MAGISTRSKO DELO Tea Kelc - COnnecting REpositories · 2018. 5. 1. · Kelc, T. Vpliv genetske...

Univerza v Mariboru

Fakulteta za naravoslovje in matematiko

Oddelek za biologijo

MAGISTRSKO DELO

Tea Kelc

Maribor, 2018

Univerza v Mariboru

Fakulteta za naravoslovje in matematiko

Oddelek za biologijo

Vpliv genetske osiromašenosti na sposobnost preživetja majhnih populacij

redkih rastlin: primer severne linejevke (Linnaea borealis)

MAGISTRSKO DELO

Influences of genetic impoverishment on survival ability of small populations of

rare plants: the twinflower (Linnaea borealis) case

Mentorica: doc. dr. Nataša Pipenbaher

Somentor: prof. dr. Mitja Kaligarič

Somentorica: izred. prof. dr. Metka Šiško

Maribor, 2018

II

IZJAVA O AVTORSTVU IN ISTOVETNOSTI TISKANE IN ELEKTRONSKE

OBLIKE MAGISTRSKEGA DELA

Ime in priimek študentke: Tea Kelc

Študijski program: Biologija in ekologija z naravovarstvom

Naslov zaključnega dela: Vpliv genetske osiromašenosti na sposobnost preživetja majhnih

populacij redkih rastlin: primer severne linejevke (Linnaea borealis)

Mentorica: doc. dr. Nataša Pipenbaher

Somentor: prof. dr. Mitja Kaligarič

Somentorica: izred. prof. dr. Metka Šiško

Podpisana študentka Tea Kelc

• izjavljam, da je zaključno delo rezultat mojega samostojnega dela, ki sem ga izdelala ob

pomoči mentorice;

• izjavljam, da sem pridobila vsa potrebna soglasja za uporabo podatkov in avtorskih del v

magistrskem delu in jih v magistrskem delu jasno in ustrezno označila;

• na Univerzo v Mariboru neodplačno, neizključno, prostorsko in časovno neomejeno

prenašam pravico shranitve avtorskega dela v elektronski obliki, pravico reproduciranja ter

pravico ponuditi zaključno delo javnosti na svetovnem spletu preko DKUM; sem seznanjena,

da bodo dela deponirana/objavljena v DKUM dostopna široki javnosti pod pogoji licence

Creative Commons BY-NC-ND, kar vključuje tudi avtomatizirano indeksiranje preko spleta

in obdelavo besedil za potrebe tekstovnega in podatkovnega rudarjenja in ekstrakcije znanja

iz vsebin; uporabnikom se dovoli reproduciranje brez predelave avtorskega dela,

distribuiranje, dajanje v najem in priobčitev javnosti samega izvirnega avtorskega dela, in

sicer pod pogojem, da navedejo avtorja in da ne gre za komercialno uporabo;

• dovoljujem objavo svojih osebnih podatkov, ki so navedeni v magistrskem delu in tej izjavi,

skupaj z objavo zaključnega dela;

• izjavljam, da je tiskana oblika zaključnega dela istovetna elektronski obliki zaključnega

dela, ki sem jo oddala za objavo v DKUM.

Datum in kraj: Podpis:

Kelc, T. Vpliv genetske osiromašenosti na sposobnost preživetja majhnih populacij redkih rastlin: primer severne linejevke

(Linnaea borealis). Mag. delo, Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, 2018.

III

Vpliv genetske osiromašenosti na sposobnost preživetja majhnih populacij redkih

rastlin: primer severne linejevke (Linnaea borealis)

Rastline, ki so omejene na majhne in izolirane populacije, so bolj občutljive na podnebne, življenjske in

biogenetske dejavnike. V raziskavo smo vključili dve majhni izolirani populaciji severne linejevke (Linnaea

borealis L.) iz vzhodnih Alp in eno populacijo iz osrednjega borealnega območja na Švedskem. Namen

magistrskega dela je bil z uporabo mikrosatelitskih markerjev dokazati, da je rastlinska vrsta (L. borealis) na

omenjenih območjih prisotna v več klonih. Ugotavljali smo tudi, ali je genetska variabilnost obeh alpskih

izoliranih populacij iz Slovenije in Avstrije zmanjšana glede na borealno populacijo iz Skandinavije. Na devetih

mikrosatelitnih lokusih A5, A102, D100a, D7, D110, D118, A112, B119 in C105 smo pri 45 vzorcih (15 iz

vsakega območja) skupaj namnožili 70 alelov, v povprečju 7,78 alela na lokus. Genetske razdalje analiziranih

genotipov smo izračunali z Diceovim koeficientom in izdelali dendrogram ter multivariatno analizo. Ugotovili

smo zelo nizke genetske razlike v obeh izoliranih populacijah in zelo visoke genetske razlike med obema

populacijama, čeprav je med njima le 73 km zračne razdalje. Sklepamo, da sta zaradi visoke genetske

variabilnosti med njima obe izolirani alpski populaciji glacialna relikta, najverjetneje zaradi zaporednih ozkih grl

in dolgoročne izolacije v posebnih okoljskih pogojih. Izolirani populaciji L. borealis nista popolnoma izgubili

svoje sposobnosti spolnega razmnoževanja, zato je »in-situ« preživetje še zmeraj mogoče. Vendar pa so

glacialni relikti običajno povezani z ranljivimi habitati, ki si zaslužijo nujno pozornost zaradi preživetja z

ohranjanjem in s posebnimi protiukrepi, zlasti z vidika globalnega segrevanja.

Ključne besede: glacialni relikt, mikrosateliti, molekulski markerji, razpršena porazdelitev

območja, vzhodne Alpe

Influences of genetic impoverishment on survival ability of small populations of rare

plants: the twinflower (Linnaea borealis) case

Plants occurring under small and isolated populations are more vulnerable to climatic, habitat and biogenetic

factors. We studied two small isolated populations of twinflower (Linnaea borealis L.) from the Eastern Alps

and one population from the core Boreal distributional range in Sweden. The purpose of the thesis was, using

microsatellite markers, to prove that the plant species (L. borealis) is in the Eastern Alps region present in

several clones. We also examined whether the genetic variability of both alpine isolated populations from

Slovenia and Austria was reduced due to the boreal population from Scandinavia. Nine microsatellite loci (A5,

A102, D100a, D7, D110, D118, A112, B119, C105) were taken into account, 45 samples were examinated (15

from each area) and 70 alleles were exhibited with an average of 7.78 alleles per loci. The genetic distances of

the analyzed genotypes were calculated by Dice coefficient to form a dendrogram and multivariate analysis. We

found very low genetic variability in both isolated populations and very high genetic variability between the two

populations, despite there is only 73 km of air distance between them. We conclude that because of the high

genetic variability between them, both isolated alpine populations are glacial relict populations, probably due to



IV

consecutive bottlenecks and long-term isolation in particular environmental conditions. The isolated populations

of the L. borealis in the Eastern Alps have not completely lost their sexual reproduction capacity, so “in-situ”

survival is still possible. However, glacial relics are usually associated with vulnerable habitats which deserve

urgent attention to survive involving conservation and special countermeasures especially in terms of global

warming.

Keywords: glacial relict, microsatellites, molecular markers, disjunct distributional range,

Eastern Alps



V

KAZALO VSEBINE

1 UVOD ..................................................................................................................................... 1

2 PREGLED LITERATURE ..................................................................................................... 2

2.1 POPULACIJE GLACIALNIH RELIKTOV .................................................................... 2

2.2 FRAGMENTACIJA HABITATA IN POPULACIJ ........................................................ 2

2.3 IZGUBA GENETSKE VARIABILNOSTI ...................................................................... 3

2.4 SEVERNA LINEJEVKA (Linnaea borealis) .................................................................. 5

2.4.1 Spolno in nespolno razmnoževanje vrste ................................................................... 6

3 NAMEN IN HIPOTEZE RAZISKAVE ................................................................................. 8

3.1 PREDPOSTAVKE IN MOREBITNE OMEJITVE ......................................................... 8

4 MATERIALI IN METODE .................................................................................................... 9

4.1 MATERIALI .................................................................................................................... 9

4.1.1 Območje raziskave ..................................................................................................... 9

4.1.2 Kemikalije ................................................................................................................ 12

4.1.3 Pribor in oprema ...................................................................................................... 13

4.2 METODE ........................................................................................................................ 14

4.2.1 Odvzem rastlinskega materiala ................................................................................ 14

4.2.2 Izolacija dnk ............................................................................................................. 14

4.2.3 Flourimetrično merjenje koncentracije dnk ............................................................. 15

4.2.4 Agarozna gelska elektroforeza ................................................................................. 15

4.2.5 Redčenje dnk ............................................................................................................ 15

4.2.6 Verižna reakcija s polimerazo (pcr) ......................................................................... 16

4.2.7 Mikrosatelitski markerji ........................................................................................... 18

4.2.8 Kapilarna elektroforeza ............................................................................................ 18

4.2.9 Analiza rezultatov .................................................................................................... 19



VI

5 REZULTATI Z DISKUSIJO ................................................................................................ 20

5.1 IZOLACIJE IN KONCENTRACIJE IZOLIRANE DNK ............................................. 20

5.2 NAMNOŽEVANJE S PCR IN MIKROSATELITI ....................................................... 22

5.3 KAPILARNA ELEKTROFOREZA .............................................................................. 24

5.4 PREŽIVETVENA SPOSOBNOST VRSTE .................................................................. 25

6 SKLEPI ................................................................................................................................. 32

ZAHVALA ............................................................................................................................... 34

7 LITERATURA ...................................................................................................................... 35



VII

KAZALO SLIK

Slika 1: Severna linejevka (Linnaea borealis) ........................................................................... 5

Slika 2: Lokacija študijskega področja populacije L. borealis; Slovenija ............................... 10

Slika 3: Lokacija študijskega področja populacije L. borealis; Avstrija .................................. 10

Slika 4: Lokacija študijskega področja populacije L. borealis; Švedska ................................. 11

Slika 5: Izolirana DNK z elektroforezo v agaroznem gelu. Švedska ...................................... 20

Slika 6: Izolirana DNK z elektroforezo v agaroznem gelu. Avstrija ...................................... 21

Slika 7: Testiranje primerne temperature za prileganje začetnega oligonukleotida (D110a)... 23

Slika 8: Testiranje primerne temperature za prileganje začetnega oligonukleotida (D7) ........ 23

Slika 9: Dolžina fragmenta vzorca SE14 v obliki vrha na mikrosatelitskem lokusu D118 ..... 24

Slika 10: DCA ordinacijski diagram matrike 45 genotipov L. borealis ................................... 28

Slika 11: Dendrogram, ki opisuje genetske povezave med 45 genotipi L. borealis ................ 29



VIII

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Zaporedje parov začetnih oligonukleotidov ..................................................... 16

Preglednica 2: Program pomnoževanja s Taq-polimerazo – temperaturni gradient. ............... 17

Preglednica 3: Program pomnoževanja s Taq-polimerazo – temperaturni gradient. ............... 18

Preglednica 4: Izmerjena koncentracija DNK v posameznih vzorcih ...................................... 21

Preglednica 5: Parametri genetske variabilnosti posameznih mikrosatelitskih lokusov .......... 25

Preglednica 6: Dolžina alelov (bp) in frekvenca alelov 45 genotipov L. borealis ................... 26



1

1 UVOD

Populacije glacialnih reliktov so ostanki arealov arktično-alpinskih vrst. Nastale so kot

rezultat premika arealov med glaciacijo in interglaciali. Le-te imajo danes vedno večji

naravovarstveni pomen, ker so naselila območja, kjer vladajo ekološko ekstremne, stresne

razmere. Ta območja se zaradi podnebnih sprememb zdaj hitro spreminjajo (Vogler in Reisch,

2013).

Zaradi hitro spreminjajočega okolja je prišlo do izgube in fragmentacije habitatov. Posledično

so številne rastlinske vrste postale redke in omejene na majhne in zelo izolirane populacije s

povečanim tveganjem za lokalno ali globalno izumrtje (Saunders in sod., 1991; Schemske in

sod., 1994).

Zaradi velikih razdalj med izoliranimi populacijami se zmanjšuje možnost prenosa in

raznašanja semen (Wilcock in Neiland, 2002). Problem majhnih populacij redkih rastlinskih

vrst nastane zaradi zmanjšanja ali celo nepopolnega uspeha spolnega razmnoževanja

(Warburton in sod., 2000; Wolf in Harrison, 2001; Fischer in sod., 2003; Aigner, 2004;

Scobie in Wilcock, 2009). Vsi omenjeni problemi pa so še večji, kadar gre za vrsto, ki

potrebuje navzkrižno oprašitev (Wroblewska, 2013). Takšen primer je karizmatična rastlina

severna linejevka (Linnea borealis), borealno-alpinska vrsta, ki je v strmem upadanju v

Evropi (Scobie in Wilcock, 2009).



2

2 PREGLED LITERATURE

2.1 POPULACIJE GLACIALNIH RELIKTOV

Pleistocenske glaciacije na severni polobli so povzročile velike kvantitativne in kvalitativne

spremembe v različnih skupinah organizmov. Ostanki ledene dobe v zmernih območjih

Evrope se kažejo v nepravilnih blokih, morenah, jezerih, šotnih bregovih in v majhni skupini

živih organizmov, imenovanih glacialni relikti (Chlebicki, 2002).

Izraz »relic« je bil uporabljen za takson, katerega obseg je bil spremenjen zaradi podnebnih

dejavnikov (Jackson, 1965), npr. Pedicularis sudetica Wild. v srednji Evropi, medtem ko je

bil izraz relikt (»relict«) uporabljen za običajno stare taksone, npr. Ginkgo biloba L. Vendar

pa se v zadnjem času za oba primera uporablja izraz relikt (Hickey in King 2000; Chlebicki,

2002).

Glacialni relikti so del podnebnih reliktov (Kornaś Medwecka-Kornaś, 1986). Večina

današnjih reliktnih vrst je bila v zadnjem poledenelem obdobju zelo razširjena, ko so bile

njihove ekološke zahteve dobro izpolnjene (Cox in Moore, 2006). Danes te vrste niso dobro

prilagojene prevladujočim podnebnim razmeram in so zato pogosto zelo redke in lokalizirane,

tako da so njihova pojavljanja na splošno dobro dokumentirana (Zimmermann in sod., 2010).

2.2 FRAGMENTACIJA HABITATA IN POPULACIJ

Izguba habitata (angl. habitat loss) in fragmentacija oz. drobljenje ter degradacija so

najpomembnejši vzroki za upad biodiverzitete (Tilman in sod., 2001). Razdrobljenost se

pojavi, ko se velika površina habitata preoblikuje v številne manjše zaplate (angl. patches). Ti

so izolirani drug od drugega z matriko habitatov, drugačno od izvirnika (Wilcove in sod.,

1986). Ko je pokrajina, ki obdaja drobce, neprimerna za vrste prvotnega habitata in kadar je

razpršitev nizka, se lahko ostanki zaplat štejejo za »habitatne otoke«, lokalne skupnosti pa

postanejo »izolati« (Preston, 1962; Wilcove in sod., 1986).

Fragmentiranost habitatov izhaja iz izgube habitatov. Obstajajo trije mehanizmi

fragmentacije:

− prvi mehanizem je mogoče pripisati neposredni izgubi območja habitata (Wilson in

sod., 2016);



3

− drugi mehanizem je mogoče pripisati spremembam prostorske konfiguracije krajine,

kar privede do izolacije (Wilson in sod., 2016). Zmanjšanje skupnega območja

habitata torej v prvi vrsti vpliva na stopnjo razpršenosti populacije in posledično na

izumrtje (Wilcove in sod., 1986);

− tretji mehanizem je mogoče pripisati posrednim ali interakcijskim učinkom izgube

habitatov in spremembam prostorske konfiguracije (Didham in sod., 2012) ter

interakciji fragmentov z matriko (npr. učinek prelivanja) (Wilson in sod., 2016).

Prerazporeditev preostale površine v ločene fragmente prvenstveno prizadene

razpršenost populacije in s tem stopnjo priseljevanja (Wilcove in sod., 1986).

Fragmentacija predstavlja temeljno grožnjo biološki diverziteti, saj zmanjšuje velikost

rastlinskih populacij, hkrati pa povečuje prostorsko izolacijo le-teh (Kryštufek, 1999; Young,

1996). Posledično so številne rastlinske vrste postale redke in omejene na majhne in zelo

izolirane populacije s povečanim tveganjem za lokalno ali globalno izumrtje (Saunder in sod.,

1991; Schemske in sod., 1994).

Fragmentacijo spremljajo erozija genetske pestrosti in povečana genetska razhajanja znotraj

populacij (Young, 1996). Z manjšanjem velikosti populacij in povečano izoliranostjo se

sprožijo negativni dejavniki, kot sta povečan naključni genski zdrs (angl. genetic drift) in

povišano križanje v sorodstvu (angl. inbreeding), kar vodi v zmanjšan pretok genov in

zmanjšanje heterozigotnosti (Young, 1996; Kryštufek, 1999).

Zaradi hitrih okoljskih sprememb, povzročenih predvsem s strani človeških dejavnosti, je

fragmentacija krajine povsod prisotna posledica sprememb v okolju. Človeške dejavnosti

vplivajo in spreminjajo naravne ekološke in evolucijske procese. Končni rezultat teh

sprememb se kaže v izgubi biološke raznovrstnosti in ne nazadnje v izumrtju populacij in vrst

(Leimu in sod., 2010). Danes je za ohranjanje in varstvo narave izziv ohraniti čim večje

število vrst v razdrobljenih populacijah kljub neprestani grožnji uničenja habitatov (Wilcove,

1986).

2.3 IZGUBA GENETSKE VARIABILNOSTI

Geni se prenašajo iz generacije v generacijo. So osnovna enota procesa evolucije in se

izražajo v obliki dednih lastnosti organizmov. Dedne lastnosti pa se znotraj populacije

razlikujejo. V tem primeru govorimo o genetski variabilnosti (raznolikosti, pestrosti) osebkov



4

(Stolzfus, 2006). Genetska pestrost med osebki iste vrste je nujno potrebna za evolucijo

(Dobzhansky, 1964).

Genetska variabilnost se tvori zaradi mutacije v genih in prenosa genov med populacijami in

vrstami (Stolzfus, 2006). Ekološka prilagodljivost je odločilnega pomena za uspevanje in

preživetje populacij. Le-to jim omogoča velika genetska variabilnost (Knapp in Dyer, 1997).

K ohranjanju koristnih in zmanjšanju škodljivih mutacij pripomore spolno razmnoževanje

(Otto, 2003).

Kadar se okolje hitro spreminja, številne rastlinske vrste postanejo omejene na majhen

habitat, posledično pa postanejo redke in jim lahko hitro sledi izumrtje (Saunders in sod.,

1991; Schemske in sod., 1994). Poleg takojšnjega izumrtja je usodna posledica lahko tudi

izguba genetske pestrosti, ki se lahko kaže kot rezultat genskega zdrsa (angl. genetic drift),

križanja v sorodstvu in zmanjšanega pretoka genov med populacijami (Young in Brown,

1999). Posledici tega sta izguba v številu in viabilnosti potomcev (Oostermeier in sod., 1995;

Fischer in sod., 2003) ter sposobnost prilagoditi se okoljskim spremembam (Willi in sod.,

2006). Viabilnost populacije je podatek, s katerim lahko ugotovimo verjetnost za obstoj

populacije v prihodnosti (Allendorf in Ryman, 2002).

Zmanjšanje števila rastlin na splošno povzroči zmanjšanje genetskih razlik znotraj njihove

populacije (Van Treuren in sod., 1991). Majhne populacije, ki jih je povzročila fragmentacija

habitatov, so občutljive in jim potencialno grozi nevarnost lokalnega izumrtja (Fischer in

Stocklin, 1997; Wilcock, 2002).

Male klonske populacije so zaradi izginotja nekaterih genetov precej izpostavljene izgubi

genetske variabilnosti; zlasti so občutljive populacije, kjer je število genetov manjše kot

število posameznih rastlin znotraj populacije. Iz teh razlogov se postopna izguba genetov iz

populacije lahko nadaljuje, dokler populacija ni enoklonska (sestavljena zgolj iz enega

genotipa), kar kasneje privede do izumrtja tega geneta (Wilcock, 2002). Trenutno je genet pri

klonskih rastlinah opredeljen kot genetski posameznik, ki se razvije iz zigote in vegetativno

proizvaja ramete (Scrosati, 2002). Ravno nasprotno pa so lahko bile majhne enoklonske

populacije ustvarjene iz zgolj enega semena in so s pomočjo vegetativnega razmnoževanja

ohranile populacijo do te mere, da lahko to predstavlja začetek populacije razširjene vrste

(Wilcock, 2002).



5

2.4 SEVERNA LINEJEVKA (Linnaea borealis)

Severna linejevka (Linnaea borealis L.) (Slika 1) je vednozelen pritlikav grmiček, ki tolerira

senco (Wroblewska, 2013). Uvrščamo jo v rod Linnaea, ta pa spada v družino Caprifoliceae

(kovačnikovke). Vrstno ime rastline (borealis) se nanaša na njeno severno razširjenost,

rodovno ime pa je dobila po Carlu Linneju.

Slika 1: Severna linejevka (Linnaea borealis) (Foto: Nataša Pipenbaher).

Vrsta L. borealis ima tri podvrste. Te imajo razlike v morfoloških značilnostih, ki se

prekrivajo po geografskih območjih (Hulten, 1968; Munz in Keck, 1975; Wroblewska, 2013).

Linejevka je cirkumpolarna rastlina (Hulten 1968; Wilcock, 1999; Scobie, 2009; Wroblewska,

2013), kar pomeni, da je razširjena po celem svetu v vlažnih subarktičnih, borealnih ali

hladnih zmernih gozdovih (Wroblewska, 2013).

L. borealis subsp. borealis raste v borealnem predelu Evrazije in SZ Severne Amerike.

L. borealis subsp. americana se pojavlja v borealnem območju Severne Amerike. L. borealis



6

subsp. longifolia pa je omejena predvsem na severozahodno pacifiško regijo. Nam najbližja je

L. borealis subsp. borealis (angl. twinflower – ime se nanaša na obliko socvetja). Ta raste v

iglastih gozdovih od nižin do nadmorskih višin, ki so nad gozdno mejo. V gorah na

Norveškem doseže nadmorsko višino 1320 m, v Alpah pa celo 1600–1800 m. Tipičen habitat

je iglasti gozd (Wroblewska, 2013).

2.4.1 SPOLNO IN NESPOLNO RAZMNOŽEVANJE VRSTE

Severna linejevka je tipična klonalna rastlina, ki ima veliko sposobnost vegetativnega

razmnoževanja. Vegetativno razmnoževanje poteka predvsem s stoloni, pri čemer rastlina

tvori velike klone, ki se lahko razprostirajo tudi do 10 m daleč. Kloni tvorijo velike zaplate, ki

so lahko med seboj zelo oddaljene in stare tudi več sto let (Eriksson, 1988; Niva, 2003;

Wroblewska, 2013). Pomlajevalni poganjki, ki se razmnožujejo vegetativno, tvorijo nove

ramete, ki imajo potencial, da postanejo neodvisni od materinske rastline. V enem letu

proizvedejo cvetoče poganjke povprečno 1–2 % vseh rametov (Niva, 2003). Ramet je

definiran kot posamezen klon – eden izmed skupine klonov. Je torej posamezna rastlina, ki je

vegetativno rastla od drugega posameznika – kot klona te rastline, vendar sta obe ločeni

(Scrosati, 2002).

Rastlinska vrsta (L. borealis) ima sistem poganjkov, ki se deli na dva tipa: glavni (plazeči) in

stranski. Glavni poganjek tvori vsako leto listne pare, listi pa so jajčasti in si nasprotni, vedno

zeleni in ostanejo tudi do 2 leti. Zakoreninja se vzdolž glavnih poganjkov. Stranski poganjki

se razvijejo v zalistjih listov na glavnem poganjku, pri tem pa ima vsak listni par potencial za

razvoj enega stranskega poganjka (Eriksson, 1988; 1992). Glede na funkcijo se ti poganjki

delijo na: asimilacijske (nespolne), cvetoče (spolno reproduktivne) ali nove glavne oz.

pomlajevalne poganjke (Eriksson, 1988; 1992; Niva, 2003). Asimilacijski in cvetoči poganjki

so krajši in pokončni (4–6 cm, socvetje doseže višino do 15 cm), pomlajevalni poganjki pa

omogočajo vegetativno razmnoževanje.

Linejevka ima mehanizme, ki preprečujejo samooploditev, kot je npr. inhibicija nastanka

pelodne cevi v vratu (Wilcock in Jennings, 1999). Zanjo je torej značilna gametofitska

nezdružljivost (Wilcock in Jennings, 1999; Wroblewska, 2013). Zaradi svoje gametofitske

nerazdružljivosti potrebuje linejevka za uspešno oprašitev in oploditev pelod genetsko

različnega osebka, ki se razlikuje vsaj za en alel na S-lokusu (Scobie in Wilcock, 2009). Če je



7

ta t. i. kompatibilni partner zaradi določenih razlogov predaleč, ne bo prihajalo do

navzkrižnega opraševanja in posledično ne bo tvorbe semen in novih genetov. Problem je

torej izguba genetske diverzitete, ki se z neuspehom spolnega razmnoževanja še bolj

zmanjšuje.

Opraševalci severne linejevke so predvsem dvokrilci (Diptera) in tudi kožekrilci

(Hymenoptera). Najpogostejše so manjše muhe iz družine Muscidae. Po uspešni oploditvi

plodnica dozori in nastane enosemenski plod (Scobie in Wilcock, 2009). Plod je orešek, ki je

obdan z dvema krovnima listoma z žleznimi trihomi (Eriksson, 1992). Plod ima majhen

kaveljček, s katerim se pritrdi na krzno živali in perje ptic. Takšen način disperzije semen se

imenuje ektozoohorija ali epizoohorija. Kolikor je znano, linejka ne tvori obstojne talne

semenske banke (Eriksson, 1992; Wroblewska, 2013). V raziskavi, ki je potekala na

Škotskem, so slabo obstojnost semenske banke pripisali pomanjkanju združljivih spolnih

partnerjev znotraj populacij in tudi omejenosti gibanja cvetnega prahu (Wilcock in Jennings,

1999; Scobie in Wilcock, 2009; Wroblewska, 2013).



8

3 NAMEN IN HIPOTEZE RAZISKAVE

Namen magistrskega dela je dokazati, da je rastlinska vrsta (L. borealis), ki je sicer klonalno

uspešna na izoliranih rastiščih v Alpah, prisotna v več klonih. Prav tako želimo dokazati, da je

genetska variabilnost obeh alpskih izoliranih populacij iz Slovenije in Avstrije zmanjšana

glede na borealno populacijo iz Skandinavije. Vsi odgovori bodo imeli pomembne aplikacije

ne le za samo rastlinsko vrsto, katere pomen v Sloveniji je izjemen, temveč za vse vrste, ki so

postale redke zaradi fragmentacije habitatov na splošno.

Pri raziskovalnem delu v okviru magistrskega dela smo si zastavili naslednji hipotezi:

Hipoteza 1: Primerjava genetske variabilnosti med izoliranima populacijama iz Slovenije in

Avstrije z borealno populacijo bo pokazala zmanjšano genetsko variabilnost izven borealnega

dela areala.

Hipoteza 2: S pomočjo ugotavljanja genetske variabilnosti z molekulskimi markerji

(mikrosateliti) bomo potrdili, da sta izolirani populaciji v Avstriji in Sloveniji sestavljeni v

glavnem iz istega klona, kontrolna populacija na Švedskem pa je sestavljena iz več klonov.

3.1 PREDPOSTAVKE IN MOREBITNE OMEJITVE

Omejitve so se pojavile pri sami izolaciji DNK iz rastlinskega materiala, kjer je bilo zahtevno

doseči dovolj velike koncentracije DNK za nadaljnje delo, kar najverjetneje pogojuje zgradba

rastlinskega materiala.



9

4 MATERIALI IN METODE

4.1 MATERIALI

4.1.1 OBMOČJE RAZISKAVE

Pri raziskovalnem delu smo preučevali populacijo L. borealis na treh različnih lokacijah:

1. soteska Nomenj, Slovenija (46,30° N, 14,04° E, nadmorska višina približno 495 m)

(Slika 2);

2. Diselingsee v Krških (Gurktalerskih) Alpah na Štajerskem, Avstrija (46,95° N,

13,95° E, nadmorska višina približno 1760 m) (Slika 3);

3. mešani iglasti gozd (škotski bor) zunaj mesta Bollnäs v osrednji Švedski na približno

70 m nadmorske višine (Slika 4).

V analiziranih vzorcih iz prve in druge lokacije je bila izolirana alpska populacija v primerjavi

s kontrolno populacijo na Švedskem, ki je bila delno znotraj svojega borealnega

(cirkumpolarnega) območja. Populacija v Julijskih Alpah je najbolj jugovzhodni kraj

pojavljanja L. borealis v Evropi (Wraber, 1963). Na tej lokaciji populacija severne linejevke

pripada združbi Rhodothamno-Rhodoretum hirsute (Aichinger) Br.-Bl. in Siss. Laricetosum

(Wraber, 1963).



10

Slika 2: Lokacija raziskovalnega območja populacije L. borealis: Soteska Nomenj, Slovenija (na sliki

označena s črno barvo) (Vir: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/2/29/Central_

Europe_location_map.svg).

Slika 3: Lokacija raziskovalnega območja populacije L. borealis: Diselingsee v Krških Alpah na

Štajerskem, Avstrija (na sliki označena s črno barvo) (Vir: https://upload.wikimedia.org/

wikipedia/commons/2/29/CentralEuropelocation_map.svg).



11

Slika 4: Lokacija raziskovalnega območja populacije L. borealis: Mešan iglast gozd zunaj mesta

Bollnäs, Švedska (na sliki označena s črno barvo) (Vir: https://upload.wikimedia.org/

wikipedia/commons/thumb/9/92/Northern_and_Central_Europe_location_map.svg/819px

Northern_and_Central_Europe_location_map.svg.png).

V Sloveniji L. borealis raste v Soteski pri Nomenju na nadmorski višini 500 do 520 m. Gre za

njeno najjužnejšo točko razširjenosti v Evropi. Tukaj se pojavlja v pasu listnatega (bukovega)

gozda skupaj s subalpinsko združbo sleča in slečnika z macesnom. Rastišče, kjer se je

pojavila linejevka, je strmo severno pobočje. Tukaj ni močne sončne svetlobe. Zaradi bližine

reke je velika zračna vlaga. Pomembna značilnost rastišča je dodatno ohlajanje. Iz številnih

odprtin in rež na apnenčasti površini piha hladen zrak, kar bi lahko bil razlog, da rastišča v

celoti ne preraste bukov gozd. L. borealis kaže tipično arktično-alpsko razširjenost in v Alpah

predstavlja glacialni element (Wraber, 1963).



12

Lokacijo v Krških Alpah na Štajerskem delu v goratem območju sta prvič omenila Ernet in

Franz (2011). Nadmorska višina na tem predelu znaša 1850 m. L. borealis sodi na tej lokaciji

v združbo Rhododendrum ferruginei Rubel 1911. Obe alpski lokaciji imata severno

izpostavljenost, kjer se pod balvani sprošča mrzel zrak, še posebej v poletnem času.

Na Švedskem se L. borealis pogosto pojavlja od province Småland in naprej proti severu.

Tukaj se tipično pojavlja v iglastih gozdovih, vendar dobro uspeva tudi v gorskih brezovih

gozdovih (Niva, 2003).

4.1.2 KEMIKALIJE

4.1.2.1 Kemikalije za izolacijo deoksiribonukleinske kisline (DNK)

Za izolacijo DNK smo uporabili naslednje kemikalije:

− CTAB (Cetyl trimethyl ammonium bromide) pufer: 2 g CTAB (Merck), 8,18 g NaCl

(Kemika), 10 ml 1 M TRIS (pH 8), 4 ml 0,5 M EDTA (pH 8), 200 µl merkaptoetanol

(Merck) in destilirana voda;

− 0,5M EDTA (Ethylene diamine tetra acetic acid), pH 8;

− TRIS, pH 8;

− 3M NaAc (natrijev acetat), pH 5,2;

− TE pufer: 1 M TRIS (pH 8), 0,5 M EDTA (pH 8) in destilirana voda;

− kloroform (Sigma): izoamilalkohol (Merck) v razmerju 24 : 1;

− izopropanol;

− 70 % etanol (Sparmachem).

4.1.2.2. Kemikalije za fluorimetrično merjenje koncentracije DNK

Delovno raztopino, v kateri smo merili koncentracijo DNK, so sestavljale naslednje

kemikalije:

− filtrsko steriliziran (0,2 µL premer por) 1x pufer TNE: 10 mM TRIS, 1 nM EDTA,

0,1 M NaCl, pH 7,4);

− 0,1 µg/mL benzimidazol/Hoechst 33258 (Stigma, St. Louis, MO, ZDA).



13

Delovno raztopino smo zmeraj pripravili svežo in jo med delom hranili v temi. V kiveto smo

odpipetirali 2 mL delovne raztopine in dodali 2 µL izolirane DNK.

4.1.2.3. Kemikalije za agarozno elektroforezo

Za agarozno elektroforezo smo uporabili naslednje kemikalije:

− 5x TBE pufer za elektroforezo: 54 g TRIS (Sigma), 27,5 g borova kislina (Sigma),

20 mL 0,5 M EDTA (pH 8) in destilirana voda;

− 1 % agarozni gel: agaroza (Sigma) in 1x TBE pufer;

− SYBER GREEN: 1 µL SyberGreen (Fluka), 99 µL DMSO (dimethyl sulfoxide)

(Sigma);

− DNK velikostni standard 1 kb (Fermentas).

4.1.2.4 Kemikalije za verižno reakcijo s polimerazo (PCR)

Sestava PCR-reakcijske mešanice:

5 µL Qiagen Multiplex PCR 10x (Qiagen), 0,5 µL začetnega oligonukleotida 1 (Sigma,

ZDA), 0,5 µL začetnega oligonukleotida 2 (Sigma, ZDA), 0,5 µL DNK in 3,5 µL vode brez

RNA-ze.

Zgoraj naveden postopek priprave PCR-reakcijske mešanice velja za en vzorec.

4.1.2.5. Kemikalije za kapilarno elektroforezo

Za kapilarno elektroforezo smo zraven PCR-pomnožkov v vsako odprtino na plošči dodali

Formamid (Sigma, St. Luis, MO, ZDA) in dolžinski standard 400 (Beckman Coulter, Brea,

Kalifornija, ZDA), na vrh pa kapljico mineralnega olja (Sigma, ZDA), ki je preprečila

izhlapevanje. Tako pripravljene vzorce smo analizirali s kapilarno elektroforezo (Beckman

Coulter CEQ 8000).

4.1.3 PRIBOR IN OPREMA

Pri laboratorijskem delu smo uporabljali laboratorijsko opremo, kot so epruvetke, čaše,

erlenmajerice, merilne valje, žličke, steklene palčke in različna stojala.



14

Uporabljali smo tudi standardne laboratorijske aparature, kot so centrifuga (Beckman

Coulter), avtoklav (Kambič, Slovenija), aparatura za PCR (Whatman Biometra T-Gradient,

Goettingen, Nemčija), avtomatski pipetni nastavki za pipete, digitalna tehtnica, elektroforezna

kadička, električni napajalnik za elektroforezo, inkubator, hladilnik, zamrzovalnik, magnetno

mešalo in mikrovalovna pečica.

4.2 METODE

4.2.1 ODVZEM RASTLINSKEGA MATERIALA

Poleti leta 2015 smo naključno vzorčili rastline na vseh treh raziskovalnih območjih. Da bi

preprečili izbiro istih klonov, smo vzeli poganjke, ki so rastli vsaj 3–5 m narazen, kot

predlaga Wróblewska (2013). Poganjki so bili shranjeni na hladnem mestu do izolacije DNK

v laboratoriju. V raziskavo je bilo vključenih 45 vzorcev L. borealis, 15 za vsako raziskovalno

območje.

4.2.2 IZOLACIJA DNK

Izolacijo DNK smo izvedli z metodo CTAB iz svežih listov.

Postopek izolacije DNK je potekal po protokolu, ki so ga opisali Šiško in sod. (2009), in

sicer:

1. Manjši količini svežega rastlinskega materiala (mladi listi) dodamo 1 mL CTAB

pufra, segretega na 68 °C, in ga v terilnici dobro stremo. Prelijemo v sterilno 2 mL

epruvetko.

2. Inkubiramo pri 68 °C 1,5–2 h.

3. Dodamo 600 µL topila kloroform : izoamilalkohol v razmerju 24 : 1 in dobro

premešamo.

4. Centrifugiramo 10 min pri 11.000 obratih.

5. Previdno odpipetiramo supernatant v novo 1,5 mL epruvetko in dodamo 60 µL NaAc

in 600 µL ledeno hladnega izopropanola.

6. Vzorce postavimo v zamrzovalnik za 20 min.

7. Vzorce pretresemo in ponovno centrifugiramo 10 min pri 11.000 obratih.



15

8. Previdno odlijemo supernatant in dodamo 600 µL 70 % etanola. Ob rahlem mešanju

počakamo, da se DNK »odlepi« in spere v etanolu.

9. Previdno odpipetiramo etanol in posušimo DNK pri sobni temperaturi ali v sušilniku

pri 40–50 °C.

10. Dodamo 100 µL TE pufra in postavimo v hladilnik, da se čez noč DNK raztopi. Nato

jo hranimo pri –20 °C.

4.2.3 FLOURIMETRIČNO MERJENJE KONCENTRACIJE DNK

Koncentracijo DNK smo izmerili kvantitativno z miniflourimetrom TK200 (Hoefer Scientific,

San Francisco, ZDA) na Fakulteti za kmetijstvo in biosistemske vede ter kvalitativno s

pomočjo gelske elektroforeze.

4.2.4 AGAROZNA GELSKA ELEKTROFOREZA

Postopek je bil naslednji:

1. V manjšo erlenmajerico smo zatehtali agarozo. Dolijemo 1x TBE pufer k zatehtani

agarozi v erlenmajerici in jo dobro raztopimo v mikrovalovni pečici.

2. Ko se agaroza popolnoma raztopi, ohladimo gel na 50–60 °C in ga vlijemo v

pripravljen nosilec za gel. Takoj namestimo glavnik za jamice in počakamo, da se gel

strdi (15–30 min).

3. Gel prenesemo na nosilec in ga prelijemo z 1x TBE pufrom za elektroforezo.

4. Nanos vzorcev: odpipetiramo po 2 µL DNK in dodamo 3 µL pripravljenega barvila

SyberGreen.

4.2.5 REDČENJE DNK

Potek redčenja: v epico smo dali 2 µL vzorca DNK in dodali izračunano količino vode.

Vzorce smo redčili na koncentracijo 4 ng/µL.

Redčenje vzorcev smo preračunali po formuli:

izmerjena koncentracija DNK/*2−2 = količina vode.



16

4.2.6 VERIŽNA REAKCIJA S POLIMERAZO (PCR)

Odseke DNK smo namnožili z verižno reakcijo s polimerazo (PCR). Uporabili smo 9 začetnih

oligonukleotidov: A5, A102, A112, B119, C105, D7, D110, D110a in D118 (Preglednica 1).

Liofilizirane začetne oligonukleotide smo najprej redčili na koncentracijo 500 pmol/µ. Ker pa

smo v delovni raztopini želeli imeti začetne oligonukleotide s koncentracijo 10 pmol/µL, smo

jih nadalje ponovno redčili.

Preglednica 1: Zaporedje parov začetnih oligonukleotidov analiziranih lokusov, uporabljenih v študiji

rastline L. borealis.

Zap.

št.

Lokus Začetni oligonukleotidi v smeri 5' proti 3' Barvilo Dolžina

alelov v bp

1 A5 For: ACA-CAC-TTT-TGA-GGG-CAT-CC

Rev: TGC-TTT-TCC-TTG-TGC-TTC-CT

Cy 5

172-186

2 A102 For: CTT-CCA-CCA-CCC-CAA-TGT-A

Rev: TAA-CAA-CCA-CCT-TCG-TGT-GC

Cy 5,5

204-250

3 A112

For: CCA-ACA-ACT-ACT-TCG-TCA-CTG

Rev: TCC-AAG-AAT-GAG-ACC-ATC-AG

Cy 5,5 244-284

4 B119

For: GAT-GGC-ACC-GAT-TGT-TTG

Rev: AAA-GGC-TGT-GAA-GTC-GTC-G

Cy 5 214-248

5 C105

For: CCA-ATC-CAC-ACA-ACC-CTA-AC

Rev: ACC-TCT-CGC-AAG-CAT-CTT-C

Cy 5,5 262-277

6 D7

For: CCT-TAC-GCT-TTG-GAG-ATG-TC

Rev: GTG-AGG-CCA-CAG-AGA-AGA-TC

Cy 5 168-192

7 D110

For: CCC-AGT-GTT-CAG-TGG-ATT-C

Rev: GAT-GGT-GGT-GCT-TTG-TTG

Cy 5,5 242-244

8 D110a

For: ACA-AAG-CAC-CAC-CAT-CAC

Rev: GCA-AAC-CTT-AGA-TAC-CAA-GTT-G

Cy 5 285-312

9 D118

For: CGG-ACA-TAT-TCC-ACC-CAT-TC

Rev: TCC-TGT-AAG-TTT-GGC-CGA-GA

Cy 5 177-193



17

PCR-reakcija je bila izvedena z uporabo termocikla Whatman Biometra T-Gradient

(Goettingen, Nemčija). Za ugotovitev optimalnih pogojev za PCR-reakcije smo najprej

naredili temperaturni gradient. Temperature prileganja, vključene v reakciji, so bile: 55 °C,

55,2 °C, 55,6 °C, 56,2 °C, 56,9 °C, 57,6 °C, 58,4 °C, 59,1 °C, 60,4 °C, 60,8 °C in 61 °C

(Preglednica 2).

Preglednica 2: Program pomnoževanja s Taq-polimerazo – temperaturni gradient.

PCR-pogoji Čas trajanja reakcije Temperatura (°C) Število ciklov

Začetna denaturacija DNK 15 min 94

40 Denaturacija DNK 30 s 94

Prileganje začetnih

oligonukleotidov

120 s 55–61

Podaljševanje verige DNK 90 s 72

Inkubacija 30 min 72

Vzdrževanje neskončno 4

Optimalna ugotovljena temperatura za rekombinacijo DNK je znašala za vsak začetni

oligonukleotid 60,4 °C. PCR-reakcije so nato potekale pod pogoji, predstavljenimi v

Preglednici 3.



18

Preglednica 3: Program pomnoževanja s Taq-polimerazo – temperaturni gradient.

PCR-pogoji Čas trajanja reakcije Temperatura (°C) Število ciklov

Začetna denaturacija DNK 15 min 94

40

Denaturacija DNK 30 s 94

Prileganje začetnih

oligonukleotidov

120 s 60,4

Podaljševanje verige DNK 90 s 72

Inkubacija 30 min 72

Vzdrževanje neskončno 4

4.2.7 MIKROSATELITSKI MARKERJI

Za analizo mikrosatelitov smo uporabili devet mikrosatelitskih lokusov, razvitih s strani

A'Hara in sod. (2011). Seznam devetih parov začetnih oligonukleotidov je predstavljen v

Preglednici 1. Za detekcijo fragmentov na kapilarni elektroforezi smo začetne oligonukleotide

označili z dvema različnima barviloma: Cy 5 in Cy 5,5. Različna barvila smo uporabili zato,

da smo lahko v eni reakciji analizirali tri vzorce oz. PCR-pomnožke.

4.2.8 KAPILARNA ELEKTROFOREZA

Za analizo na kapilarni elektroforezi je treba dodati optimalno količino PCR-produkta. To

količino smo določili na podlagi slike, ki smo jo dobili z agarozno elektroforezo. V večini

primerov smo odpipetirali 1 µL PCR-pomožka in ga dodali k 40 µL formamida ter dodali

0,33 µL dolžinskega standarda. Na vrh smo dodali kapljico mineralnega olja.

Zaradi optimizacije postopka smo hkrati analizirali več lokusov. Lokuse smo razvrstili v štiri

skupine: CE1, CE2, CE3 in CE4. Skupina CE1 predstavlja lokuse A5, A102 in D110a.

Skupina CE2 predstavlja lokuse D7, D110 in C112. V skupini CE3 sta lokusa D118 in A112,

v skupini CE4 pa lokusa B119 in C105.



19

4.2.9 ANALIZA REZULTATOV

Mere variabilnosti, ki smo jih vključili v analizo vrednotenja raznolikosti, so bile naslednje:

− število alelov na posamezen lokus;

− PI (probability of identity) – verjetnost identitete oz. verjetnost enakih genotipov;

− pričakovana heterozigotnost (He);

− dejanska/opažena heterozigotnost (Ho).

Dobljeni fragmenti so bili zabeleženi za prisotnost (1) ali za odsotnost (0) fragmenta. Iz teh

podatkov (podatki o prisotnosti in odsotnosti določenega alela pri genotipu) smo sestavili

binarno matriko. Binarna matrika se je uporabila za izračun koeficientov podobnosti po Dicu

(Dice, 1945) s pomočjo računalniškega paketa DARWIN (Perrier in Jacquemond-Collet,

2005).

Diceovi koeficienti podobnosti:

D(ij) = (b + c)/[(2a + (b + c))],

kjer je:

a – število spremenljivk, ki vsebujejo i + j;

b – število spremenljivk, ki vsebujejo i, ne pa tudi j;

c – število spremenljivk, ki vsebujejo j, ne pa tudi i.

Za vsak mikrosatelitni lokus smo z računalniškim programom IDENTITY 1.0 (Wagner in

Sefc, 1999) izračunali število alelov na lokus (n), frekvenco alelov, opazovano

heterozigotnost (Ho), pričakovano heterozigotnost (He) in verjetnost enakih genotipov (PI).

Povprečna razdalja med pristopnimi pari je bila pridobljena z upoštevanjem mikrosatelitskih

podatkov. Genotipe smo v sorodnostne skupine razvrstili z uporabo metode z algoritmom NJ

(angl. neighbour-joining tree). Nato smo z računalniškim paketom DARWIN (Perrier in

Jacquemond-Collet, 2005) izdelali dendrogram. Za ugotavljanje podobnosti med vzorci smo

izvedli korespondenčno analizo z odstranjenim trendom DCA (angl. Detrended

Correspondence Analysis). Analizo smo izvedli s programsko opremo Canoco in CanoDraw

avtorjev ter Braak in Šmilauer (2002).



20

5 REZULTATI Z DISKUSIJO

5.1 IZOLACIJE IN KONCENTRACIJE IZOLIRANE DNK

V raziskavo smo vključili 45 vzorcev, 15 iz vsakega raziskovalnega območja. Petnajst

vzorcev je bilo iz Slovenije (Bled). Označili smo jih kot SI1, SI2, SI3, SI4, SI5, SI6, SI7, SI8,

SI9, SI10, SI11, SI12, SI13, SI14 in SI15. Petnajst vzorcev je bilo iz Avstrije. Označili smo

jih AT1, AT2, AT3, AT4, AT5, AT6, AT7, AT8, AT9, AT10, AT11, AT12, AT13, AT14 in

AT15. Ostalih petnajst vzorcev je bilo iz Švedske, označili smo jih SE1, SE2, SE3, SE4, SE5,

SE6, SE7, SE8, SE9, SE10, SE11, SE12, SE13, SE14 in SE15. Preglednica 4 prikazuje

izmerjene koncentracije DNK v posameznih vzorcih.

Pri vseh uporabljenih vzorcih smo DNK z metodo CTAB uspešno izolirali. Izolacijo DNK

smo preverili na agaroznem gelu. Dodano barvilo SyberGreen se je vezalo na fragmente

DNK, zato so na gelu vidne frakcije, ki so pod UV-žarki fluorescentno osvetljene.

Fotografiranje gela pod UV-žarki nam je dalo vpogled v količino in kakovost izolirane DNK

(Sliki 5 in 6).

Slika 5: Izolirana DNK z elektroforezo v agaroznem gelu. Proge: 1–15: vzorci izolirane severne

linejevke iz Švedske, 16: velikostni standard DNK (1 kb DNK Ladder).



21

Slika 6: Izolirana DNK z elektroforezo v agaroznem gelu. Proge: 2–16: vzorci izolirane severne

linejevke iz Avstrije, 1: velikostni standard DNK (1 kb DNK Ladder).

Pri agarozni elektroforezi se fragmenti DNK pod vplivom električne napetosti skozi agarozni

gel gibajo od negativnega proti pozitivno nabitemu polu. Potovanje fragmentov DNK nam

razkriva okvirno dolžino baznih parov analizirane DNK.

Preglednica 4: Izmerjena koncentracija DNK v posameznih vzorcih. Legenda: AT(1–15): Avstrija,

SI(1–15): Slovenija in SE(1–15): Švedska.

Vzorci Koncentracija, izmerjena s

fluorimetrom (µg/mL)

A1 68,75

A2 69,71

A3 79,63

A4 89,51

A5 98,16

A6 108,8

A7 112,4

A8 117,5

A9 119,5

A10 119,8

A11 129,8

A12 139,5

A13 140,3

A14 141,5

A15 157,5

SI1 53,34

SI2 55,03

SI3 55,19

SI4 56,01

SI5 57,77

SI6 59,71



22

5.2 NAMNOŽEVANJE S PCR IN MIKROSATELITI

Za ugotovitev optimalne temperature prileganja začetnih oligonukleotidov v PCR-reakciji

smo naredili temperaturni gradient s temperaturami 55–61 °C (Sliki 7 in 8). Najboljšo

amplifikacijo smo dosegli pri temperaturi 60,4 °C (velja za vse začetne oligonukleotide). Pri

enem izmed začetnih oligonukleotidov smo v PCR-produktu zaznali nespecifično namnožene

fragmente DNK, zato smo ga izločili in delo nadaljevali z ostalimi devetimi začetnimi

oligonukleotidi: A5, A102, D100a, D7, D110, D118, A112, B119 in C105. Za nadaljnje

analize vseh 45 vzorcev smo uporabljali označene začetne oligonukleotide (Cy 5, Cy 5,5), ki

omogočajo detekcijo fragmentov na kapilarni elektroforezi. Pri PCR-reakcijah lahko na

uspešnost namnoževanja mikrosatelitskih lokusov vplivajo različni dejavniki: kakovost

izolirane DNK, število ciklov, temperature prileganja, razmerja med količinami kemikalij,

nenatančno pipetiranje itd.

SI7 61,49

SI8 64,67

SI9 70,21

SI10 71,47

SI11 81,79

SI12 83,71

SI13 86,57

SI14 97,12

SI15 134,2

SE1 29,11

SE2 32,23

SE3 32,3

SE4 37,29

SE5 38,09

SE6 39,33

SE7 40,9

SE8 46,75

SE9 46,75

SE10 48,63

SE11 54,65

SE12 55,28

SE13 66,12

SE14 67,05

SE15 120,6



23

Slika 7: Testiranje primerne temperature za prileganje začetnega oligonukleotida (lokus D110a),

temperaturni gradient 55–61 °C.

Slika 8: Testiranje primerne temperature za prileganje začetnega oligonukleotida (lokus D7),

temperaturni gradient 55–61 °C.



24

5.3 KAPILARNA ELEKTROFOREZA

Za natančno določitev dolžin fragmentov smo uporabili kapilarno elektroforezo (Beckman

Coulter CEQ 8000, Kalifornija, ZDA). Slika 9 nam prikazuje elektroforetske krivulje, iz

katerih odčitamo velikosti fragmentov v baznih parih (bp) za posamezen mikrosatelitski

lokus. Z dodanim dolžinskim standardom (na sliki krivulja rdeče barve) računalnik izračuna

dolžino namnoženih fragmentov. Na Sliki 9 sta prikazana vzorec Š14 in lokus D118 (modre

barve, označen s Cy 5).

Slika 9: Dolžina fragmenta vzorca SE14 v obliki vrha na mikrosatelitskem lokusu D118; velikosti so

podane v bp.

0

1 0 0 0 0

2 0 0 0 0

3 0 0 0 0

4 0 0 0 0

5 0 0 0 0

6 0 0 0 0

7 0 0 0 0

8 0 0 0 0

9 0 0 0 0

1 5 5 1 6 0 1 6 5 1 7 0 1 7 5 1 8 0 1 8 5 1 9 0S iz e ( n t )

Dye S

ignal

153.19

155.18

155.63

157.75

157.91

158.88

159.17

160

160.98

161.05

161.85

162.68

163.64

165.36

166.34

166.87

167.91

168.98

169.46

169.88

170.69

172.03

172.60

172.96

173.84

174.57

175.97

176.67

177.77

179.02

180

180.70

181.59

190

191.05



25

5.4 PREŽIVETVENA SPOSOBNOST VRSTE

Z analizo mikrosatelitov smo uspeli namnožiti skupaj 70 alelov na 9 mikrosatelitskih lokusih.

Najmanj alelov smo odkrili na mikrosatelitskem lokusu A5 (4), na lokusu D118 (5), na lokusu

D110 (6), na lokusih D110a, D7 in C105 (7), na lokusu A102 (10) in največ na lokusih A112

in B119 (12) (Preglednica 5).

Preglednica 5: Parametri genetske variabilnosti posameznih mikrosatelitskih lokusov za analiziranih

45 genotipov L. borealis: število alelov (n), opažena stopnja heterozigotnosti (Ho) in

pričakovana stopnja heterozigotnosti (He), verjetnost enakosti genotipov (PI).

Lokus n Ho He PI

A5 4 0,89 0,65 0,33

A102 10 0,82 0,84 0,09

D110a 7 0,87 0,63 0,29

D7 7 0,69 0,74 0,21

D110 6 0,51 0,76 0,17

D118 5 0,58 0,72 0,22

A112 12 0,93 0,86 0,06

B119 12 0,93 0,86 0,07

C105 7 0,98 0,75 0,18

Povprečje 7,78 0,80 0,76 5,15 × 10-8*

* kombinirana verjetnost enakih genotipov (PI) v vseh lokusih (z množenjem)

Parametri genetske variabilnosti 9 mikrosatelitskih lokusov so pokazali 70 polimorfnih alelov.

Število alelov (Preglednica 5), ugotovljenih na lokusu, je bilo od 4 (A5) do 12 (A112 in

B119), in sicer s povprečjem 7,78 alelov na lokus. Opažena heterozigotnost (H0) je znašala

med 0,51 (lokus D110) in 0,98 (C105), in sicer s povprečjem 0,80. Pričakovana

heterozigotnost (He) je znašala med 0,65 (A5) in 0,86 (lokusa A112 in B119), in sicer s



26

povprečjem 0,76. Razlike med opaženo in pričakovano heterozigotnostjo so bile preučene za

vse preiskovane lokuse. Največja razlika je bila ugotovljena na lokusu D110 (0,25), najnižja

pa na lokusu A102 (0,02). Povprečje opažene (0,80) in pričakovane (0,76) heterozigotnosti je

bilo precej podobno. Pri 5 od 9 lokusov (A5, D110a, A112, B119 in C105) je bila opažena

heterozigotnost višja od pričakovane, vendar pa je bila pri štirih lokusih (A102, D7, D110 in

D118) H0 nižja od He. Najbolj informativni lokus za to skupino genotipov je bil A112, in sicer

z verjetnostjo enakih genotipov (PI) 0,06, najmanj informativen lokus pa je A5, in sicer z

verjetnostjo enakih genotipov (PI) 0,33. Kumulativna verjetnost pridobitve identičnih

genotipov z uporabo vseh 9 lokusov je bila dokaj nizka (5,15 × 10-8) (Preglednica 5).

Zaradi lažje genotipizacije smo alele na posameznem lokusu poimenovali s črkami A–L.

Črka A pripada alelu, ki je na lokusu najkrajši, črka B alelu, ki je naslednji najkrajši, do črke

L, ki pripada alelu, ki je na lokusu najdaljši. Število alelov se ujema s številom črk. To velja

za vsak lokus. Za posamezne alele smo izračunali dokaj nizke frekvence (Preglednica 6).

Lokus A5 ima najpogosteje zastopan alel B (171 bp), lokus A102 ima najpogosteje zastopan

alel A (184 bp), lokus D110a ima najpogosteje zastopan alel B (270 bp), lokus D7 ima

najpogosteje zastopan alel D (160 bp), lokusa D110 in D118 imata najpogosteje zastopan alel

C (221 in 175 bp), lokus A112 ima najpogosteje zastopan alel H (243 bp), lokus B119 ima

najpogosteje zastopan alel G (222 bp), lokus C105 pa ima najpogosteje zastopan alel D

(248 bp). Dolžine alelov (bp) so prikazane v Preglednici 6.

Preglednica 6: Dolžina alelov (bp) in frekvenca alelov (v oklepajih) 45 genotipov L. borealis pri

devetih mikrosatelitnih lokusih.

Lo

ku

s

Aleli

A B C D E F G H I J K L

A5 163

(0,19)

171

(0,43)

173

(0,36)

191

(0,02)

- - - - - - - -

A102 184

(0,23)

186

(0,02)

200

(0,07)

202

(0,22)

204

(0,03)

206

(0,01)

208

(0,17)

210

(0,04)

218

(0,13)

220

0,07)

- -

D110a 264

(0,01)

270

(0,53)

278

(0,17)

282

(0,23)

284

(0,02)

290

(0,01)

302

(0,02)

- - - - -

D7 146

(0,01)

156

(0,04)

158

(0,24)

160

(0,36)

162

(0,27)

164

(0,07)

166

(0,01)

- - - - -



27

D110 215

(0,01)

219

(0,29)

221

(0,31)

223

(0,19)

227

(0,13)

229

(0,07)

- - - - - -

D118 169

(0,28)

172

(0,12)

175

(0,39)

178

(0,03)

182

(0,18)

- - - - - - -

A112 223

(0,02)

227

(0,03)

229

(0,17)

235

(0,03)

237

(0,04)

239

(0,01)

241

(0,18)

243

(0,20)

249

(0,11)

255

(0,03)

257

(0,14)

259

(0,02)

B119 198

(0,02)

202

(0,09)

204

(0,08)

209

(0,02)

211

(0,01)

218

(0,02)

222

(0,21)

224

(0,02)

226

(0,17)

232

(0,17)

234

(0,17)

238

(0,02)

C105 241

(0,01)

243

(0,06)

246

(0,04)

248

(0,33)

250

(0,18)

252

(0,31)

254

(0,07)

- - - - -

Vrednotenje genetske sorodnosti: s podatki, zabeleženimi za prisotnost (1) ali za odsotnost (0)

določenega alela pri genotipu, smo sestavili binarno matriko, ki se je uporabila za izračun

koeficientov podobnosti po Dicu (Dice, 1945) s pomočjo računalniškega paketa DARWIN

(Perrier in Jacquemond-Collet, 2005). Genotipe smo v sorodnostne skupine razvrstili z

uporabo algoritma NJ (angl. neighbour-joining tree) in za grafični prikaz izdelali dendrogram

(Slika 11). Nato smo izdelali še multivariatno analizo (Slika 10). Modre številke na

dendrogramu imajo vrednosti od 1 do 100. Višja, kot je številka, večja je verjetnost pravilne

razporeditve. Multivariatna analiza (Slika 10) in dendrogram (Slika 11) sta razkrila tri ločene

skupine (angl. cluster), od katerih vsaka označuje eno lokacijo, vendar so vzorci iz borealne

lokacije prisotni v vseh treh skupinah. Vsi vzorci, ki smo jih nabrali na lokaciji v Avstriji, so

tvorili svojo skupino, enako so vsi vzorci iz Slovenije razporejeni v svojo skupino.

Čeprav smo se izognili vzorčenju istih vzorcev, smo v Sloveniji našli le 8 različnih genotipov

(od 15 primerov), v Avstriji pa le 5 (od 15). Na Švedskem je bilo ugotovljenih 14 (od 15)

genotipov. Ko opazujemo dolžino vodoravnih linij v dendrogramu, lahko opazimo najvišjo

genetsko variabilnost med borealno populacijo – kot pričakovano in zelo nizko raznolikost v

obeh alpskih populacijah. Presenetljivo sta zelo tesno izolirani populaciji iz Avstrije in

Slovenije popolnoma različni in z zelo visokimi variacijami med populacijama. Genetska

varianca, ki temelji na devetih mikrosatelitnih lokusih, je pokazala zelo nizko genetsko

variabilnost v dveh izoliranih populacijah, kar je bilo pričakovano zaradi relativno majhne

pokritosti rastlin in še manjšega, zelo omejenega števila razlikovalnih klonov na obeh mestih.



28

Slika 10: DCA-ordinacijski diagram matrike 45 genotipov L. borealis pri 9 mikrosatelitnih

lokusih. Lastne vrednosti DCA: os 1: 18,1; os 2: 26,1. Legenda: črni krogci: Avstrija; zeleni

romboidi: Švedska in vijoličasti kvadrati: Bled.



29

Slika 11: Dendrogram, ki opisuje genetske povezave med 45 genotipi L. borealis s treh lokacij

(AT = Avstrija, SI = Slovenija, SE = Švedska).



30

Ugotovili smo zelo veliko genetsko raznolikost med obema populacijama (slovensko in

avstrijsko), čeprav je med njima le 73 km zračne razdalje. To kaže na zelo slabo razpršilno

sposobnost ali pa je celo ni. Kljub temu pa ne smemo podcenjevati odsotnosti neprimernih

habitatov. Tako lahko jasno sklepamo, da sta obe izolirani alpski populaciji populaciji

glacialnih reliktov, kar menijo tudi raziskovalci Hensen in sod. (2010), Reisch in sod. (2002;

2003) ter Jermakowicz in sod. (2017). Ti raziskovalci pojasnjujejo visoko genetsko

variabilnost med populacijami v smislu zaporednih ozkih grl in dolgoročne izolacije. V

študiji, ki jo je izvedla Wróblewska (2013), je bila za L. borealis v Evraziji razkrita

filogeografska struktura, ki je izhajala iz plastidne DNK, in zmerna raznolikost genoma,

ocenjena z markerji AFLP. Identificiranih je bilo šest haplotipov v razponu od Škotske do

gorovja Altai (Rusija) in od Norveške do Italije. Vendar je Wróblewska (2013) ugotovila, da

čeprav je bila polovica preiskovanih populacij močno izolirana, se je ohranila podobna raven

genetske raznovrstnosti v celotnem geografskem območju. Zraven tega ni našla nobene

podpore za hipotezo, da sta ozko grlo in/ali križanje v sorodstvu spremljala habitatno

razdrobljenost kot dejavnika, ki sta oblikovala genetsko raznolikost. Kar zadeva alpsko

populacijo, je Wróblewska (2013) vzorce vzela le v zahodnih Alpah (Aosta, Italija, Les

Allues, Francija) in osrednjih Alpah (Zernez, Švica). Vzorci so bili vzeti po razpredelnici

distribucije Meusel in Jäger (2011), kjer pa distribucija ni točna (izolirane lise) kot v

vzhodnem delu Alp, temveč je prikazana kot območje podrazreda. Vzhodno od črte

Innsbruck-Wipp-Valley-BrennerPass-Eisack-Valley-Etsch-Valley obstajajo le raztresena

najdišča, ki jih najdemo predvsem v gorovju Hohen Tauren. Od tam in po celotnih preostalih

vzhodnih Alpah, z izjemo treh krajev na jugovzhodnih mejah Alp (Ernet in Franz, 2011), L.

borealis ni bila najdena nikjer. To je morda razlog za prisotnost štirih od šestih halotipov na

zgoraj navedenih lokacijah v zahodnih in osrednjih Alpah.

Segrevanje je po koncu zadnje poledenitve v vsakem primeru vplivalo in povzročilo izgubo

ustreznega habitata, kar je povzročilo bolj ali manj izrazito fragmentacijo alpske populacije.

To je dokončno, vsaj v vzhodnih Alpah, pripeljalo do le nekaj preostalih prostih mest s

specifičnimi življenjskimi pogoji, ki so povezani z veliko nadmorsko višino, severno

izpostavljenostjo in posebnimi razmerami v tleh. Ernet in Franz (2011) omenjata pobočja, za

katera je značilen hladen zrak, ki piha izpod balvanov v poletnem času. To je ravno značilnost

Krških Alp na avstrijski lokaciji, še izrazitejša pa je ta značilnost za Sotesko Nomenj v

Sloveniji, kjer na izredno nizki nadmorski višini (495 m) v času vegetacijske sezone piha iz

lukenj pod ruševinami ledeno hladen zrak. Na strmih severnih pobočjih ni neposrednega



31

sonca, kar povečuje vlago v tleh in zračno vlago. Po mnenju Wraberja (1963) je to razlog,

zakaj se na tem območju ni razvil conski bukov gozd, temveč je tukaj prevladala skupnost

Rhododendron hirsutum skupaj s škotskim borom in macesnom.

Dobro je znano, da najhujši negativni učinek razdrobljenosti izhaja iz genetskega drifta,

povečanega križanja v sorodstvu in zmanjšanega pretoka genov med populacijami (Ellstrand

in Elam, 1993; Young in sod., 1996; Young in Brown, 1999; Scobie in Wilcock, 2009;

Wilberg in sod., 2016). To je privedlo do manjšega števila potomcev in zmanjšanja fitnesa

populacij (Oostermeijer in sod., 1994; Fischer in Matthies, 1998; Willi in Fischer, 2005;

Scobie in Wilcock, 2009). V primeru L. borealis, ki je avto-inkompatibilna rastlina, je učinek

izolacije na uspešnost reprodukcije še večji. Za uspešno oploditev avto-inkompatibilne

rastline, kot je L. borealis, se zahteva navzkrižno opraševanje z združljivim partnerjem, ki ne

pripada istemu klonu. Poročali so, da se v ekstremnih primerih, kjer imajo vse preostale

rastline enake S-alele, lahko set semen zmanjša na nič (Demauro, 1993). Vendar pa je bila

omejena razpoložljivost partnerja vedno bolj opredeljena kot vzrok za razmnoževanje v

majhnih populacijah številnih klonskih, avto-inkompatibilnih rastlin, kot so Rubus saxatilis,

Aster furcatus, Calystegia collina, Arnica montana, Ranunculus reptans in Maianthemum

bifolium (Scobie in Wilcock, 2009). To je bilo ugotovljeno tudi za ločeno populacijo severne

linejevke na Škotskem, kjer reproduktivni neuspeh ni posledica pomanjkanja obiskov

insektov ali opraševanja z žuželkami, temveč je neuspeh posledica omejene partnerske

razpoložljivosti znotraj obližev in izolirane izmenjave peloda med obliži (Scobie in Wilcock,

2009).



32

6 SKLEPI

V raziskavi smo ugotavljali, ali je rastlinska vrsta L. borealis, ki je sicer klonalno uspešna na

izoliranih rastiščih, na območjih v vzhodnih Alpah (Slovenija in Avstrija) prisotna v več

klonih. Prav tako smo ugotavljali, ali med dvema populacijama L. borealis lahko pričakujemo

razlike v genetski variabilnosti v primerjavi s kontrolno populacijo na Švedskem. V genetsko

analizo smo vključili 45 genotipov, od teh jih je bilo 15 iz vsakega območja.

Končen rezultat našega raziskovalnega dela je predstavljen na dendrogramu in multivariatni

analizi, zato lahko podamo naslednje sklepe:

− S prvo hipotezo smo predpostavili, da bo genetska variabilnost med izoliranima

populacijama iz Slovenije in Avstrije v primerjavi z borealno populacijo pokazala

zmanjšano genetsko variabilnost izven borealnega dela areala. Rezultati, predstavljeni

na dendrogramu, so nam pokazali zelo nizko raznolikost v obeh alpskih populacijah,

kar je potrdilo našo prvo hipotezo. To je bilo tudi pričakovano zaradi majhne

pokritosti rastlin in zelo omejenega števila razlikovalnih klonov na obeh mestih.

− S pomočjo mikrosatelitskih lokusov smo ugotavljali število klonov, iz katerih je

sestavljena posamezna populacija. Čeprav smo se izogibali vzorčenju istih rastlin, smo

v Sloveniji našli le 8 različnih genotipov (od 15), v Avstriji pa le 5 (od 15). Za razliko

od Avstrije in Slovenije je bilo na Švedskem ugotovljenih kar 14 (od 15) različnih

genotipov. Drugo hipotezo smo tako potrdili: izolirani populaciji v Avstriji in

Sloveniji sta sestavljeni v glavnem iz istega klona, kontrolna populacija na Švedskem

pa je sestavljena iz več klonov.

− Pri analiziranih genotipih se je namnožilo 70 alelov na 9 mikrosatelitskih lokusih.

Najmanj polimorfen je lokus A5, ki je namnožil 4 alele, najbolj polimorfna pa sta

lokusa A112 in B119 z 12 aleli. V povprečju se je na lokus namnožilo 7,78 alelov.

− Presenetil nas je podatek, da sta populaciji iz Avstrije in Slovenije, ki sta sicer tesno

izolirani, popolnoma različni, čeprav je med njima relativno majhna zračna razdalja.

Obe populaciji sta po naših sklepanjih glacialna relikta, kar je najverjetneje posledica

dolgoročnih ozkih grl in dolgoročne izolacije v samem okolju. Pri uspešnosti

reprodukcije L. borealis, ki je avto-inkompatibilna rastlina, je učinek izolacije še večji.

− Ob predpostavki, da sta obe izolirani populaciji L. borealis v vzhodnih Alpah

glacialna relikta z znatno zmanjšano genetsko variacijo, so potrebne dodatne raziskave



33

o sposobnosti preživetja in reproduktivnosti, da se lahko zagotovi boljši ohranitveni

uspeh.

− Ta študija je pokazala, da izolirani populaciji v vzhodnih Alpah nista popolnoma

izgubili svoje sposobnosti za spolno razmnoževanje, kot se je zgodilo na Škotskem

(Scobie in Wilcock, 2009). To je seveda dobra novica, vendar je z vidika globalnega

segrevanja treba takšne populacije skrbno preučiti. Za ohranitev teh populacij so

potrebni tudi posebni protiukrepi.



34

ZAHVALA

Iskreno se zahvaljujem mentorici doc. dr. Nataši Pipenbaher za vodenje, vso strokovno

pomoč, nasvete in usmerjanje pri izdelavi magistrskega dela. Zahvaljujem se tudi somentorici

prof. dr. Metki Šiško za vso tehnično pomoč in somentorju prof. dr. Mitji Kaligariču za

strokovni pregled magistrskega dela.

Iz srca se zahvaljujem staršem, ki so mi zmeraj stali ob strani in mi omogočili študij.

Iskrena hvala tudi Reneju za potrpežljivost in vso podporo tekom celotnega študija ter bratu

Aljažu.



35

7 LITERATURA

A’Hara, S.W., Scobie, A.R., Broome, A., Long, D., Cottrell, J.E. 2011. Development of

microsatellite markers in twinflower (Linnaea borealis L.), a rare Scottish pinewood plant.

Mol. Ecol. Resour. 12(1), 185-9.

Aigner, PA. 2004. Ecological and genetic effects on demographic processes: pollination,

clonality and seed production in Dithyrea maritima. Biol. Conserv. 116, 27-34.

Allendorf, F. W., Ryman N. 2002. The role of genetics in population viability analysis.

University of Chicago Press. Chicago. 50–85.

Chlebicki, A. 2002. Biogeographic relationship between fungi and selected glacial relict

plants. Monographiae Botanicae. 90, 5-7.

Comes, H.P., Kadereit, J.W. 1998. The effects of quaternary changes on plant distribution and

evolution. Trends Plant Sci. 3, 432-438.

Cox, C. B., Moore, P.D. 2006. Biogeography: an ecological and evolutionary approach.

Oxford, Blackwell.

Demauro, M.M. 1993. Relationship of breeding system to rarity in the lakeside daisy

(Hymenoxys acaulis var. glabra). Conservation Biol. 7, 542-550.

Dice, L.R. 1945. Measures of the amount of ecologic association between species. Ecology.

26, 297-302.

Didham, R.K. , Kapos, V., Ewers, R.M. 2012. Rethinking the conceptual foundations of

habitat fragmentation research. Oikos. 121, 161–170.

Dobzhansky, T. 1964. Biology, Molecular and Organismic. American zoologist. 4(4), 443-

452.

Ellstrand, N.C., Elam, D.R. 1993. Population genetic consequences of small population size:

Implications for plant conservation. Annu. Rev. Ecol. Syst. 24, 217-242.

Eriksson, O. 1988. Variation in growth rate in shoot populations of the clonal dwarf shrub

Linnaea borealis. Holarctic Ecol. 11, 259-266.

Eriksson, O. 1992. Population structure and dynamics of the clonal dwarf-shrub Linnaea

borealis. Journal of Vegetation Science. 3(1), 61-68.



36

Ernet, D.R., Franz, W.R. 2011. Das Moosglöckchen, Linnaea borealis (Linnaeaceae), neu für

die Steiermark. Mit Anmerkungen zur Gesamtverbreitung und zu den Vorkommen dieser Art

in den Alpen. Joannea-Botanik. 09, 23-48.

Fischer, M., Matthies, D. 1998. Effects of population size on performance in the rare plant

Gentianella germanica. J.Ecol. 86, 195-204.

Fischer, M., Hock, M., Paschke, M. 2003. Low genetic variation reduces crosscompatibility

and offspring fitness in populations of a narrow endemic plant with a self-incompatibility

system. Conserv. Genet. 4, 325-336.

Hensen, I., Kilian, C., Wagner, V., Durka, W., Pusch, J., Wesche, K. 2010. Low genetic

variability and strong differentiation among isolated populations of the rare steppe grass Stipa

capillata in Central Europe. Plant Biol. 12, 526-536.

Hewitt, G.M. 1996. Some genetic consequences of ice ages, and their role in divergence and

speciation. Biol. J. Linn. Soc. 58, 247-276.

Hickey, M., King, C. 2000. The Cambridge illustrated glossary of botanical terms. Cambridge

University Press, Cambridge.

Hultén E. 1968. Flora of Alaska and neighboring territories: a manual of the vascular plants.

Stanford University Press. Stanford.

Hultén, E., Fries, M. 1986. Atlas of the north European vascular plants. Kӧnigstein: Koeltz

Scientific Books.

Jermakowicz, E., Brzosko, E., Kotowicz, J., Wroblewska, A. 2017. Genetic diversity of orhid

Malaxis monophyllos over European range as an effect of population properties and

postglacial colonization. Pol. J. Ecol. 65, 69-86.

Knapp, E. E., Dyer, R.A. 1997. When do genetic considerations require special approaches to

ecological restoration?. Conserv. Biol. 2, 345–363.

Kolos, A., Wolkowycki, D., Banaszuk, P., Kamocki, A. 2015. Protection of relict plant

species at the limit of their geographical range: response of Salixlapponum to competitor

removal. Ann. Bot. Fenn. 52, 303-314.

Kornaś, J. & Medwecka-Kornaś, A. 1968. The occurrence of introduced plants in natural and

semi-natural plant communities in Poland. Zakladu Fitosocjol. Stosowanej Uniw. Warszawsk.

25, 55–63.

Kryštufek, B. 1999. Osnove varstvene biologije. Tehniška založba Slovenije. Ljubljana.

http://www.zobodat.at/personen.php?id=1727

http://www.zobodat.at/personen.php?id=3040



37

Leimu, R., Vergeer, P., Angeloni, F., Ouborg, J. P. 2010. Habitat fragmentation, climate

change and inbreeding in plants. Ecol. and Concerv. Biol. 1195, 84-98.

Leimu, R., Mutikainen, P., Koricheva, J., Fischer, M. 2006. How general are positive

relationships between plant populationsize, fitness and genetic variation? Journal of Ecology

94,942–952.

Meredith, C.P., Bowers, J.E., Riaz, S., Handley, V., Bandman, E.B., Dangl, G.S. 1999. The

identity and parentage of the variety known in California as Petite Sirah. Am. J. Enol.

Viticult. 50, 236-242.

Meusel, H, Jäger, E. 2011. Vergleichende chorologie der zentral europäischen flora band I,II

und III. http://www2.biologie.uni-halle.de/bot/ag_chorologie/choro/index.php?Lang=D,

15.05.2017.

Munz, P. A., Keck D. D. 1975. A California flora and supplement. University of California

Press. Berkely.

Niva, M. 2003. Life history strategies in Linnaea borealis. Acta Universitatis Upsaliensis.

Comprehensive Summaries of Uppsala Dissertations from the Faculty of Science and

Technology. Uppsala: Acta Universitatus Upsaliensis.

Oostermeijer, J.G.B., van Eijk, M.W., Den Nijs, J.C.M. 1994. Offspring fitness in relation to

population size and genetic variation in the raw perennial plant Gentiana Pneumonanthe

(Gentianaceae). Oecologia. 97, 289-296.

Oostermeijer, J. G. B., Van Eijck, M. W. Van Leuween, N. C., Den Nijs, J. C. M. 1995.

Analysis of the relationship between allozyme heterozygosity and fitness in the rare Gentiana

pneumonanthe L. Journal of Evolutionary Biol. 8(6).

Otto S. P. 2003. The advantages of segregation and the evolution of sex. Genetics. 164, 1099–

1118.

Perrier, X., Jacquemoud-Collet, J. P. 2005. DARWIN-5.0. Dissimilarity analysis and

representation for Windows. User’s manual. Montpellier: CIRAD.

Preston, F. W. 1962. The canonical distribution of commonness and rarity: Part I. Ecology.

43(2).

Reisch, C., Poschlod, P., Wingender, R. 2002. Genetic variation of Sesleria albicans Kit ex

Schultes (Poaceae): lack of evidence for glacial relict endemism in central Europe. Plant Biol.

4, 1-9.



38

Reisch, C., Poschlod, P., Wingender, R. 2003. Genetic variation of Saxifraga paniculata

(Saxifragaceae): molecular evidence for glacial relict endemism in central Europe. Biol. J.

Linn. Soc. 80, 11-21.

Ross, M.S., La Roi, G.H. 1990.Above ground biomass allocation by four understorey vascular

plant species in central Alberta jack pine Pinus banksiana forests. Can. Field Nat. 104,394-

402.

Saitou, N., Nei, M. 1987. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing

phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4, 406-425.

Saunders, D.A., Hobbs, R.J., Margules, C.R. 1991. Biological consequences of ecosystem

fragmentation: a review. Conservation Biol. 5, 18-32.

Schemske, D.W., Husband, B.C., Ruckelshaus, M.H., Goodwillie, C., Parker, I.M., Bishop,

J.G. (1994). Evaluating approaches to the conservation of rare and endangered plants.

Ecology. 75, 585-606.

Scobie, A.R., Wilcock, C.C. 2009. Limited mate availability decreases reproductive success

of fragmented populations of Linnaea borealis, a rare, clonal self-incompatible plant. Ann.

Bot-London. 103, 835-846.

Scrosati, R. 2002. An updated definition of genet applicable to clonal seaweeds, bryophytes

and vascular plants. Basic and Applied Biol. 3 (2), 97-99.

Singleton, P. 2010. Dictionary of DNA and genome technology. John Wiley & Sons.

Šiško, M., Javornik, B., Šiftar, A., Ivančič, A. 2009. Genetic relationships among Slovenian

pears assessed by molecular markers. J. Am. Soc. Hortic. Sci. 134(1), 97-108.

Stolzfus, A. 2006. Mutationism and the Dual Causation of Evolutionary Change. Biochemical

science division, National institute of Standards and Technology. Gaithersburg.

Sundberg, S. 2014. Boreal plant decline in southern Sweden during the twentieth century.

New J. Bot. 4(2), 76 - 84.

Svenning, J.C., Normand, S., Skov, F. 2008. Postglacial dispersal limitation of widespread

forest plant species in nemoral Europe. Ecography. 31(3), 316 – 326.

ter Braak, C.J.F., Šmilauer, P. (2002). CANOCO Reference Manual and CanoDraw for

Windows User's Guide: Software for Canonical Community Ordination. Version 4.5.

Microcomputer power.



39

Tessier, C.; David, J.; This, P.; Boursiquot, J.M.; Charrier, A. 1999. Optimization of the

choice of molecular markers for varietal identification in Vitis vinifera L. Theor. Appl Genet.

98, 171-177.

Tilman, D., Reich, B. P., Knops, J., Wedin, D., Mielke, T., Lehman, C. 2001. Diversity and

Productivity in a Long-Term Grassland Experiment. Science. 294(5543), 843-845.

Valasek, M.A.; Repa J.J. 2005. The power of real-time PCR. Advances in Physiology

Education. 29 (3), 151-159.

Van Treuren, R., Bijlsma, R., Van Delden, W., Ouborg, N.J. 1991. The significance of genetic

erosion in the process of extinction. I. Genetic differentiation in Salvia pratensis and Scabiosa

columbaria in relation to population size. Heredity. 66, 181-189.

Vogler, F.; Reisch, C. 2013. Vital survivors: low genetic variation but high germination in

glacial relict populations of the typical rock plant Draba aizoides. Biodivers. Conserv. 22,

1301-1316.

Wagner, H.W., Sefc, K.M. 1999. IDENTITY 1.0. Center for Applied Genetics, University of

Agricultural Sciences Vienna.

Warburton, C.L., James, E.A., Fripp, Y.J., Trueman, S.J., Wallace, H.M. 2000. Clonality and

sexual reproductive failure in remnant populations of Santalum lanceolatum (Santalaceae).

Biol. Conserv. 96, 45-54.

Wiberg, R.A., Scobie, A.R., AˈHara, S., Ennos, R.A. Cottrell, J.E. 2016. The genetic

consequences of long term habitat fragmentation on a self-incompatible clonal plant, Linnaea

borealis L. Biol. Conserv. 201, 405-413.

Wilcock, C.C., Jennings, S.B. 1999. Partner limitation and restoration of sexual reproduction

in the clonal dwarf shrub Linnaea borealis L. (Caprifoliaceae). Protoplasma. 208, 76-86.

Wilcock, C.C. 2002. Maintenance and Recovery of Rare Clonal Plants: The Case of

Twinflower (Linnaea borealis). Botanical Journal of Scotland. 54(1), 121-131.

Wilcock, C.C., Neiland, M.RM. 2002. Pollination failure in plants: why it happens and when

it matters. Trends. Plant.Sci.7, 270-277.

Wilcove, D. S., McLellan H. C., Dobson, P. A. 1986. Habitat fragmentation in the temperate

zone. Conserv. Biol. 11, 238-256.

Willi, Y., Fischer, M. 2005. Genetic rescue in interconnected populations of small and large

size of the self-incompatible Ranunculus reptans. Heredity. 95, 437–443.



40

Willi, Y., van Buskirk, J., Hoffmann, A. 2006. Limits to the adaptive potential of small

populations. Annu. Rev. Ecol. Evol. S. 37, 433–458.

Wilberg, R.A.W., Scobie, A.R., A'Hara, S.W., Ennos, R.A., Cottrell, J.E. 2016. The genetic

consequences of long term habitat fragmentation on a self-incompatible clonal plant, Linnaea

borealis L. Biol. Conserv. 201, 405-413.

Wilson, M.C. 2016. Habitat fragmentation and biodiversity conservation: key findings and

future challenges. Landscape Ecology. 31(2), 219-227.

Wraber, T. 1963. Linnaea Borealis L., Planta rediviva slovenske flore. Prirodoslovni muzej v

Ljubljani.

Wróblewska, A. 2013. The phylogeographical and population genetic approach to the

investigation of the genetic diversity patterns in self-incompatible clonal and polyploidy

Linnaea borealis subsp. borealis. Biol. J. Linn. Soc. 173, 64-76.

Wolf, A.T., Harrison, S.P. 2001. Effect of habitat size and patch isolation on reproduction

success of the serpentine morning glory. Conservation Biol. 15, 111-121.

Young, A.G., Brown, A.H.D. 1999. Paternal bottlenecks in fragmented populations of the

grassland daisy Rutidosis leptorrhynchoides. Genet. Res. 73, 111–117.

Young, A., Boyle, T., Brown, T. 1996. The population genetic consequences of habitat

fragmentation for plants. Trends Ecol. Evol. 11, 413-418.

Zimmermann, M., Vischer-Leopold, M., Ellwanger, G., Ssymank A., Schröder E. 2010. The

EU Habitats Directive and the German Natura 2000: Network of Protected Areas as Tool for

Implementing the Conservation of Relict Species. Springer. Berlin, Heidelberg .

Zulini, L., Russo, M., Peterlunger, E. 2002. Genotyping wine and table grape cultivars from

Apulia (Southern Italy) using microsatellite markers. Vitis. 41, 183-187.

Date post:	08-Mar-2021
Category:	Documents
Upload:	others
View:	1 times
Download:	0 times

MAGISTRSKO DELO Tea Kelc - COnnecting REpositories · 2018. 5. 1. · Kelc, T. Vpliv genetske...

Documents