工學博士學位請求論文
Lipase를 이용한 금속비누와 Calcium stearate의
합성 및 Scale-up 인자 분석
Synthesis of Metallic soap and Calcium Stearate
by Lipase and Analysis of Scale-up Factor
2005年 6月
仁荷大學校大學院
生物工學科(生物工學專攻)
金 炫 秀
工學博士學位請求論文
Lipase를 이용한 금속비누와 Calcium stearate의
합성 및 Scale-up 인자 분석
Synthesis of Metallic soap and Calcium Stearate
by Lipase and Analysis of Scale-up Factor
2005年 6月
指導敎授 金 殷 基
이 論文을 工學博士學位 論文으로 提出함
仁荷大學校大學院
生物工學科(生物工學專攻)
金 炫 秀
이 論文을 金炫秀의 博士學位論文으로 認定함.
2005年 6月
主審 :
副審 :
委員 :
委員 :
委員 :
- I -
국 문 요 약
촉매로서의 효소는 화학촉매와 마찬가지로 기질과 조건이 적당하면 촉매
작용을 하는 특성이 있고 특히 리파아제의 반응은 조건에 따라 정반응과 역반
응을 일으킨다. 본 연구의 목적은 효소를 사용하여 금속비누를 합성하여 기존
의 공정에 비해 보다 환경 친화적이고 에너지 절감형인 공정을 개발하는 것이
다. 금속비누는 시멘트, 폭약, 벽돌 등의 방수제로 사용되며 왁스, 크레용, 연
필 등의 윤활제로 사용된다. 또한 식품과 제약 제품의 conditioning agent, 화
장품의 모발보호제, 펄제 그리고 PVC 안정제로 사용되고 있다. 현재 금속비누
를 생산하는 방법은 복 분해법과 용융법이 있으나 이 두 방법은 다량의 폐수
를 발생시키고 고온과 고압의 반응이라서 에너지의 소비가 크다.
효소를 선정하는 실험에서는 Alcaligenes sp., Pseudomonas sp.,
Rhizopus sp. 근원의 1,3-specific Lipases로부터 우지금속비누 합성에 적합한
Lipolase 100-T와 Calcium stearate 합성에 적합한 Liposam SDL-451 효소가
다른 효소에 비하여 양호한 효율을 보였다.
Calcium stearate를 분석하는 방법으로는 CaO (%)로 Calcium stearate
의 함량을 나타내는 분석법인 CTFA법과 FCCⅢ 분석법이 있다. 그러나 두
방법이 미반응 Ca(OH)2의 양까지도 포함되는 단점이 있는 관계로 미반응
Ca(OH)2를 제거하여 순수한 Calcium stearate의 양만을 측정하는 새로운 분석
방법을 정립하였다.
우지를 사용하여 우지 칼슘비누와 마그네슘비누, 아연비누의 합성 최적
화를 수행하였고 hydrogenated beef tallow를 사용한 고체상의 calcium
stearate와 milky calcium stearate 합성의 최적화 작업을 수행하였다. 최적화
조건에서의 합성율은 우지 칼슘비누는 96.72 %, 마그네슘 비누가 81.27 %, 그
- II -
리고 아연 칼슘비누가 66.42 %의 합성률을 보였다.
폐수 발생량을 최소화 할 수 있는 실험을 진행하였고 Boiling water 처
리에 의한 글리세린의 제거 및 회수 공정의 타당성에 대한 연구도 수행하였
다. 공정개선이나 공정변화 대처를 위하여 효소반응 mechanism을 규명하였다
또한 Scale-up 인자에 대한 분석을 하여 Pilot system에서의 최적화 시험을
하였고 경제성 검토를 수행하였다.
- III -
Abstract
The enzyme as the catalyst does a catalyst activity if substrate and
condition are suitable like the chemical catalyst. Especially, reaction of
lipase does a forward reaction and backward reaction according to the
condition. The objectives of this study are to synthesize the metallic soap
by using a enzyme in resulting in energy reduction and environmental
friendly process compared with the conventional process. Metallic soap is
used for lubricant in wax, crayon, pencil and used for waterproof agent of
cement, explosive, brick etc. Also, it is used for conditioning agent of food
and pharmaceutical product, hair treatment agent, pearl agent of cosmetics,
pearl agent and PVC stabilizer. Metallic soap is produced by fusion process
and double decomposition process but these two methods breed much
wastewater and energy intensive because of high temperature and high
pressure.
In screening test, Lipolase 100-T and Liposam SDL-451 from
Alcaligenes sp, Pseudomonas sp, Rhizopus sp. showed relatively good
efficiencies for the synthesis of metallic soap by beef tallow and calcium
stearate by hydrogenated beef tallow.
There are CTFA law and FCCⅢ law that is analysis law to express
calcium stearate's content by CaO (%) for analyze Calcium stearate. But
two methods have included weakness to quantity of free Ca(OH)2. So,
established new analysis method to measure pure calcium stearate's
quantity removing free Ca(OH)2.
- IV -
Established optimal condition that produce calcium soap and
magnesium soap and zinc soap by beef tallow. And established optimal
condition that produce calcium stearate at solid phase and milky calcium
stearate by hydrogenated beef tallow. Under optimization condition, the
conversion ratio showed calcium soap 96.72 %, magnesium soap 81.27 %,
zinc soap 66.42 %.
Achieved test for wastewater occurrence minimization and achieved
study for exclusion and recycling process of glycerin by boiling water
treatment. Examined closely enzyme reaction mechanism for process
change provision or process improvement. Tested optimization in Pilot
system by analysis about Scale-up factor and achieved economic
performance examination.
- V -
목 차
국문요약 ………………………………………………………………………………Ⅰ
Abstract ……………………………………………………………………………… Ⅲ
목차 ………………………………………………………………………………… Ⅴ
List of Tables ……………………………………………………………………… Ⅹ
List of Figures …………………………………………………………………… XIII
Ⅰ 서론 ……………………………………………………………………………… 1
1. 리파아제 ………………………………………………………………………… 1
2. 비누 ……………………………………………………………………………… 5
3. 금속비누 ………………………………………………………………………… 7
4. 복 분해법과 용융법 …………………………………………………………… 8
5. 금속비누의 생물학적 합성법 ………………………………………………… 10
Ⅱ 재료 및 방법 …………………………………………………………………… 12
1. 재료 ……………………………………………………………………………… 12
2. 실험방법 ………………………………………………………………………… 12
2.1 리파아제의 역가측정방법 ………………………………………………… 12
2.1.1 적정법에 의한 리파아제의 역가 측정방법 ………………………… 15
2.1.2 Ruben method에 의한 역가 측정방법 ……………………………… 16
2.1.3 흡광광도법에 의한 역가의 측정방법 ………………………………… 17
2.1.4 TLC/FID를 이용한 리파아제의 역가측정 …………………………… 18
2.2 G.C를 이용한 지방산의 조성 확인방법 ………………………………… 18
2.3 유지의 가수분해 …………………………………………………………… 19
2.4 지방산의 정량과 가수분해율의 측정방법 ……………………………… 20
- VI -
2.5 금속비누의 합성방법 ……………………………………………………… 20
2.6 TLC/FID를 이용한 반응물의 조성 확인 방법 ………………………… 21
2.7 FI-IR를 이용한 생성물의 확인 …………………………………………… 25
2.8 AAS를 이용한 미 반응 Ca(OH)2의 확인 ……………………………… 25
Ⅲ. 결과 및 고찰 …………………………………………………………………… 28
1. 리파아제의 선정 ……………………………………………………………… 28
1.1 리파아제의 역가 비교 ……………………………………………………… 28
1.2 우지 금속염 합성용 리파아제 선정 ……………………………………… 31
1.3 Lipolase 100T의 온도에 따른 Activity변화 …………………………… 35
1.4 Calcium stearate 합성용 리파아제의 선정 …………………………… 35
2. Calcium stearate 분석 방법의 정립 ………………………………………… 39
2.1 Calcium stearate 합성율의 측정 ………………………………………… 39
2.1.1 중화값(Ⅰ) 측정법 ……………………………………………………… 43
2.1.2 중화값(Ⅱ) 측정법 ……………………………………………………… 45
2.1.3 비누화값 측정법 ………………………………………………………… 45
2.1.4 Calcium stearate의 산 분해 실험 …………………………………… 46
2.2 용매를 이용한 calcium stearate 분석 방법 …………………………… 47
2.2.1 수분량의 측정 …………………………………………………………… 49
2.2.2 용매추출실험 ……………………………………………………………… 49
(가) 용매 선정을 위한 실험 ………………………………………………… 53
(나) 추출온도가 Chloroform의 추출 특성에 미치는 영향 ……………… 53
(다) 용매 에탄올을 사용한 반복추출실험 ………………………………… 53
(라) 용매 Chloroform을 사용한 반복추출실험 …………………………… 56
(마) Chloroform을 이용한 Calcium Stearate에서의 미 반응물 추출… 56
(바) Chloroform을 이용한 각종 시료의 반복추출 실험 ………………… 63
- VII -
(사) Calcium stearate 시료의 시간에 따른 추출실험 …………………… 68
(아) Beef Tallow의 산 처리에 따른 TG, DG, MG 및 FFA 조성의
변화 ………………………………………………………………………… 71
2.2.3 분석 방법 정립 …………………………………………………………… 71
(가) 용매 선택 실험 ………………………………………………………… 76
2.3 Calcium stearate를 CaO % 함량으로 나타내는 분석방법 …………… 79
2.3.1 CTFA 분석법 …………………………………………………………… 79
2.3.2 FCCⅢ 분석법 …………………………………………………………… 81
2.3.3 미반응 Ca(OH)2 제거 방법 정립 ……………………………………… 82
2.3.4 미반응 지방산 분석방법 정립 ………………………………………… 89
3. 우지 금속염 반응조건 최적화 ……………………………………………… 89
3.1 Calcium Hydroxide와 물의 첨가량 최적화 …………………………… 89
3.2 반응온도와 효소 첨가량의 최적화 ……………………………………… 95
4. 여러 가지 우지 금속염 합성 실험 ………………………………………… 98
4.1 우지 마그네슘염 합성 ……………………………………………………… 98
4.1.1 실험계획 …………………………………………………………………… 98
4.1.2 효소선정 실험 …………………………………………………………… 98
4.1.3 마그네슘염 선정실험 …………………………………………………… 99
4.1.4 효소 및 마그네슘염과 물의 사용량 최적화 ………………………… 99
4.1.5 온도별 반응 실험 및 최적화 실험 …………………………………… 104
4.2 우지 아연염 합성 ………………………………………………………… 104
4.2.1 실험계획 ………………………………………………………………… 104
4.2.2 효소 및 아연염과 물의 사용량 최적화 ……………………………… 108
4.2.3 최적조건 ………………………………………………………………… 108
5. Calcium stearate의 합성 …………………………………………………… 112
- VIII -
5.1 고체상 Calcium Stearate의 생산 최적화 ……………………………… 112
5.1.1. 반응시간 및 온도와 금속염 ………………………………………… 112
5.1.2 고체상태에서의 합성반응 규명 ……………………………………… 116
5.1.3 Calcium stearate의 합성 분포 비교 ………………………………… 116
5.1.4 물의 첨가 ………………………………………………………………… 120
5.2 Milky calcium stearate의 생산 ………………………………………… 120
5.2.1 계면활성제를 이용한 생산 …………………………………………… 120
5.2.2 H2O의 첨가를 이용한 milky calcium stearate의 제조 …………… 122
5.2.3 Fresh water를 통한 milky calcium stearate의 합성율 개선 …… 126
5.2.4 Milky calcium stearate 생산에서 pH, 지방산의 변화 …………… 129
5.2.5 효소 재사용 검토 ……………………………………………………… 129
6. 분말 calcium stearate의 형성 및 폐수 최소화 실험 …………………… 129
6.1 300 ㎖ 반응기 실험방법 ………………………………………………… 134
6.2 300 ㎖ 반응기 실험결과 ………………………………………………… 134
6.3 1ℓ 반응기 실험방법 ……………………………………………………… 136
6.4 1ℓ 반응기 실험결과 ……………………………………………………… 139
7. Glycerin 회수에 관한 연구 ………………………………………………… 139
7.1 Boiling Water 처리에 의한 글리세롤 수분제거 실험 ……………… 139
7.2 Boiling Water 내로 미 반응물질의 추출가능성 실험 ……………… 142
8. 효소반응 mechanism ………………………………………………………… 142
8.1 포화 Ca(OH)2의 농도와 pH ……………………………………………… 145
8.2 Ca2+
이온과 pH가 리파아제의 활성에 미치는 영향 …………………… 145
8.3 리파아제의 product inhibition 효과와 hydroxide ion 영향 ………… 147
8.4 지방산과 금속염과의 상관관계 ………………………………………… 153
8.5 효소 반응 mechanism 정리 ……………………………………………… 153
- IX -
9. Scale-up 관련인자 …………………………………………………………… 157
9.1 Calcium stearate 반응기의 scale-up …………………………………… 157
9.1.1 기하학적 구조의 scale-up …………………………………………… 157
9.1.2 작동변수의 scale-up …………………………………………………… 157
9.2 Scale-up 인자 변화에 의한 calcium stearate의 합성실험 ………… 159
9.2.1 실험방법 ………………………………………………………………… 159
9.2.2 실험결과 ………………………………………………………………… 161
10. Pilot system과 1ℓ반응기에서의 calcium stearate 합성 ……………… 166
10.1 효소량 최적화 실험 ……………………………………………………… 166
10.2 반응용수(H2O)량 결정 실험 …………………………………………… 171
10.3 교반 속도 결정 실험 …………………………………………………… 171
10.4 반응시간 결정 실험 ……………………………………………………… 178
10.5 효소 pluse 투입 실험 …………………………………………………… 178
11. Calcium stearate 경제성 검토 …………………………………………… 183
Ⅳ. 결론 …………………………………………………………………………… 186
Ⅴ. 참고문헌 ……………………………………………………………………… 189
- X -
List of T ables
Table 1. Properties of metallic soap processes ……………………………… 9
Table 2. Commercialized Lipase that use in an experiment ……………… 13
Table 3. Composition of hydrogenated oil that use in an experiment … 14
Table 4. Separation analysis of each composition by TLC/FID ………… 22
Table 5. Separation quantitative analysis of standard material by
TLC/FID ………………………………………………………………… 23
Table 6. Fatty acid properties and composition of the oil and fat by GC
analysis ………………………………………………………………… 33
Table 7. Analysis and composition of fatty acids of refined hydrogenated
beef tallow ……………………………………………………………… 34
Table 8. Composition of calcium stearate at a hydrolysis experiment that
use acid … …… … …… …… … …… …… …… … …… …… … …… …… 48
Table 9. Calcium stearate decrease (dry during 50o
C, 26 hours) ………… 52
Table 10. Extraction property of material that do not react in Chloroform
by extraction temperature …………………………………………… 55
Table 11. Step decrease tendency by repeat extraction experiment …… 58
Table 12. Decrease tendency of Calcium stearate sample by repeat
extraction number of times ………………………………………… 61
Table 13. Decrease tendency of Calcium stearate sample by repeat
extraction number of times ………………………………………… 65
Table 14. Ratio of each ingredient about beef tallow ……………………… 73
- XI -
Table 15. Ratio of each ingredient about solution that treated beef tallow
by acid ………………………………………………………………… 73
Table 16. Comparison of CTFA analysis law and FCC Ⅲ analysis law․84
Table 17. CTFA and FCC Ⅲ analysis result by sample ………………… 85
Table 18. Extraction efficiency comparison by concentration of NH4Cl
solution ………………………………………………………………… 87
Table 19. Amount of Ca (OH) 2 that do not react in industry grade, a
reagent grade and calcium stearate emulsion …………………… 88
Table 20. Amount of free fatty acid …………………………………………… 91
Table 21. The milky calcium stearate production using nonionic
surfactant ……………………………………………………………… 123
Table 22. Experiment condition of H2O quantity control at calcium
stearate synthesis …………………………………………………… 124
Table 23. Experiment condition and reaction result in 300㎖ reactor … 135
Table 24. Experiment condition and reaction result in 1ℓ reactor …… 140
Table 25. CaO content change (Type Ⅰ) of last product by the stirring
speed …………………………………………………………………… 163
Table 26. CaO content change (Type Ⅱ) of last product by the stirring
speed …………………………………………………………………… 165
Table 27. Synthesis condition of 1ℓ reactor and 100ℓ reactor ……… 169
Table 28. Change of CaO Quantity by the enzyme amount in 1ℓ
reactor ………………………………………………………………… 170
Table 29. Change of CaO Quantity by the enzyme amount in 100ℓ
reactor ………………………………………………………………… 172
- XII -
Table 30. Change of CaO Quantity by the water amount in 1ℓ
reactor ………………………………………………………………… 174
Table 31. Change of CaO Quantity by the water amount in 100ℓ
reactor ………………………………………………………………… 175
Table 32. Change of CaO Quantity by the stirring speed in 1ℓ
reactor ………………………………………………………………… 176
Table 33. Change of CaO Quantity by the stirring speed in 100ℓ
reactor ………………………………………………………………… 177
Table 34. Change of CaO Quantity by the enzyme amount and
reaction time in 1ℓ reactor ……………………………………… 179
Table 35. Change of CaO Quantity by the reaction time in 100ℓ
reactor ………………………………………………………………… 180
Table 36. CaO content change by the enzyme pluse injection in 1ℓ
reactor ………………………………………………………………… 181
Table 37. CaO content change by the enzyme pluse injection in 100ℓ
reactor ………………………………………………………………… 182
Table 38. Calcium stearate's economic performance analysis …………… 185
- XIII -
List of Fig ures
Figure 1. Reversible reaction of lipase ………………………………………… 2
Figure 2. The chemical of soap manufacture ………………………………… 6
Figure 3. Standard chromatogram of composite by TLC/FID …………… 24
Figure 4. Calcium stearate confirmation by FT-IR analysis ……………… 26
Figure 5. Ca2+
ion analysis weigh use AAS ………………………………… 27
Figure 6. Lipase activity of various commercial lipases …………………… 29
Figure 7. Hydrolysis of olive oil by various lipases ……………………… 30
Figure 8. Conversion ratio of Beef tallow metallic salts by various
lipases …………………………………………………………………… 32
Figure 9. Effect of temperature on the Activity of Lipolase 100T ……… 36
Figure 10. Analysis of hydrogenated beef tallow by G.C ………………… 37
Figure 11. Lipase activity at 60℃ by commercial lipases ………………… 38
Figure 12. Measurement of fatty acid quantity ……………………………… 40
Figure 13. Hydrolysis ratio of lipase at different pH ……………………… 41
Figure 14. Measurement of Lipase activity …………………………………… 42
Figure 15. The Method of measurement yield of a calcium stearate by
the acid value law ………………………………………………… 44
Figure 16. Process flowchart for extraction of by-product and un-reactant
in Calcium stearate ………………………………………………… 50
Figure 17. A weight change according to the dryness time of Calcium
stearate ………………………………………………………………… 51
Figure 18. Extraction analysis result of un-reactant by solvent ………… 54
- XIV -
Figure 19. The repeat extraction experiment by Ethanol and
chloroform …………………………………………………………… 57
Figure 20. A mass change of the test sample according to the extraction
number of times …………………………………………………… 59
Figure 21. The repeat extraction by Chloroform …………………………… 60
Figure 22. Decrease tendency of Calcium stearate sample by repeat
extraction number of times ……… ……… ……… ……… ……… 62
Figure 23. Repeat extraction experiment result by chloroform for calcium
stearate that is created from hydrogenated beef tallow ……… 64
Figure 24. Decrease tendency of Calcium stearate sample according to
repeat extraction number of times ……………………………… 66
Figure 25. Decrease tendency of samples by repeat extraction of
Chloroform …………………………………………………………… 67
Figure 26. When extract various kinds Calcium stearate samples four times
repeat, average mass of samples and the average yield …… 69
Figure 27. When extract four samples by Chloroform, concentration change
of un-reactant in extracted solution by extraction time …… 70
Figure 28. Analysis result of beef tallow by TLC/FID …………………… 72
Figure 29. Amount of TG, DG, MG, FFA after treatment Beef Tallow
by acid ………………………………………………………………… 74
Figure 30. concentration ratio between TG and each ingredient about
samples of before acid treatment and behind acid treatment․75
Figure 31. Flowchart for calculation yield …………………………………… 77
Figure 32. Effect that extraction temperature gets in the extracted
amount of un-reactant ……………………………………………… 78
- XV -
Figure 33. CTFA analysis law ………………………………………………… 80
Figure 34. FCCⅢ analysis law ………………………………………………… 83
Figure 35. Free Ca(OH)2 exclusions process flowchart …………………… 86
Figure 36. Free fatty acid analysis method ………………………………… 90
Figure 37. The conversion ratio of beef tallow metallic salts by time … 93
Figure 38. The conversion ratio of beef tallow metallic salts by the H2O
addition ………………………………………………………………… 94
Figure 39. The conversion ratio of beef tallow metallic salts by reaction
temperature …………………………………………………………… 96
Figure 40. The conversion ratio of beef tallow metallic salts by the
emzyme addition … …… …… …… …… …… …… …… …… …… … 97
Figure 41. The conversion ratio of beef tallow magnesium salt by
various lipases ……………………………………………………… 100
Figure 42. The conversion ratio of beef tallow magnesium salt by
various magnesium salts ………………………………………… 101
Figure 43. The conversion ratio of beef tallow magnesium salt by
amount of enzyme ………………………………………………… 102
Figure 44. The conversion ratio of beef tallow magnesium salt by
amount of magnesium salt ……………………………………… 103
Figure 45. The conversion ratio of beef tallow magnesium salt by
amount of water …………………………………………………… 105
Figure 46. The conversion ratio of beef tallow magnesium salt by
reaction temperature ……………………………………………… 106
Figure 47. The conversion ratio by time in optimal synthesis condition
of beef tallow magnesium salt ……… ……………… ………… 107
- XVI -
Figure 48. The conversion ratio of beef tallow zinc salt by amount of
enzyme ……………………………………………………………… 109
Figure 49. The conversion ratio of beef tallow zinc salt by amount of
zinc salt ……………………………………………………………… 110
Figure 50. The conversion ratio of beef tallow zinc salt by amount of
water ………………………………………………………………… 111
Figure 51. The conversion ratio of beef tallow zinc salt by time in
optimal ondition …………………………………………………… 113
Figure 52. Time curve of calcium stearate conversion at each
temperature ……………………………………………………………114
Figure 53. The time courses of calcium stearate conversion …………… 115
Figure 54. A photograph of calcium stearate process at solid phase … 117
Figure 55. Conversion ratio of calcium stearate at solid phase ………… 118
Figure 56. Distribution tendency of synthesis calcium stearate at solid
phase ………………………………………………………………… 119
Figure 57. Conversion ratio of calcium stearate by adding H2O at solid
phase ………………………………………………………………… 121
Figure 58. Conversion ratio of milky calcium stearate by H2O quantity․125
Figure 59. Hydrolysis tendency by time at calcium stearate synthesis
process ……………………………………………………………… 127
Figure 60. The time course of milky calcium stearate …………………… 128
Figure 61. The effect of rpm at milky calcium stearate production …… 130
Figure 62. A photograph of milky calcium stearate process …………… 131
Figure 63. Variation of pH and fatty acid in milky calcium stearate
production …………………………………………………………… 132
- XVII -
Figure 64. Conversion ratio and activity of recycling enzyme ………… 133
Figure 65. A photograph of separated powder calcium stearate in 300㎖
reactor ……………………………………………………………… 137
Figure 66. Confirmation of calcium stearate by FT-IR analysis ……… 138
Figure 67. Glycerine exclusion process ……………………………………… 141
Figure 68. TLC-FID analysis result of distilled water before an
experiment and after boiling 2 hours ………………………… 143
Figure 69. Enzyme reaction mechanism ……………………………………… 144
Figure 70. The effect of calcium ion on lipase activity ………………… 146
Figure 71. The effect of calcium ion concentration on lipase activity … 148
Figure 72. The effect of pH on lipase activity …………………………… 149
Figure 73. Product inhibition of Liposam SDL-451 ……………………… 150
Figure 74. The effect of calcium stearate on lipase activity …………… 151
Figure 75. The effect of hydroxide ion on calcium stearate production․152
Figure 76. An interaction of calcium stearate and fatty acid …………… 154
Figure 77. Influence about the lipase by Ca(OH)2 ………………………… 155
Figure 78. Influence about the conversion ratio by OH-
………………… 156
Figure 79. Scale up by standard size ratio ………………………………… 158
Figure 80. Scale up model by operation variable ………………………… 160
Figure 81. Conversion ratio(Type Ⅰ) by the stirring speed …………… 162
Figure 82. Conversion ratio(Type Ⅱ) by the stirring speed …………… 164
Figure 83. A photograph of 100ℓ reactor ………………………………… 167
Figure 84. A photograph of parts of 100ℓ reactor ……………………… 168
Figure 85. A photograph of calcium stearate synthesis process in 100ℓ
reactor … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 1 73
- 18 -
Ⅰ . 서 론
1 . 리 파 아 제
효소는 단백질로 된 생체촉매 (Bio-Catalyst)로서 그 자신은 반응의 전후
에서 변화하지 않으면서 화학반응의 속도를 빠르게 하며 효소의 대부분은 생
물의 세포 내에 존재하면서 생물체에서 볼 수 있는 모든 물질대사를 촉매하고
있다. 이러한 촉매작용은 특정기질에 한하며 (기질 특이성) 이러한 기질 특이
성에는 유사한 일군의 기질 중 특이적으로 한 종의 기질만을 촉매 하는 절대
적 특이성, 일정한 기를 가진 한 그룹의 기질을 특이적으로 촉매 하는 절대적
군 특이성과 어떤 그룹의 기와는 우선적으로 반응하며 다른 그룹과도 어느 정
도 반응하는 상대적 군 특이성 및 기질의 광학적 구조의 상이에 따라 특이성
을 나타내는 광학적 특이성이 있다.
효소는 단백질로 되어 있기 때문에 열에 불안정하며 온도, pH에 의해서
영향을 받는다(1). 촉매로서의 효소는 생체 내에서뿐만 아니라 화학촉매와 마
찬가지로 생체의 외부에서도 기질과 조건이 적당하면 작용을 하는 특성이 있
어서 효소의 생산과 산업적 이용이 급속도로 발전되어 왔다. 이 중 지질분해
효소(리파아제)는 중성지방을 가수분해하는 효소로서 지질과 관련된 생체내의
동화작용과 이화작용을 담당하며 이러한 작용을 이용하여 유지와 관련된 분야
에서 리파아제를 이용할 수 있으며 실제로 상업화도 되어있다. 특히 리파아제
의 반응은 비가역반응이 아니라 가역반응으로서 Figure 1과 같이 반응계의 조
건에 따라 정반응과 역반응을 일으킨다(2). 양 반응의 평형관계는 반응액 중의
몰농도에 의해 지배되며 일례로 반응계 중 수분이 충분할 경우에는 가수분해
반응을 일으키고 최소한의 수분만이 존재할 경우에는 에스터 합성반응을 일으
킨다(17). 이러한 특성을 이용하여 반응조건을 적당히 조절하면 고부가가치의
- 19 -
Sufficient HOH
Enzyme Enzyme
RCOOR RCO-Enz RCOOH
R'OH HOH
(a) Enzymatic ester hydrolysis
Minimum HOH
Enzyme Enzyme
RCOOH RCO-Enz RCOOR'
HOH HOH
(b) Enzymatic ester synthesis
Fig ure 1 . R ev ersible reaction of lipase
- 20 -
여러 가지 유용물질을 선택적, 효율적으로 생산할 수 있다. 또한 기질의 특이
성을 이용하여 화학적으로는 만들어낼 수 없는 이성질체의 합성도 가능하다
(3, 4). 리파아제는 동물의 췌장, 식물, 곰팡이, 효모, 세균에서부터 얻어 지고
있으며(5) 이 중 미생물 유래의 리파아제가 동물이나 식물에서 얻어지는 리파
아제에 비해서 생산비가 훨씬 적게 들며, 계절이나 지역에 제한조건이 없고
대량생산이 가능하며 열에 대한 안전성이 더 크다(6). 미생물에서 분리한 리파
아제는 유지 산업과 식품산업 및 세제산업 등 각종 산업에서 다양하게 사용되
고 있다. 예를 들어 합성세제의 경우 세정대상 오염에는 인체에서 분비되는
피지, 식용유, 음식물로부터의 지방분이 다량 함유되어 있으며 이러한 지질오
염은 단백질 오염에 비하여 약 4～5배 정도로 많다. 합성세제에 리파아제를
혼합하면 지질오염의 제거율이 대폭 상승되는 이유로 리파아제의 사용량도 점
차로 증가하는 추세이다(7). 이외에도 리파아제는 화장품, 두유, 알콜 음료 등
광범위하게 산업적으로 이용되고 있다.
현재 유지를 가수분해하여 지방산을 얻는 방법으로는 고온고압분해법
(Colgate-Emergy Process), 알칼리분해법(Saponification Method), 알콜분해법
(Alcoholysis Method), 효소분해법(Enzymatic Hydrolysis Method) 등이 알려
져 있다. 이들 여러 방법 가운데 가장 일반적으로 사용되고 있는 방법은 고온
고압분해법을 들 수 있는데(8) 운전조건인 190～250℃, 10～30 atm에서 9～10
시간 반응시 가수 분해율이 약 90% 이상에 도달하나 운전조건, 반응조건 및
설비에 있어서 문제점이 있는 것으로 되어 있으며(9) 고온 고압에 의한 유지
의 산패(Rancidity), 자동 산화로 인한 과산화물의 생성(Peroxidization), 악취
생성(Odorization), 색도변화(Decolorization) 등의 고품질 지방산 생산의 한계
가 있다. 알칼리 분해법 역시 에너지 소모가 크며 수율이 낮은 단점이 있고
알콜 분해법 역시 설비가 대형이고 에너지 소모가 큼은 물론 폭발이나 화재의
위험까지 수반된다. 이에 비해 리파아제에 의한 유지분해 공정은 에너지 비용
- 21 -
이 절감되고 설비비가 적으며 품질과 작업환경을 개선할 수 있는 장점이 있으
나 유지분해에 사용하는 리파아제가 몇 가지 특성을 갖추어야 한다. 리파아제
는 Hydrolysis, Esterification, Interesterification의 3가지 반응을 수행하는 것
으로 알려져 있다(16). 이 중 Hydrolysis에 사용되는 리파아제는 글리세롤에
에스테르 형태로 결합되어 있는 1,2,3 위치의 지방산을 결합 위치에 상관없이
분해하여야 하며 Chain의 길이와 종류에 상관없이 다양한 기질을 분해할 수
있는 특성과 내열성이 있어야 한다. 이러한 이유로 아실기의 탄소수는 높지만
불포화도가 높은 관계로 녹는점이 낮은 카스터 오일(Castor oil) 등의 유지를
사용하거나(10) 리파아제의 단점을 보완하기 위해 제올라이트(Zeolite) 등의 담
체를 사용하여 고정화 효소로 팜유(Palm oil) 등의 유지를 가수분해 하기도
한다(11).
지질을 분해하는 리파아제는 일반적으로 기질에 대한 반응 특이성에 따
라 위치 특이성(1,3-specific and non-specific), 지방산에 대한 반응 특이성,
부분 글리세리드(partial glyceride) 분해 특이성, 인지질 및 지단백질 분해 특
이성 리파아제의 4가지로 분류 할 수 있다(12). 첫째 1,3-특이적 리파아제는
트리글리세리드의 세 아실기를 전부 절단하지 못하고 1번 위치와 3번 위치의
아실기만을 절단하기 때문에 가수분해용보다는 모노글리세리드나 디글리세리
드의 합성이나 에스터 교환반응, 합성반응에 적합한 것으로 알려져 있다(13).
두 번째 지방산의 반응 특이성은 아실기의 탄소수, 포화․불포화 등의 구조
차이에 따라 상대적 반응 속도가 달라지는 경우이다. 대부분의 효소는 불포화
지방산의 경우가 반응속도가 더 빠른 것으로 알려져 있다(14). 부분 글리세리
드 분해 특이성은 트리글리세리드 보다 디글리세리드나 모노글리세리드를 분
해하는 속도가 훨씬 빠른 현상으로 가수분해를 위해서는 다른 효소와 조합해
서 사용되어야 한다(15). 인지질 분해 특이성 리파아제는 반응속도가 느리고
1,3-특이적 리파아제라서 가수분해용으로는 적합하지 않다.
- 22 -
2. 비누(Soap)
지방산에 알칼리를 반응시켜 생성되는 지방산 염은 지방산 알칼리 금속
염과 지방산 비알칼리 금속염으로 나누어 볼 수 있다. 지방산에 NaOH, KOH
등의 알칼리를 작용시켜 얻어지는 지방산 알칼리 금속염을 비누(Soap)라고 하
며 수용성으로서 주로 세정의 목적으로 사용되며 알칼리 금속을 제외한 금속
염을 금속비누라고 한다. 일반적으로 비누는 Figure 2에서와 같이 2가지 화학
적인 방법으로 생산한다(18). 첫 번째는 검화법(Saponification of triglyceride)
이며 두 번째 방법은 중화법(Neutralization of fatty acids)이다. 검화법
(Saponification of triglyceride)에서 알칼리와 triglyceride는 서로 섞이지 않는
물질이지만 Saponification 반응은 자가 촉매반응으로 생성되는 비누에 의해서
서로 섞이지 않는 반응물이 에멀젼 형상을 만들기 때문에 반응속도가 증가되
게 된다(18).
Triglyceride + 3NaOH → 3RCOONa + Glycerin
중화법(Neutralization of fatty acids)은 지방산과 알칼리의 산-염기 중화반응
에 의해서 비누를 생산하며 아래의 반응식은 triglyceride와 알칼리의 반응을
보여준다.
RCOOH + NaOH → RCOONa + H2O
중화에 사용되는 알칼리(NaOH)의 양은 지방산의 분자량에 의해 식 (2.1)과
같이 계산 할 수 있으며 지방산의 평균 분자량은 식 (2.2)에 의해서 계산 할
수 있다.
NaOH = Weight fatty acid × 40MW fatty acid
(식 2.1)
MW fatty acid = 56.11 × 1000A.V
(식 2.2)
※ A.V(Acid value) = 지방산 1g을 중화시키는데 필요한 KOH의 mg수
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Saponification
3RCOONa + Glyceride NaOH (Soap) N eutral Fat Saponification process
RCO OCH2
RCO OCH
RCO OCH2
Triglyceride Fatty Acid N eutraliz ation process
Fat splitting 3RCOOH + Glyceride H20 (Fatty Acid)
Neutralization (NaOH)
3RCOONa (Soap)
Fig ure 2. T he chemical of soap manufacture
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3 . 금속비누
지방산과 수용성 무기 금속염, 또는 금속 산화물이나 금속 수산화물과
반응하여 얻어지는 지방산 비알칼리금속염을 금속비누(Metallic soap)라고 부
르며 일반적으로 결정성 고체이고 대체로 고체 이온의 빛깔을 띠고 있는 물에
난용성 또는 불용성인 물질이다. 이런 금속비누 중에서 Ca2+
이온과 스테아
린산이 결합된 칼슘스테아레이트가 산업적으로 대단히 많이 사용되고 있다.
금속비누는 기질과 반응시키는 수용성 무기 금속염, 금속산화물, 금속수산화물
등의 종류에 따라 다양한 종류의 금속비누를 얻을 수 있기 때문에 윤활제, 이
형제, 안정제, 촉매불활성제, 방착제, 제지코팅제, 시멘트 첨가제, 동물사료첨가
제, 의약품 원료 등 그 용도도 매우 다양하다(25, 57, 62). 예를 들어 지방산
나트륨과 황산알루미늄과의 수중에서의 복분해 반응에 의해 생성되는 알루미
늄 비누의 경우 섬유의 방수제, 페인트의 윤활제, 고온 고압용의 그리스
(greases), 윤활유 등으로 사용되며 지방산 나트륨과 아세트산 납과의 복분해
에 의해 생성되는 제일납비누나 사아세트산납과 지방산과의 반응에 의해 생성
되는 제이납비누는 바니쉬(varnishes)의 건조제, 극한 압력 하에서의 윤활유로
사용되고 있다. 칼슘비누의 일종인 칼슘스테아레이트는 직물, 시멘트, 회반죽
과 폭약의 방수제로 쓰이며 플라스틱 몰딩파우더를 위한 Releasing agent로
사용되고 있고 폴리비닐클로라이드레진을 위한 안정제로 사용되며 연필과 크
레용에서는 윤활유로 사용된다(19-23, 58). 식용 우지에서 유래된 지방산 칼슘
은 젖소의 산유량을 증가시키고 영양원으로 작용되기 때문에 사료의 원료로
사용되며 펄프의 성능 향상제로 이용되는 등 식품과 제지 분야에서도 많이 사
용되고 있다(24).
현재 이러한 금속비누를 합성하는 방법으로는 지방산 알칼리 금속염과
수용성 무기금속염과의 수용액 속에서의 복 분해 반응에 의해 금속비누를 침
전시키는 복 분해법(double decomposition process)과 용융된 지방산과 금속산
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화물이나 금속 수산화물 등과 반응시키는 용융법(fusion process)이 있으며
(34) 복 분해법과 용융법의 특성을 Table 1에 정리하였다.
4 . 복 분해 법 과 용융 법
복 분해법은 포화 또는 불포화 지방산과 가성소다를 용매 하에서 반응시
켜 먼저 지방산염을 만든 후에 수용성 금속염을 첨가시켜 Na+ 이온과 금속을
치환하는 과정을 거쳐 생산하는 방법이다. 87℃～ 90℃에서 반응하며 반응식
은 아래와 같다.
NaOH + RCOOH → RCOONa + H2O
2RCOONa + MeCl2 → Me(OOCR)2 + 2NaCl
복 분해법은 저농도 용액 중에서의 반응이므로 대용량의 반응기가 필요한 등
설비비가 많이 들고 제조공정이 복잡하며, 특히 반응중에 생성되는 NaCl이 반
응물에 잔류시 각종 사용용도에 따라 치명적인 영향을 주므로 수세 공정이 필
요하여 그에 따른 대량의 폐수가 발생된다. 또한 생산되는 금속비누가 다량의
수분을 함유하고 있어 건조공정이 필요하여 현재 상업적인 공정에서는 잘 사
용되고 있지 않다(26). 그러나 생성된 금속비누의 순도가 높고 색조와 안정성
이 뛰어난 장점이 있다.
용융법이란 용융된 지방산을 금속 산화물이나 금속 수산화물 등과 반응시키는
방법으로서 반응시간은 3.5 ～5 시간이며 용해법과 부분용해법, 반 용융슬러리
법, 산-금속 반응법의 4가지가 있다. 용해법은 고온( 162℃～ 204℃), 고압에서
용융된 지방산과 Metal oxide나 Metal hydroxide를 반응시켜 금속비누를 생산
하는 것으로 반응식은 다음과 같다.
MeO + 2RCOOH → Me(RCOO)2 + H2O
Me(OH)2 + 2RCOOH → Me(OOCR)2 + H2O
부분 용해법은 지방산과 Metal oxide에 소량의 물을 첨가한 후 반응시켜 반응
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D ouble decomposition
processFusion process
R eaction
T emperatureAmbient temperature High temperature
R eactionnRCOONa+MXn → (RCOO)nM+nNaX
(K) (nKX)
nRCOOH+MOn/2 → (RCOO)nM+N/2H2O
(M(OH)nM)
Characteristics
․Large scale reactor was
required.
․Washing, sewage treatment
and drying process were
required.
․Reaction hardly reaches
completion.
․High quality of raw material
was required.
․Reaction was performed
without solvent or with
mineral oil.
Cost High cost (High equipment
cost and many processes)Low cost
Q uality of
metallic soap
High purity
Excellent color and stabilitySlightly colored by heat
T able 1 . P roperties of metallic soap processes
- 27 -
중에 생성된 물이 반응 온도에 의해 제거되며 반응을 수행하는 방법이며 반
용융슬러리법은 지방산을 Metal oxide나 Metal hydroxide의 수용성 슬러리와
반응시켜 금속비누를 형성시키는 방법으로서 반응온도가 상대적으로 낮고 경
제적이지만 Granular size가 크거나 수분이 많아 분쇄가 곤란하여 분쇄 전에
건조공정이 필요하다. 산-금속 반응법은 지방산과 금속을 직접 반응시켜 수소
를 발생시키며 금속비누를 형성하는 반응으로 반응식은 다음과 같다(27-29).
2RCOOH + Me → Me(OOCR)2 + H2
용융법은 생성물의 점도가 높을 경우에 용융시 반응기내의 교반이 불가능하게
되고 이송이 어려우며, 고온으로 인한 생성물의 열변색이 발생하는 등 개선해
야 할 점들이 있다(30). 용융법은 무용액 조건이나 광물유 등의 불활성 액체
속에서 반응을 진행하며 여과 공정에서만 정제가 되므로 순도가 좋은 원료를
사용해야 한다. 용융법으로 생산된 금속비누는 미반응 지방산이나 원료 금속
화합물이 잔존하기 쉽고 고온 반응이므로 생성물의 색상이 나쁘다(31).
5. 금속비누의 생 물 학 적 합성법
현재 각종 산업에서 응용되고 있는 금속비누를 생산하는 화학적 방법은
설비비가 많이 들고 대량의 폐수의 발생으로 인한 환경 분담비용의 발생, 고
온에서의 반응으로 인한 열 변성 등의 문제가 있다. 이에 반하여 효소를 이용
한 금속비누의 제조 공정은 원유에 물과 Metal hydroxide을 혼합한 후 리파아
제를 촉매로 하여 금속비누를 합성하는 방법으로서 온화한 조건하에서의 반응
으로 열 변성 등의 문제가 없으며 간단한 장치설비로 운전이 가능하여 에너지
비용이 절감된다. 또한 설비가 간단하여 설비비 및 부지비용이 적게 소요되며
환경에 대한 피해가 적은 등의 여러 가지 장점이 있지만 효소의 가격이 고가
라는 단점으로 인해 범용적으로 실시하기가 어려웠었다. 그러나 계속적인 연
구로 내열성 리파아제를 사용하여 녹는점이 높은 유지를 가수분해하는 방법
- 28 -
(29, 54)과 효소를 친유성의 고분자 담체나 폴리에틸렌과 같은 다공성 담체에
고정화하여(32, 33) 사용하는 등 많은 연구가 진행되어 왔고 고유가 시대의 에
너지 비용 및 환경 분담금의 계속적인 상승으로 볼 때 장기적으로 상당히 바
람직한 방법이라 할 수 있다. 리파아제를 이용한 칼슘비누의 반응개요는 다음
과 같다.
RCO OCH2 HOCH2 Enzyme RCO OCH + H2O HOCH + 3RCOOH
RCO OCH2 HOCH2 Ca(OH)2 첨가
Ca(OOCR)2 + H2O
반응개요에서 볼 수 있는 것과 같이 효소를 사용하여 금속비누를 생산하는 생
물학적 방법은 리파아제가 먼저 유지를 가수분해하고 가수분해로 인해 생성된
지방산과 calcium hydroxide가 다음으로 반응을 하여 금속비누를 만드는 형식
으로 되어있다. 또한 사용되는 beef tallow나 hydrogenated beef tallow의 녹
는점이 높고 최종적으로 생성되는 금속비누의 pH가 알칼리염을 형성하는 관
계로 이러한 생물학적 합성을 위해서는 가수분해 능력이 우수할 뿐만 아니라
높은 온도와 알칼리 하에서도 활성이 우수한 호 알칼리 효소를 필요로 하게
된다. 따라서 기존의 화학적 합성방법과 비교하여 산업적으로 경쟁력이 있는
저렴한 효소와 90 % 이상의 합성율을 보일 수 있는 합성 방법이 관건이라 할
수 있으며 본 연구에서는 리파아제를 이용한 온화한 환경 하에서 금속비누를
합성하여 제품의 품질을 상승시키고 에너지의 소모가 적어 환경 부담을 줄이
는 환경 친화적이며 경제성이 뛰어난 대량생산 공정을 개발하여 금속비누 제
조의 새로운 청정기술을 확립하는 것을 목적으로 하였다.
- 29 -
Ⅱ . 재 료 및 방 법
1 . 재 료
본 연구에 사용한 효소는 이미 상업화되어 있는 리파아제로서 덴마크
NOVO NORDISK사의 Lipolase 100T(from Aspergillus oryzae), Lipolase
100L(from Aspergillus oryzae), Lipozyme IM(from Mucor miehei),
Lipozyme 10,000L(from Mucor miehei), 일본 Meito Sangyo사의 Lipase-OF
360,000(from Candida cylindracea), Lipase-PL(from Alcaligenes sp.),
Lipase-PLC(from Alcaligenes sp.), Lipase-PLG(from Alcaligenes sp.) 일본
Showa Denko사의 Liposam SDL-451(from Pseudomonas sp.) 핀란드
GENENCOR INTERNATIONAL Lumafast 2,000G(from Pseudomonas
mendocina), 네덜란드 GIST-BROCADES의 Lipomax CXT 1,000 일본
Amano Seiyaku사의 Lipase-A"Amano"(from Aspergillus niger), Lipase
F-AP15(from Rhizopus sp.)라는 제품명의 리파제들을 구하여 사용하였다. 각
리파아제에 대한 사항은 Table 2에 나타내었다.
경화유(Hydrogenated Beef Tallow)는 평화유지 제품과 웰가 제품을 사
용하였다. 각 회사별 경화유의 지방산 조성은 Table 3에 나타내었다. 나머지
시약들은 시약 등급의 것을 사용하였으며, pilot system에서 사용한 수산화 칼
슘은 식품첨가물 등급을 사용하였다.
2. 실 험 방 법
2.1 리 파 아 제 의 역 가 측 정 방 법
일반적으로 리파아제의 역가는 주어진 조건에서 리파아제 1g이 단위시간
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T able 2. Commercializ ed Lipase used in the ex periments
Product Name Manufacturer Micro-organism(origin) Price/Kg
Lipase-PL
Lipase-PLC
Lipase-PLG
Lipase-OF 360,000
Lipolase 100L
Lipolase 100T
Lipomax CXT
Liposam SDL-451
Lipozyme 10,000L
Lipozyme IM
Lumafast 2,000G
Lipase-A
Lipase F-AP15
MEITO SANGYO
MEITO SANGYO
MEITO SANGYO
MEITO SANGYO
NOVO NORDISK
NOVO NORDISK
GIST-BROCADE
SHOWA DENKO
NOVO NORDISK
NOVO NORDISK
GENENCOR
AMANO
SEIYAKU
Alcaligenens sp.
Alcaligenens sp.
Alcaligenens sp.
Candida cylindracea
Asperillus oryzae
Asperillus oryzae
Pseudomonas
Pseudomonas sp.
Mucor miehei
Mucor miehei
Pseudomonas mendocina
Aspergillus niger
Rhizopus sp.
￥12,000
￥12,000
￥12,000
￥26,000
$23
$23
$20
$17
$175
$524
$20
￥13,000
￥10,000
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T able 3 . Composition of hydrog enated oil that use in an
ex periment
Fatty Acid TypesPyungHwa
hydrogenated Oil
Wellga
hydrogenated Oil
C14 4.07% 4.84%
C15 0.57% 0.61%
C16 29.91% 28.43%
C17 2.36% 2.34%
C18 61.46% 61.20%
C18:1 0.14% 0.65%
C18:2 0.51% 0.36%
C20 0.99% 1.57%
- 32 -
당 1 μmol의 유리지방산을 생성시킬때 이를 1 UNIT라고 정의한다.
역가 (U/g) = 1 μmol 유리지방산리파제 1g × 1min (식 2.1a)
그러나 근원이 다른 모든 리파아제는 각각 다른 최적 조건과 다른 특이성을
가지고 있어서 각각의 리파아제 메이커들은 각 리파아제의 최적조건에서 역가
를 측정하도록 하고 있다. 따라서 상업화된 리파아제에 있어서 제시되는 역가
측정법에서는 반응기질, 반응온도, 반응시간 등이 모두 다르다. 다시 말하자면
리파아제의 제시된 역가는 그 리파아제의 근원과 종류, 특성에 따라 역가에
대한 기본적 정의는 같으나 각각의 반응 최적조건과 활성에 있어서 반응조건
이 달라질 때에는 절대적 개념이 되지 못하고 상대적 개념이 될 뿐이다. 따라
서 상업화된 여러 리파아제의 역가측정방법에 있어서는 기질의 종류, 유화제
의 종류, 해당성분의 비율, 온도조건, 반응조건 등이 모두 다르게 제시되어 있
어서 각 리파아제는 각각 상이한 역가단위를 사용하기 때문에 제시된 역가만
으로는 상대적 역가 또는 성능을 비교하기가 어렵다. 여러 가지 다른 근원의
리파아제들을 한 목적에 사용하고자 할 때에는 리파아제의 최적조건에 초점을
맞추는 것보다는 우선의 방향을 설정하고 이에 적합한 리파아제를 선정한 후
다시 이 조건을 최적화하여 나가는 것이 바람직하다. 어느 한 조건에서 우수
한 역가를 나타내는 리파아제라 할지라도 다른 조건에서는 그 역가를 제대로
발휘하지 못하는 경우가 많으므로 실제 반응조건에 근접하는 조건을 기준으로
하는 통일된 역가 체계를 정립하여야 한다.
2.1 .1 적 정 법 에 의한 리 파 아 제 의 역 가 측 정 방 법
효소반응을 위한 유화기질(emulsion substrate)로서 18.5g의 PVA 117,
1.5g의 PVA 205(PVA : Polyvinylalcohol)를 증류수에 녹여 1,000 ㎖로 한 다
음 이 용액 75 ㎖와 올리브유 22.5g을 합하여 Homogenizer로 11,000 rpm에
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서 5분 교반, 5분 정치하는 것을 2회 반복, 균질화 하여 5℃에서 1시간 정치
안정화한 다음 사용하였다(37, 38). 이 유화기질은 장시간 보존 시 산패와 유
화 안정성이 우려되어 유효사용기간을 48시간으로 한다. 유화기질 5 ㎖와
Mcllvaine Buffer(0.1M Potassium Dihydrogen Phosphate 39 ㎖와 Disodium
Hydrogen Phosphate 61 ㎖를 혼합하여 pH를 7.0으로 조절) 4 ㎖를 합하여 잘
섞어준 다음 37℃의 수욕 상에서 10분간 예열한 후 10 ppm의 리파아제 용액
1 ㎖를 가하여 잘 섞은 다음 37℃ 수욕 상에서 20분 반응시킨다. 아세톤/에탄
올(1:1)(v:v) 20 ㎖를 첨가하여 반응을 정지시키고 1 % 페놀프탈레인 지시약
5-6방울을 넣어 0.05N KOH/EtOH로 적정하였다. 유리된 지방산의 양과 역가
는 다음의 식으로 계산되었다. 여기서 f는 0.05N KOH의 농도계수이다.
유리지방산(μ mol) = (0.05N KOH의 ㎖ - Blank ㎖) × f × 50 (식 2.2b)
리파아제 기준역가(U/g) = 유리된 지방산의 양 (μ mol)시료 리파아제의양(g)×반응시간(min ) (식 2.3)
= (0.05N KOH ㎖ - blank ㎖ × f × 50시료 1 ㎖당 리파아제의양(g) ×반응시간(min ) (식 2.4)
2.1 .2 R uben method에 의한 역 가 측 정 방 법
Lipase의 활성을 측정하는 방법으로 Ruben(1993)의 방법을 사용할 수도
있다(56). p-nitrophenyl palmitiate(pNPP) 37.5mg을 2-propanol 2ml에 녹여
0.1% Triton X-100이 첨가된 50mM Tris-HCl(pH 8.0) 50ml에 소량씩 첨가하
면서 60℃의 온도에서 강하게 교반하여 준비하고 이를 기질용액으로 사용하였
다. 효소활성은 시료 0.2ml을 기질용액 3ml에 첨가하여 교반한 후 분광광도계
를 이용하여 410nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이때 배양액을 넣지 않은 시
- 34 -
료를 대조구로 사용하였다. 효소활성은 1umol의 pNP를 생성하는데 작용한 효
소위 양을 1unit로 환산하였다. Assay buffer(pH 8.0)에서 pNP의 molar
absorption coefficient 15100/M이었다.
2.1 .3 흡 광 광 도 법 에 의한 역 가 의 측 정 방 법
앞의 2.1.1의 적정법에서와 동일하게 제조한 유화 기질과 Mcllvainc
Buffer, 리파아제 용액의 혼합액에 6N HCI 0.1 ㎖을 첨가 30초 동안 vortex
mixer로 격렬하게 혼합하여 반응을 정지시키고 2,2,4-Trimethyl
pentane(Isooctane) 20 ㎖을 가하여 다시 30초동안 vortex mixer로 격렬하게
혼합한 후, 95 % 에탄올 0.5 ㎖을 조용히 가하여 상층과 하층을 분리시켰다.
기존의 Cupric acetate method(39)에 있어서 문제점으로 나타난 것이 첫째는
생성된 유리 지방산을 100 % 측정해 낼 수 없다는 것이고, 둘째로는 지방산
과 구리의 착염을 만들기 위하여 교반하고 난 뒤에 형성되는 유화상 때문에
실제 흡광도를 측정해야하는 isooctane을 분리해내기가 쉽지 않다. 이 때문에
원심분리를 행하거나 수욕 상에서 가열을 해 왔으나 효과적으로 유화를 파괴
하여 isooctane을 분리하기위한 대책이 되지 못하였다. 본 연구를 수행하면서
이 문제의 대안으로 극성용매로서 에탄올을 첨가하여 준 결과 이러한 문제점
이 어느 정도 해결되었다. 층 분리가 완결되어 상층부의 isooctane 5 ㎖를 취
하여 Cupric acetate 용액( 5 % Cupric acetate 용액을 Pyridine으로 pH 6.1
로 조절) 3 ㎖를 가하여 30초동안 vortex mixer로 격렬하게 섞어준 다음 순수
isooctane을 바탕(blank)으로 하여 705nm에서 흡광도를 측정하였다. 유리된 지
방산의 양과 리파아제의 기준 역가는 다음의 식으로 계산되었다.
유리된 지방산(μ mol) = 5 × (43.807 × 흡광도 - 0.2987) (식 2.5)
- 35 -
기준 역가(U/g) = 5×(43.807 ×흡광도- 0.298)시료 1 ㎖당 리파아제의양(g) ×반응시간(min ) (식 2.6)
2.1 .4 T LC/ FI D 를 이용한 리 파 아 제 의 역 가 측 정
일본 IATRON사의 TLC/FID(Thin layer Chromatography/Flame
Ionization Detector) IATROSCAN MK-5를 사용하여 각 성분을 분리한 후
확인된 지방산의 면적 분율로서 계산하였다. 이 방법은 글리세린을 미리 제거
한 후 정량하게 되어 피크에 글리세린이 나타나지 않게 되어 이때의 지방산의
면적 분율이 곧 가수분해의 진행도가 되어 이를 가수 분해율로 나타낼 수 있
어 많은 시료를 단 시간 내에 측정 할 수 있는 편리한 방법이다. 20분 반응
후 반응을 정지시키고 시료를 취하여 3,600rpm에서 15분간 원심 분리하여 글
리세롤을 제거한 후 상층부의 유층을 100 μl 취하여 클로로포름에 녹인 후 박
층 크로마로드 CHROMAROD-SⅢ에 시료 1 μl를 점적(Spotting)하여 100
mm의 높이로 전개하였다. 전개 용매는 벤젠 : 클로로포름 : 아세트산을 70 :
30 : 2의 부피비로 혼합하여 조제한 것이 우수한 분리능을 보였다(40).
TLC/FID의 분석조건으로는 수소는 160 ㎖/min, 공기는 2.0l/min으로 하였고
Scan speed는 30초로 하였다. 결과처리는 일본 IATRON사의
IATROCORDER TC-21을 사용하였으며 Attenuation 64 mV/F.S., Chart
speed 10.0 cm/min으로 하였다.
2.2 G .C를 이용한 지 방 산 조 성 확 인방 법
기질로 사용되는 경화유의 지방산 조성을 확인하기 위해서 미국
HEWLETT PACKRD사의 GC(Gas Chromatograph) HP 5890을 사용하였다
(25). 시료는 지방산을 유도체 화한 FAME(Fatty Acid Methyl Ester)사용하였
으며 시료 전처리 및 기기 조건은 다음과 같다. 시료는 먼저 유지
- 36 -
(Triglyceride)인 경우 1g을 취해 20 ㎖ 0.5N KOH/Methanol로 사욕조(Sand
bath)에서 환류냉각기가 부착된 상태로 1시간비누화 시킨 후 수욕조(Water
bath)에서 20 ㎖ BF3/Methanol로 공기 냉각기가 부착된 상태로 15분간 메틸
화(Methylation)반응을 한다. 반응이 끝나면 석유에테르 20 ㎖로 추출한 후 이
중 3 ㎖를 취해 Hexane으로 50 ㎖로 채워 시료를 만들고 시료 주입 양은 1
㎕로 하였다. 칼럼은 SUPELCO사의 SUPELCOWAX 10(30m×0.53㎜×1㎛)으로
서 극성(polar)인 모세관 칼럼(Capillary column)을 사용하였으며, 운반 기체
(Carrier Gas)로는 질소 (N2)를 사용했고 주입구 압력을 20 psi로 하였다. 주입
구(Injection) 온도는 240℃이고 검출기(Detector) 온도는 250℃이며 내부
(Oven) 온도는 처음에 110℃에서 5℃/min 간격으로 230℃까지 올려 주었다.
분리된 시료의 확인은 불꽃 이온화 검출기(Flame Ionization Detector FID)를
사용했으며 수소(H2)는 20 psi, 공기(Air)는 40 psi로 하였다(51). 피크 면적
(Peak Area)과 머무름 시간(Retention Time)의 확인은 HP 3390A 적분기를
사용하였다.
2.3 유 지 의 가 수 분해
가수분해 반응을 위하여 진탕기와 속도가 조절되는 가수분해 반응기
(Dissolution Tester)를 사용하여 실험을 진행하였다. 진탕기에서는 총량 200g
을 사용하였으며 가수분해 반응기에서는 총량 800g을 사용하였다. 가수분해
반응기의 임펠러는 터빈식을 사용하였으며 교반속도는 회전수가 높을수록 반
응이 잘 이루어지나 일정 회전수가 되면 반응에 변화가 적어져서 350rpm으로
고정하여 실험을 진행하였다. 먼저 유지를 넣고 교반을 시키면서 물을 넣어
유화를 시키고 온도가 안정되면 효소를 넣어 반응을 진행하였다. 반응도중 일
정시간 간격으로 시료를 취하고 기수분해율과 조성을 확인하였다. 시료는 3㎖
를 취하여 미리 예열 시킨 원심분리관에 넣고 15분 동안 3,500rpm으로 원심분
- 37 -
리 하였다. 분리된 층에서 상층부인 유층을 취하여 분석에 사용하였다.
2.4 지 방 산 의 정 량 과 가 수 분해 율 의 측 정 방 법
반응시간별로 시료를 취하고 3,500rpm에서 15분간 원심분리한 후 상층부
의 유층을 0.5g 취하여 에탄올:벤젠(1:1) 혼합액에 녹인 후 페놀프탈레인 지시
약(1w/v%) 2-3 방울을 넣고 0.1N KOH/EtOH로 적정하였다. 산가(Acid
Value)는 다음 식에 의해 계산되었다(41).
산가(Acid Value) = 5.611 × 0.1N KOH용액의 소비량(㎖)시료 (g) × f (식 2.7)
※ f는 0.1N KOH의 농도계수이다.
가수분해율은 산가와 비누화가를 측정하여 다음식에 의해 계산하였다.
가수분해율 = 산가비누화가 × 100 (식 2.8)
2.5 금속비누의 합성방 법
금속비누의 합성반응을 위해 가수분해 반응기(Dissolution tester)를 사용
하여 실험을 진행하였다. 실험은 먼저 효소를 선정하고 선정된 효소에 대하여
반응조건들의 최적화를 수행하는 방식으로 진행하였다. 즉 수산화 칼슘의 첨
가량, 기질과 물의 비, 효소의 첨가량, 온도 등의 입력변수들에 대하여 최적화
를 수행하였다. 사용한 반응기에서는 총량을 반응기 부피의 2/3를 넘도록 하
여 교반이 원활하게 이루어지도록 하였다. 기질은 스테아린기가 많이 포함되
어 있고 사료용 영양원으로도 가장 많이 사용되고 있는 우지(beef tallow)와 c
alcium stearate를 생산하기 위한 경화우지(Hydrogenated beef tallow)를 사용
- 38 -
하여 먼저 유지와 수산화칼슘을 칭량하여 반응기에 넣고 교반을 일정시간 시
켜 수산화칼슘을 기질 속에 고르게 분산시킨 후 물을 첨가하여 유화가 형성되
도록 한다. 온도가 안정화되면 효소를 넣고 교반 속도를 유지시키면서 반응을
진행하였다.
2.6 T LC/ FI D 를 이용한 반 응 물 의 조 성 확 인 방 법
리파아제를 이용하여 가수분해한 조성물의 구성 성분으로서 트리글리세
라이드(Triglyceride), 지방산(Fatty Acid), 모노글리세라이드(Monoglyceride),
디글리세라이드(Diglyceride), 글리세롤(Glcerol)을 각각 분리하여 분석하는 데
에는 일본 IATRON사의 TLC/FID(Thin Layer Chromatograph / Flame
Ionization Detector) IATROSCAN MK-5를 사용하였다(35, 36, 52). 반응시간
별로 시료를 취하여 10㎖ 클로로포름(Chloroform)에 녹인 후, 박층 크로마로
드 CHROMAROD-SⅢ에 시료 1㎕를 점적(Spotting)하여 100 ㎜의 높이로 전
개하였다. 전개 용매는 Benzene : Chloroform : Acetic acid = 70:30:2의 부피
비로 혼합하여 조제한 것이 우수한 분리능을 보였다. TLC-FID의 분석 조건
으로서 수소는 160㎖/min, 공기는 2.0ℓ/min으로 하였고, Scan Speed는 30초
로 하였다. 이 조건에서의 Rf값과 Retention time은 Table 4와 같다. 결과 처
리는 일본 IATRON사의 IATROCORDER TC-21을 사용하였으며
Attenuation 64 ㎷/F.S., Chart Speed 10.0㎝/min으로 하였다. 표준 물질로는
트리팔미틴(Tripalmitin), 팔미틴산(Palmitic acid), 디팔미틴(Dipalmitin), 모노
팔미틴(Monopalmitin)을 전개시킨 결과 Rf(Rt)가 각각 0.72(0.164), 0.60(0.212),
0.41(0.294), 0.31(0.334), 0.04(0.447)로 나타났다. 각각의 조성은 면적 백분율
(Area %)로 나타내었으며 오차 범위는 Table 5와 같다. TLC/FID를 사용하여
가수분해한 조성물의 구성 성분을 분석한 standard chromatogram을 Figure 3
에 나타내었다.
- 39 -
T able 4 . Separation analysis of each Composition by
T LC/ FI D
Section Rf Rt
Triglyceride
Free Fatty Acid
1,3-diglyceride
1,2-diglyceride
Monoglyceride
0.72
0.60
0.41
0.31
0.04
0.165
0.212
0.294
0.334
0.447
Rf : Retardation factor
Rt : Retention time
- 40 -
T able 5. Separation q uantitativ e analysis of standard material
by T LC/ FI D
Component CompositionAverage
Area%
Standard
Deviation
Tripalmitin
Palmitic acid
Dipalmitin
Monopalmitin
25.6
27.1
24.5
22.8
26.51
29.03
22.75
21.72
1.03
0.47
0.54
1.31
- 41 -
Fig ure 3 . Standard chromatog ram of composite by T LC/ FI D
1. Triglyceride 2. Free Fatty Acid 3. 1,3-diglyceride
4. 1,2-diglyceride 5. Monoglyceride
- 42 -
2.7 FT -I R 을 이용한 생 성물 의 확 인
최종 생성물을 정성적으로 분석하기 위해 일본 JASCO사의 FT-IR
(Fourier Transform Infared Spectrometer) 300E를 사용하였다. 시료는 수분을
제거한 생성물을 KBr 판(Plate)에 소량 첨가해서 4000-500 ㎝-1
영역에서 측
정하였다. 시료의 주된 화학구조를 보면 적외선 영역에서 가장 특이적인 작용
기(Functional group)로 카보닐(Carbonyl;C=O)기를 볼 수 있다. 이는 일반적으
로 1750-1700 ㎝-1
에서 나오나 주위 결합이 에스테르(Ester)와 카르복시산
(Carboxylic Acid)일때에 각각 1750-1730 ㎝-1
과 1725-1700 ㎝-1
로 다르게 나
오며 이 피크가 생성물을 분석하는데 가장 중요한 부분이다(Figure 4).
2.8 AAS를 이용한 미 반 응 Ca(O H )2의 확 인
생성된 calcium stearate의 수분을 제거 한 후 15 % NH4Cl Solution을
이용하여 미 반응한 Ca(OH)2만을 선택적으로 추출해 낸 후 원소 분석기인
Analytik jena사의 AAS vario 6를 사용하여 Ca2+
의 양을 정량적으로 분석하
였다. Flame Ionization의 method를 사용하는 AAS(Atomic absorption
spectrometer)의 분석 조건으로 flame은 C2H2/air를 사용하여 발생시켰으며
fuel flow는 98NL/h, burner type은 50mm, burner height 5mm, wavelength
422.7nm, lamp type HCL, analy mode는 single beam으로 하여 분석하였고
그 결과를 Figure 5에 나타내었다.
- 43 -
Standard calcium stearate
Milk y calcium stearate
Fig ure 4 . Calcium stearate confirmation by FT -I R analysis
- 44 -
Fig ure 5. Ca2+ ion analysis w eig h use AAS
- 45 -
Ⅲ . 결 과 및 고 찰
1 . 리 파 아 제 의 선 정
1 .1 리 파 아 제 의 역 가 비교
2.1절의 Table 2에 나타낸 총 13가지의 리파아제들을 사용해서 역가를
측정하여 Figure 6에 나타내었다. 각각의 효소마다 최적의 반응조건이 다르지
만 본 실험에서 사용한 리파아제 역가 측정 방법은 Meito사에서 제시하는 효
소의 역가 측정 방법에 따라서 역가를 측정하였다. 결과를 보면 비 특이적 효
소인 Lipase OF(318,070U/g)가 가장 높은 역가를 나타내었으며 1,3-특이적 효
소인 Lipolase 100T(193,610U/g)와 Lipolase 100L(167,080U/g)이 다음으로 높
은 역가를 나타내었다. Lipolase 100T와 100L은 분말과 액체라는 상태만 다를
뿐 같은 근원의 효소라서 온도 안정성이 뛰어난 Lipolase 100T와 Lipase OF
의 두가지 효소가 가장 적당하다고 할 수 있다. 나머지 효소는 고정화 상태와
pH, 기질에 따라 영향을 받아서 좋은 결과를 보이지는 않았다. 역가측정은 초
기의 분해속도만을 측정하기 때문에 장시간의 가수분해 반응에 작용하는 것을
보기 위하여 실제 가수분해 반응을 시행하였다.
Figure 7은 올리브유 130g에 물 70g과 각각의 리파아제 0.13g을 혼합한
후 진탕기에서 37℃, 240 rpm으로 72시간 동안 가수분해 반응을 실시하여 반
응시간별로 유지의 가수분해율을 측정한 결과이다(37). 결과를 보면 비 특이적
효소인 Lipase OF는 주어진 조건에서 약 4시간 만에 90%의 가수분해율을 보
이고 약 25시간 만에 약 95 %의 가수분해율을 보이면서 반응평형을 보였다.
나머지 1,3 특이적 리파아제는 1.7 %에서 58 %선까지로서 거의 더 이상의 반
응이 없이 반응평형을 나타내었는데 그 중에서는 Lipolase 100L, Lipolase
- 46 -
0.E+00
5.E+04
1.E+05
2.E+05
2.E+05
3.E+05
3.E+05
4.E+05
Lipa
se O
F
Lipo
lase
100
T
Lipo
lase
100
L
Lipo
zyme IM
Lipo
zyme 30
,000
L
Lipo
max
CXT
Lumafas
t 2,000
G
Lipo
sam S
DL-
451
Lipa
se P
N
Lipo
se P
NC
Lipa
se P
NG
Lipa
se A
Lipa
se F/A
P15
L ipase
Lip
ase A
ctivi
ty(U
/g)
Fig ure 6. Lipase activ ity of v arious commercial lipases
- 47 -
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Time(hr)
Hydro
lysis
(%)
Lipolase 100T Lipolase 100T Lipozyme IM
Lipozyme 10,000L Lumafast 2,000G Lipomax CXT
Liposam SDL-451 Lipase OF Lipase PL
Lipase PLC Lipase PLG Lipase A "Amano"6
Lipase F/AP15
Fig ure 7 . H ydrolysis of oliv e oil by v arious lipases
[Enzyme concentration was 0.1% (W/W)]
- 48 -
100T, Lipase F-AP15, Liposam SDL-451이 비교적 우수한 가수분해율을 나
타내었고 역가 비교에서와 마찬가지로 역가가 높은 순서로 가수분해가 진행되
었음을 알 수 있었다.
1 .2 우 지 금속염 합성용 리 파 아 제 의 선 정
금속비누의 합성은 리파아제가 유지를 가수분해하는 반응을 촉매하는 동
시에 지방산과 수산화칼슘을 결합시켜 금속비누를 합성하는 과정이 동시에 수
행되게 된다. 따라서 가수분해 능력이 뛰어난 효소가 합성효율도 좋을 것으로
생각되어 2.1절의 Table 2의 13가지 효소 중 가수분해 효율이 가장 우수한
Lipase OF 효소를 사용하여 합성실험을 수행했지만 의외로 낮은 합성율을 보
여 가수분해율과 금속비누의 합성율이 반드시 비례하는 것은 아니라는 것을
추론하고 2.1절의 효소 중 7종의 효소를 이용하여 금속비누 합성실험을 수행
하였으며 그 결과를 Figure 8에 나타내었다. 결과에서 나타난 바와 같이 가수
분해 능력이 뛰어나고 비 특이적 효소인 Lipase OF는 33.1 %의 낮은 합성율
을 나타낸 것에 비하여 1,3-특이적 효소들인 Lipolase 100T와 Lipase F/Ap15,
Liposam SDL-451, Lipomax CXT, Lipase PL 등은 모두 90 % 이상의 합성
율을 보였다. 1,3-특이적 효소는 트리글리세리드의 1,3번의 아실기만을 절단하
는 효소지만 가수분해용보다는 모노글리세리드나 디글리세리드의 합성이나 에
스터 교환반응, 합성반응에 적합한 것으로 알려져 있는 것(13)을 볼 때 이것은
리파아제의 기질 특이성에 관련이 있는 것으로 생각된다.
Lipase OF 효소의 역가측정 방법은 기질로서 올리브유를 사용하고
Lipolase 100T 효소는 기질로 트리 부티린(Tributirin)을 사용한다. 이는 OF
효소는 불포화기가 많은 유지를 잘 분해하며 100T 효소는 저 탄소수 포화지
방산을 잘 분해하기 때문이다. 실험에 사용된 기질인 Beef Tallow와
Hydrogegenated Beef Tallow의 조성을 Table 6와 Table 7에 나타내었다. 결
- 49 -
0
20
40
60
80
100
Lipase OF Lipolase100T
LipaseF/AP15
LiposamSDL-451
LipomaxCXT
Lumafast2,000G
Lipase PL
Convers
ion(%
)
Fig ure 8 . Conv ersion ratio of B eef tallow metallic salts by
v arious lipases
- 50 -
Olive
oil
Beef
TallowFat
Palm
Kernel
Palm
Stearin
C10 0.16 3.04 -
C12 0.1 1.20 51.64 0.24
C14 2.80 2.26 15.66 1.37
C14:1 0.58 0.29 - -
C15 0.48 0.19 - 0.09
C16 9.64 26.03 23.46 8.74 57.18
C16:1 0.75 3.85 2.53 - -
C17 0.04 1.32 0.60 - 0.17
C17:1 - 0.69 0.36 - -
C18 3.43 17.96 12.88 2.19 5.34
C18:1 81.09 40.92 42.54 15.83 29.35
C18:2 3.91 3.89 11.58 2.68 5.84
C18:3 0.43 0.42 0.74 - -
C20 0.42 0.15 0.30 0.23 0.43
C20:1 0.29 0.81 0.76 - -
C22 - - 0.16 - -
S.V 191.9 197.2 197.0 239.9 201.4
I.V 81.8 50.1 64.4 19.1 36.9
M.P 7℃ 42℃ 40.5℃ 27℃ 53℃
T able 6. Fatty acid properties and composition of the oil
and fat by G C analysis
S.V : Saponification Value
I.V : Iodine Value
MP : Melting point
- 51 -
Composition B eef T allow (% ) Analysis V alue
C8 0.02 Acid value 4.3239
C1 0 0.05 Iodine value 1.1600
C1 2 0.11 Saponification value 229.2558
C1 4 3.26 Melting point 60℃
C1 4 :1 0.10 Saturation(%) 99.51
C1 5 0.49 Unsaturation(%) 0.49
C1 6 28.02
C1 6:1 0.22
C1 7 1.83
C1 7 :1 0.17
C1 8 63.61
C20 0.92
C22 0.96
T able 7 . Analysis and composition of fatty acids of refined
hydrog enated beef tallow
- 52 -
과를 보면 Olive oil은 불포화 지방산이 85 % 이상을 차지하는데 비하여 Beef
Tallow는 50 % 이하이고 Hydrogegenated Beef Tallow는 불포화 지방산이
0.5 % 이하임을 알 수 있다. 이런 것을 고려하여 볼때 가수분해율과 합성율은
정비례할 수 없으며 결국 기질에 따라 직접 금속비누를 합성하여 적당한 효소
를 선정할 수밖에 없다고 할 수 있다. 결과적으로 실제로 금속비누의 합성반
응을 진행하여 높은 합성율과 양호한 가수분해율을 보인 효소들 중 금속비누
의 합성율이 뛰어난 Lipolase 100T를 우지금속염 합성에 있어서 최적의 효소
로 선정하였다.
1 .3 Lipolase 1 00T 의 온 도 에 따 른 activ ity변 화
선정된 Lipolase 100T의 온도 안정성을 보기 위해 온도에 따른 Activity
변화를 측정하였다. 결과적으로 52℃에서 최고의 Activity를 보였으며 그 후
급격히 감소하는 경향을 보였다(Figure 9).
1 .4 Calcium stearate 합성용 리 파 아 제 의 선 정
Calcium stearate의 합성에 사용되는 hydrogenated beef tallow의 조성을
gas chromatograpy를 이용해서 비교 분석한 결과 는 Figure 10과 같 았다. 그
결과 수첨 우지는 stearic acid가 63.08 %. oleic acid가 0.46 %, linoleic acid가
0.65 % 이었 다 . 이를 통 해 수 소 첨 가 를 통 해 서 beef tallow 의 oleic acid와
linoleic acid의 이중결합이 단일결합으로 바뀌어서, stearic acid로 전환된 것을
확인 할 수 있었다(60). 우지를 사용한 금속비누의 합성에서 얻은 결과를 토대
로 7종의 효소를 이용하여 hydrogenated beef tallow를 기질로 하여 반응온도
60℃ 에 서 lipase 의 activity를 측정하 여 그 결과 를 Figure 11에 나타내었다 .
온 도 60℃에 서 높 은 activ ity를 나 타 내 는 효 소 를 screening 한 이유 는 온 도
6 0℃가 수 첨 우 지 의 m e l t i n g p o i n t 이 었 기 때 문 이 었 다 . 결 과 를 보 면
- 53 -
1.2E+05
1.3E+05
1.4E+05
1.5E+05
1.6E+05
1.7E+05
1.8E+05
1.9E+05
2.0E+05
35 40 45 50 55 60 65
Temperature('C)
Activity(U
/g)
Fig ure 9 . E ffect of temperature on the Activ ity of Lipolase
1 00T
- 54 -
Fatty acid Retention time Fatty acid of beet tallow(%)Fatty acid of hydrogenate
beef tallow(%)
C 14 10.03 3.34 3.41
C 15 11.8 0.93 0.51
C 16 13.60 23.53 27.99
C 17 15.29 1.31 2.45
C 18 17.07 17.01 63.08
C 18:1 17.37 38.15 0.46
C 18:2 17.97 5.42 0.65
C 20 20.23 0 1.44
Fig ure 1 0. Analysis of hydrog enated beef tallow by G .C
- 55 -
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Lipase OF Lipolase100T
LipaseF/AP15
LiposamSDL-451
LipomaxCXT
Lumafast2,000G
Lipase PL
Lip
ase a
ctivity (
Unit/g
)
.
Fig ure 1 1 . Lipase activ ity at 60℃ by commercial lipases
- 56 -
Lipase of 360000, Lipase CXT 1000, Lipolase 100T, Liposam SDL-451 등이
높은 activity를 나타내었다. 또한 생성물인 지방산의 양을 측정하여 Figure
12에 나타내었다. Figure 12에 나타난 바와 같이 반응온도 60℃에서 높은
activity를 나타내었던 Lipase of 360,000, Lipase CXT, Lipolase 100T,
Liposam SDL 451 등이 역시 많은 양의 지방산을 생산하는 것을 확인 할 수
있었다. 다음으로 높은 pH에서 높은 activity를 나타내는 효소를 screening 한
것을 Figure 13에 나타내었다. 높은 pH에서 높은 activity를 나타내는 효소를
screen한 이유는 calcium materials로 사용되어지는 Ca(OH)2로 인한 pH의 상
승을 고려한 것이었다. 높은 pH에서 높은 activity를 나타낸 효소는 Liposam
SDL 451, Lipase of 360000, Lipase PL, Lipomax CXT 1000이었다. 60℃, 알
칼리성에서 높은 활성을 나타내는 효소들을 선정한 후에 경화유에 Ca(OH)2를
첨가하여 Calcium Stearate를 합성하여 보았다. 경화유와 물의 비는 1:1 (v:v)
로 하였고 반응 온도는 경화유가 녹는 온도인 60℃, 교반속도는 550 rpm으로
고정하였으며 경화유와 Ca(OH)2의 비는 0.075 mol로 반응을 진행시켰다. 4시
간 기준으로 수행하였고 그 결과를 Figure 14에 나타내었다. 결과에서 나타난
바와 같이 경화유의 가수분해 능력이 뛰어나고 높은 Calcium stearate 전환율
을 나타내는 비 특이적 효소인 Liposam SDL-451 효소가 제일 효율적인 것으
로 나타났으며 이런 결과로 Liposam SDL-451을 합성용 효소로 선정하였다.
2. Calcium stearate 분석 방 법 의 정 립
2.1 Calcium stearate 합성율 의 측 정
본 실험에서는 리파아제가 유지를 가수분해하는 반응을 촉매 하는 동시
에 지방산과 수산화칼슘을 결합시켜 금속비누를 만드는 과정이 동시에 수행되
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