f r o m t a i l l e s s c a p s i d s ( h e n c e f o r t h r e f e r r e d t o a s h e a d D N A )r e p r e s e n t s a n o v e l c l a s s o f t o p o l o g i c a l i s o m e r s o f h y d r o g e n -b o n d e d m o n o m e r i c c i r c u l a r P 2 DNA. T h e a p p a r e n t l o w v i s -c o s i t y o f h e a d D NA r e l a t i v e t o t h a t o f D NA f r o m m a t u r e p h a g e s( h e n c e f o r t h r e f e r r e d t o a s p h a g e D N A ) i s d u e t o t h e p r e s e n c eo f c o m p l e x t o p o l o g i c a l k n o t s .

MATERIALS A ND M E T H O D SB a c t e r i a a n d B a c t e r i o p h a g e s . E s c h e r i c h i a c o l i C s t r a i n s C -l a ( 7 ) a n d C - 5 2 0 ( 8 ) , c a r r y i n g t h e a m b e r s u p p r e s s o r s u p D, w e r eu s e d a s h o s t s t o g r o w s t o c k s o f p h a g e P 2 . T h e p h a g e u s e d w e r et h e c l e a r p l a q u e m u t a n t P 2 y i r l ( 9 ) ; t h e t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v eh e a d - f i n i s h i n g m u t a n t P 2 v i r 2 2 L t s 3 7 , w h i c h c a r r i e s a 1 . 5 - k i l -

o b a s e d e l e t i o n ( 1 0 - 1 2 ) ; a n d t h e l y s i s - d e f i c i e n t a m b e r m u t a n tP 2 v i r l a m l 2 ( 1 3 ) . P h a g e s t o c k s w e r e p r e p a r e d a s d e s c r i b e d b yL e n g y e l e t a L ( 1 4 ) i n L B b r o t h ( 1 5 ) / 2 mM M g C L 2 / 0 . 5 mMC a C l 2 . T h e p h a g e p r e p a r a t i o n s w e r e p r e c i p i t a t e d w i t h 1 0 %p o l y e t h y l e n e g l y c o l a n d t h e n s u s p e n d e d i n P b u f f e r ( 1 4 ) a n di n c u b a t e d a t 3 7 0 C f o r 3 0 m i n t o d i g e s t f r e e D N A . T h e r e a f t e r ,d e b r i s w a s r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n ( 1 3 ) . C s C l w a s a d d e d t oa d e n s i t y o f 1 . 4 2 g c m - ' , a n d t h e s o l u t i o n w a s c e n t r i f u g e d t os e d i m e n t a t i o n e q u i l i b r i u m ( 1 4 ) . T w o b a n d s , t h e d e n s e r o n ec o n t a i n i n g t h e t a i l l e s s c a p s i d s a n d t h e l i g h t e r o n e c o n t a i n i n g t h ev i a b l e p h a g e , w e r e v i s i b l e d u e t o l i g h t s c a t t e r i n g . E a c h b a n dw a s c o l l e c t e d s e p a r a t e l y b y p u n c t u r i n g t h e s i d e o f t h e c e n t r i f u g et u b e w i t h a s y r i n g e . T h e p h a g e a n d c a p s i d s w e r e t h e n c e n t r i -f u g e d s e p a r a t e l y t o o b t a i n h i g h e r p u r i t y a n d c o n c e n t r a t i o n .C s C l w a s r e m o v e d f r o m t h e p u r i f i e d p h a g e b y d i a l y s i s a g a i n s tP b u f f e r .D NA E x t r a c t i o n . D NA w a s e x t r a c t e d f r o m p h a g e o r h e a d sa t A a w = 5 - 1 5 , u s i n g b u f f e r - s a t u r a t e d p h e n o l ( 1 6 ) . T h e a q u e o u sp h a s e w a s d i a l y z e d a g a i n s t s t e r i l e 1 0 mM T r i s - H C I / 5 0 mMN a C l / 1 0 0 , u M E D T A , pH 8 . 0 .E n z y m a t i c R e a g e n t s . P r o n a s e ( C a l b i o c h e m ) a n d f u n g a l p r o -t e i n a s e K ( M e r c k ) w e r e p r e p a r e d a t 2 0 m g / m l i n 1 0 mMT r i s - H C l , pH 8 . 0 , a n d a u t o d i g e s t e d a t 3 7 0 C f o r 9 0 m i n b e f o r eu s e . R i b o n u c l e a s e A ( C a l b i o c h e m ) w a s p r e p a r e d a t 1 0 m g / m li n 1 0 mMT r i s . H C l / 0 . 1 mM E D T A , pH 8 . 0 , a n d h e a t e d a t 8 0 0 Cf o r 1 0 m i n b e f o r e u s e t o i n a c t i v a t e D N a s e . D NA p o l y m e r a s eI f r o m E . c o l i ( 1 7 ) w a s t h e g i f t o f A . K o r n b e r g . P u r i f i e d E . c o l iD NA l i g a s e ( 1 8 ) w a s t h e g i f t o f P . M o d r i c h . D N a s e I w a s p u r -c h a s e d f r o m W o r t h i n g t o n . B o v i n e p l a s m a a l b u m i n a n d N A D 'w e r e f r o m C a l b i o c h e m .A n a l y t i c a l U l t r a c e n t r i f u g a t i o n . B a n d s e d i m e n t a t i o n w a sp e r f o r m e d w i t h 3 0 - 4 0 p 1 o f s a m p l e a n d r e f e r e n c e s o l u t i o n s i nt y p e I I I 3 0 - m m d o u b l e - s e c t o r c e n t e r p i e c e s ( 1 9 ) . T h e b u l k s e d i -m e n t a t i o n m e d i u m w a s 3 M C s C l / 1 0 mM N a 3 E D T A ( n e u t r a l3 M C s C l ) o r 3 M C s C V 1 0 0 mM K O H / 1 0 mM N a 3 E D T A ( a l -k a l i n e 3 M C s C l ) . C e n t r i f u g a t i o n w a s a t 2 0 , 0 0 0 r p m a n d 2 0 0 Ci n a m o d e l E ( S p i n c o ) a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g e e q u i p p e d w i t ha p h o t o e l e c t r i c s c a n n e r . T h e s e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t s m e a -s u r e d w e r e n o t c o r r e c t e d f o r b u o y a n c y o r v i s c o s i t y e f f e c t s . C s C ld e n s i t y - g r a d i e n t e q u i l i b r i u m c e n t r i f u g a t i o n w a s p e r f o r m e d i n12-mm d o u b l e - s e c t o r c e l l s a t 3 9 , 0 0 0 r p m a n d 2 0 0 C f o r a m i n -i m u m o f 6 0 h r . M i c r o c o c c u s l u t e u s D NA w a s u s e d a s a d e n s i t ym a r k e r ( p = 1 . 7 3 3 g c m 3 ) .E l e c t r o n M i c r o s c o p y . D NA m o l e c u l e s w e r e v i s u a l i z e d i n a

5 4 9 8

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e -m e n t " i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .

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P r o c . N a t L A c a d . S c i . USA 7 8 ( 1 9 8 1 ) 5 4 9 9P h i l i p s 2 0 1 e l e c t r o n m i c r o s c o p e a t 2 0 , 0 0 0 - f o l d m a g n i f i c a t i o n .T h e a q u e o u s s p r e a d i n g p r o c e d u r e o f D a v i s e t a l ( 2 0 ) w a s u s e du n l e s s s p e c i f i e d o t h e r w i s e .D NA L i g a s e R e a c t i o n . T w e n t y m i c r o g r a m s o f p h a g e o r h e a dD NA a n d 0 . 8 u n i t o f D NA l i g a s e w e r e i n c u b a t e d f o r 2 0 m i n a t3 0 0 C i n 1 5 0 A l o f 7 IM N A D + / 1 mM M g C l 2 / 5 mM T r i s H C l ,pH 8 . 0 / 5 0 , A M N a 3 E D T A c o n t a i n i n g b o v i n e p l a s m a a l b u m i na t 0 . 1 m g / m l . T h e r e a c t i o n w a s s t o p p e d b y h e a t i n g a t 6 5 0 C f o r5 m i n .D N a s e I - T r e a t m e n t o f L i g a t e d D N A . F o u r m i c r o l i t e r s o fD N a s e I ( 4 A g / m l ) w a s a d d e d t o t h e a b o v e m i x t u r e a n d i n c u -b a t e d a t 2 2 0 C . F i f t e e n - m i c r o l i t e r s a m p l e s w e r e w i t h dr a wn a tt h e t i m e s i n d i c a t e d i n F i g . 5 , a n d t h e r e a c t i o n w a s s t o p p e d b ya d d i t i o n o f 1 5 / u l o f 4 M N a C I / 2 0 mM N a 3 E D T A .D NA P o l y m e r a s e I R e a c t i o n . T w o m i c r o g r a m s o f P 2 D NAw a s t r e a t e d w i t h 0 . 0 0 2 u n i t o f D NA p o l y m e r a s e I i n 3 0 & l o f5 mM M g C l 2 / 3 0 mM N a C V 3 mM T r i s H C l , p H 8 . 0 / 1 0 0 I MN a 3 E D T A c o n t a i n i n g e a c h o f t h e f o u r d e o x y r i b o n u c l e o s i d e t r i -p h o s p h a t e s a t 2 5 , u M . I n c u b a t i o n w a s f o r 1 5 m i n a t 3 7 0 C ; t h i sw a s f o l l o w e d b y a d d i t i o n o f 3 0 1 4 o f 4 ' M N a C V 2 0 mMN a 3 E D T A t o s t o p t h e r e a c t i o n .T r e a t m e n t o f C o n d e n s e d D NA w i t h P r o t e a s e s a n d R N a s eA . D NA f r o m t a i l l e s s c a p s i d s ( 0 . 5 A g ) w a s t r e a t e d w i t h 1 2 0 Z go f P r o n a s e o r 1 2 0 j u g o f p r o t e i n a s e K o r 6 0 j i g o f R N a s e A ' f o r3 0 m i n a t 37C i n 6 0 ' j u 1 o f 5 0 mM N a C V 1 0 m M ' T r i s H C l , pH8 . 0 / 1 0 mM N a 3 E D T A . T h e r e a c t i o n s w e r e t e r m i n a t e d b y c h i l l -i n g t o 0 0 C a n d b y a d d i n g 6 0 A l o f 4 M N a C V 2 0 mM N a 3 E D T A .

RESULTST h e a p p e a r a n c e o f P 2 H e a d D NA a s a C o n d e n s e d F o r m .D NA w a s e x t r a c t e d f r o m P 2 v i r 2 2 L t s 3 7 h e a d s p r e p a r e d f r o m

a p h a g e s t o c k g r o w n a t p e r m i s s i v e t e m p e r a t u r e . T h i s D NA w a ss p r e a d i n c y t o c h r o m e c b y t h e a q u e o u s m e t h o d ( F i g . 1 ) ( 2 0 ) , a n dm o l e c u l e s o f a b o u t P 2 m o n o m e r l e n g t h w e r e o b s e r v e d . S i x t y -n i n e o u t o f 1 0 0 m o l e c u l e s w e r e h i g h l y c o n d e n s e d , w i t h n o v i s -i b l e e n d s a n d t h r e e o r m o r e l o o p s p r o t r u d i n g f r o m a c e n t r a lr e g i o n ( F i g . 1 ) . T h e c e n t r a l r e g i o n u s u a l l y c o n t a i n e d a d a r k s p o t .T h e r e m a i n i n g D NA c o n s i s t e d o f 2 0 n o n c o n d e n s e d c i r c u l a rm o l e c u l e s a n d 1 1 l i n e a r m o n o m e r s . T h e c o n d e n s e d D N A f o r m sa r e 2 2 % s h o r t e r t h a n t h e l i n e a r m o l e c u l e s , s u g g e s t i n g t h a t t h ed a r k s p o t m a y c o n t a i n a c o n s i d e r a b l e a m o u n t o f h i g h l y k n o t t e dD N A . T h e d a r k s p o t s a r e n o t a r t i f a c t s o f s p r e a d i n g i n c y t o -c h r o m e c , a s t h e y a r e a l s o s e e n a f t e r s p r e a d i n g b y t h e p r o t e i n -f r e e e t h i d i u m b r o m i d e p r o c e d u r e ( 2 1 ) . T h e c o n d e n s e d s t r u c -* t u r e d o e s n o t d e p e n d o n t h e v i r 2 2 o r L t s 3 7 m u t a t i o n s ; t h e s a m er e s u l t w a s o b t a i n e d u s i n g h e a d s o f t h e c l e a r - p l a q u e l y s i s - d e f i -c i e n t m u t a n t P 2 y i r l a m l 2 . M o r e o v e r , t h e c o n d e n s e d s t r u c t u r ew a s n o t f o u n d i n D NA e x t r a c t e d f r o m t h e c o m p l e t e p h a g e o fe i t h e r g e n o t y p e : i n s t e a d , l i n e a r m o n o m e r , c i r c u l a r m o n o m e r ,a n d l i n e a r c o n c a t e m e r s w e r e o b s e r v e d ( d a t a n o t s h o w n ) . T h em i c r o s c o p y r e s u l t s a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e e a r l i e r o b s e r v a t i o n

( u n p u b l i s h e d ) t h a t P 2 h e a d D NA i s m u c h l e s s v i s c o u s t h a n P 2p h a g e D NA a t t h e s a m e c o n c e n t r a t i o n .T r e a t m e n t o f t h e C o n d e n s e d F o r m w i t h P r o t e a s e s a n dR N a s e . P 2 h e a d D NA w a s a n a l y z e d b y b a n d s e d i m e n t a t i o n i nn e u t r a l 3 M C s C l ( F i g . 2 B ) . ' T w e n t y - e i g h t p e r c e n t o f t h e m a -t e r i a l s e d i m e n t e d a t 2 1 S , a s d i d l i n e a r m o n o m e r i c P 2 D N A f r o mm a t u r e p h a g e ( F i g . 2 A ) . S e v e n t y - t w o p e r c e n t o f t h e h e a d D NAs e d i m e n t e d a s a h e t e r o g e n e o u s p o p u l a t i o n w i t h a m e a n s e d i -m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t o f 4 5 S . A s n o n c o n d e n s e d c i r c u l a r P 2D NA s e d i m e n t s o n l y 1 0 % f a s t e r t h a n l i n e a r m o l e c u l e s ( 2 2 ) , t h er a p i d l y s e d i m e n t i n g p e a k ( - 4 5 S ) m o s t l i k e l y r e p r e s e n t s t h e

E . . . , . h . - . *

- , ' I . ae=

s- . a t w

. - W } G o A , , ; A w d ,F I G . 1 . E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f D NA f r o m t a i l l e s s c a p s i d s o f P 2 v i r 2 2 L t s 3 7 .

B i o c h e m i s t r y : L i u e t a L

8/3/2019 Leroy F. Liu, Luke Perkocha, Richard Calendar and James C. Wang- Knotted DNA from bacteriophage capsids

3/5

P r o c . N a t d A c a d . S c i . USA 7 8 ( 1 9 8 1 )

F I G . 2 . B a n d s e d i m e n t a t i o n o f P 2 p h a g e D NA a n d h e a d D NA i nn e u t r a l 3 MC s C l . T h e d i r e c t i o n o f s e d i m e n t a t i o n i s t o t h e l e f t . C u r v e s :u p p e r , p h a g e D N A ; l o w e r , h e a d D N A . T h e t r a i l i n g o f t h e 2 1 S s p e c i e si n t h e u p p e r c u r v e t o w a r d t h e b o t t o m o f t h e c e l l i s d u e t o t h e f o r m a t i o no f s o m e c i r c l e s a n d c o n c a t e m e r s .c o n d e n s e d f o r m s e e n u n d e r t h e e l e c t r o n m i c r o s c o p e . T h u s , t h ec o n d e n s e d f o r m c a n n o t b e s i m p l y a n a r t i f a c t o f t h e e l e c t r o nm i c r o s c o p i c t e c h n i q u e . T o t e s t w h e t h e r t h e c o n d e n s e d f o r mc o n t a i n s c o m p o n e n t s o t h e r t h a n D NA ( s u c h a s p r o t e i n a n dR N A ) , t h e h e a d D NA w a s d i g e s t e d s e p a r a t e l y w i t h P r o n a s e ,p r o t e i n a s e K , a n d R N a s e A . T h e s e t r e a t m e n t s d i d n o t a l t e r t h es e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y o f t h e D NA i n n e u t r a l 3 MC s C l , n o r w a st h e r e a n y c h a n g e i n t h e a m o u n t o r a p p e a r a n c e o f t h e c o n d e n s e dD NA f o r m s e e n u n d e r t h e e l e c t r o n m i c r o s c o p e . B u o y a n t d e n -s i t y m e a s u r e m e n t s i n C s C l o f t h e h e a d D NA a n d t h e p h a g eD NA a l s o s h o w e d n o d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o , w i t h i n e x -p e r i m e n t a l e r r o r ( + 0 . 2 m g / m l ) . M o r e o v e r , D NA r e c o v e r e df r o m t h e d e n s i t y g r a d i e n t s t i l l c o n t a i n e d a m a j o r i t y o f t h e c o n -d e n s e d m o l e c u l e s , a s m e a s u r e d w i t h t h e e l e c t r o n m i c r o s c o p e .T h u s , i t s e e m s u n l i k e l y t h a t b o u n d p r o t e i n o r RNA i s e s s e n t i a lf o r t h e m a i n t e n a n c e o f t h e c o n d e n s e d f o r m .T h e C o n d e n s e d F o r m o f P 2 H e a d D NA R e p r e s e n t s a n U n -u s u a l C l a s s o f T o p o l o g i c a l I s o m e r s o f t h e H y d r o g e n - B o n d e dP 2 M o n o m e r i c C i r c l e . T h e c o n d e n s e d f o r m o f P 2 h e a d D NAs h o w e d n o f r e e e n d s w h e n e x a m i n e d b y t h e a q u e o u s s p r e a d i n gm e t h o d ( s e e F i g . 1 ) . T o i n v e s t i g a t e t h e p h y s i c a l s t r u c t u r e o f t h ec o h e s i v e e n d s , s e v e r a l e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d . F i r s t , t h eD NA w a s h e a t e d t o 8 5 T C f o r 5 m i n i n 2 M N a C V 1 0 mMN a 3 E D T A ( a c o n d i t i o n k n o w n t o d i s s o c i a t e t h e c o h e r e d e n d so f P 2 D N A ) . T h i s ' t r e a t m e n t c o n v e r t e d a l l o f t h e f a s t - s e d i -m e n t i n g m a t e r i a l t o t h e 2 1 S f o r m ( d a t a n o t s h o w n ) , s u g g e s t i n gt h a t t h e j o i n i n g o f t h e t w o c o h e s i v e e n d s i s i m p o r t a n t f o r t h em a i n t e n a n c e o f t h e c o n d e n s e d f o r m . S e c o n d , w e a n a l y z e d h e a da n d ' p h a g e D NA b y s e d i m e n t a t i o n i n a l k a l i n e 3 M C s C l . U n d e rt h e s e c o n d i t i o n s , D NA f r o m e i t h e r s o u r c e s e d i m e n t e d a s a s i n -g l e s p e c i e s o f P 2 m o n o m e r l e n g t h ( d a t a n o t s h o w n ) , a g a i n s u g -g e s t i n g t h a t t h e e n d s a r e n o t j o i n e d c o v a l e n t l y a n d t h a t t h e i rj o i n i n g i s i m p o r t a n t f o r t h e m a i n t e n a n c e o f t h e c o n d e n s e d f o r m .T h i r d , t h e h e a d D NA a n d t h e p h a g e D NA w e r e t r e a t e d w i t hE . c o l i D NA p o l y m e r a s e I a n d t h e f o u r d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e s . B e c a u s e o f t h e r e c e s s e d 3 ' - O H e n d , n i c k t r a n s -l a t i o n o f t h e h y b r i d i z e d c o h e s i v e e n d s o f P 2 D NA i s e x p e c t e dt o l i n e a r i z e t h e m o l e c u l e ( 4 ) . A f t e r t h e p o l y m e r a s e t r e a t m e n t ,t h e p h a g e D N A , a s e x p e c t e d , i s e n t i r e l y c o n v e r t e d t o l i n e a rm o n o m e r i c P 2 D NA a s s h o w n b y s e d i m e n t a t i o n i n n e u t r a l 3 MC s C l ( F i g . 3 A ) . T h e s a m e t r e a t m e n t a l s o c o n v e r t e d a l l t h e f a s t -m o v i n g m a t e r i a l o f P 2 h e a d D NA ( 4 5 S ) t o t h e l i n e a r f o r m ( 2 1S ) ( F i g . 3 B ) . T h e s e r e s u l t s w e r e a l s o c o n f i r m e d b y e l e c t r o n

m i c r o s c o p y . We t h u s c o n c l u d e t h a t t h e j o i n i n g o f t h e t w o c o -h e s i v e e n d s i s e s s e n t i a l f o r t h e m a i n t e n a n c e o f t h e c o n d e n s e ds t r u c t u r e a n d t h a t t h e c o n d e n s e d s t r u c t u r e i s m o s t l i k e l y a t o -p o l o g i c a l v a r i a n t o f h y d r o g e n - b o n d e d s i m p l e P 2 D NA c i r c l e .T h e T o p o l o g y o f t h e C o n d e n s e d Form I s C o m p l e x K n o t s .A l l t h e r e s u l t s o b t a i n e d s o f a r f o r t h e c o n d e n s e d f o r m o f P 2 h e a dD NA a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e i n t e r p r e t a t i o n t h a t t h e D NA i s i na h i g h l y k n o t t e d t o p o l o g i c a l s t a t e a n d t h a t t h e c i r c u l a r i t y o f t h eD NA m a i n t a i n s t h e s e c o m p l e x k n o t s . T o c o n f i r m t h e k n o t t e dt o p o l o g y o f t h e c o n d e n s e d f o r m , w e s e a l e d i t s h y b r i d i z e d c o -h e s i v e e n d s w i t h D NA l i g a s e a n d a n a l y z e d t h e p r o d u c t s o f r a n -d o m n i c k i n g w i t h D N a s e I . A f t e r s e a l i n g t h e f i r s t n i c k o f a P 2h y b r i d i z e d c i r c l e , a s i n g l y n i c k e d c i r c l e i s o b t a i n e d , a n d s e a l i n go f t h e s e c o n d n i c k g i v e s c o v a l e n t l y c l o s e d c i r c u l a r m o l e c u l e . I fs i n g l y n i c k e d c i r c u l a r m o l e c u l e s a r e k n o t t e d , t h e n a l k a l i n e s e d i -m e n t a t i o n w i l l s h o w a b a n d r e p r e s e n t i n g k n o t t e d s i n g l e -s t r a n d e d P 2 D NA ( 2 3 ) . A s e x p e c t e d , w h e n l i g a s e - t r e a t e d P 2h e a d D NA w a s s e d i m e n t e d i n a l k a l i n e 3 M C s C l , f o u r m a j o rc o m p o n e n t s w e r e o b s e r v e d ( F i g . 4 ) . T h e s l o w e s t p e a k ( = 2 4 S )r e p r e s e n t s m o n o m e r i c l i n e a r a n d c i r c u l a r s i n g l e - s t r a n d e dD N A s , w h i c h s e p a r a t e f r o m o n e a n o t h e r a f t e r f u r t h e r s e d i m e n -t a t i o n . A p e a k t h a t s e d i m e n t s a t = 9 3 S r e p r e s e n t s c o v a l e n t l yc l o s e d d o u b l e - s t r a n d e d m o l e c u l e s ( 2 2 ) . A b r o a d p e a k a t - 1 2 5S a n d t h e r e m a i n i n g p e a k a t w 4 5 . S m o s t l i k e l y r e p r e s e n t s k n o t -t e d d o u b l e - s t r a n d e d c i r c l e s a n d k n o t t e d s i n g l e - s t r a n d e d c i r c l e s ,r e s p e c t i v e l y .I f o u r i n t e r p r e t a t i o n o f t h e a l k a l i n e s e d i m e n t a t i o n p a t t e r n i sa c c u r a t e , t h e n t h e d i s a p p e a r a n c e o f t h e f a s t e s t s e d i m e n t i n gf o r m ( 1 2 5 S , k n o t t e d d u p l e x r i n g s ) b y n i c k i n g w i t h D N a s e Is h o u l d f o l l o w o n e - h i t k i n e t i c s . T h e k i n e t i c s f o r t h e d i s a p p e a r -a n c e o f t h e 4 5 S s p e c i e s ( k n o t t e d s i n g l e - s t r a n d e d r i n g s ) d u r i n gt h e c o u r s e o f d i g e s t i o n w i t h D N a s e I w o u l d , h o w e v e r , b e m o r ec o m p l e x a s , i n t h e i n i t i a l p h a s e o f D N a s e I t r e a t m e n t , t h i s s p e -c i e s w o u l d b e g e n e r a t e d b y t h e n i c k i n g o f t h e 1 2 5 S f o r m . I f , o nt h e o t h e r h a n d , t h e f a s t e s t s e d i m e n t i n g p e a k r e p r e s e n t s u n -k n o t t e d m o l e c u l e s - t h a t a r e h i g h l y s u p e r c o i l e d , t h e s e w o u l d i m -m e d i a t e l y a s s u m e t h e u n k n o t t e d n i c k e d c i r c u l a r f o r m a f t e r t h ef i r s t n i c k i s m a d e , a n d d e n a t u r a t i o n w i l l g i v e a s i n g l e - s t r a n d e dc i r c u l a r m o n o m e r a n d a s i n g l e - s t r a n d e d u n k n o t t e d c i r c l e . T ot e s t o u r m o d e l , w e a d d e d D N a s e I t o t h e l i g a s e - t r e a t e d h e a dD NA a n d r e m o v e d s a m p l e s a t v a r i o u s t i m e s f o r a l k a l i n e s e d i -m e n t a t i o n , a n a l y s i s ( F i g . 5 ) . T h e f a s t e s t s e d i m e n t i n g f o r m d i s -a p p e a r e d w i t h a h a l f - t i m e o f w 1 m i n . I n c o n t r a s t , t h e p u t a t i v es i n g l e - s t r a n d e d k n o t t e d c i r c u l a r f o r m ( 4 5 S ) d i d n o t d e c r e a s ea t a l l i n t h e f i r s t s e v e r a l m i n u t e s . I t s t a r t e d t o d i s a p p e a r o n l y

F I G . 3 . N i c k t n s l a t i o n o f p h a g e D NA a n d h e a d D NA a t t h e c o -h e s i v e e n d s . P h a g e D NA ( c u r v e A ) a n d h e a d D NA ( c u r v e B ) w e r e n i c kt r a n s l a t e d b y E . c o l i p o l y m e r a s e I a n d s e d i m e n t e d i n n e u t r a l 3 MC s C l .T h e d i r e c t i o n o f s e d i m e n t a t i o n i s t o t h e l e f t . .

5 5 0 0 B i o c h e m i s t r y : L i u e t a L

8/3/2019 Leroy F. Liu, Luke Perkocha, Richard Calendar and James C. Wang- Knotted DNA from bacteriophage capsids

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P r o c . N a t L A c a d . S c i . USA 7 8 ( 1 9 8 1 ) 5 5 0 1

F I G . 4 . A l k a l i n e s e d i m e n t a t i o n o f P 2 v i r 2 2 L t s 3 7 h e a d D NA a f t e r t r e a t m e n t w i t h D NA l i g a s e . T h e d i r e c t i o n o f s e d i m e n t a t i o n i s t o t h e l e f t .w h e n t h e d o u b l e - s t r a n d e d k n o t t e d m o l e c u l e s ( 1 2 5 S ) h a d n e a r l yd i s a p p e a r e d ( F i g . 5 ) . I n s u m m a r y , l i g a s e c l o s u r e a n d s u b s e -q u e n t D N a s e c l e a v a g e g i v e s r e s u l t s c o n s i s t e n t w i t h t h e i d e a t h a tt h e c o n d e n s e d f o r m o f P 2 h e a d D NA i s k n o t t e d , T h e h i g h r a t eo f s e d i m e n t a t i o n o f b o t h t h e k n o t t e d d o u b l e - s t r a n d e d c i r c l e s( 1 2 5 S ) a n d t h e k n o t t e d s i n g l e - s t r a n d e d c i r c l e s ( 4 5 S ) f u r t h e rs u g g e s t s t h a t t h e k n o t s m u s t b e e x c e e d i n g l y c o m p l e x .

DISCUSSIONT h e N a t u r e o f t h e K n o t s i n P 2 H e a d DNA. O u r r e s u l t s i n -d i c a t e t h a t t h e P 2 D NA e x t r a c t e d f r o m t a i l l e s s c a p s i d s i n a t o -p o l o g i c a l v a r i a n t o f t h e P 2 D NA e x t r a c t e d f r o m m a t u r e p h a g e .P 2 h e ad D NA i s a m o n o m e r i c c i r c u l a r f o r m i n w h i c h t h e t w oc o h e s i v e e n d s a r e h y d r o g e n b o n d e d , a n d i t c o n t a i n s c o m p l e xk n o t s . T h e s e d i m e n t a t i o n r a t e o f k n o t t e d s i n g l e - s t r a n d e d D NAh a s b e e n m e a s u r e d p r e v i o u s l y f o r f d p h a g e D NA a n d f o r 4 X 1 7 4

& 2 0s Z0

z

1 0

0 1 2 3 4 5 6 ' ' 1 5T i m e o f D N a s e t r e a t m e n t , m i n

F I G . 5 . E f f e c t o f p a n c r e a t i c D N a s e I t r e a t m e n t o n l i g a s e - c l o s e dk n o t t e d P 2 h e a d DNA. P 2 v i r 2 2 L t s 3 7 h e a d D NA t r e a t e d w i t h DNAl i g a s e was s u b s e q u e n t l y t r e a t e d w i t h D N a s e I . S a m p l e s were w i t h -d r a w n a t t h e i n d i c a t e d t i m e s a n d a n a l y z e d b y s e d i m e n t a t i o n i n a l -k a l i n e 3 M C s C I ( s e e F i g . 3 ) . T h e r e l a t i v e a m o u n t o f e a c h D NA f o r mwas e s t i m a t e d f r o m t h e areas u n d e r e a c h p e a k . o , D o u b l e - s t r a n d e dk n o t t e d D NA ( 1 2 5 S ) ; * e s i n g l e - s t r a n d e d k n o t t e d D NA ( 4 5 S ) .

p h a g e D NA k n o t t e d b y E . c o l i D NA t o p o i s o m e r a s e I ( 2 3 ) . D NAw i t h t h e m o s t c o m p l e x k n o t s p r o d u c e d b y t o p o i s o m e r a s e t r e a t -m e n t s e d i m e n t e d n o t f a s t e r t h a n 1 . 5 t i m e s t h e r a t e o f t h e u n -k n o t t e d f o r m ( 2 3 ) . I n c o n t r a s t , t h e k n o t t e d P 2 h e a d D NA s e d -i m e n t e d a b o u t t w i c e a s f a s t a s t h e u n k n o t t e d f o r m , b o t h i n n e u -t r a l 3 M C s C l ( 4 5 S v s . 2 1 S ) a n d i n a l k a l i n e 3M C s C l ( 4 5 S v s .2 4 S ) . T h e c o m p l e x i t y o f t h e t o p o l o g i c a l k n o t s , h o w e v e r , d o e sn o t s e e m t o b e r e f l e c t e d b y t h e e l e c t r o n m i c r o g r a p h s . We b e -l i e v e t h a t t h e c e n t r a l d a r k r e g i o n r e p r e s e n t s v e r y c o m p l e x o v e r -l a p p i n g o f D NA d o u b l e - s t r a n d s , d u e t o k n o t t i n g . T h i s i s c o n -s i s t e n t w i t h t h e r e s u l t o f t h e c o n t o u r l e n g t h m e a s u r e m e n t s ,w h i c h s h o w t h a t t h e c e n t r a l d a r k s p o t c o n t a i n s 2 0 % o f t h e t o t a lD N A . S u c h a l o o p e d s t r u c t u r e w i t h c e n t r a l o v e r l a p p i n g m i g h tr e s u l t f r o m t h e s p r e a d i n g f o r c e d u r i n g D NA f i x a t i o n f o r e l e c t r o nm i c r o s c o p y ( 2 0 ) . A l t e r n a t i v e l y , t h e h i g h l y k n o t t e d t o p o l o g ym i g h t i n d u c e s t r u c t u r a l c h a n g e s o f t h e D NA t o g i v e a c o m p a c tc o r e o f y e t u n k n o w n n a t u r e .O r i g i n o f t h e K n o t s . T h e f a c t t h a t P 2 h e a d D NA c o n t a i n sc i r c u l a r k n o t t e d m o l e c u l e s i n d i c a t e s t h a t , i n a P 2 h e a d , t h e c o -h e s i v e e n d s e i t h e r a r e f r e e t o j o i n o r a r e i n c l o s e p r o x i m i t y , s ot h a t t h e i r j o i n i n g o c c u r s r a p i d l y o n d i s r u p t i o n o f t h e c a p s i d s b yp h e n o l . I n e i t h e r c a s e , t h e c o m p l e x i t y o f t h e k n o t s m u s t r e f l e c tt h e w a y t h e D NA i s p a c k a g e d i n t h e p h a g e h e a d . D NA i n p h a g eh e a d s i s c u r r e n t l y t h o u g h t t o b e a r r a n g e d a s - i n a s p o o l o f t h r e a d( 2 4 - 2 6 ) , a n d t h e p o s i t i o n o f t h e D NA e n d s h a s n o t b e e n e s t a b -l i s h e d . T h e e n d s m a y n o t h a v e a f i x e d p o s i t i o n a n d m a y m e e ta n d h y b r i d i z e a f t e r a r a n d o m w a l k t h a t o c c u r s a f t e r p a c k a g i n gi s c o m p l e t e . A l t h o u g h r a n d o m c y c l i z a t i o n o f P 2 D NA h a s b e e nc a l c u l a t e d t o p r o d u c e o n l y =28% k n o t t e d r i n g s w i t h l o w c o m -p l e x i t i e s ( 2 7 ) , r a n d o m c y c l i z a t i o n o f P 2 D NA i n t h e p h a g e c a p s i dm a y p r o d u c e m o r e k n o t t e d r i n g s w i t h h i g h c o m p l e x i t y , d u e t ot h e c o n f i n e d s p a c e . I t i s a l s o p o s s i b l e t h a t t h e t o p o l o g y o f t h ek n o t s o b s e r v e d b e a r s l i t t l e r e l a t i o n s h i p t o t h e D NA t o p o l o g yi n t h e c a p s i d . T h e k n o t s m a y b e g e n e r a t e d a s a r e s u l t o f r a n d o md i f f u s i o n a n d s u b s e q u e n t j o i n i n g o f t h e c o h e s i v e e n d s d u r i n go r s h o r t l y a f t e r d i s r u p t i o n o f t h e p h a g e h e a d s b y p h e n o l , w h i l eD NA i s d e c o n d e n s i n g .T h e l a c k o f k n o t s i n D NA f r o m m a t u r e p h a g e i s n o t s u r p r i s -i n g . A f t e r t h e t a i l i s j o i n e d t o t h e h e a d , a u n i q u e e n d o f t h e D NAc a n b e c r o s s l i n k e d t o t h e h e a d - p r o x i m a l e n d o f t h e p h a g e t a i l( 6 ) , i n d i c a t i n g t h a t a t l e a s t o n e D NA e n d h a s a f i x e d p o s i t i o ni n m a t u r e p h a g e . T h e f i x a t i o n o f o n e D NA e n d t o t h e p h a g ec o l l a r p r e s u m a b l y a c c o u n t s f o r t h e l a c k o f c i r c u l a r i z a t i o n o f D NAi n m a t u r e p h a g e .A S u b s t r a t e f o r T y p e I I T o p o i s o m e r a s e . H i g h l y k n o t t e dD NA i s a c o n v e n i e n t s u b s t r a t e f o r s t u d i e s o f t y p e I I D NA t o -

p o i s o m e r a s e s ( 2 8 ) . T h e s e e n z y m e s c a t a l y z e t h e b r e a k a g e a n dr e j o i n i n g o f D NA b a c k b o n e b o n d s i n a d o u b l e - s t r a n d e d f a s h i o nt o p e r m i t t h e p a s s a g e o f o n e d o u b l e - s t r a n d e d D NA s e g m e n t

0

0 " % * %**N N %

0 \

B i o c h e m i s t r y : L i u e t a L

8/3/2019 Leroy F. Liu, Luke Perkocha, Richard Calendar and James C. Wang- Knotted DNA from bacteriophage capsids

5/5

P r o c . N a t ! A c a d . S c i . USA 7 8 ( 1 9 8 1 )t h r o u g h a n o t h e r ( 2 8 - 3 0 ) . A s a r e s u l t , k n o t t e d d u p l e x D NA r i n g sc a n b e c o n v e r t e d t o r i n g s w i t h o u t k n o t s b y t h e s e e n z y m e s ( 2 8 ,3 0 ) . W e . h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t t h e c o m p l e x k n o t s o f P 2 h e a dD NA a r e q u i c k l y r e m o v e d b y t y p e I I D NA t o p o i s o m e r a s e s( 3 1 ) . T h e t y p e I D NA t o p o i s o m e r a s e s , w h e t h e r f r o m e u k a r y o t i co r p r o k a r y o t i c s o u r c e s , d o . n o t c h a n g e t h e k n o t t e d t o p o l o g y o fP 2 h e a d D NA e f f i c i e n t l y a l t h o u g h , w i t h t h e p r o k a r y o t i c . e n -z y m e s , s o m e u n k n o t t i n g i s d e t e c t a b l e i f t h e D N A i s f i r s t n i c k e dw i t h D N a s e 1 ( 3 2 , 3 3 ) .T h e m o s t c o n v e n i e n t s o u r c e o f s u b s t r a t e f o r t h e a s s a y o f t y p eI I D NA t o p o i s o m e r a s e s a p p e a r s t o b e t h e D NA e x t r a c t e d f r o mt h e h e a d s o f s a t e l l i t e p h a g e P 4 . P 4 D NA c o n t a i n s o n l y 1 1 k i l -o b a s e s ( 3 4 ) a n d h a s t h e s a m e c o h e s i v e e n d s a s P 2 ( 3 5 ) . M o r e t h a n9 5 % o f t h e D NA f r o m P 4 h e a d s i s h i g h l y k n o t t e d . P 4 h e a d D NAh a s b e e n u s e d s u c c e s s f u l l y a s a s u b s t r a t e f o r a s s a y i n g e u k a r y o t i ct y p e I I t o p o i s o m e r a s e i n c r u d e c e l l e x t r a c t s c o n t a i n i n g e x c e s st y p e I D NA t o p o i s o m e r a s e ( 3 3 ) .We a r e g r a t e f u l t o G a i l P r u s s f o r a d v i c e . T h i s i n v e s t i g a t i o n w a s s u p -p o r t e d b y G r a n t s GM 2 7 7 3 1 a n d GM 2 4 5 4 4 f o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t eo f G e n e r a l M e d i c a l S c i e n c e s , A l 0 8 7 2 2 f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e o fA l l e r g y a n d I n f e c t i o u s D i s e a s e s , a n d PC M 7 8 - 5 8 9 2 f r o m t h e N a t i o n a lS c i e n c e F o u n d a t i o n .

1 . M a n d e l , M . ( 1 9 6 7 ) M o t G e n . G e n e t . 9 9 , 8 8 - 9 6 .2 . I n m a n , R . B . & B e r t a n i , . G . ( 1 9 6 9 ) J . M o ! B i o L , 4 4 , 5 3 3 - 5 4 9 .3 . M u r r a y , K . & M u r r a y , N . E . ( 1 9 7 3 ) N a t u r e ( L o n d o n ) New B i o l b g y2 4 3 , 1 3 4 - 1 3 9 .4 . P a d m a n a b h a n , R . , W u , R . & C a l e n d a r , R . ( 1 9 7 4 ) J . B i o ! C h e m .2 4 9 , 6 1 9 7 - 6 2 0 7 . .5 . B e r t a n i , G . , L j u n g g u i s t , E . , J a g u s z t y n - k r y n i c k a , K . & J u p p ; S .( 1 9 7 8 ) J . G e n . V i r o t 3 8 , 2 5 1 - 2 6 1 .6 . C h a t t o r a j , D . K . & I n m a n , R . B . ( 1 9 7 4 ) ] J . M o l d B i o ! . 8 7 , 1 1 - 2 2 .7 . S a s a k i , I . & B e r t a n i , G . ( 1 9 6 5 ) J . G e n . M i c r o b i o t 4 0 3 6 5 - 3 7 6 .8 . S u n s h i n e , M . G . , T h o r n , M . , G i b b s , W . , C a l e n d a r , R . & K e l l y , .B . ( 1 9 7 1 ) V i r o l o g y 4 6 f 6 9 1 - 7 0 2 .9 . B e r t a n i , L . E . ( 1 9 5 7 ) V i r o l o g y 4 , 5 3 - 7 1 .1 0 . B e r t a n i , G . ( 1 9 7 5 ) M o L G e n . G e n e t 1 3 6 , 1 0 7 - 1 3 7 .1 1 . P r u s s , G . & C a l e n d a r , R . ( 1 9 7 8 ) V i r o l o g y 8 6 , 4 5 4 - 4 6 7 .1 2 . C h a t t o r a j , D . K . & I n m a n , R . B . ( 1 9 7 2 ) J . M o t B i o L 6 6 , 4 2 3 - 4 3 4 .

1 3 . L i n d a h l , G . ( 1 9 7 1 ) V i r o l o g y 4 6 , 6 2 0 - 6 3 3 .1 4 . L e n g y e l , J . , G o l d s t e i n , R . N . , M a r s h , M . , S u n s h i n e , M . G . &C a l e n d a r , R . ( 1 9 7 3 ) V i r o l o g y 5 3 , 1 - 2 3 .1 5 . B e r t a n i , G . ( 1 9 5 1 ) J . B a c t e r i o t 6 2 , 2 9 3 - 3 0 0 .1 6 . T h o m a s , C . A . , J r . & A b e l s o n , J . ( 1 9 6 6 ) i n P r o c e d u r e s i n N u d l e i cA c i d R e s e a r c h , e d s . C a n t o n i , . G . L . & D a v i e s , D . R . ( H a r p e r &R o w , New Y o r k ) , p p . 5 5 3 - 5 6 1 .1 7 . J o v i n , T . M . , E n g l u n d , P . T . & B e r t s c h , L . L . ( 1 9 6 9 ) J . B i o l .C h e m . 2 4 4 , 2 9 9 6 - 3 0 8 .1 8 . M o d r i c h , P . , A n r a k u , . Y . & L e h m a n , I . R . ( 1 9 7 3 ) J . B i o l . C h e m .2 4 8 , 7 4 9 5 - 9 5 0 1 .1 9 . V i n o g r a d , J . , R a d l o f f , R . & B r u n e r , R . ( 1 9 6 5 ) B i o p o l y m e r s 3 ,4 8 1 - 4 8 9 .2 0 . D a v i s , R . W . , S i m o n , M . & D a v i d s o n , N . ( 1 9 7 1 ) M e t h o d s E n -z y m o l . 2 1 , 4 1 3 - 4 2 8 .2 1 . K o l l e r , T . , S o g o , J . M . & B u j a r d , . . H . ( 1 9 7 4 ) B i o p o l y m e r s 1 3 ,9 9 5 - 1 0 0 9 .2 2 . L i n d q v i s t , B . H . ( 1 9 7 1 ) M o l . G e n . G e n e t . 1 1 0 , 1 7 8 - 1 9 6 .2 3 . L i u , L . F . , D e p e w , R . E . & W a n g , J . C . ( 1 9 7 6 ) J . M o t . B i o . 1 0 6 ,4 3 9 - 4 5 2 .2 4 . E a r n s h a w , W . C . 8 & C a s j e n s , S . R . ( 1 9 8 0 ) C e l l 2 1 , 3 1 9 - 3 3 1 . .2 5 . R i c h a r d s , K . E . , W i l l i a m s , R . C . & C a l e n d a r , R . ( 1 9 7 3 ) J . M o ! .B i o l 7 8 , 2 5 5 - 2 5 9 .2 6 . E a r n s h a w , W . C . & H a r r i s o n , S . C . ( 1 9 7 7 ) N a t u r e ( L o n d o n ) . 2 6 8 ,5 9 8 - 6 0 2 .2 7 . F r a n k - K a m e n e t s k i i , J . D . , L u k a s h i n , A . V . & V o l o g o d s k i i , A . V .( 1 9 7 5 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 5 8 , 3 9 8 - 4 0 2 .2 8 . L i u , L . F . , L i u , C . C . & A l b e r t s , B . M . ( 1 9 8 0 ) C e l l 1 9 , 6 9 7 - 7 0 7 .2 9 . B r o w n , P . O . & C o z z a r e l l i , N . R . ( 1 9 7 9 ) S c i e n c e 2 0 6 , 1 0 8 1 - 1 0 8 3 .3 0 . M i z u u c h i , K . F i s h e r , L . M . , O ' De a , M . & G e l l e r t , . M . ( 1 9 8 0 )P r o c . N a t ! A c a d . S c i . U S A 7 7 , 1 8 4 7 - 1 8 5 1 .3 1 . M i l l e r , K . G . , L i u , L . F . & E n g l u n d , P . T . ( 1 9 8 1 ) ] . B i o l . C h e m . ,i n p r e s s .3 2 . L i u , L . F . & M i l l e r , K . G . ( 1 9 8 1 ) P r o c . N a t ! . A c a d . S c i . U S A 7 8 ,3 4 8 7 - 3 4 9 1 .3 3 . L i u , L . F . , D a v i s , J . L . & . C a l e n d a r , R . ( 1 9 8 1 ) N u c l e i c A c i d s R e s . ,i n p r e s s .3 4 . I n m a n , R . B . , S c h n o s , M . , S i m o n , L D . , S i x , E . W . & W a l k e r , .D . H . ( 1 9 7 1 ) V i r o l o g y 4 4 , 6 7 - 7 2 .3 5 . W a n g , J . C . , M a r t i n , K . V . & C a l e n d a r , . R . ( 1 9 7 3 ) B i o c h e m i s t r y

1 2 , 2 1 1 9 - 2 1 2 3 .

=A5 5 0 2 B i o c h e m i s t r y : L i u , e t d