Manual de Laboratorio para el diagnóstico de

Rabia

MVZ. Baltazar Cortés García Responsable del diagnóstico de rabia en el CENASA

MVZ. Alejandro Jiménez Ramírez

Coordinador de la Campaña contra la Rabia Paralítica Bovina

Introducción.

La rabia es una enfermedad neurotrópica transmisible que afecta a todos los animales mamíferos de sangre caliente incluido al humano. Su letalidad es del 100% y esta considerada como zoonosis, la susceptibilidad varía en las diferentes especies animales.

La transmisión se efectúa por medio de la saliva de un animal rabioso a uno susceptible y sirve al virus como medio de transporte o vehículo para que se introduzca por medio de una mordedura o lamedura en una lesión reciente de la piel o en las mucosas.

La rabia se presenta en todo el mundo, excepto en países como Japón e Inglaterra. En los países infectados su distribución no es uniforme y puede encontrarse zonas libres, zonas de baja y alta endemicidad, así como áreas con brotes epidémicos.

El virus de la rabia pertenece a la familia Rhabdoviridae, y al género lyssavirus, el cual comprende todas las cepas del virus rábico clásico (virus PV, cepas vacunales y otros virus relacionados antigénicamente que son llamados Mokola, Duvenhage, Lagos bat, Obodiang, Kotonkan, EBL-1 (European Bat Lyssavirus) y EBL-2, ABL (Australian Bat Lyssavirus).

El virus de la rabia se inactiva a una temperatura de 56° C, con una solución de jabón, con la luz ultravioleta o beta propiolactona, así como con radiaciones, detergentes, éter, cloroformo, detergentes, etanol al 45 - 70%, soluciones de amonio e hipoclorito de sodio. Son resistentes a la desecación, a la congelación y descongelación y es estable a un pH entre 5 y 10.

La importancia de la rabia para la salud pública no se limita al número de casos, sino a la letalidad, prácticamente del 100% de los enfermos. Es importante también considerar el impacto emocional y psicológico que ocasiona en los individuos mordidos por el temor de contraer la enfermedad, así como las pérdidas económicas que se generan por concepto de horas-hombre pérdidas durante los tratamientos antirrábicos, el costo de los mismos, servicios médicos y en el caso de la rabia paralítica bovina (derriengue) los daños directos e indirectos que ocasiona a la ganadería.

Una de las medidas de prevención primaria para el control de esta enfermedad, es la educación a la población, cuando estas medidas no son llevadas a cabo o son incompletas, existe el riesgo de que se presente la enfermedad y entonces las medidas de prevención secundaria se tornan importantes. El diagnóstico es una de ellas y juega un papel muy importante en este tipo de acciones.

La rabia en el hombre y en los animales se caracteriza por un cuadro encefalítico cuyo diagnóstico diferencial con otras encefalitis es difícil o imposible y sólo el examen de laboratorio permite establecer un diagnóstico seguro de rabia. El diagnóstico clínico de la rabia en un animal permite la justificación del inicio del tratamiento antirrábico en una persona y el diagnóstico de laboratorio permitirá la continuación o interrupción del mismo, estos mismos criterios son de valor en la ganadería para tomar las medidas de control en el caso del derriengue, sin embargo las pruebas de laboratorio estarán garantizadas cuando se llenan ciertos requisitos como son:

• La buena calidad de la muestra.

• Las buenas condiciones de su transporte al laboratorio

• La rapidez con que se obtienen los resultados de laboratorio.

• La difusión inmediata de los mismos.

• La capacidad técnica del personal.

En el CENASA las técnicas utilizadas para el diagnóstico de la rabia, se basan principalmente en la inmunofluorescencia directa (IFD) o anticuerpos fluorescentes (AF) y la prueba biológica en ratones (PB).

La Inmunofluorescencia por su alta sensibilidad y especificidad, es la técnica de elección para el diagnóstico de la rabia, aunado a la facilidad de su realización, interpretación y su bajo costo de aplicación. La prueba biológica en ratones se utiliza para confirmar la presencia del virus viable en muestras que por inmunofluorescencia directa resultaron negativas y el criterio para aplicarla es que en dichas muestras negativas se hallen personas lesionadas, en contacto directo con la saliva del animal agresor o provengan de animales silvestres.

La prueba de IFD, cuando es efectuada por un laboratorista altamente capacitado, identifica cuando menos al 98% de las muestras de cerebro infectadas por rabia enviadas para diagnóstico. La prueba de inoculación al ratón es un procedimiento de diagnóstico ligeramente más sensible que la prueba de IFD para la rabia. Cuando las dos pruebas son efectuadas por personal calificado y con amplia experiencia, la concordancia entre ellas es por lo general de 99 % y son pocas las muestras que dan resultados negativos en la prueba de IFD y con resultados positivos por la inoculación al ratón.

Objetivos

Proporcionar al personal de laboratorio el soporte técnico-científico para realizar un diagnóstico confiable de rabia.

Alcance

Este manual tiene por objetivo el brindar al Médico Veterinario Zootecnista y/o técnico laboratorista, el sustento técnico científico en el diagnóstico de la rabia mismo que se aplicará en la Campaña Nacional contra la Rabia Paralítica Bovina (derriengue) y programas de control y/o erradicación de la rabia urbana, además de proporcionar los lineamientos técnicos para la preparación, desarrollo y control de las pruebas específicas para el diagnóstico de la rabia.

Responsabilidades

Todo personal profesional o técnico que utilice este manual para el desarrollo de las pruebas descritas, será responsable de conocer, controlar y aplicar las condiciones mínimas necesarias de seguridad para llevar a efecto el diagnóstico de la rabia.

Actividades

En este documento se describen los lineamientos a seguir por el personal profesionista y técnico para el buen uso y correcta aplicación de las pruebas en el diagnóstico de la rabia.

Extracción y Toma de Muestras

En caso de que la muestra sea el cadáver o la cabeza del animal, se deberá extraer el encéfalo, esta práctica se efectuará en una sala de necropsias, el personal deberá utilizar el equipo de protección necesario para la extracción de la muestra.

Equipo de Protección

• Careta

• Botas de hule

• Overol

• Gorro protector

• Cubreboca

• Guantes gruesos de hule

Material

• Cuchillo

• Sierra

• Hacha

• Pinzas de disección

• Tijeras rectas

• Tijeras curvas

• Frascos limpios o estériles de plástico

• Maskin tape

Procedimiento para la extracción y toma de muestras para el diagnóstico de rabia

Paso 1.- El cadáver del animal deberá ser

lavado con abundante agua y jabón antes de practicar la extracción del cerebro.

Paso 2.- El cadáver se sujeta firmemente por la cabeza (o esta misma) y con un cuchillo se hace un corte a lo largo de la línea media del cráneo que atraviese la piel, fascias y músculos, desde los ojos hasta la base del cráneo, se separan los tejidos y se levantan hasta exponer el hueso.

Paso 3.- Con la sierra o segueta, se procede a realizar dos cortes uno que va desde el agujero occipital hasta el hueso frontal y otro haciendo un corte longitudinal y una incisión transversal por la lámina del frontal.

Paso 4.- Por encima de los ojos se separa el hueso con el cuchillo, se disecan las meninges y se extrae el encéfalo completo a partir del mesencéfalo (tallo cerebral) hasta los dos hemisferios.

Paso 5.- En el caso de que el encéfalo llegue congelado se debe esperar a que se descongele. Si el encéfalo llegase en glicerina al 50% en PBS, se debe lavar por lo menos 3 veces al chorro del agua y tomar las porciones indicadas. Las porciones del cerebro obtenidas deben ser colocadas en un recipiente limpio y/o estéril con los datos correspondientes para la posterior identificación y enviar al laboratorio para su procesamiento.

Paso 6.- Se colecta a partir del encéfalo las muestras indicadas para el diagnóstico de rabia. La calidad de la muestra es en extremo importante, pues de esta depende la confiabilidad del diagnóstico.

Retención y conservación de muestras para estudios confirmatorios.

Las muestras positivas a rabia por Inmunofluorescencia se clasifican por año para el cepario del laboratorio y estudios posteriores, estas se mantendrán almacenadas en congelación de -20° a 70° C por tiempo indefinido.

Todas las muestras negativas se conservarán durante un período de por lo menos 2 meses a -20° C, transcurrido dicho tiempo se procede a eliminarlas por incineración.

Manejo de residuos.

Para el manejo de productos biológicos potencialmente infectados se recomienda:

1. Trabajar en un área cerrado y reservado exclusivamente para este uso.

2. Es obligatorio el uso de bata de manga larga, guantes gruesos, careta facial o lentes protectores gorro protector y cubre boca.

3. Se tiene que descontaminar la mesa antes de realizar el trabajo y al final de la jornada o con una solución de etanol al 70 %, hipoclorito de sodio al 5-10 % u otros desinfectantes comerciales que sean efectivos.

4. Los utensilios de vidrio, plástico y el instrumental, no deberán estar rayados o rotos y una vez utilizados deben sumergirse en alguna solución de las antes citadas o esterilizarlos durante 30 minutos en autoclave a 121° C.

5. Colocar los punzo cortantes en un recipiente destinado para ello.

6. Es necesario el descontaminar el suelo por lo menos una vez al día.

7. Se debe descontaminar los instrumentos y el material con residuos de tejido con una solución desinfectante.

8. Una vez realizados los estudios, los tejidos y el material utilizado se deben desechar en forma tal que no representen peligro para otras personas.

9. Hay que introducirlos en bolsas de plástico para esterilizarlos o incinerarlos.

10. Obligatoriamente hay que lavarse los guantes y las manos con jabón después de realizar la prueba.

11. Quitarse la bata o el vestuario de protección antes de salir del laboratorio o del área de necropsias.

Prueba de inmunofluorescencia directa para diagnóstico de rabia.

Objetivo

Detectar la presencia del virus de la rabia por medio de la prueba de Inmunofluorescencia directa (IFD).

Procedimiento

Esta prueba se basa en determinar la presencia del virus de la rabia a través de la IFD para el diagnóstico de rabia por la utilización de anticuerpos específicos contra el virus rábico, teñidos con un colorante fluorescente (conjugado), que al unirse con el antígeno respectivo puede ser observado en el tejido infectado, con un microscopio para fluorescencia.

Condiciones ambientales

Temperatura óptima de 18 a 22° C en un lugar exclusivo para el diagnóstico de rabia.

Se requiere de un lugar exclusivamente para el diagnóstico de rabia, debiendo observar las medidas de bioseguridad pertinentes.

Equipo requerido en el laboratorio. El equipo que se muestra, es el utilizado en el CENASA.

Autoclave Congelador con temperatura de

-18 a -20 °C.

Estufa bacteriológica Microscopio de epifluorescencia y bitácora

Ultra congelador y/ o termo

para nitrógeno líquido Refrigerador con congelador integrado.

Centrifuga refrigerada. Agitador magnético

Materiales para el diagnóstico de rabia.

Abate lenguas de madera exentos de cera Viales

Cámara húmeda Recipientes para lavado de laminillas

Cubreobjetos Jarras de Coplin o recipientes de tinción

Portaobjetos Micropipetas

Pipetas estériles de 1,5 y10 ml Cinta adhesiva (Maskin tape)

Papel secante Pinzas y tijeras estériles

Marcador rojo para laminillas Puntas para micropipeta.

Canastilla para portaobjetos. Pisetas con soluciones a emplear.

Reactivos

Acetona. Agua destilada. Glicerina fosfatada

pH 8.0 – 8.4.

Solución salina amortiguada con fosfatos

(PBS, pH 7.6)

Aceite de inmersión para fluorescencia.

Preparación de la solución salina amortiguada con fosfatos (PBS)

a) Soluciones concentradas:

Solución I

0.1 M Na2HPO4 (Fosfato de Sodio)

Se disuelven 14.2 gr de Na2HPO4 anhidro en 1 litro de agua destilada ó

Se disuelven 26.8 gr de Na2HPO4 7H2O en 1 litro de agua destilada.

Solución II:

0.1 M Na2HPO4 (Fosfato de Sodio)

13.8 g de Na2HPO4 H2O en 1 litro de agua destilada.

Solución III:

8.5% NaCl (Cloruro de Sodio)

Se colocan 85 gr NaCl en un litro de agua destilada.

Conservar estas soluciones a una temperatura entre 4 y 8°C.

b) Solución de trabajo

• 91.5 ml. de la Solución I

• 8.5 ml. de la Solución II

• 100.0 ml. de la Solución III

• 800.0 ml. de agua destilada

• Preparación del Medio de montaje

• 50 ml de Solución buferada de trabajo

• 50 ml de glicerol

Biológicos

Conjugado antirrábico titulo mínimo de 1:8. Portaobjetos con impresiones de tejido nervioso

positivo y negativo al virus rábico.

Características de las muestras

El encéfalo es la muestra ideal para realizar esta técnica, ya que este tejido contiene la mayor cantidad de células blanco del virus; ahí la importancia de mantener en buen estado la muestra ya que la autolisis y la descomposición por la acción microbiana, contribuyen a degradar las proteínas del virus, lo cual puede generar resultados falsos-negativos.

Las muestras deben ser frescas, refrigeradas, congeladas o estar conservadas en una solución de glicerina al 50 % con solución salina buferada (PBS) y estas últimas deberán lavarse con agua 3 veces antes de proceder a trabajarlas.

Nota: Las muestras congeladas deben descongelarse previamente a la elaboración de las improntas.

Marcar los portaobjetos con el número del caso, así como de la región del encéfalo de la cual se hace la impronta. Prepare improntas de tejido de las siguientes regiones del encéfalo:

Especie

Parte del encéfalo a seleccionar

Caninos y felinos

Cerebelo, bulbo raquídeo y Asta de Ammón

Bovinos y/o pequeños rumiantes Corteza cerebral, cerebelo, bulbo raquídeo, tallo cerebral y Asta de Amón.

Quirópteros y roedores

Corte transversal del cerebro completo

Fauna silvestre Corteza cerebral, cerebelo, bulbo raquídeo, tallo cerebral y Asta de Amón.

Procedimientos para el diagnóstico de rabia

Equipo de seguridad.

• Gorro protector.

• Cubre boca.

• Bata de manga larga.

• Guantes de hule.

• Careta facial o lentes protectores.

• Pantalón exclusivo de laboratorio

• Calzado exclusivo de laboratorio

Preparación y acondicionamiento de la muestra.

Se toma una parte de encéfalo con la ayuda de unas pinzas y se procede a colocarlo en el abatelenguas.

En el extremo de un abatelenguas se coloca un trozo pequeño expuesto de aproximadamente 0.5 cm del tejido nervioso (utilizar un juego de tijeras y pinzas por caso) y se presiona ligeramente contra éste el portaobjetos que se ha dividido en tres regiones, una para la identificación y las otras dos para las improntas.

Las impresiones que se hacen en el portaobjetos, deben ser delgadas pues de lo contrario incrementa la fluorescencia inespecífica, para ello se debe quitar el exceso de tejido en papel secante, seguir el mismo procedimiento para los controles.

Procedimiento para la fijación y tinción de las improntas

1.- Se recomienda que la acetona esté

conservada a una temperatura de -20°C, donde se colocarán las laminillas problema y los controles.

Se deposita en el vaso de Coplin una cantidad suficiente para que sean posteriormente depositados los portaobjetos.

Se Sumergen los portaobjetos en un vaso de Coplin con acetona por un período mínimo de 10 a 60 minutos (hasta 24 horas), pues esto permite que la muestra se adhiera fuertemente al portaobjetos, elimina grasas e incrementa la permeabilidad celular, lo que facilita que el conjugado penetre al tejido y reaccione con el virus.

Se sacan el vaso de Coplin con los portaobjetos y se procede al secado de los mismos

El proceso de secado se realizara simplemente colocando los portaobjetos en una cama de papel para que absorba el exceso de acetona y esta se evapore.

Al término de la fijación se deben hacer dos marcas de forma circular con lápiz marcador en las improntas, preferentemente de color rojo para hacer contraste con el verde de la fluoresceína. Esto evitará que el conjugado se extienda y se seque o se utilice mayor cantidad de éste.

Nota: No se deben omitir el uso de testigos tanto positivos como negativos en cada prueba.

El conjugado deberá diluirse a una concentración óptima (se tiene que realizar la titulación previa) y de acuerdo a las indicaciones del fabricante.

Agregar 25-50 µl de conjugado, a las improntas ya delimitadas.

Colocar los portaobjetos en la cámara

húmeda e incubar a 37 °C en la estufa por 30 minutos.

Transcurrido los 30 minutos y con la ayuda de una piseta que contenga PBS, se deben lavar los portaobjetos, ya hecho esto se dejarán sumergidas en una solución de PBS y dar un mínimo de 10 lavados, al término de los lavados con PBS, se procede a realizar el enjuague con agua destilada de igual manera un mínimo 10 veces.

Permitir que se sequen las improntas y adicionar una gota de glicerina fosfatada a cada una de las improntas y colocar sobre ellas un cubreobjetos, observar al microscopio de epifluorescencia con el objetivo 40X, utilizar el objetivo de 100X si existe duda en las partículas más pequeñas, agregar sobre el cubreobjetos una gota de aceite de inmersión para fluorescencia.

Anotar en la bitácora la hora de inicio y el término del uso del microscopio

Interpretación de Resultados

Observe primero el portaobjetos con el testigo positivo para identificar las características de la fluorescencia específica, después observe su control negativo para reconocer la presencia de fluorescencia inespecífica y por último sus muestras problema.

La intensidad de la fluorescencia varía de negativo a 4 + (valor arbitrario), siendo directamente proporcional a la cantidad de antígeno específico presente. La reacción antígeno-anticuerpo es evidente cuando las improntas positivas a las que se les agregó el conjugado se observan en el microscopio con luz ultravioleta.

El antígeno se observa como conglomerados (producto de la acumulación de proteínas del virus) de color verde manzana fluorescente, que tienen diferentes formas y tamaños con ubicación intracelular o extracelular. Si son ovalados se denominan “cuerpos ovoides” o “corpúsculos de Negri”, si tienen forma de pequeños puntos fluorescentes distribuidos en toda la impronta se les denomina “polvo antigénico” y, sí se observan en forma de rayones o líneas se les denomina “hilos antigénicos”.

Polvo antigénico Cuerpos ovoides

Cuerpos ovoides Hilos antigénicos

Inmunofluorescencia típica

La fluorescencia típica de las formaciones anteriores se determina si se observa un contorno muy brillante que se atenúa hacia dentro del cuerpo de Negri.

Las muestras provenientes de casos en donde haya personas mordidas o en contacto directo, así como de aquellas de animales silvestres, que resulten negativas en esta prueba deberán examinarse nuevamente por medio de la inoculación en ratones lactantes, de 21 días de edad, en cultivos celulares de neuroblastoma o células BHK-21.

Anexos

Manejo de residuos.

Las normas de disciplina de trabajo se deben observar obligatoriamente en el laboratorio, ya que el personal está expuesto a:

Los riesgos de contaminación por el virus de la rabia de la calle durante las necropsias de animales rabiosos o en el momento de manipular el material obtenido durante dicho procedimiento.

Los riesgos de contaminación por virus aislado en el laboratorio, durante la inoculación de animales o el manejo de cultivos celulares infectados

La posibilidad de infectarse al cortarse con objetos que contienen material biológico potencialmente infeccioso.

Salpicaduras con material contaminado en la mucosa ocular u oral o en la piel con lesiones recientes.

El riesgo de contaminarse con cualquier otro agente infeccioso patógeno (virus y bacterias) capaz de atacar el SNC, para los cuales el personal que trabaja rabia no tiene inmunidad comprobada.

Recomendaciones para el manejo de productos biológicos potencialmente infectados.

1.- El recinto de trabajo debe ser cerrado y

reservado exclusivamente para el manejo de biológicos potencialmente infectados con el virus de la rabia.

2.- Es obligatorio trabajar con bata de manga larga, guantes gruesos, careta facial o lentes protectores gorro protector y cubre boca.

3.- La mesa se descontaminará durante el trabajo con una solución de etanol al 70 %, hipoclorito de sodio al 5-10 % u otros desinfectantes comerciales que sean efectivos.

4.- Los utensilios de vidrio, de plástico y el instrumental no deberán estar rayados o rotos y después de haberse empleado deberán sumergirse en alguna solución de las antes citadas o esterilizarlos durante 30 minutos en autoclave a 121° C.

5.- El suelo del área de trabajo se descontaminará con una solución de etanol al 70 %, hipoclorito de sodio al 5-10 % u otros desinfectantes comerciales que sean efectivos, al menos una vez al día.

6.- Es obligatorio el descontaminar con solución desinfectante, todos los instrumentos y el material con residuos de tejido.

7.- Una vez estudiados, los tejidos de animales (y estos mismos si es el caso) se deben desechar en forma tal que no representen peligro para otras personas. Hay que introducirlos en bolsas de plástico para esterilizarlos o incinerarlos, igual que todo el material desechable que haya sido usado y pueda estar contaminado.

8.- Forzosamente se debe de lavar los guantes y las manos con jabón después de realizar la prueba diagnóstica.

9.- Al término de la jornada, es importante el quitarse la bata y guardarla antes de salir del laboratorio.

Glosario de términos

Alícuota: Parte de un número que lo divide de manera exacta. Por extensión, cualquier porción que guarda relación cuantitativa con un todo o con las demás partes del mismo todo, como una porción alícuota de una solución; una muestra de un todo tomada para estimar la composición cuantitativa del todo.

Anticuerpo: Molécula de inmunoglobulina que tiene una solución especifica de aminoácidos, por virtud de la cual reacciona únicamente con el antígeno que produjo su síntesis en las células de la serie linfoide (especialmente las células plasmáticas), o con antígeno íntimamente relacionado. Los anticuerpos se clasifican según el mecanismo de acción como aglutininas, bacteriolisinas, hemolisinas, opsoninas, precipitinas, etc.

Antígeno: Cualquier sustancia que tiene la facultad, en circunstancias adecuadas, de producir respuesta inmunitaria específica y de reaccionar con los productos de esta respuesta, esto es, con anticuerpo específico, linfocitos T específicamente sensibilizados, o ambos. Los antígenos pueden ser sustancias solubles, como toxinas y proteínas extrañas, o en partículas, como bacterias y células. Sin embargo, sólo la parte de la proteína o de la molécula polisacárida que se llama determinante antigénico se combina con el anticuerpo o con un receptor específico sobre un linfocito. Se abrevia Ag.

Autoclave: Aparato empleado para lograr esterilización por vapor a presión; está provisto por un manómetro que automáticamente regula la presión y, en consecuencia, el grado de calor al que se somete el contenido.

Cámara húmeda: Recipiente hermético que sirve para mantener la humedad y evita la deshidratación de su contenido.

Conjugado antirrábico: Anticuerpos policlonales o monoclonales específicos contra el virus de la rabia y marcados con un fluorocromo, usualmente isotiocionato de fluoresceína.

Epifluorescencia: Excitación de fluorescencia por luz reflejada. Es la forma más rica en energía, la más eficaz y sencilla de la microsocopia de fluorescencia.

Fluorescencia: Propiedad de emitir luz mientras se está expuesto a la luz., la longitud de onda de la luz emitida es algo mayor que la luz absorbida., recibió este nombre por haberse observado por primera vez el espato flúor.

Impronta: Es la impresión o huella que deja un tejido en una superficie sólida (por ejemplo cuando se deja parte de un tejido en el portaobjeto).

Inmunofluorescencia directa: Método para precisar el sitio del antígeno (o anticuerpo) en los tejidos valiéndose del cuadro de fluorescencia resultante cuando el tejido se expone al anticuerpo específico (o al antígeno) marcado con un fluorocromo.

Macerado: Es el resultado de ablandar y homogeneizar un tejido u órgano por la acción de estrujamiento a través de un medio físico, aplicando presión con ayuda de un medio líquido hasta formar una suspensión.

Negativo: Que indica falta o ausencia.

Neuroblastoma: Sarcoma que se origina en el sistema nervioso, compuesto principalmente por neuroblastos. Célula embrionaria que se convierte en célula nerviosa o neurona.

Positivo: Indica existencia o presencia de un trastorno.

Rabia: Enfermedad infecto-contagiosa, aguda y mortal que ataca el sistema nervioso central, provocada por un virus del género Lyssavirus y de la familia Rhabdoviridae. Transmitida al hombre o a los animales por la saliva de algún animal enfermo infectante o por material contaminado.