Date post: | 01-May-2015 |
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Lez 12
• Protein folding• Intracellular Compartments and
Protein Sorting• Nucleo, mitocondri, perossisomi,
reticolo endoplasmico• Meccanismi di trasporto
• Il peptide sintetizzato deve ripiegarsi (folding)
• poi può andare incontro a modificazioni covalenti (es. fosforilazione, glicosilazione) e legarsi a metalli o altre subunità
Sintesi di una proteina funzionale
Folding è co-traduzionale
• Il folding avviene durante la sintesi, inizia dal N-terminale, ed è in gran parte spontaneo
Molten globule• Nel refolding in
vitro in molte proteine si forma rapidamente un intermedio: il molten globule, che ha alta struttura secondaria, ma manca di molte interazioni stabilizzanti. Ha zone indrofobiche esposte.
Protein folding
• Il passaggio da molten globule a struttura corretta è critico e può essere assistito da chaperoni
Molecular chaperones: hsp70
• Una classe di chaperoni assiste il folding coprendo le zone idrofobiche
Hsp60 chaperones
• Un’altra classe di chaperoni crea le condizioni per la “denaturazione” e refolding
Controllo di qualità della sintesi di proteine
Ubiquitina
Catene di ubiquitine
• La ubiquitinizzazione prevede l’azione dell’enzima di attivazione, la ligasi il riconoscimento della proteina bersaglio e la formazione della catena di ubiquitine
Meccanismi per degradare le proteine
• Sia le ubiquitine ligasi che i segnali di degradazione devono essere attivati. Usano meccanismi in parte simili
Produzione di una proteina in
eucarioti
• Le proteine vanno ad occupare vari compartimentidella cellula
Compartimenti di una cellula eucariota
Schema del possibile sviluppo di organelli
• Nucleo e mitocondrio hanno origini molto diverse
Comunicazioni tra organelli
Traffico di proteine
• Schema semplificato
• Tipi di trasporto:– Gated – Transmembrana– vescicolare
Trasporto vescicolare
• Il trasporto vescicolare usa gemmazione e fusione di vescicole. I componenti solubili sono trasportati insieme a membrane. La orientazione delle molecole transmembrana e delle membrane è conservata
I segnali possono essere di sequenza di zone
unite nella struttura
Trasporto attraverso il nuclear envelope
• Il nucleo è separato da citoplasma da una doppia membrana: il nuclear envelope
• Esso ha dei pori: nuclear pores che sono fatti da strutture chiamate Nuclear Pore Complex (NPC)
• NPC sono grossi, c.a. 125 MDa, e composti da copie multiple di nucleoporine
• La struttura è stata in parte determinata
Trasporto nucleare
• NPC ha una struttura a tre anelli • Gli anelli sono coassiali e sono collegati alle
braccia radiali. Il poro centrale è all’interno
• The nuclear pore complex.
A: scanning electron microscopy del complesso di Xenopus
B: schema del complesso
Nuclear localization signal
(NLS)
• Per essere importate le proteine debbono avere un segnale NLS signal, e per essere esportate un NES (nuclear export signal)
• NLS e NES consistono di corte sequenza che sono necessarie e sufficienti alle proteine per essere trasportate attraverso i pori dentro o fuori dal nucleo
Enzima fuso a NLS
Trasporto nel nuclear pore complex
• Molecole <50 kDa diffondono liberamente.
• Le altre sono trasportate da nuclear import receptors
Ran GTPase dirige il trasporto • Compartimentalizzazione di
Ran-GDP e Ran-GTP• GAP (GTPase activating
protein: Ran-GTPRan-GDP) è citosolica
• GEF (Guanine Exchange Factor: Ran-GDPRan-GTP) è nucleare
Idrolisi di GTP da la direzione del trasporto
Il legame con Ran-GTP induce il rilascio del cargo
Le membrane nucleari si rompono nella mitosi
Trasporto nei mitocondri
• Mitocondri e plastidi hanno 2 membrane diverse: interna ed esterna
Trasporto nei mitocondri
• Le tre proteine traslocatori nella membrana mitocondriale
La sequenza segnale ha la conformazione di un’alfa elica con una superficie basica
Trasporto nei mitocondri
• Il trasporto attraverso le due membrane avviene probabilmente nei contact sites
Trasporto nei mitocondri: energia• Il rilascio delle hsp70 citosoliche consuma ATP• Il trasferimento richiede pontenziale elettrochimico• Le hsp70 mitocondriali consumano ATP
Hsp70 guida l’importazione delle proteine
Trasporto mitocondriale: proteine di membrana
Trasporto nei peroxisomi
• Il trasporto è guidato da una sequenza di 3 amino acidi di solito at C-terminale
Trasporto nel reticolo endoplasmico
• ER rugoso di una cellula pancreatica Colorazione
di proteine dell’ER
Ribosomi liberi e legati alle membrane
• Gli stessi ribosomi ciclano tra poliribosomi liberi e di membrana.
• L’ancoraggio alla membrana avviene ad opera della proteina nascente
Separazione del poliribosomi
Trasporto nell’ ER
• Ipotesi originaria e semplificata.
• La sequenza segnale porta il ribosoma al traslocatore
• Il segnale è poi tagliato
Signal-recognition particle (SRP)
• SPR lega la sequenza segnale ed anche SPR receptor sulla membrana ER• Il legame al segnale induce una pausa nella sintesi, per facilitare l’interazione
con il recettore. • Il complesso viene poi portato al traslocatore.
Meccanismo di trasporto nell’ER
Ribosoma legato la traslocatore
• Il poro del traslocatore si allinea con il tunnel del ribosoma da cui esce il peptide
Trasporto di una proteina solubile
• Il poro del traslocatore si apre dopo il legame con la leader sequence.
• Dopo la traslocazione il poro si chiude ed il traslocatore si apre lateralmente e rilascia il peptide segnale
Trasporto di una proteina transmembrana, N-terminal signal
• Quando il traslocatore incontra la sequenza stop-transfer, si apre e rilascia il peptide
Proteina transmembrana: internal signal
• Le cariche elettriche intorno al segmento transmembrana determinano la polarità della proteina.
• Il C-terminale può essere esterno o citosolico
Proteine di membrana• Contengono da sequenze start e stop.
Glicosilazione delle proteine • La parte esterna delle proteine di membrana
è spesso glicosilata. Un meccanismo (N-glycosilation) usa la asparagina (Asn o N)
Ruolo di N-linked glycosilation nel folding
• La calnexina lega e trattiene proteine che non sono completamente foldate ed hanno un glucosio esposto.
• La glucosyl transferase riconosce le protiene unfolded, e le le glicosila
Esportazione e degradazione di proteine dell’ER misfolded
• Le proteine misfolded vengono traslocate al citosol per la degradazione
Unfolded protein response nel lievito
GPI anchor proteins