J ourna l o f M i c rob i o log i c a l M e t hods 8 (1988) 131 - 137 131Elsevier
JMM 00259
E v a l u a t i o n o f a h ex a n e / i s o p ro p a n o l l i p i d s o l v en t
s y s t em fo r a n a l y s i s o f b a c ter i a l p h o s p h o l i p i d s a n d
a p p l i ca t i o n to ch l o ro fo rm -s o l u b l e Nu c l ep o re
polycarbonate) membranes wi th re ta ined bacter ia
James B Guckert and David C. WhiteD ep art m ent o f Biolo gical Science, Florida State Universi ty , Tallahassee, FL 32306 U SA )
(Received 31 August 1987) (Revised version received 28 December 1987) (Accepted 10 January 1988)
Summa r y
The recovery of phospholipid, ester-linked fatty acids and phospholipid phosphate from the
eubacterium Pseudomonas a t lant ica was shown to be equivalent for the modified Bligh and Dyer
(chloro form/methanol /wate r) procedure and a hexane/isopropanol (HIP) lipid extraction. In addition to
its previously suggested lower toxicity, the HIP solvent system allows lipid analyses to be routinely done
on chloroform-soluble materials such as Nuclepore polycarbonate membranes, useful for well-definedsize fractionation studies of bacterioplankton communities.
The analysis of membrane phospholipids has become an important tool for the
quantitative description of the viable microbial biomass, community structure, and
nutrit ional status in complex, natural environments [1]. There are a diversity of
procedures utilized, however, for the extraction, isolation and purification of these
lipids. These procedures may not all be equivalent in recovery of the lipid classes o f
interest for microbial ecology research. New or modified methods need to be
evaluated in terms of quali ty and quantity of lipid recovered with respect to standard
analyses.
Correspondence to: James B Guckert, Department of Microbiology, Montana State University,
Bozeman, MT 59717, USA.
* Present address: Department of Microbiology, Montana State University, Bozeman, MT 59717, USA.** Present address: Institute for Applied Microbiology, University of Tennessee, 10515 Research Drive,
T h e m o s t w i d e l y u s e d s o lv e n t s y s te m is c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( C M , 2 :1 , v / v ) w h i c h
is r e p o r t e d t o e x t r a c t l ip i d m o r e c o m p l e t e l y f r o m a n i m a l s , p l a n t s o r b a c t e r i a t h a n
m o s t o t h e r ' s i m p l e ' s o l v e n t s y s t e m s [ 2 ] . T h i s e x t r a c t i o n s y s t e m w a s i m p r o v e d b y
E . G . B l i g h a n d W . J . D y e r [3 ]. T h e ' B l i g h a n d D y e r ' ( B / D ) e x t r a c t io n u se s a
m o n o p h a s i c s o l u t i o n o f c h l o r o f o r m : m e t h a n o l : w a t e r ( 1 : 2 : 0 . 8 , v / v / v ) f o r t h e p r i m a r ye x t r a c t i o n . W a t e r h e l p s t h e e x t r a c t i o n o f t h e p o l a r l i p i d s a s it c a u s e s c e l lu l a r s w e l li n g
w h i c h f a c i l i t a t e s t h e p e r m e a b i l i t y o f t h e c e l l w a l l s f o r t h e s o l v e n t s [ 4 ] . A f t e r t h e
p r i m a r y e x t r a c t io n , c h l o r o f o r m a n d w a t e r a r e a d d e d t o a f i n a l r a ti o o f 2 :2 :1 .8
( c h l o r o f o r m : m e t h a n o l : w a t e r , v / v / v ) t o f o r m t w o p h a s e s . T h e s e r a ti o s r es u l t i n a l o w e r
p h a s e c l o se t o 1 0 0 c h l o r o f o r m (l ip i d - ri c h ) a n d t h e u p p e r p h a s e l a rg e l y o f m e t h a -
n o l / w a t e r c o n t a i n i n g t h e n o n - li p i d s . R e c o v e r y is r e p o r t e d t o b e 9 5 o f th e to t a l l ip i d
w i t h a s in g l e e x t r a c t i o n [ 3]. W h i t e e t a l . [5 ] s u b s t i t u t e d a 5 0 m M p h o s p h a t e b u f f e r
( 8. 7 g K z H P O 4 p e r l it er , a d j u s t e d w i t h 1 N H C 1 t o p H 7 . 4) f o r w a t e r i n t h e o r i g i n a l
p r o p o r t i o n s f o r e n v i r o n m e n t a l s a m p l e s to m i n i m i z e p H s h i ft s w h i c h c o u l d r e su l t i n
t r a n s e s t e r i f i c a t i o n a r t i f a c t s o c c u r r i n g d u r i n g t h e l i p i d e x t r a c t i o n p r o c e d u r e [ 2 ] . T h em o d i f i e d B / D ( m B / D ) w a s u s e d i n t h i s r e s e a r c h .
T h e m B / D e x t r a c t i o n d o e s h av e li m i t a ti o n s . A p r i n c i p a l c o n c e r n f o r li p id a n a l ys i s
i n m i c r o b i a l e c o l o g y is th e c h l o r o f o r m - s o l u b i l i t y o f m a n y c o m m o n m a t e ri a ls w h i c h
c o u l d c o n t r i b u t e i n t e r f e r e n c e t o t h e a n a l y si s. T h i s i n c lu d e s c e r t a i n p l a st ic s t h a t m a y
b e o f i n t e re s t a s s u b s t r a t a i n b i o f o u l i n g r e s e a r c h [6 ], a n d N u c l e p o r e f i lt e r s f o r
q u a n t i t a t i v e s i z e f r a c t i o n a t i o n s t u d i e s o f a q u a t i c m i c r o b i o t a [ 7 ] .
A n e x t r a c ti o n s y st em o f h e x a n e / i s o p r o p a n o l / w a t e r ( H I P ) w a s s u g ge s te d a s a lo w -
t o x i c i ty s u b s t i tu t e f o r th e B / D p r o c e d u r e [8 ]. T h e H I P w o u l d p e r m i t li p id a n a l y s is
o f m a t e r i a l r e t a i n e d o n N u c l e p o r e f i l t e r s s i n c e p o l y c a r b o n a t e i s s t a b l e i n t h e s e
s o l v e n ts [ N u c l e p o r e C a t a l o g , 1 98 4]. I n a d d i t i o n , i s o p r o p a n o l is a n i n h i b i t o r o f
p h o s p h o l i p a s e D a n d h a s b e e n u s e d i n p r e v i o u s w o r k t o k e e p p l a n t l i p i d s i n t h e i r
n a t i v e s t a te [ 2]. O t h e r a d v a n t a g e s o f H I P r e p o r t e d h a v e b e e n t h a t i t e x t r a c t s l es s
p i g m e n t a n d n o n - l i p i d s ( e s p e c ia l ly p r o t e o l i p i d s ) t h a n C M [8 ].
A c o m p a r i s o n o f H I P v s. m B / D w a s c a r r ie d o u t f o r r e c o v er y o f p h o s p h o l i p i d ,
e s t e r -l i n k e d f a t t y a ci d s ( P L F A ) o f a e u b a c t e r i a l c u l tu r e . P L F A , t h e p r i n c i p a l l ip i d s
o f e u b a c t e r i a [9 ], a r e u s e d a s b i o c h e m i c a l m a r k e r s o f th e v i a b le m i c r o b i o t a f o r
e n v i r o n m e n t a l s a m p l e s [ 1 ] a n d a r e t h e s p e c i f i c l i p i d s o f i n t e r e s t f o r m u c h o f c u r r e n t
m i c r o b i a l e c o l o g y li p id r e s e a r c h [ 10 ]. O n e p u r p o s e o f t h is c o m p a r i s o n w a s to v a l i d a t e
a l i p id e x t r a c t i o n s y s t em c o m p a t i b l e w i t h N u c l e p o r e f i lt e rs t o a l l o w l i pi d a n a l y s e s t o
b e d o n e o n b a c t e r i o p l a n k t o n c o m m u n i t i e s d e f i n e d b y s p e c if ic s i z e -f r a c ti o n a t io n .
T h e r e c o v e r y o f b a c t e r i a l l ip i d f r o m c e ll s re t a i n e d o n N u c l e p o r e f il te r s w as a l s o
i n c l u d e d i n t h e c o m p a r i s o n . A n a l y s i s o f re c o v e r e d l ip i d w a s b y m o l a r q u a n t i t ie s o f
p h o s p h o l i p i d p h o s p h a t e a n a l y s e d c o l o r i m e t r ic a l ly a n d t o t a l P L F A p e r g d r y w e i g ht
o f c e l l c u l t u r e q u a n t i f i e d b y g a s c h r o m a t o g r a p h y . T h e p r o f i l e s o f P L F A r e c o v e r e d
w e r e e v a l u a t e d f o r p o s s i b l e s e l e c t i v i t y o f t h e s o l v e n t s y s t e m s .
a t e r i a l s a n d e t h o d s
B a c t e r i a l c u l t u r e c o n d i t i o n s
P s e u d o m o n a s a t l a n t i c a H u m m ( A T C C 1 92 62 N C M B 3 01 ) w a s g r o w n f o r 18 h in
1 l it e r o f m e d i u m c o n t a i n i n g : 1 0 g g a la c t o s e , 5 g c a s a m i n o a c i d s , a n d s u f f i c i e n t
f r a c t i o n w a s s u b j e c t e d t o a m i l d a l k a l i n e m e t h a n o l i c t r a n s e s t e r i f i c a t i o n w h i c h
r e s u lt e d i n f a t ty a c id m e t h y l e s te r s F A M E ) a n d a q u e o u s - s o l u b l e g l y c e r o l p h o s p h a t e .
T h e F A M E w e r e q u a n t i f i e d b y c a p i ll a ry g a s c h r o m a t o g r a p h y G C ) w i t h o u t a n y
f u r t h e r p u r i f i c a t i o n . T h e G C c o n d i t i o n s a r e a s d e s c r i b e d [ 1 1] e x c e p t t h a t t h e
t e m p e r a t u r e p r o g r a m w a s 80 ° C - 2 1 0 ° C a t 3 ° / m i n f o ll o w e d b y a 1 0 m i n i s o t h e r m a lp r o g r a m . P e a k a r e a s w e r e q u a n t i f i e d u s i n g th e N e l s o n A n a l y t i c a l 3 50 0
C h r o m a t o g r a p h y S o f t w a r e p ac k a g e. T h e i n te r n a l s ta n d a r d o p t i o n w i th i n th e T a rg e t
C o m p o u n d s o f tw a r e p r o g r a m w a s e m p l o y e d re la ti v e t o 5 0 p m o l o f 1 9:0 a d d e d a s t h e
i n t e r n a l i n j e c t io n s t a n d a r d j u s t p r i o r t o G C a n a ly s is . I d e n t i f i c a t i o n o f t h e P.
at lant ica F A M E w a s b a s e d o n i d e n t i c a l r e t e n t i o n i n d ic e s w i t h p r e v i o u s l y a n a l y s e d P .
at lant ica l ip i d w h i c h w a s s t ru c t u r a l l y v e r i fi e d u s i n g G C / m a s s s p e c t r o m e t r y
G C / M S ) [11 ], a d im e t h y l d is u l fi d e D M D S ) d e r i v a ti z a ti o n w it h G C / M S [ 12 ] t o
d e t e r m i n e d o u b l e b o n d p o s i t i o n a n d g e o m e t r y , a n d F o u r i e r t r a n s f o r m i n f r a r e d
s p e c t r o s c o p y to v e r i f y t h e u n u s u a l t r a n s - g eo m e t r y o f s o m e o f P. a t lant ica s P L F A
[131.
P h o s p h o l i p i d p h o s p h a t e a n a ly s is
A l l l i p i d f r a c t i o n s f r o m t h e s i l i c i c a c i d c h r o m a t o g r a p h y w e r e a n a l y s e d w i t h
p e r c h l o ri c a c id d i g es ti o n s a n d c o l o r i m e t r i c f o r p h o s p h o l i p i d p h o s p h a t e P L P O 4 )
d e t e r m i n a t i o n a s d e s c r i b e d i n W h i t e e t a l . [ 5 ] .
4 :(~A 16:0
5 O
o
; 2o
o 8 C ~ , 8:1,~7c
oE
6
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0 m B DHIP
• HI P f [ter
1 8 :
C Y Q A C ~ C ~ D : l~ S t
17 :0 17 :108c IN; I~T t1 8 ; 1 ~ 9 c
F i g. 1. C o m p a r i s o n o f t h e p h o s p h o l i p i d f a t ty a c i d (P L F A ) p r o f i le s r e c ov e r ed b y m o d i f i e d B l i g h a n d
D y e r ( m B / D ) e x t r a c t io n , h e x a n e / i s o p r o p a n o l ( H I P ) a n d H I P o f ce ll s r e t a i n e d o n N u c l e p o r e p o l y c a r-
b o n a t e m e m b r a n e f il te r s ( H I P / f i lt e r ) . T h e s y m b o l s i n d i c a te t h e a v e r a g e (n = 3 ) p e r c e n t o f t h e t o ta l m o l a rq u a n t i t y r e c o v e r e d f o r e a c h f a t t y a c i d . T h e e r r o r b a r s i n d i c a t e - -_ S D . W h e n e r r o r b a r s a r e n o t v i s i b le ,
t h e S D w a s e q u a l t o o r l e s s t h a n t h e w i d t h o f t h e s y m b o l .
F a t t y ac id s a r e d e s i g n a te d a s to t a l n u m b e r o f c a r b o n a t o m s : n u m b e r o f d o u b l e
b o n d s w i t h t h e p o s i t i o n o f t h e d o u b l e b o n d c l o se s t t o t h e a li p h a t i c ( o m e g a , w ) e n d
o f t h e m o l e c u l e in d i c a te d w i th t h e g e o m e t r y ' c ' f o r cis a n d ' t ' f o r t rans (e.g. 16:lw7t,
t rans-9 -hexadecenoa te .
S ta t i s t ical analysis
A l l a n a l y s e s w e r e d o n e o n t h e F l o r i d a S t a t e U n i v e r s i t y C y b e r 7 3 0 m a i n f r a m e
c o m p u t e r u t i l i z i n g p r o g r a m s a v a i l a b l e i n t h e s t a t i s t i c a l s o f t w a r e p a c k a g e S P S S .
L o g a r i t h m i c t r a n s f o r m a t i o n s o f d a t a w e r e d o n e t o m e e t t h e h o m o g e n e i t y o f e r r o r
v a r i a n c e a s s u m p t i o n s o f t h e a n a l y s is o f v a r i a n c e m o d e l u s e d [1 4].
R e s u l t s
C o m p a r i s o n o f m B / D a n d H I P l ip id e xt ra c ti on
A c o m p a r i s o n o f t h e P L F A p r o fi le s r e c ov e r e d b y m B / D , H I P a n d H I P f r o m f i lt er s
is s h o w n i n F i g . 1. T h e r e l a t i v e f a t t y a c id l e v e ls a r e e x p r e s s e d a s p e r c e n t o f t h e t o t a l
m o l a r q u a n t i t y r e c o v e r e d ( t o o l ) . T h e s y m b o l s i n d i c a t e t h e m e a n o f t h r e e r e p l ic a t e s
_+ 1 s t a n d a r d d e v i a t i o n ( S D ) . T h e r e w e r e n o s t a t is t i c a ll y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s
b e t w e e n t h e s e e x t r a c t io n m e t h o d s f o r a n y P L F A ( A N O V A o~ -- 0 .0 5 ).
T h e t o t a l m o l a r q u a n t i t y o f P L F A p e r g d r y w t. c e ll m a t e r ia l a n d t h e p h o s p h o l i p i d
p h o s p h a t e ( P L P O 4 ) p e r g d r y w t . f o r t h e t h r e e l i p i d t r e a t m e n t s a r e s h o w n i n
T a b l e 1. N o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s (o~ = 0 . 0 5 ) w e r e f o u n d f o r e i t h e r b i o c h e m i c a l
e s t i m a t e o f b a c t e r i a l b i o m a s s f o r t h e l ip i d e x t r a c ti o n m e t h o d s . T h e r a t i o s o fP L F A / P L P O 4 f o r t h e t h r e e t r e a t m e n t s a r e a ls o s h o w n in T a b le 1. T h e r e w e re n o
s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s (e~ = 0 . 0 5 ) f o u n d f o r t h e s e d a t a , e i th e r .
i s c u s s i o n
T h e H I P p r o c e d u r e is a n e q u i v a l e n t s u b s ti t u te f o r t h e m B / D l ip i d e x t r a c t i o n fo r
b o t h t h e q u a n t i t y o f t o t a l P L F A a n d P L P O 4 ( T a bl e 1) a s w e ll a s th e P L F A p r o f i le s
( F ig . 1) r e c o v e r e d f r o m a b a c t e r ia l c u l tu r e , w h e t h e r h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o n o r
N u c l e p o r e f i l t r a t i o n .
TABLE 1
COMPARISON OF PHOSPHOL1PID FATTY ACID PLFA) AND PHOSPHOL IPID PHOSPHA TE
PLPO4) RECOVERIES FROM HEX ANE: ISOP ROPA NOL HIP) FOR CELLS HARVESTED BY
CENTRIFUGAT ION OR NUCLEPORE MEMBRANE FILTRATION, COMPARED WITH THE
CORRE SPOND ING MODIFI ED BLIGH AND DYER roB/D) EXTRACT ION FOR P A TLA NTI CA
P r e v i o u s e v a l u a ti o n s o f t h e H I P l ip i d e x t r a c t io n h a ve c o m p a r e d H I P v s. B / D
e x t r a c t i o n s o f b e e f l i p id [ 1 5 ] a n d H I P v s. C M e x t r a c t i o n s o f r a t b r a i n l ip i d [ 8 ]. I n
b o t h c a s e s, t h e H I P w a s f o u n d t o r e c o v e r l o w e r a m o u n t s o f p o l a r l i pi ds , w h e n
e v a l u a t e d b y w e i g h t o f l i p i d r e c o v e r e d . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t p r o t e o l i p i d s
e x t r a c t e d w i t h C M , b u t n o t H I P , a c c o u n t e d f o r t h is d i f f e re n c e [8 ]. W h e n t h e s o l v e n ts y s t e m s w e r e e v a l u a t e d a n a l y t i c a l l y b y g a s c h r o m a t o g r a p h y i n t h e p r e s e n t s t u d y , n o
d i f f e r e n c e i n t h e r e c o v e r y o f b a c t e r i a l d i a c yl p h o s p h o l i p i d s w a s f o u n d , h o w e v er , a
c o m p a n i o n s t u d y c o m p a r i n g t h e r e c o v e r y o f l ip i d c la s se s f r o m a u n i c e l l u l a r g r e e n
a l g a i n d i c a t e s t h a t H I P d o e s n o t r e c o v e r t h e g l y c o - a n d p o l a r l i p id s a s w e ll a s t h e
m B / D p r o c e d u r e f o r t h is e u k a r y o t i c m e m b r a n e s y s te m [16 ]. Tw o o f t h e p r e v io u s H I P
e v a l u a t i o n s [8 , 1 5] a s w e ll a s t h e p r e s e n t s t u d y ( F ig . 1) h a v e s h o w n t h a t t h e p r o f i l e o f
f a t t y a ci d s r e c o v e r e d b y t h e H I P is e q u i v a le n t t o t h e C M e x t r a c t io n p r o c e d u r e s .
T h e m B / D e f f i c ie n t l y r e m o v e s n o n - l ip i d s w h e n t h e p h a s e s a r e s e p a r a t e d [2 ].
P r o c e d u r e s h a v e b e e n s u g g e s t e d f o r a n a q u e o u s w a s h t o r e m o v e n o n - l i p id s i n th e
H I P e x t r a c t i o n [ 8]. N o n - l i p i d s w h i c h m i g h t b e r e c o v e r e d o n l y i n te r f e re w i t h n o n -
s p e c i f i c a n a l y s e s , s u c h a s g r a v i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n s o f l i p id r e c o v e r y . T h e
p r o c e d u r e s u s e d i n t h e p r e s e n t s t u d y a r e s p e c i f i c f o r P L F A a n d P L P O 4 a n d a r e ,
t h e r e fo r e , u n a f f e c t e d b y n o n - l i p i d c o n t a m i n a t i o n . W h e n N a z S O 4 w a s u s e d t o s e p a -
r a te th e p r i m a r y H I P e x t r a c t i o n in t o t w o p h a s e s f o r n o n - l i p i d r e m o v a l as o r i g in a l l y
d e s c r i b e d [8 ], t h e t o t a l P L F A r e c o v e r y b y G C a n a l y s is d e c r e a s e d t o 5 6 o f t h e m B / D
( u n p u b l i s h e d d a t a ) . T h e s e re s u lt s s u g g e st e d t h a t n o p h a s e p a r t i t i o n i n g b e u s e d i n th e
H I P p r o c e d u r e w h e n s p e c i f i c a n a l y t i c a l e s t im a t e s o f l ip i d s m i n i m i z e t h e i n t e r f e re n c e s
o f n o n - l i p i d c o n t a m i n a n t s .
I n c o n c l u s i o n , t h e r e su l ts f r o m t h is e x a m i n a t i o n o f P atlantica l ip i d s i n d i c a t e s t h a t
t h e H I P e x t r a c t i o n o f H a r a a n d R a d i n [8 ] is e q u i v a l e n t to t h e m B / D f o r b a c t e r i a l
b i o m a s s d e t e r m i n a t i o n s o f e i th e r P L P O 4 o r t o t a l P L F A . T h e P L F A p r o fi le s fo r
b a c t e r i a l c o m m u n i t y s t r u c t u r e d e t e r m i n a t i o n s w e r e a l so f o u n d t o b e e q u i v a l e n t f o r
t h e t w o p r o c e d u r e s i n d i c a t i n g n o p r e f e r e n ti a l re c o v e r y o f b a c t e r i a l p h o s p h o l i p i d s . A
c o m p a n i o n s t u d y t o t h is p r e s e n t r e s e a r c h i n d i c a t e s t h a t t h i s a n a ly s i s w i ll o n l y b e v a li d
i n e n v i r o n m e n t s w i t h l o w m i c r o e u k a r y o t i c b i o m a s s d u e t o t h e l o w e r re c o v e r ie s o f
g l y c o - a n d p o l a r l i p id s f r o m t h e s e m e m b r a n e s y s t e m s b y H I P [1 6]. T h e u s e o f t h e
H I P e x t r a c t i o n i n m i c r o b i a l e c o l o g y l ip i d a n a ly s i s w il l p e r m i t t h e e x t r a c t i o n o f
b a c t e r i a l s a m p l e s o n c h l o r o f o r m - s o l u b l e c o m p o n e n t s s u c h a s p l a st ic s u s e d a s
a r t i f i c i a l s u b s t r a t a i n b i o f o u l i n g r e s e a r c h a s w e l l a s N u c l e p o r e p o l y c a r b o n a t e f i l t e r s
f o r s i z e f r a c t i o n a t i o n s t u d i e s o f a q u a t i c e n v i r o n m e n t s . W h e n t h e s e e n v i r o n m e n t s a r e
p r i m a r i l y b a c t e r i a l (e .g . g r o u n d w a t e r , s u b s u r f a c e w e l ls [ 1 7] a n d i n i ti a l m i c r o f o u l i n g
c o m m u n i t i e s [1 8]), th e u t i l i z a t io n o f l ip i d a n a ly s e s f o r b a c t e r ia l b i o m a s s , c o m m u n i t y
s t r u c t u r e a n d n u t r i t i o n a l s t a tu s [1] d o e s n o t h a v e t o b e r e s t r ic t e d to c h l o r o f o r m - s t a b l e
s u b s t r a t a o r f i l t e r s w i t h t h e u s e o f t h e H I P l i p i d e x t r a c t i o n p r o c e d u r e .
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T h i s r e s e a rc h w a s s u p p o r t e d b y c o l l a b o r a t i v e a g r e e m e n t C R - 8 1 3 7 2 5 f r o m t h e
R o b e r t S . K e r r E n v i r o n m e n t a l R e s e ar c h L a b o r a t o r y o f t h e U S E P A , g r a n t s
N 0 0 0 1 4 - 8 2 - C - 0 4 0 4 a n d N 0 0 0 1 4 - K - 0 0 5 6 f r o m t h e O f f i c e o f N a v a l R e s e a rc h , a n d a
S i g m a X i G r a n t - i n - A i d o f R e s e a r c h . T h e a u t h o r s a l s o a c k n o w l e d g e t h e g e n e r o u s g i f t
