Manual de Bio-Cel 2010 BORRADOR

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BAJA CALIFORNIA UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BAJA CALIFORNIA UNIDAD UNIVERSITARIA VALLE DE LAS PALMAS

Campus Tijuana Centro de Ciencias de la Salud

MANUAL DE LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR

ÍNDICE

INTRODUCCIÓN.............................................................................................................2

OBJETIVO GENERAL.....................................................................................................3

REGLAMENTO GENERAL DE LOS LABORATORIOS..................................................3

INDICACIONES GENERALES PARA EL DESARROLLO DE LAS PRÁCTICAS...........6Equipos de trabajo:.......................................................................................................7Limpieza y seguridad de laboratorio:............................................................................7Permanencia en laboratorio:........................................................................................7Prácticas de laboratorio:...............................................................................................8Evaluación de laboratorio:............................................................................................8

ELABORACIÓN Y ENTREGA DE REPORTES DE LABORATORIO..............................8

PRÁCTICA No. 1........................................................................................................10PRÁCTICA No. 2........................................................................................................12PRÁCTICA No. 3........................................................................................................15PRÁCTICA No. 4........................................................................................................17PRÁCTICA No. 5........................................................................................................21PRÁCTICA No. 6........................................................................................................23PRÁCTICA No. 7........................................................................................................26PRÁCTICA No. 8........................................................................................................28PRÁCTICA No. 9........................................................................................................31PRÁCTICA No. 10......................................................................................................34PRÁCTICA No. 11......................................................................................................37

ANEXOS........................................................................................................................39RÚBRICA PARA EVALUAR UN INFORME DE PRÁCTICA......................................39INFORMACIÓN COMPLEMETARIA PRÁCTICA No. 1.............................................40INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA PRÁCTICA No. 2...........................................42INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA PRÁCTICA No. 4...........................................43INFORMACIÓN COMPLEMETARIA PRÁCTICA No. 5.............................................45INFORMACIÓN COMPLEMETARIA PRÁCTICA No. 7...............................................47CARIOTIPO HUMANO DESORDENADO..................................................................49

INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA PRÁCTICA No. 10.........................................50

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INTRODUCCIÓN

El presente Manual de Laboratorio de Biología celular reúne las prácticas a desarrollar en las sesiones de laboratorio de la asignatura, recopila la información necesaria para su realización e indica los pasos principales de la experimentación, de tal manera que los estudiantes cuentan con la herramienta teórica básica para la realización exitosa de las prácticas.

Este material de apoyo didáctico ha sido diseñado para servir de apoyo tanto para los alumnos como para los instructores, el proceso de experimentación en un laboratorio escolar es fundamental para relacionar y aplicar los conocimientos adquiridos en clase y reforzar el proceso de enseñanza aprendizaje, sin importar la orientación científica por la que se inclinen los alumnos.

Para que el alumno desarrolle las capacidades de resolución de problemas es

necesario proporcionarle un ambiente donde tenga la oportunidad de encontrarse con casos y/o situaciones que lo motiven a experimentar. El proceso constante de integración de información requiere apoyarse en la construcción de ideas, y es ahí donde las actividades experimentales propician la reorganización y clarificación de conocimientos que facilitan alcanzar un aprendizaje significativo.

Así pues, el seguimiento y la aplicación del método científico en un proceso de experimentación culmina con encontrar una respuesta a cuestionamientos que surgen en base a sucesos reales; los objetivos del laboratorio de Biología celular, es extrapolar a casos reales problemáticas revisadas en teoría, donde el alumno podrá sugerir posibles soluciones en base a datos arrojados por un proceso de experimentación desarrollado por el mismo.

OBJETIVO GENERALEl objetivo general que persigue el presente Manual de Laboratorio como

herramienta de trabajo es que el alumno tenga a su alcance la información necesario referente a la reglamentación del uso y permanencia de laboratorio, asi como la temática de cada una de las prácticas permitiendo asi avanzar favorablemente en la práctica.

Las ilustraciones y ejemplos que contienen las practicas aquí propuestas respaldan y demuestran los resultados de las practicas, de ésta manera, el alumno podrá apoyarse en las mismas para elaborar un informe de laboratorio completo y al nivel de trabajo que la materia y la sesión práctica exija.

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REGLAMENTO GENERAL DE LOS LABORATORIOS

Este reglamento es de observancia obligatoria para cualquier persona que ingrese o visite nuestros laboratorios.

1. Presentarse preparados previa lectura de la práctica correspondiente de su manual de laboratorio.

2. Usar bata de laboratorio manga larga, limpia, abotonada, pantalón al tobillo, zapato cerrado con tacón máximo de 6 cm de altura, cabello recogido, uñas cortas. La bata será de uso exclusivo para las prácticas y no deberá portarse fuera del laboratorio o clínica.

3. Portar credencial de identificación visible en todo momento.

4. No presentarse bajo el influjo de bebidas alcohólicas o cualquier otra droga.

5. Mantener sus pertenencias fuera del área de trabajo o en espacios asignados por el profesor del laboratorio.

6. Prohibido: introducir alimentos, bebidas, mascotas fumar, gritar, correr, jugar y sentarse en las mesas de trabajo. El uso de accesorios, joyería y alhajas. El uso de celulares o sistemas de comunicación móvil.

7. Lavarse las manos antes y después de trabajar de cada sesión.

8. Mantener limpia, ordenada y/o saneada su área de trabajo, antes y después de realizar la actividad.

9. El usuario deberá de contar con material de limpieza de acuerdo a las actividades realizadas.

10.Uso de equipo de protección personal (guantes de látex, goggles, mascarilla, etc) durante la permanencia dentro del laboratorio, de acuerdo a la actividad a realizar.

11.Mantener las puertas y ventanas cerradas en caso de que la actividad a realizar así lo requiera.

12.Reportar incidentes o accidentes por leve que sean con o sin lesión, condiciones inseguras y equipo dañado al personal de laboratorio o al responsable del laboratorio.

13.No trate de atender un accidente o contingencia para lo cual no ha sido capacitado.

14.En simulacros o contingencias obedecer las disposiciones de seguridad indicadas por el profesor, coordinador o responsable del evento.

15.No distraer a sus compañeros durante la manipulación de material, equipo y sustancias.

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16.Respetar horarios de actividades y en caso de no terminar la actividad en su horario, solicitar acceso al responsable.

17.No se podrán realizar prácticas sin la supervisión de un responsable del laboratorio.

18.No mover, sustraer, manipular o hacer uso indebido de equipo sin autorización, así como sistemas de cómputo y transmisión de datos.

19.En caso de ruptura o daño del material de laboratorio este deberá ser repuesto en un lapso no mayor de 15 días.

20.Disponer los residuos generados en la práctica en su contenedor correspondiente bajo supervisión del técnico académico, responsable del laboratorio o por personal capacitado para ello. Es responsabilidad del instructor de laboratorio proporcionar la información acerca de la disposición de residuos.

21.Prohibido verter sólidos o sustancias peligrosas en los lavabos.

22.Prohibido visitas no autorizadas. (Los responsables del laboratorio o dirección son los que autorizan las visitas y deberán de advertir a los visitantes sobre los riesgos y medidas de seguridad del laboratorio).

23.El responsable de la sesión o actividad que se realice, deberá supervisar el desarrollo de la misma.

24.Los alumnos que tengan asignada gaveta o área mantenerla limpia, en buenas condiciones y desocuparla en el tiempo establecido por el CISALUD.

25.No se podrá guardar reactivos, ni muestras biológicas en las gavetas de los alumnos.

26.Respetar las condiciones de seguridad y funcionalidad del laboratorio.

27.El responsable de la sesión o actividad, deberá anotar, las cantidades utilizadas de reactivos y lo que genere de residuos en las prácticas, investigaciones o servicios externos, en la bitácora de consumo de reactivos y generación de residuos.

28.Se deberá notificar al coordinador de laboratorio acerca de las prácticas que requieran muestras biológicas. En caso de ser externas, se llenará y firmará el formato de consentimiento informado. Las muestras solo pueden ser utilizadas con fines de docencia.

29.No se podrán tomar muestras biológicas sin la autorización y supervisión de un responsable de laboratorio.

30.Al terminar la sesión de laboratorio, verificar que los servicios de agua y energía eléctrica no se desperdicien.

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Por lo cual, en caso de incumplimiento parcial o total a estos lineamientos, se harán acreedores a las sanciones correspondientes indicadas en la reglamentación universitaria o estipulada en el contrato colectivo de trabajo según corresponda.

Nota:a) En el caso de alumnos se sancionará según lo establecido en el reglamento

universitario para alumnos.b) En el caso de empleados o maestros se sancionará según el contrato colectivo de

trabajo SPSU o SUTU, según corresponda.

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INDICACIONES GENERALES PARA EL DESARROLLO DE LAS PRÁCTICAS

Los alumnos (as) que se encuentren inscritos en el curso de Biología celular deberán contar con el presente manual de laboratorio y presentarse con él en todas las sesiones prácticas. Así mismo, deberán ingresar al laboratorio con conocimiento de la práctica que se va a realizar y los materiales a utilizar (en caso de ser necesario que los alumnos traigan algún material).

Equipos de trabajo:

Los alumnos (as) serán asignados el primer día de curso a un equipo de trabajo para todo el semestre, en cada práctica se dotará a cada equipo del material de trabajo que utilizará, responsabilizándose de la integridad del mismo para entregarlo al finalizar la práctica. El material o equipo que sea destruido o perdido será restituido por los alumnos responsables.

Se pretende que los equipos en las mesas de trabajo no sean numeroso, de ésta manera, la sesión de laboratorio se hará más eficiente y todos los alumnos podrán tener acceso al trabajo.

Limpieza y seguridad de laboratorio:

El aseo del laboratorio es de primordial importancia, por lo que los alumnos (as) deberán cooperar en el mantenimiento de la limpieza de su mesa de trabajo y del material que así lo requiera. Deberán limpiar con solución desinfectante el área de trabajo ANTES de empezar y al TERMINAR la práctica. Los alumnos (as) son responsables de que las llaves de agua y de gas de sus mesas de trabajo queden debidamente cerradas al finalizar cada práctica.

Se requiere que los alumnos aporten ciertos materiales para el mantenimiento y trabajo en el laboratorio. Sin falta, para cada sesión traer:

Por grupo: Un encendedor y una cinta adhesiva. Por mesa de trabajo: Un rollo de papel para limpieza y una botella de

jabón líquido. Por equipo: Un atomizador y un plumón negro permanente de punta extra

fina (Sharpie) Individual: Bata de laboratorio, lentes de seguridad, guantes de látex,

cuaderno de uso exclusivo para el laboratorio.Los alumnos (as) que no aporten el material que les sea solicitado para alguna

de las prácticas no podrán entrar al laboratorio.

Permanencia en laboratorio:

Los alumnos deberán permanecer en laboratorio mientras el instructor así lo indique, se planeará el trabajo de manera que la práctica se complete puntualmente, y los alumnos puedan salir del laboratorio 10 minutos antes de la próxima clase o

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práctica, previendo el tiempo que utilizarán para recoger, ordenar el material y limpiar su mesa.

Prácticas de laboratorio:

Para la elaboración de los informes de laboratorio, los alumnos deberán consultar el formato general para su realización que se encuentra seguido del reglamento general del uso de laboratorios.

Evaluación de laboratorio:

La evaluación de los alumnos en laboratorio incluye, además de la realización del informe de práctica, mantener una buena conducta, demostrar destreza en el desarrollo de los experimentos, tener una actitud de compañerismo, trabajo y respeto basado en valores, estos aspectos serán considerados para su evaluación final.

La calificación obtenida en cada informe de laboratorio estará basada en los requisitos que marca una rúbrica de evaluación (Anexo 1), la cual precisa los puntos a seguir para elaborar un reporte de la laboratorio completo.

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ELABORACIÓN Y ENTREGA DE REPORTES DE LABORATORIO

Los reportes de las prácticas realizadas en el Laboratorio de Biología Celular, deberán ser entregados la siguiente semana de haberse realizado la práctica y deberán contener los siguientes rubros:

Portadao Nombre de la Universidad, unidad universitaria ó facultad.o Materia y nombre el maestroo Grupo y subgrupo al que perteneceo Título de la práctica, nombre del alumno y fecha de entrega

Introduccióno Fundamentos y marco teórico

Materiales y Métodos Experimentaleso Materiales utilizadoso Descripción breve de las técnicas o métodos experimentales utilizados

Resultadoso Descripción de los resultados obtenidos. Tablas, Figuras, Gráficas, etc.

Cuestionarioso Resolución de los cuestionamientos y temas a investigar.

Discusióno Análisis de los resultados obtenidos y comparación de tus resultados con

los de otros trabajos, ya sean internos (compañeros) o de investigación bibliográfica. Observaciones y/o recomendaciones

Conclusioneso Plasmar las conjeturas a las cuales llegaron después de la realización de

la práctica y habiendo analizado y comparado los resultados.

Referencias bibliográficas:o Libros, artículos, sitios de internet, colaboración y discusiones con

maestros y compañeros de clase. Debidamente citados.

Anexoso De considerarlo necesario agregar un sección al final del informe donde

se encuentre material de apoyo.

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PRÁCTICA No. 1

Reglamento del uso de laboratorio y manejo de residuos peligrosos biológico-infecciosos (R.P.B.I.)

TEMA TEÓRICO AL QUE APOYA: Introducción al curso de Biología celular y bases químicas de la biología.

OBJETIVO GENERAL: Que el alumno revise y se informe respecto a la normatividad vigente del uso de laboratorio, sus obligaciones con respecto al mismo y las sanciones a las que se hará acreedor en caso de incumplimiento de las mismas. Así mismo, que identifique, maneje, envase y recolecte, los residuos peligrosos biológico infecciosos (R.P.B.I.) en forma adecuada y segura, de acuerdo a la NOM-087-ECOL-2002 y/o NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002 y que conozca los principales métodos de desinfección.

FUNDAMENTOS DE LA PRÁCTICA: Es de suma importancia que los alumnos conozcan el reglamento vigente de laboratorio ya que infringir las normas de seguridad y disciplina entorpecen las prácticas de laboratorio además de poner en riesgo la seguridad y salud de los estudiantes. Así mismo, la realización de las prácticas del Laboratorio de Biología Celular, se generan R.P.B.I. por lo que es importante conocer y aplicar la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002 (Más información, ver Anexo 2).

MATERIALES:a) Recipientes y bolsas especiales para depósito de R.P.B.I.b) Jeringas, tubos, gasas, asas de inoculación, caja petri, etc.

METODOLOGÍA:- Primera parte:a) El reglamento deberá ser leído íntegramente en la primera sesión de trabajo. El

instructor (a) hará del conocimiento del alumnado la serie de requisitos y obligaciones vigentes para el uso del laboratorio.

b) El instructor (a) explicará las sanciones en caso de desobedecer el reglamento.c) Después de haber desarrollado el tema en cuestión el instructor (a) resolverá las

dudas del alumnado con respecto al uso del laboratorio.

- Segunda parte:a) El instructor explicará a los estudiantes la generación, uso y manejo de los

residuos peligrosos biológico infecciosos en el laboratorio.b) Los alumnos llevará a cabo un simulacro de depositación de R.P.B.I mediante la

colocación de materiales, presentados por el instructor, en los recipientes señalados según la naturaleza de los mismos como sigue:1. Identifique y separe los materiales de acuerdo a la Tabla 1 (Anexo 2).

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2. Identifique y envase los materiales en los recipientes adecuados de acuerdo a la Tabla 2 (Anexo 3).

3. Identifique el área de depósito de los R.P.B.I. en el Laboratorio.

RESULTADOS: Al finalizar la práctica de laboratorio se espera que el alumno cuente con el conocimiento necesario para permanecer en el laboratorio bajo las normas de seguridad, así como el correcto confinamiento de los R.P.B.I. Anotar en su bitácora de laboratorio los resultados obtenidos.

CONCLUSIONES: Plasmar las conjeturas a las que el alumno llegó con la realización de la práctica, así como la utilidad de la misma en su profesión.

CUESTIONARIO:1. ¿Qué es un residuo peligroso biológico infeccioso?2. ¿Por qué es importante el buen manejo de los residuos peligrosos biológico infecciosos dentro del laboratorio?3. Enliste los residuos peligrosos biológico infecciosos que identifique dentro de las actividades relacionadas con el laboratorio.4. ¿La orina y excremento se consideran residuos peligrosos biológico infecciosos?

APLICACIÓN PRÁCTICA: La generación y manejo de los R.P.B.I. es una práctica habitual en el ejercicio profesional de las ciencias medicas, por tal motivo, en cualquier caso clínico será de mucha utilidad saber sobre el confinamiento de este tipo de residuos.

BIBLIOGRAFÍA:- NOM 087 SEMARNAT SSA1 2002- http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/bbp/Exp_to_Blood.pdf- http://msds.ehs.cornell.edu/msdssrch.asp

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PRÁCTICA No. 2

Uso y mantenimiento del microscopio óptico

TEMA TEÓRICO AL QUE APOYA: Estructura de la célula. Diferenciación celular.

OBJETIVO GENERAL: Al finalizar la práctica el estudiante conocerá el manejo adecuado del microscopio óptico mediante la observación de laminillas e identificación de diferentes tipos celulares. Conocerá de manera teórica los tipos avanzados de microscopía óptica y electrónica más utilizados, sus principios de funcionamiento y utilización (contraste de fase, interferencia diferencial, marcadores fluorescentes, TEM, SEM, etc.).

FUNDAMENTOS DE LA PRÁCTICA: Dadas las dimensiones extremadamente pequeñas de los objetos materiales que estudia, la biología celular y molecular depende más de instrumentos y técnicas en comparación a cualquier otra rama de la biología. Por consiguiente, para estudiar estas materias es necesario conocer y manejar adecuadamente un microscopio de luz, instrumento que permitió a los biólogos descubrir la existencia física de la célula.

Adicionalmente al uso del microscopio óptico tradicional, existen técnicas avanzadas de microscopía que nos permiten visualizar de una manera más precisa la estructura interna de la célula, ya sea porque permiten un grado mayor de resolución de la imagen o por resaltar ciertos componentes o compartimientos celulares. Las técnicas de microscopía óptica por contraste de fase e interferencia diferencial utilizan las diferencias en el modo de transmisión de la luz a través de regiones celulares con diferente índice de refracción. El uso de marcadores fluorescentes que se fijan a moléculas específicas, permite su visualización al absorber la luz de una cierta longitud de onda y emitirla en otra longitud de onda (más larga). Las técnicas de microscopía electrónica permitan visualizar estructuras celulares más allá de la limitación impuesta por la longitud de onda de la luz visible (200 nm) (microscopía electrónica de transmisión), y es posible incluso observar estructuras de manera tridimensional (microscopía electrónica de barrido) (Más información, ver Anexo 3).

MATERIALES:a) Microscopio óptico.b) Laminillas con diferentes tipos celulares.c) Papel y líquido para limpieza de lentes de microscopio.d) Aceite de inmersión.e) Imágenes representativas de los diferentes tipos de microscopía avanzada.

METODOLOGÍA:A. El alumno (a) deberá dominar los siguientes temas antes de iniciar la práctica:

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1. Unidades y equivalencias correspondientes a micrómetros (μm) y nanómetros (nm).

2. Cuanto miden generalmente las células procariotas y las eucariotas.3. Cuál es la longitud de onda del espectro visible en humanos.

B. El instructor (a) demostrará imágenes representativas de cada una de las técnicas avanzadas de microscopía.C. El instructor (a) demostrará los elementos más importantes de un microscopio óptico.D. Se observarán diferentes laminillas bajo el microscopio con el siguiente procedimiento:

a)Coloque la laminilla sobre la platina, en el centro, deslizando los clips sujetadores.

b)Verifique que el objetivo que esté colocado para la visualización sea el de menor aumento.

c) Coloque mediante el movimiento de la platina la muestra de estudio en el centro.

d)Mediante el ajuste macrométrico, y bajo la visión directa de la platina, acercar la platina al objetivo hasta alcanzar una distancia de 2 mm. aproximadamente entre el cubreobjetos y el objetivo.

e)Posteriormente viendo a través del ocular y usando el ajuste micrométrico, enfocar la muestra a observar. Ajustar el diafragma para mejorar la iluminación.

f) Una vez observando las características de la muestra con el objetivo menor, cambiar el objetivo por el siguiente de mayor aumento. Enfocar la imagen con el ajuste micrométrico y observar la diferencia.

g) “Barrer” la muestra a través de movimientos de arriba hacia abajo en forma de ondas.

h)Cambie nuevamente el objetivo hacia el de mayor aumento. Ajuste nuevamente la imagen con el ajuste micrométrico y ajuste el diafragma para mejor iluminación.

ES IMPORTANTE EL SEGUIMIENTO DE ESTOS PASOS PORQUE DE ÉSTO DEPENDE EL ÉXITO DE LA OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO.

E. Los alumnos (as) observarán y realizarán un dibujo de lo observado de las laminillas de diferentes tipos celulares.

RESULTADOS: Consignar en cuaderno de prácticas y en su reporte las imágenes de los diferentes tipos celulares observados. Describir en el reporte, el principio de funcionamiento, ventajas y desventajas de cada técnica de microscopía avanzada, incluyendo imágenes representativas de cada una de ellas.

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CONCLUSIONES: Consignar en el reporte las conclusiones relativas a la importancia del microscopio óptico en la investigación biomédica y práctica clínica, así como el uso de las diferentes técnicas de microscopía avanzada.

APLICACIÓN PRÁCTICA: El adecuado manejo del microscopio óptico permite observar diferentes tipos, características y organizaciones inter e intracelulares, en el ejercicio medico se utiliza ampliamente en el diagnóstico clínico y actualmente, con microscopias más finas, para estudiar enfermedades a nivel molecular.

BIBLIOGRAFÍA:1. Karp, G. 2001. Biología Celular y Molecular. ISBN: 97010164402. Alberts et al. 2006. Essential Cell Biology: An Introduction to the Molecular Biology

of the Cell. Garland Publishing, Inc. ISBN 0-8153-2045-0

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PRÁCTICA No. 3

Observación de células epiteliales de la mucosa bucal humana

TEMA TEÓRICO AL QUE APOYA: Generalidades de la organización y estructura celular. Organelos.

OBJETIVO GENERAL: Observar células animales al microscopio y sus principales estructuras, así como iniciarse en las técnicas de realización de preparaciones.

FUNDAMENTOS DE LA PRÁCTICA: Todas las paredes de la cavidad bucal están tapizadas por mucosa. La mucosa es una superficie húmeda, que consta de un revestimiento epitelial y tejido conjuntivo. Las células en su estado natural, son casi invisibles al microscopio convencional. Una manera de hacerlas visibles es teñirlas con colorantes orgánicos selectivos. La Coloración es el proceso mediante el cual un cuerpo es teñido por una sustancia colorante, sin perder el color cuando es lavado con el disolvente utilizado al preparar la solución colorante. Los colorantes se comportan como compuestos ácidos o básicos y tiene la tendencia de formar uniones electrostáticas con los radicales ionizables de los tejidos.

MATERIALES: Células epiteliales de la mucosa bucal Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Gotero Papel para la limpieza del microscopio Aplicadores de madera o hisopos Azul de metileno Puente para tinción

METODOLOGÍA:1. Tomar un portaobjetos y un cubreobjetos bien limpios y secos. 2. Tirando del labio inferior hacia fuera, raspar la parte interna del mismo con el borde del portaobjetos o con el palillo. 3. Colocar una gota de agua en el centro del portaobjetos. 4. Con un palillo, extender la mucosa extraída y dispersarla en la gota de agua. A esto se le llama realizar un frotis. 5. Teñir las preparaciones con una gota de azul de metileno. 6. Colocar el cubreobjetos. 7. Observar al microscopio, enfocando progresivamente con los objetivos de mayor aumento.

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RESULTADOS: La fotografía muestra un ejemplo de las células que se observarán en el microscopio después de la preparación.

CONCLUSIONES: El alumno indicará el aprendizaje obtenido a partir de la realización de la práctica, así como su comentario final al respecto de las observaciones.

CUESTIONARIO:a. Dibuje lo observado con cada objetivo. b. Indique en su imagen o dibujo las partes de la célula que alcance a distinguirc.¿Cómo debe procederse para colocar el cubreobjetos? d. ¿Qué diferencias se observan entre las células teñidas y las no teñidas?e. ¿Se observa algún orgánulo citoplasmático? f. ¿Porqué las células retienen los colorantes?g. ¿Cuáles colorantes se utilizan para teñir células eucariotas, además del azul de

metileno?

APLICACIÓN PRÁCTICA: Se utilizan tinciones específicas para observar ciertas características celulares como la organización de organelos o resaltar de manera especial alguna característica o componente celular.

BIBLIOGRAFÍA:1. Karp, G. 2001. Biología Celular y Molecular. ISBN: 97010164402. Alberts et al. 2006. Essential Cell Biology, An Introduction to the Molecular

Biology of the Cell. Garland Publishing, Inc. ISBN 0-8153-2045-0

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Imagen de una célula de la mucosa bucal teñida con azul de metileno. Se indican dos de sus organelos.




PRÁCTICA No. 4

Extracción de una muestra sanguínea mediante la técnica de punción venosa

TEMA TEÓRICO AL QUE APOYA: Tejido sanguíneo.

OBJETIVO GENERAL: Conocer el protocolo básico para la obtención de una muestra sanguínea mediante la punción venosa.

FUNDAMENTOS DE LA PRÁCTICA: La sangre se compone de células suspendidas en un líquido llamado plasma. El

color de la sangre se debe a los eritrocitos (glóbulos rojos), los cuales contienen el pigmento hemo; también hay leucocitos (glóbulos blancos) y trombocitos (plaquetas). Las características físicas de la sangre incluyen una temperatura aproximada de 38ºC, un pH promedio de 7.4 aunque varía de 7.35 a 7.45 que le da una ligera alcalinidad.

La técnica de venopunción es muy común en la práctica clínica, se realiza cotidianamente con fines de diagnóstico y es de suma importancia que los alumnos conozcan el procedimiento y los realicen exitosamente (Más información, ver Anexo 4).

MATERIALES:a) Guantes de látexb) Brazo para realizar la técnica de venopunciónc) Torniqueted) Torundas de algodóne) Alcohol f) Jeringas con aguja g) Tubos vacutainerh) Cinta adhesiva redonda (Curita)i) Contenedores de RPBIj) Marcador permanentek) Agujar vacutainerl) Portavacutainer

METODOLOGÍA:Técnica de extracción sanguínea

1. Lavarse las manos.2. Preparar el equipo necesario.3. Identificar al paciente y explicar el procedimiento, esto ayuda a reducir ansiedad.4. Seleccione la vena que va a puncionar, teniendo en cuenta el flujo venoso.

Inicie por la parte distal a la proximal de la extremidad (región cubital del brazo)

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5. Si se utiliza el sistema vacutainer, se debe enroscar la aguja en el capuchón plástico y se coloca (sin insertar) el tubo por el otro extremo del capuchón. El borde del tapón de color debe alcanzar la delgada línea de guía en el capuchón. No ejerza presión sobre el tubo, si se sobre pasa la línea descarte el tubo ya que pudo haberse liberado el vacío.

6. Si se utiliza el método con jeringa, abrir el paquete, asegurar la aguja en la jeringa, soltar el tapón de la aguja (sin retirar hasta que vaya a ser utilizado) y mover el embolo hacia arriba y abajo.

7. El brazo deberá estar extendido en una posición donde la palma de la mano quede hacia arriba.

8. Aplique un torniquete adecuadamente aproximadamente de 4 a 6 centímetros de distancia por encima del sitio donde realizara la punción, esto es para que las venas se salten.

9. Ponerse los guantes de látex.10.Se escoge una vena apropiada para la punción. Con el dedo índice, se palpa el

brazo hasta encontrar la mejor vena, si no se siente una vena se puede buscar en el otro brazo.

11.Limpiar el sitio con una torunda con alcohol en un movimiento circular comenzando del sitio de la punción hacia afuera, o bien con un barrido, evitando pasar el algodón varias veces por el mismo sitio.

12.Deje que el alcohol se evapore.13.Estabilice la vena colocando el dedo pulgar de la mano no dominante

aproximadamente a 4 cm del sitio de punción y jalar la piel para tensarla y evitar que la vena se mueva.

14. Insertar la aguja con el bicel hacia arriba, en un movimiento lento y suave con una angulación aproximada de 15 a 30 grados. No se requiere empujar mucho la vena ya que se puede atravesar. Es conveniente mantener la aguja alineada con la vena.

15.Una vez canalizada la vena se observara en la aguja una gotita de sangre.16.Si se utiliza el método de aguja y jeringa se puede mover el émbolo hacia atrás

para succionar la sangre. 17.Si se utiliza el sistema vacutainer, entonces se deberá fijar la aguja en la vena,

sostenga de manera firme el dispositivo base y se deberá empujar únicamente el tubo sobre el capuchón para que se active el vacío y salga la sangre. El tubo se llenara hasta aproximadamente ¾ de su volumen (hasta que el mismo vacio del tubo se lo permita).

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18.Retirar el torniquete antes de extraer la aguja, de preferencia en cuanto empiece a llenar los tubos, es importante no mantener el torniquete por un tiempo prolongado ya que esto le pudiera afectar en alguno de sus resultados

19.En cuanto se retira la aguja se debe colocar una torunda seca o gasa ligeramente humedecida con alcohol sobre el sitio de punción aplicando una presión firme, esto ayuda a disminuir el riesgo de formación de hematoma.

20.Colocar cinta adhesiva piel o curita redonda (si se cuenta con ella) sobre el sitio de punción.

21.Si se utilizó el método de aguja y jeringa, con la aguja puesta se puede encajar en un tubo Vacutainer y automáticamente se vaciara la sangre al tubo. Si se utiliza un tubo de ensayo de vidrio entonces se deberá retirar la aguja y depositará la sangre lentamente dejando que esta corra por las paredes del tubo.

22.En caso de que requiera del llenado de varios tubos estos deberán llevar un orden de tal manera que no se vea afectada ninguna de las muestras. (* valorar si es necesario este punto o no)

23.Descarte la aguja como un RPBI (objeto punzocortante) de acuerdo a la legislación aplicable.

24.De manera suave invertir los tubos con la muestra de 8 a 10 veces.25.Etiquete los tubos con el nombre del paciente, fecha, hora, número de

identificación, o de acuerdo a l procedimiento de laboratorio.26.Retire los guantes y deposítelos en la bolsa roja para RPBI no anatómicos.27.Lavarse las manos.

RESULTADOS: Anotar los resultados de la venopunción realizada por cada uno de los alumnos.

CONCLUSIONES: Definir los aciertos, errores y anotaciones pertinentes para una buena práctica, finalizando con una conclusión que aporte acerca de la importancia de ésta técnica en la práctica clínica.

CUESTIONARIO:a) Elabore un cuadro sinóptico con los componentes de la sangreb) ¿Cuál es la función del plasma?c) ¿Cuál es la diferencia entre el suero y plasma?d) Mencione las venas que comúnmente se utilizan para obtener muestras de sangre.e) ¿Qué es la venopunción?f) ¿Qué actitudes se deben tomar en cuenta durante la práctica?

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APLICACIÓN PRÁCTICA: La aplicación de ésta técnica de venopunción es prácticamente diaria, por lo cual los estudiantes deberán contar con ésta habilidad al terminar el curso práctico.

BIBLIOGRAFÍA:1. Sánchez, Uribe, Flores. 2008. Manual de Prácticas de Bioquímica, 2ª edición.

Mc Graw Hill. 2. Medical assisting, Laboratory procedures- module E, 2007. 3rd. Edition. Perason

Custom Publishing.3. Becton Dickinson. Guía para la flebotomía. Disponible en la red:

http://www.mydigitalpublication.com/display_article.php?id=276304

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PRÁCTICA No. 5

Fragilidad osmótica del eritrocito

TEMA TEÓRICO AL QUE APOYA: Membrana celular. Transporte. Ósmosis

OBJETIVO GENERAL: Al finalizar la práctica el alumno(a) comprobará experimentalmente la fragilidad osmótica de la membrana eritrocitaria y verificará el efecto de los detergentes en las membranas celulares.

FUNDAMENTOS DE LA PRÁCTICA: La membrana eritrocitaria es la más sencilla de las membranas celulares. Esta consta de una doble capa lipídica y un esqueleto proteico en su cara citoplasmática. La morfología del eritrocito depende de la osmolaridad del medio en que se encuentra. En condiciones fisiológicas (osmolaridad de 290 mOsm/Kgr), el eritrocito tiene forma de disco biconcavo.

En ésta práctica se visualizarán al microscopio los cambios morfológicos del eritrocito en medios hipertónico, isotónico e hipotónico.

MATERIALES:1. Microscopio óptico.2. Laminillas portaobjetos3. Cubreobjetos4. Papel y líquido para limpieza de lentes de microscopio.5. Aceite de inmersión.6. 500 ml de Solución estéril de NaCl al 1.8%7. Agua destilada8. 20 ml de solución de sodio-dodecil-sulfato (SDS) al 0.1%9. 4 tubos de microcentrífuga de 1.6 ml10.1 Jeringa de 10 ml con aguja11.Ligadura para venoclisis12.Antiséptico para limpieza de piel antes de la venopunción13.1 tubo recolector de sangre con EDTA o heparina14.Contenedor para productos contaminados con sangre

METODOLOGÍA:1. Antes de la práctica, el alumno estudiará los conceptos de ósmosis, difusión y los

principales tipos de transporte de solutos a través de las membranas celulares.2. Se obtendrá sangre fresca (aprox. 5 ml) de uno de los alumnos del subgrupo,

utilizando la técnica apropiada de venopunción y se transferirá la sangre a un tubo conteniendo EDTA o heparina.

3. Preparar una solución NaCl al 1.8% en 1.5ml de agua desionizada.4. A partir de la solución NaCl al 1.8%, realizar diluciones para obtener las

soluciones de NaCl al 0.9% y al 0.45%.

20




5. Agregar 1 gota de SDS al 0.1% a una de las soluciones al 0.9%.6. Colocar 1 gota de sangre a cada una de las soluciones. Mezcle con cuidado.7. Aplique 1 gota de cada una de las suspensiones obtenidas en una laminilla

portaobjetos y cubra cuidadosamente con un cubreobjetos. Visualize la morfología eritrocitaria al microscopio.

RESULTADOS: a) Describa en su reporte la morfología observada en cada tipo de solución de NaCl y

con el SDS. b) Realice un dibujo (a mano, no copiar una imagen) de la membrana eritrocitaria,

indicando la doble capa lipídica y la estructura detallada del esqueleto proteico.

CONCLUSIONES: Consignar en su reporte las conclusiones relativas a la fragilidad osmótica del eritrocito.

CUESTIONARIO:a) ¿A qué se le denomina fantasma de eritrocito?



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PRÁCTICA No. 6

Recuento leucocitario

TEMA TEÓRICO AL QUE APOYA: Tejido sanguíneo.

OBJETIVO GENERAL: El alumno aprenderá a utilizar la cámara de Neubauer con la finalidad de realizar un conteo celular de tejido sanguíneo.

FUNDAMENTOS DE LA PRÁCTICA: El recuento de las células hemáticas, tanto de eritrocitos como de leucocitos, es una de las pruebas clásicas en analítica clínica. El recuento de plaquetas no se suele hacer, salvo cuando se sospecha que el paciente tiene alguna anomalía grave (normalmente de tipo leucémico).Estas pruebas tienen por objeto determinar la concentración de los distintos tipos celulares presentes en la sangre. Permiten detectar anomalías como anemias y policitemias en el caso de los glóbulos rojos, y leucopenias y leucocitosis en los de los glóbulos blancos. En el recuento leucocitario no existe distinción entre las diferentes sub-poblaciones leucocitarias normales, si no que se hace referencia a la concentración total de leucocitos en la sangre. Los límites normales para adultos están situados entre 4500 y 11000 células por mm3.

La sangre debe estar con anticoagulante EDTA u oxalato de sodio.

MATERIALES:1. Cámara de recuento de Neubauer.2. Cubre cámara.3. Pipeta automática de 10-100 micro litros.4. Pipeta automática de 10 micro litros.5. Solución, diluyente para sangre. (liquido de turk) 6. Microscopio.

METODOLOGÍA:1. Tomar 10 micro litros de sangre total y colocar en un tubo de 0.2 mililitros.2. Agregar 90 micro litros de diluyente de turk.3. Mezclar vigorosamente con un homogeneizador.4. Tomar una gota y llenar las 2 cámaras de recuento.5. Contar los leucocitos en los 4 cuadrantes de las esquinas con el objetivo de 40X.

Un consejo al momento de realizar la cuantificación: en ocasiones pueden aparecer células que se encuentren entre 2 cuadros, en estos casos es conveniente aplicar un criterio para evitar duplicar su recuento, este puede ser el contabilizar a las células que se encuentren entre las líneas superior e izquierda como presentes en ese cuadro.

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1 2

3 4




Las células se cuentan en cada uno de los cuadros pequeños, primero de izquierda a derecha, empezando por la parte superior de 4 cuadrados pequeños y luego de derecha a izquierda para la próxima hilera y así sucesivamente. El número de células de cada uno de los 8 grupos de 16 cuadrados cada se registran por separado y se suman los resultados.

VALORES DE REFERENCIA: 4000 a 9000 células por micro litro.

FORMULA:

No. de células en 4 cuadrantes X 10 (1 mm 3 ) X 10 (dilución) Número de leucocitos = 4

Número de leucocitos = Número de de células en 4 cuadrantes x 25 células x micro litro.

RESULTADOS: Calcular el número de células por micro litro de sangre total.

CONCLUSIONES: Consignar en su reporte las conclusiones relativas a la fragilidad osmótica del eritrocito.

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Profundidad de la cámara de recuento

1




CUESTIONARIO:1. ¿Cómo se miden las poblaciones celulares?

a) Describa tres técnicas directas.b) Describa tres técnicas indirectas.

2. ¿Qué estudia la citometría?

APLICACIÓN PRÁCTICA: Algunas enfermedades son detectables por medio de la determinación de concentraciones, presencia y/o ausencia de algunas formas celulares, tal es el caso de algunas enfermedades como la leucemia, cuya cantidad de glóbulos blancos aumenta de manera anomal, provocando esta patología en los pacientes.



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PRÁCTICA No. 7

Cariotipo humano

TEMA TEÓRICO AL QUE APOYA: Composición y propiedades del núcleo. Patrones de bandeo. Anormalidades cromosómicas.

OBJETIVO GENERAL: Aprender a reconocer los cromosomas humanos. Elaborar un cariotipo a partir de una fotografía y saber determinar las anomalías cromosómicas más frecuentes.

FUNDAMENTOS DE LA PRÁCTICA: El cariotipo es el complemento cromosómico particular de un individuo y viene definido por el número y morfología de los cromosomas en la metafase mitótica. En la especie humana la dotación cromosómica es de 2n = 46 (22 pares de autosomas y un par de cromosomas sexuales). Utilizando técnicas de tinción estándar los cromosomas aparecen uniformemente teñidos en metafase y se clasifican en 7 grupos de la A a la G atendiendo a su longitud relativa y a la posición del centrómero que define su morfología. Hay cromosomas grandes, medianos y pequeños. Dentro del cariotipo humano podemos encontrar cromosomas metacéntricos (tienen los dos brazos aproximadamente iguales en longitud), submetacéntricos (con un brazo más pequeño que otro) y acrocéntricos (con un brazo corto muy pequeño) (Ver Anexo 6).

MATERIALES:1. Imagen de un cariotipo humano. 2. Idiograma3. Tijeras4. Cinta adhesiva o goma.

METODOLOGÍA:1. Se les proporcionará una imágen de un cariotipo humano, sin anomalías

cromosómicas, de una persona sana (Anexo 7).2. Cuente los cromosomas de la fotografía y recorte todos y cada uno de ellos.3. Ordénelos por tamaños e identifique, por su patrón de bandas, los pares

cromosómicos. Para averiguar de qué cromosoma se trata, compárelos con el patrón de bandas mostrado por el ejemplo.

4. Una vez ordenados los cromosomas, sujételos con cinta adhesiva o goma.5. Indique qué cromosomas son metacéntricos, cuales submetacéntricos y cuales

acrocéntricos.

RESULTADOS: Entregar el cariotipo humano organizado y clasificado según lo requerido en la metodología.

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CONCLUSIONES: Detallar las conclusiones a las cuales llegaron al finalizar su cariotipo. ¿Pertenecía a una persona sana? ¿Enferma? ¿Hombre? ¿Mujer?.

CUESTIONARIO:1.- ¿Qué características permiten diferenciar, en general, unos cromosomas de

otros? 2.- ¿Cuáles son las diferencias que podrían encontrarse en un cariotipo de una

persona sana y en una persona con alguna enfermedad relacionada con aberraciones cromosómicas?

3.- ¿Cuáles son las características cromosómicas de las personas con síndrome de down y síndrome de Turner?

APLICACIÓN PRÁCTICA: La organización de los cromosomas en un cariotipo permite identificar ciertas anomalías cromosómicas que indican o comprueban la prevalencia de una enfermedad, cuando se trata de un producto en gestación en ocasiones se opta por hacer un cariotipo si se tiene la sospecha de alguna anormalidad genética.



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PRÁCTICA No. 8

Frotis sanguíneo

TEMA TEÓRICO AL QUE APOYA: Diferenciación celular. Formas celulares. Tipos de tejidos.

OBJETIVO GENERAL: El alumno distinguirá las técnicas básicas de tinción para la identificación morfológica de células sanguíneas; utilizando técnicas básicas de microscopia óptica. Identificarán los subtipos celulares y realizarán un conteo celular.

FUNDAMENTOS DE LA PRÁCTICA: Un procedimiento útil para el examen de muestras es el estudio microscópico de preparaciones fijas y coloreadas por un método adecuado. La forma más común de preparar un frotis es extender un poco de muestra sobre un portaobjetos desengrasado, con el asa bacteriológica, pero también se puede hacer con un hisopo ó presionando el portaobjetos sobre la muestra. Dependiendo del tipo de célula que se desee observar es el tipo de tinción que se emplea. Los colorantes son productos químicos sintéticos del tipo de la anilina, capaces de combinarse con una gran variedad de sustancias confiriéndoles color. El color se debe a la estructura química de los pigmentos. Los colorantes de alquitrán de hulla usan bases de anillos aromáticos tales como benceno, naftaleno o antraceno. Varios grupos químicos son ligados a los anillos aromáticos para impartir los diferentes colores. Los grupos productores del color son llamados cromóforos, siendo los más comunes ρ-quinona y diazo. Ciertos grupos químicos llamados auxocromos, tales como los grupos amino e hidroxilo ayudan a fortalecer a los cromóforos.

Tinción diferencialLa tinción diferencial requiere más de un tipo de colorante y se utiliza para distinguir entre varios tipos de células bacterianas o estructuras celulares. Una tinción diferencial típicamente consiste de tres pasos principales: primero un colorante primario, el cual se utiliza para teñir a todas las células en la tinción; enseguida un paso de decoloración, el cual remueve el colorante solo de ciertos tipos de células y finalmente un colorante de contraste, el cual tiñe las células recién decoloradas pero no tiene efecto sobre las células que aún retienen el colorante primario.

MATERIALES: Para la toma de muestra sanguínea:

o Jeringa con aguja desechable o Sistema Vacutainer®o Tubo con anticoagulante (EDTA)o Torniqueteo Torundas con alcohol

Otros materiales y Reactivos

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gota de sangre




o Portaobjetoso Alcoholo Agua Destiladao Colorantes para tinción de Wrighto Microscopio ópticoo Aceite de inmersióno Recipientes RPBI

METODOLOGÍA:Análisis de Sangre.

6. Tomar una muestra de sangre por vía venosa y depositarla en un tubo con anticoagulante EDTA.

7. Depositar una gota de sangre en un portaobjetos limpio, realizar la extensión con otro portaobjetos en un ángulo de 45 grados, procurado no dejar el frotis demasiado grueso o delgado.

8. Dejar secar el frotis y fijar con metanol, teñir enseguida con la eosina por 40 segundos, enseguida lavar y posteriormente teñir con el policromo por 30 segundos).

9. Lavar el frotis con agua de la llave o con una piceta y observarlo con el objetivo de 40 X y 100X.

Observación microscópica

Al microscopio se verán con un dominio predominante los glóbulos rojos, hematíes o eritrocitos teñidos de color rojo por la eosina. No tienen núcleo y son más delgados por el centro que por los bordes.

Los glóbulos blancos o leucocitos se identifican fácilmente por la presencia de núcleo, teñido de morado por la hematoxilina. Hay varias clases de leucocitos:

1. Linfocitos: De tamaño aproximado al de los glóbulos rojos, tienen un solo núcleo que ocupa casi todo el glóbulo.

2. Monocitos: Son los leucocitos mayores, poco frecuentes normalmente, núcleo grande, redondo, son los más móviles y su función principal es la fagocitosis.

3. Polimorfonucleares: Núcleo fragmentado. Pueden ser eosinófilos, con abundantes granulaciones teñidas de rojo por la eosina, así como neutrófilos y basófilos.

Las plaquetas no son visibles ya que precisan una técnica especial de tinción.

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Realice un conteo diferencial de la subpoblación de leucocitos, contará 100 células en total.

RESULTADOS: Dibuje los diferentes tipos y subtipos celulares observados. Reporte el diferencial que obtuvo según su conteo celular. Indique los valores de referencia de cada uno de los tipos celulares observados

CONCLUSIONES: En base a sus resultados obtenidos realice sus conclusiones de acuerdo a la utilidad y/o relación que tenga con su carrera profesional. Según el conteo diferencial proponga si es muestra de una persona sana o con alguna deficiencia, basándose en los valores de referencia.

CUESTIONARIO:1.- ¿Cuales son las diferencias morfológicas que observó en cada uno de los diferentes tipos celulares?2.- ¿De qué color aparece teñido el núcleo de los leucocitos?3.- ¿Existe alguna diferencia en el citoplasma de los diferentes tipos celulares observados? ¿Explique cuáles y porque?4.- ¿Qué forma tienen los eritrocitos? Tienen núcleo?


Biology of the Cell. Garland Publishing, Inc. ISBN: 0-8153-2045-0

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PRÁCTICA No. 9

Observación de células de cebolla en mitosis

TEMA TEÓRICO AL QUE APOYA: División celular. Cromatina y cromosomas.

OBJETIVO GENERAL: El alumno observará células eucarióticas de vegetales y animales e identificará la organización de genoma en interfase y mitosis.

FUNDAMENTOS DE LA PRÁCTICA: El estudio de los cromosomas de células eucarióticas con el microscopio óptico se hace preferencialmente en metafase, cuando estos tienen la morfología y estructura definida. La observación de la estructura del genoma en interfase, está fuera de la resolución del microscopio óptico, sin embargo, en algunas células es posible observar el cromosoma X heterocromatizado que se identifica como un corpúsculo, el cuerpo de Barr o cromatina sexual.

MATERIALES:

Materiales de laboratorio por equipo Material del alumno por equipo

2 PortaobjetosRaices primarias de Allium cepa

(cebolla)2 cubreobjetos Células de epitelio bucal

1 Vidrios de reloj Barniz de uña transparente

1 Estuche de disección Materiales de laboratorio por grupo1 Lámpara de alcohol HCl 1 N

1 Microscopio Ac. Acético 45%1 pinzas Orceína acética

METODOLOGÍA:Preparación de los meristemos

1. Cortar de 1-2 cm la parte terminal de las raíces y colocar en vidrio de reloj con orceina acética. Cuidar que los meristemos queden perfectamente cubiertos con el colorante.

2. Calentar a la llama de la lámpara de alcohol, retirar al desprenderse vapores, enfriar y volver a calentar suavemente por 2-3 veces, cuide que la temperatura no ponga en ebullición el colorante, ya que esto daña los meristemos.

3. Enfríe y transfiera cada una de las raíces a un portaobjeto, corte 2 mm después del ápice, añada una gota de orceína y coloque encima el porta, presione con la punta de un lápiz la zona donde se encuentra el meristemo y mediante golpes con la goma del lápiz, dispérselo en monocapa, quite el exceso de colorante.

30




4. Observe al microscopio a 40X.

Método para la cromatina sexual-cuerpo de Barr

1. En porta objetos perfectamente lavados y desengrasados (alcohol etílico-ácido acético 45%, 3:1), coloque una muestra de epitelio bucal (enjuague varias veces la boca), tomando por raspado suave con un abatelenguas, haga frotis de hombre, etíquetelos.

2. Hidrolice con HCl 1N por 30-60 seg. Y absorba el ácido acético por goteo, cubra con un portaobjetos y selle con barniz. Observa al microscopio a 100X.

RESULTADOS:

MeristemosDescripción

Cromatina SexualDescripción

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CONCLUSIONES: Aportar las conclusiones producto de la realización de la presente práctica.

CUESTIONARIO:1. ¿Qué es el cariotipo? Explique cómo haría usted uno.2. ¿Qué aplicación daría usted a la observación de las células meristemáticas?3. ¿Qué diferencia hay entre la mitosis de células animales y vegetales?4. Investiga cómo Barr y Bertram (1949), encontraron cromatina sexual.5. Investiga que dice la hipótesis de Mary Lyon, respecto a la heterocromatización

del cromosoma X6. De acuerdo a la hipótesis de Lyon explica por qué en hombres con una formula

cromosómica 46XY, no se observa la cromatina sexual o cuerpo de Barr.


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PRÁCTICA No. 10

Identificación de cromosomas politénicos

TEMA TEÓRICO AL QUE APOYA: Componentes del núcleo. Cromosomas. Patrones de bandeo cromosómico.

OBJETIVO GENERAL: Al finalizar la práctica el alumno será capaz de identificar la estructura microscópica de los cromosomas politénicos presentes en las larvas de la mosca de la fruta, así como reconocer del patrón de bandeo y tener conocimiento sobre la importancia del estudio de estos cromosomas.

FUNDAMENTOS DE LA PRÁCTICA: Algunos insectos como la mosca de la fruta cuyo nombre científico es Drosophila melanogaster posee en sus glándulas salivales células que se encuentran en una fase de la división celular llamada Interfase, éste proceso se puede prolongar permanentemente, de tal manera que en el tercer estadio de las larvas la división celular se detiene pero las células siguen en crecimiento4. De ésta manera, los cromosomas contenidos en el núcleo se duplican repetidamente sin separarse, lo que se conoce como endomitosis. El resultado de este proceso son cromosomas gigantes compuestos gran cantidad de información genética (Politenia). Solo para hacer una comparación, los cromosomas de Drosophila en una metafase es del orden de 7,5μ mientras que el largo total de los cromosomas en un núcleo de las glándulas salivares es de alrededor de 2.000μ. Los cromosomas implicados en este proceso muestran un patrón particular de bandeo transversal que consiste en zonas más oscuras, llamadas bandas, que alternan con zonas claras, llamadas interbandas. Cuando se observan al microscopio óptico se identifican como bandas oscuras y claras transversales alternantes7. []EEl patrón de bandeo que presentan los cromosomas politénicos es un reflejo constante de las secuencias de ADN, las bandas sirven como marcadores para localizar varias características genéticas (lugar de los genes, o cambios en el genoma debido a reordenamientos cromosómicos, por ejemplo deleciones, duplicaciones de bandas y translocaciones)[][] y se han utilizado en diversos estudios genéticos y evolutivos.[][][]

MATERIALES:- Larvas activas del tercer estadio de la mosca Drosophila melanogaster- Microscopio estereoscopio- Microscopio óptico.- 1 platina de vidrio.- Portaobjetos- Cubreobjetos- Reactivo de Aceto – orceína- Pipeta Pasteur- Estuche de disección

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METODOLOGÍA:1. Se extrae con una aguja de disección una larva de tercer estadio de Drosophila,

la cual se reconoció por ser proporcionalmente más grande que las de 1° y 2° estadios. Generalmente estas larvas se encuentran en las paredes del frasco de cultivo. Se elige a una que se encuentre activa.

2. Se coloca la larva en una platina de vidrio, se le añade una mínima cantidad de agua, esto para no dejar que se seque la larva y así poder realizar la disección.

3. La disección comienza localizando primero las mandíbulas las cuales se distinguen claramente por su forma y color negro (Fig. 1, Anexo 8). Se coloca la punta de una de las agujas en las mandíbulas y la punta de la otra aguja en la región media del cuerpo de la larva.

4. Se jalan en sentido opuesto las 2 agujas al mismo tiempo, para poder desgarrar así a la larva.

5. Se separan las glándulas salivales del resto de los órganos por la forma característica de sacos alargados que aparentan estar formados por una red. Las glándulas generalmente se quedan adheridas a la región mandibular.

6. Las glándulas salivales están rodeadas por tejido adiposo opaco, se quita la mayor cantidad de este tejido con ayuda de las agujas con el fin de que la preparación quedara más limpia.

a. Las glándulas salivales son órganos pares localizados cerca de extremo anterior de larva, generalmente tienen un cuerpo graso largo, delgado, unido a ellas.

7. Una vez separadas las glándulas salivales, se transportan con las agujas a un portaobjetos y se les agrega unas gotas de Aceto – orceína.

8. Observar las células de las glándulas (Fig. 2, Anexo 8). 9. Para poder apreciar los cromosomas politénicos, la muestra de tejido se aplana

colocando suavemente el dedo pulgar sobre el cubreobjetos y se presiona lo más fuertemente posible (Fig. 3, Anexo 8).

RESULTADOS: En ésta sección se dan a conocer los resultados obtenidos en esta práctica: células de las glándulas salivares con su núcleo claramente definido y cromosomas politénicos.

CONCLUSIONES: Concluir acerca de la utilidad e importancia de estudiar estos cromosomas.

CUESTIONARIO:a) ¿En qué tipos de organismos se pueden observar los cromosomas politénicos? b) ¿Cuál es su función?c) Explique brevemente la forma en la que se generan los cromosomas politénicos.d) ¿Qué es un Puff y un anillo de Balbiani, existe alguna diferencia?e) En Genética ¿Qué utilidad tiene los cromosomas politénicos?

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Biology of the Cell. Garland Publishing, Inc. ISBN: 0-8153-2045-0W. 3. Kulg et al. Conceptos de genética. Ed prentice hall 5ª ed. Madrid 1999. pp.

43-45.4. Del Castillo Falcón, V. M., Jiménez Pedraza, M., Romero Rosales M. G.,

Romo Bonilla, J. A., Valdez Hernández M. Identificación de los cromosomas politénicos en las glándulas salivales de la fase larvaria de Drosophila melanogaster. Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Autónoma de México. Coyoacán; México DF.

5. http://www.cienciaybiologia.com/bgeneral/organizacion-material-genetico.htm

6. http://www.uniovi.es/esr/pp/tch2.pdf7. http://www.agro.uchile.cl/docencia/dpan/genetica/clase6/6Sexta.pdf

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http://www.uniovi.es/esr/pp/tch2.pdf

http://www.cienciaybiologia.com/bgeneral/organizacion-material-genetico.htm

http://www.cienciaybiologia.com/bgeneral/organizacion-material-genetico.htm




PRÁCTICA No. 11

Extracción de ADN

TEMA TEÓRICO AL QUE APOYA: Estructura del ADN.

OBJETIVO GENERAL: El alumno al finalizar la práctica conocerá el procedimiento para extraer ADN a partir de una muestra de células epiteliales de la mucosa bucal humana. Observar la ADN a simple vista y conservarlo.

FUNDAMENTOS DE LA PRÁCTICA: ADN es la abreviatura del ácido desoxirribonucleico (en inglés, DNA), esta molécula constituye el material genético de los organismos. Es el componente químico primario de los cromosomas y el material del que los genes están formados. Para extraer el ADN de un organismo es necesario llevar a cabo una serie de etapas que permiten ir liberando la molécula de los componentes químicos que lo acompañan. Existen diferentes técnicas de extracción de ADN de las células, ya sean eucariotas o procariotas, varían en algunos pasos entre si pero al finalizar la practica e producto se puede distinguir mediante la observación de un material precipitado. Estos resultados pueden utilizarse en numerosas investigaciones, diagnósticos, estudios moleculares, etc. los cuales arrojan resultados sobre ciertas regiones de interés del genoma, todo esto aunado a que conociendo la información genética de un individuo se pueden manipular muchas de sus funciones con fines médicos.

MATERIALES:- Kit de extracción de ADN Genes in a bottle (166-2000EDU).- Muestra de células epiteliales- Alcohol isopropanol o etanol- Agua potable- Tubos Falcon de 15 ml- Pipetas de transferencia- Gradilla para tubos Falcon- Baño maría- Termómetro- Cronómetro

METODOLOGÍA:1. Colocar el alcohol (isopropanol o etanol) en el congelador.2. Un estudiante se llevará a la boca los 3 ml de agua potable. Hará que el agua

pase por las paredes bucales durante 30 segundos para obtener una muestra. 3. Cuidadosamente se regresa el líquido a un tubo Falcon de 15 ml.4. Se agregan 2 ml de buffer de Lisis. Colocar la tapa al tubo e invertirlo 5 veces.

NO AGITAR!

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5. Observa el tubo, ¿Notas algún cambio? Anota observaciones.6. Agrega 5 gotas de proteasa al tubo con la muestra. Tapar el tubo e invertirlo.7. Incubar el tubo en baño maría a 50° C, por 10 minutos.8. Destapar el tubo e inclinarlo a 45°. Llena el tubo con alcohol frío (10 ml +/-).9. Tapar el tubo y dejarlo reposar 5 minutos. Anota observaciones de que lo

observas en el tubo.10.Despacio y cuidadosamente invertir el tubo 5 veces.11.Transferir a un vial de vidrio el precipitado de DNA con 750 microlitros de la

solución de alcohol.

RESULTADOS: Anota tus observaciones. ¿Cuál era la apariencia del ADN?. ¿En que momento se empezó a observar?

CONCLUSIONES: Enriquece y finaliza tus observaciones concluyendo acerca del proceso de extracción y el resultado esperado.

CUESTIONARIO:a) Explique la importancia de la extracción y purificación de DNA en la investigación biomédica y práctica clínica.

APLICACIÓN PRÁCTICA: La extracción de ADN hoy en día es una técnica molecular utilizada ampliamente con el fin de conocer ciertas características de la información genética, parentescos, secuencias de interés, mutaciones, silenciamiento de genes, etc. En algunas ocasiones para investigación molecular y en otras para diagnóstico de predisposición a enfermedades hereditarias.


Biology of the Cell. Garland Publishing, Inc. ISBN: 0-8153-2045-0W. 3. Kulg et al. Conceptos de genética. Ed. Prentice Hall. 5ª ed. Madrid 1999. pp. 43-45.

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A N E X O S

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RÚBRICA PARA EVALUAR UN INFORME DE PRÁCTICA

CATEGORÍA 10-9 8-7 6-4 3-0

Elementos del informe

10%

Todos los elementos requeridos están presentes.

Se agregan elementos adicionales para enriquecer la información (anexos) han sido

incluidos.

Todos los elementos requeridos están

presentes.

Un elemento requerido para el

informe está omitido. Se

incluyen anexos.

Varios elementos requeridos han sido

omitidos.

Presentación de dibujos,

diagramas y datos20%

Se incluye diagramas claros, etiquetados y precisos que facilitan la comprensión del experimento. Presentación

precisa de los datos en tablas y/o gráficas debidamente

descritas.

Se incluye diagramas

ordenados, los datos se agrupan en

tablas y/o gráficas.

Se incluye diagramas con

deficiencias en los nombramientos, los datos se presentan de forma escrita no

estructurados.

Faltan diagramas importantes y los que

existen están mal etiquetados, se

muestran los datos o están en desorden.

Manejo de los conceptos científicos

15%

El reporte representa y demuestra un minucioso

entendimiento por parte del alumno de los conceptos

científicos esenciales para llevar a cabo la práctica.

Se maneja la información de

manera clara, se entiende la mayoría

de los conceptos científicos

esenciales en el laboratorio.

Se refleja un entendimiento limitado de los

conceptos científicos

esenciales en el laboratorio.

El reporte representa un entendimiento

incorrecto o nulo de los conceptos

científicos esenciales en el laboratorio.

Marco teórico y citas

bibliográficas15%

Son utilizadas y referenciadas correctamente varias fuentes

de importancia para realizar el marco teórico. Se evita la copia textual de la cita, las ideas son expresadas en

propias palabras del alumno.

Pocas fuentes de antecedentes de

renombre son usadas y citadas correctamente.

Las fuentes son escasas, algunas de buena fuente y otras no, algo de la información o ideas principales no son

propias del alumno.

Toda la información fue es copiada

textualmente. Las fuentes de

antecedentes están citadas

incorrectamente, faltan datos en las citas bibliográficas.

Apariencia, organización, secuencia del

método científico

30%

El informe está escrito de manera ordenada, separa la

información en títulos y subtítulos, se observa

limpieza y cuidado en su elaboración. Se respeta la

secuencia del método científico.

Se observa orden y secuencia en la información, usa

títulos para organizar el

material. Puede estar escrito a mano

de manera organizada.

Se observa un poco de

desorganización en el informe, la secuencia se vuelve poco

confusa, se omite algún paso del

método científico.

El informe está escrito a mano descuidando la organización y limpieza, con

tachones y borrones, además de omitir la

secuencia del método científico.

Ortografía, puntuación y

gramática10%

Se cuidaron los errores de gramática y puntuación. Se observan pocas faltas de

ortografía.

Se observan algunos errores repetidos en la

ortografía, puntuación y

gramática en el reporte.

Los errores de ortografía son

consistentes. Falta puntación

importante.

No se cuida la ortografía y

gramática. Muchos errores ortográficos.

La puntuación es escasa. Los textos son seguidos sin

respetar las ideas.

39

A-A-11

A-A-22




INFORMACIÓN COMPLEMETARIA PRÁCTICA No. 1

Tabla No. 1: Identificación y clasificación de los R.P.B.I.

Denominación Estado físico Descripción

Cultivos y cepas Líquido / sólidoCultivos en caja, tubos, hisopos, medios de transporte, guantes, colorantes, placas, etc.

Patológicos Sólido / liquido Biopsias, líquidos organicos.No anatómicos Sólido Gasas, hisopos, papel, tiras reactivas, etc.

Punzocortantes SólidoLancetas, agujas, agujas de bolsa de sangría, capilares de hematocrito, aplicadores, tubos

rotos, portaobjetos, etc.

Generación y manejo de R.P.B.I en el laboratorio: Es importante minimizar la generación de R.P.B.I. identificando y segregando los materiales que NO los contengan, por ejemplo: papel de envoltura de gasa estéril, envoltura de la jeringa, protector de las agujas, etc. En el desarrollo de las actividades se deberá separar adecuadamente los materiales que son reciclables, depositándolos en los recipientes destinados para su posterior tratamiento y recuperación (Ejemplo: tubos de ensayo, matraces, etc.). En el manejo de R.P.B.I. se deberán utilizar los implementos de protección personal para su manejo e identificar los sitios designados en el laboratorio para depositarlos. El depósito y envasado de R.P.B.I. se realizará de acuerdo a la siguiente tabla, observando que los recipientes solo se llenarán hasta las ¾ partes de su capacidad. Los depósitos se etiquetaran con la leyenda PELIGRO: RESIDUO PELIGROSO (SÓLIDO O LÍQUIDO) BIOLÓGICO INFECCIOSO.

Depósito y Confinamiento: El área temporal de depósito se encuentra previamente señalado en el Laboratorio con el símbolo universal que lo identifica y todos los recipientes que contiene R.P.B.I. deben ser colocados en estos sitios. El personal responsable del manejo de los R.P.B.I., de acuerdo a la norma NOM-087-Ecol-2002, también es responsable de la recolección y transporte al almacén general, almacenamiento y entrega a la empresa tratadora, registro y elaboración de bitácoras y reportes, disposición y tratamiento interno y externo y capacitación y monitoreo.

Tabla No.2: Envasado de R.P.B.I.

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Tipo de residuos Estado físico Envasado Color

Sangre Líquidos Recipientes herméticos Rojo

Cultivos y cepas deagentes infecciosos

Sólidos Bolsas de polietileno Rojo

PatológicosSólidos Bolsas de polietileno Amarillo

Líquidos Recipientes herméticos Amarillo

Residuos no anatómicos

Sólidos Bolsas de polietileno Rojo

Líquidos Recipientes herméticos Rojo

Objetos punzocortantes SólidosRecipientes rígidos

polipropilenoRojo

41

A-A-33




INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA PRÁCTICA No. 2

42

Figura 1: Imágenes de la misma célula utilizando diferentes técnicas de microscopía óptica. A. Microscopía óptica convencional. B. Contraste de fases.C. Contraste Diferencial de Interferencia.

Figura 2: Imágenes de microscopía utilizando marcadores fluorescentes para componentes celulares específicos. A. Filamentos de actina. B. Microtúbulos. C. Filamentos intermedios.

Figura 3: Microscopía electrónica. A. Imagen de barrido del estereocilio de una célula del oído interno. B. Imagen de transmisión de una mitocondria.

A B

C

A B C

A-A-44





Técnicas de extracción sanguínea

Cuando se extrae sangre del cuerpo y se deja reposar en un recipiente de vidrio por algunos minutos, ésta se coagula, el cual se debe a la precipitación de una proteína plasmática llamada fibrinógeno, que forma hebras de fibrina insoluble. Las células de la sangre son atrapadas en una red de fibrina que gradualmente se contrae y libera un líquido llamado suero. El suero no contiene fibrinógeno ni algunos factores de la coagulación, ya que estos se han consumido durante la formación del coagulo. El plasma a diferencia del suero, si contiene factores de coagulación y se obtiene si el tubo donde se recolecta la sangre tiene un anticoagulante.

Si se requiere una pequeña cantidad de sangre ésta puede obtenerse por punción capilar (puncionando la piel del dedo o el lóbulo de la oreja con un instrumento cortante), para obtenerla primero se limpia la piel con alcohol y se deja secar. Se inserta una lanceta o aguja estéril en la piel a profundidad de 1 o 2 mm. La primera gota de sangre que sale de la herida se limpia con torunda de algodón. Las gotas subsecuentes se recogen con un portaobjetos para frotis, o con una pipeta o con algún otro recipiente para pruebas diversas.

Si se requiere un volumen mayor de 0.5 ml entonces se debe realizar la técnica de venopunción o flebotomía. Esta técnica consiste en la punción de la barrera protectora exterior (piel) por vía extracutánea; con un objeto punzocortante (cánula o aguja) para la obtención de una muestra sanguínea que puede ser periférica, arterial o venosa. Por lo general se prefiere sangre venosa para la mayor parte de exámenes y se procurara obtener una mayor cantidad por si fuese necesario verificar alguna prueba. La flebotomía se puede realizar por dos métodos diferentes: utilizando tubos al vacío (sistema Vacutainer) y utilizando aguja y jeringa convencional. El método de utilizar tubos al vacío es más rápido, pero se prefiere utilizar aguja y jeringa cuando se trabaja en venas pequeñas y frágiles, para evitar que estas colapsen.

Comúnmente se emplea una vena del brazo (fosa antecubital) ya que éstas son de fácil acceso, relativamente largas y fáciles de localizar. Se utiliza un torniquete para bloquear la circulación venosa, se selecciona alguna vena adecuada por su calibre y prominencia y se limpia la piel con alcohol (utilizando técnicas de asepsia y antisepsia ya estandarizadas). Una vez que el alcohol se ha evaporado se introduce una aguja afilada adaptada a una jeringa de tamaño adecuado y estéril; enseguida se tira del embolo de la jeringa para que la sangre penetre en ésta. Tan pronto como se haya obtenido una cantidad adecuada se libera la presión ejercida sobre el brazo y se extrae la aguja. Se aplica una torunda de algodón estéril en el sitio de la punción y se ejerce presión firme durante medio minuto para evitar escurrimiento de la sangre en los tejidos

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circunvecinos. Debe quitarse la aguja de la jeringa antes de distribuir la sangre en los tubos de ensayo (no así cuando se depositará dentro de un tubo al vacío – vacutainer).

Si se requiere suero, la sangre puede ser vertida en el interior de un tubo de ensayo (esterilizado). Si se necesita sangre total o plasma, deberá utilizarse algún anticoagulante, el más común para la mayor parte de análisis es el ácido etilen-diamino-tetra-acético (EDTA). El citrato de sodio al 3% también es un anticoagulante. La heparina es un anticoagulante antitrombínico que se usa en pruebas donde no se desea la eliminación de iones calcio. Los tubos del sistema Vacutainer vienen con tapones de diferentes colores que indican los anticoagulantes o aditivos que contienen:

Tapón rojo: el tubo no contiene anticoagulante y el interior del tubo es estéril, la sangre coagulará y liberará suero después de la centrifugación. Se utiliza para analizar la química del suero.

Tapón rojo y gris/negro: también llamado tubo de separador de suero, este tubo contiene un gel que separa permanentemente el suero del coagulo después de la centrifugación. También contiene activador de coágulos.

Tapón lavanda/púrpura: este tubo contiene EDTA, se usa si se requiere sangre entera o plasma.

Tubo verde: el tubo contiene heparina, se utiliza si se requiere sangre entera o plasma.

Tapón azul cielo: el tubo contiene citrato de sodio, se utiliza si se requiere sangre entera o plasma, comúnmente se usa para determinación de tiempo de protrombina o tiempo parcial de tromboplastina.

Tapón gris: el tubo contiene oxalato de potasio, se utiliza si se requiere sangre entera o plasma, comúnmente se usa para la prueba de tolerancia a la glucosa.

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TUBOS VACUTAINER

Imagen extraída de http://www.proveedormedico.com/pmhyl.html





2. En algunos pacientes con tendencia a las hemorragias, puede producirse una estribación local de la sangre. Aplicando una presión adecuada (torunda) sobre el lugar de punción se evita la formación de hematomas.

3. Después de una serie de punciones venosas repetidas puede producirse trombosis (Formación de un trombo en el interior de un vaso sanguíneo). O flebitis (inflamación de las venas).

Riesgos relacionados con la punción venosa:

1. Sangrado excesivo 2. Desmayo o sensación de mareo 3. Hematoma (acumulación de sangre debajo de la piel) 4. Infección (un riesgo leve en cualquier momento que se presente ruptura de la

piel)

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Precauciones que se debe observar en la venopunción:

1. El operador debe inspirar confianza durante la extracción.

2. Debe utilizarse una aguja con grosor adecuado para obtener sangre fácilmente y la cantidad necesaria de sangre.

3. Debe utilizarse venas que se vean o palpen con facilidad.

4. El antebrazo siempre deberá estar apoyado en una superficie fija.

5. Al realizar la punción venosa, el Bicel deberá estar hacia arriba.

Complicaciones que se pueden presentar en la venopuncion:

1. Algunas veces se produce sincope (desvanecimiento con pérdida de conocimiento repentina y por lo general es breve y reversible), en general se presenta en algunas personas emotivas. Si el paciente se mantiene acostado, la recuperación espontánea es rápida.

Diagrama de las venas del brazo




5. Punciones múltiples para localizar las venas

Contraindicaciones absolutas:

1. Inserción en zonas con hematomas.2. Inserción en zonas de infiltración o flebitis.3. Venas esclerosadas o trombosadas.4. Sitios con reacciones inflamatorias.5. Sitios con enfermedades de la piel.6. Sitios con solución de continuidad de la piel.7. Sitios con proceso infeccioso.8. Venas del cuero cabelludo.

Contraindicaciones relativas:

1. Zonas de flexión.2. Venas muy pequeñas

Diagrama de la técnica de venopunción mediante sistema vacutainer

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Clasificación de los cromosomas para la elaboración de un cariotipo humano

Los grupos que comprende el cariotipo humano son los siguientes: - Cromosomas grandes * Grupo A, (cromosomas 1, 2 y 3), meta y submetacéntricos * Grupo B, (cromosomas 4 y 5), submetacéntricos- Cromosomas medianos * Grupo C, (cromosomas 7, 8, 9, 10, 11, 12 y además los cromosomas X), submetacéntricos * Grupo D, (cromosomas 13, 14 y 15) acrocéntricos- Cromosomas pequeños * Grupo E, (cromosomas 16, 17 y 18) submetacéntricos * Grupo F, (cromosomas 19 y 20) metacéntricos * Grupo G, (cromosomas 21 y 22) acrocéntricos

Idiograma

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Patrón de bandeo




Un idiograma es la representación esquemática del tamaño, forma y patrón de bandas de todo el complemento cromosómico, los cromosomas se sitúan alineados por el centrómero, y con el brazo largo siempre hacia abajo. Los cromosomas sexuales X e Y se separan de sus grupos correspondientes y se ponen juntos aparte al final del cariotipo.

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Idiograma de una persona sana

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CARIOTIPO HUMANO DESORDENADO

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Fig. 1. Vista esquemática de la estructura de una larva de Drosophila melanogaster donde puede observarse la localización de las glándulas salivales.

Fig. 2. Tinción de las glándulas salivales con reactivo de aceto - orceína

Fig. 3 Ejemplo de un cromosoma politénicos de Drosophila melanogaster. El cromocentro se halla en el ángulo superior derecho. La flecha señala el extremo del cromosoma X. La imagen ampliada (B) muestra las bandas y las interbandas con mayor detalle.

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Células de las glándulas salivales con núcleo claramente definido

Fig. 2

Fig. 3

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Manual de Bio-Cel 2010 BORRADOR

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