Manual de Micología - Instituto Nacional de Salud, Perú

5/24/2018 Manual de Micolog a - Instituto Nacional de Salud, Per

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Y

TCNICAS DE LABORATORIO PARA LA

IDENTIFICACIN DE LOS PRINCIPALES

HONGOS OPORTUNISTAS CAUSANTESDE MICOSIS HUMANAS

MINISTERIO DE SALUD

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

SERIE DE NORMAS TCNICAS N. 44

Lima, 2007IDENTIFICACIN

DELOSPRINCIPALE

SHONGOSOPORTUNISTASCA

USANTESDEMICOSISHUMANA

S

SERIEDENORM

ASTCNICASN.44


MINISTERIO DE SALUD DEL PER

MINISTRODr. Carlos Vallejos Sologuren

VICEMINISTRODr. Jos Caldern Yberico

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

JEFADra. Patricia J. Garca Funegra

SUBJEFEDr. Rubn Espinoza Carrillo

CENTRO NACIONAL DE

SALUD PBLICADirector General

Dr. Luis Fuentes Tafur

CENTRO NACIONAL DEPRODUCTOS BIOLGICOS

Directora GeneralDra. Silvia Pessah Eljay

CENTRO NACIONAL DE

ALIMENTACIN Y NUTRICINDirectora GeneralMg. Mara Ins Snchez-Grin

CENTRO NACIONAL DE

CONTROL DE CALIDADDirector GeneralQ.F. Alberto Valle Vera

CENTRO NACIONAL DESALUD INTERCULTURALDirector GeneralDr. Neptal Cueva Maza

CENTRO NACIONAL DE SALUD

OCUPACIONAL Y PROTECCIN

DEL AMBIENTE PARA LA SALUD

Director GeneralDr. Luis Santamara Jurez

COMIT EDITORINSTITUTO NACIONAL DE SALUD

PRESIDENTEDr. Csar Cabezas Snchez

MIEMBROS

Dr. Pedro lvarez FalconBlg. Ana Barrientos Tejada

Q.F. Rosario Belleza ZamoraDr. Zuo Burstein Alva

Dra. Patricia Caballero opoDr. Walter Curioso VilchezDr. Manuel Espinoza Silva

Ing. Fernando Farfn Rocha

ASISTENTE EDITORIALLic. Melissa Daga Caycho

Dr. Claudio Lanata de las CasasDr. Percy Mayta TristnMg. Mercedes Ochoa AlencastreMg. Graciela Rengifo GarcaDr. Miguel Salcedo LunaBlg. Silvia Seraylan OrmaecheaDr. Javier Vargas HerreraQ.F. Diana Vergara Nuez

CORRECTOR DE ESTILODaniel Crdenas Rojas


MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Y TCNICAS

DE LABORATORIO PARA LAIDENTIFICACIN DE LOS PRINCIPALESHONGOS OPORTUNISTAS CAUSANTES

DE MICOSIS HUMANAS

Elaboracin:Miriam Guevara RoblesBilogaLaboratorio de MicologaCentro Nacional de Salud PblicaInstituto Nacional de Salud

Flor Urcia AusejoBilogaLaboratorio de Micologa

Centro Nacional de Salud PblicaInstituto Nacional de Salud

Jos Casquero CaveroBilogo. Magster en Microbiologa.Laboratorio de Micologa.Centro Nacional de Salud PblicaInstituto Nacional de Salud

Lima, 2007

MINISTERIO DE SALUDINSTITUTO NACIONAL DE SALUD


Los autores agradecen a Alida Navarro Marias por su valiosa colaboracin.

Catalogacin hecha por el Centro de Documentacin e Informacin del INS

Guevara Robles, Miriam; Urcia Ausejo, Flor y Casquero Cavero, JosManual de procedimientos y tcnicas de laboratorio para la identificacinde los principales hongos oportunistas causantes de micosis humanas /Elaborado por Miriam Guevara Robles : Flor Urcia Ausejo y Jos CasqueroCavero. -- Lima: Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, 2007.100 p. : 21 x 14,5 cm. -- (Serie de Normas Tcnicas; 44)1. MICOSIS 2. INFECCIONES OPORTUNISTAS 3. CANDIDA ALBICANS4. ASPERGILLUS FUMIGATUS 5. CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS

6. TCNICAS Y PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO

I. Guevara Robles, Miriam II. Urcia Ausejo, Flor III. Casquero Cavero, Jos IV. Instituto Nacional de Salud (Per) V. Per. Ministerio de Salud

ISBN: 978-9972-857-62-1ISSN 1607 4904

Hecho el Depsito Legal en la Biblioteca Nacional del Per N.: 2007-08290

Ministerio de Salud, 2007Av. Salaverry cuadra 8 s/n, Jess Mara, Lima, PerTelfono: (511) 431-0410Telefax: 01 3156600 anexo 2669Pgina Web: www.minsa.gob.pe

Instituto Nacional de Salud, 2007Cpac Yupanqui 1400, Jess Mara, Lima, PerTelfono: (511) 471-9920 Fax 471-0179Correo electrnico: [email protected] Web: www.ins.gob.pe

Publicacin aprobada con R.J. N. 356-2007-J-OPD-INS

Se autoriza su reproduccin total o parcial, siempre y cuando se cite la fuente

Forma de citacin sugerida:

Guevara M, Urcia F, Casquero J. Manual de procedimientos y tcnicas de labo-ratorio para la identificacin de los principales hongos oportunistas causantesde micosis humanas. Lima: Instituto Nacional de Salud; 2007. Serie de Normas

Tcnicas N. 44.


NDICE

ndiceINTRODUCCIN. 5

SECCIN 1: GENERALIDADES. 7

1.1 OBJETIVO. 91.2 CAMPO DE APLICACIN. 91.3 REFERENCIAS. 91.4 DEFINICIONES. 12

1.5 RESPONSABILIDADES. 14

SECCIN 2: PROCEDIMIENTOS PARA OBTENCIN, TRANSPORTE YCONSERVACIN DE MUESTRAS. 15

2.1 MUESTRA DE SANGRE PARA HEMOCULTIVO. 172.2 MUESTRA DE ORINA PARA CULTIVO. 182.3 MUESTRA DE BIOPSIA. 192.4 MUESTRA DE ESPUTO Y SECRECIONES BRONQUIALES. 202.5 MUESTRA DE CATTER INTRAVASCULAR 22

2.6 MUESTRA DE EXUDADO PERICATTER. 222.7 MUESTRA DE LQUIDO CEFALORRAQUDEO. 23

SECCIN 3: PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNSTICOMICOLGICO. 25

3.1 EXAMEN DIRECTO (KOH, TINTA CHINA,COLORACIN GIEMSA, COLORACIN GRAM). 27

3.2 CULTIVO DE MUESTRA DE SANGRE. 283.3 CULTIVO DE MUESTRA DE ORINA. 29

3.4 CULTIVO DE BIOPSIA. 303.5 CULTIVO DE CATTER Y EXUDADO DE PERICATTER. 313.6 CULTIVO DE ESPUTO Y SECRECIONES BRONQUIALES. 323.7 CULTIVO DE LQUIDO CEFALORRAQUDEO. 32

SECCIN 4: IDENTIFICACIN DE PRINCIPALES LEVADURAS. 35

4.1 IDENTIFICACIN DE Candida albicans, Candida noalbicans, Rhodotorula rubra, Trichosporon spp,Geotrichum spp yCryptococcus neoformans

4.2 IDENTIFICACIN DE Malassezia furfur 56


SECCIN 5: IDENTIFICACIN DE PRINCIPALES HONGOSFILAMENTOSOS. 59

IDENTIFICACIN DE Aspergillus fumigatus, A. flavus,A. niger, Fusarium solani, Scedosporium apiospermum,Mucor spp. Rhizopus oryzae y Absydia corymbifera. 61

ANEXOS 73

ANEXO A TCNICA DE LISIS CENTRIFUGACIN. 75

ANEXO B PREPARACIN DE REACTIVOS. 77

ANEXO C PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO. 83

ANEXO D CLAVE N. 1 : CLAVE PARA IDENTIFICARTrichosporon spp. 91

CLAVE N. 2 : CLAVE MORFOLGICA PARAIDENTIFICAR Geotrichum spp. 92

CLAVE N. 3 : CLAVE FISIOLGICA PARAIDENTIFICAR Geotrichum spp. 92

ANEXO E FLUJOGRAMA DE IDENTIFICACIN N. 1.Trichosporon spp. y Geotrichum spp. 93

ANEXO F TABLA N. 1: CARACTERSTICAS MORFOLGICAS YFISIOLGICAS DE PRINCIPALESLEVADURAS DE IMPORTANCIAEN SALUD PBLICA. 96

TABLA N. 2: CARACTERSTICAS BIOQUMICASDE PRINCIPALES LEVADURAS DEIMPORTANCIA EN SALUD PBLICA. 97

TABLA N. 3: CARACTERSTICAS FISIOLGICAS DEMalassezia furfury M.pachidermatis

CAUSANTES DE INFECCIN SISTMICA. 98 TABLA N. 4: CARACTERSTICAS FISIOLGICAS

PARA LA IDENTIFICACIN DE ESPECIESDETrichosporon sp. 99

TABLA N. 5: CARACTERSTICAS FISIOLGICAS DEESPECIES DE Geotrichum sp. 99

TABLA N. 6: CARACTERSTICAS MORFOLGICASDE LAS PRINCIPALES ESPECIES DEAspergillus sp. 100


INTRODUCCIN

Introduccin

Durante la ltima dcada se ha observado un incrementode las enfermedades micticas, sobre todo las de tipooportunista, ello ha significado la aparicin de nuevasformas clnicas de micosis as como localizaciones opresentaciones no habituales, adems de la presencia

de nuevas especies fngicas consideradas antiguamentecomo no patgenas pero que excepcionalmente producanenfermedad en individuos inmunodeprimidos.Diversos factores han permitido la aparicin de infeccionesemergentes: cambios poblacionales y sus patrones decostumbres, avances tecnolgicos y desarrollo econmicode algunos pases, que ha permitido la generalizacinde tratamientos mdicos quirrgicos invasivos, consupervivencia de enfermos que difcilmente superabanprocesos patolgicos y que favorecen el desarrollo

de micosis sistmicas; incremento de viajes inter ytranscontinentales, nuevos mecanismos de adaptacinde algunos microorganismos que conlleva a la aparicinde resistencia a los antifngicos e infeccin por VIH.Actualmente se reconocen entre 300 y 400 especiesde hongos causantes de micosis sistmicas, las cualesconstituyen un pequeo porcentaje del total de ms de100 000 especies catalogadas. Por todo ello se prefieremencionar un comportamiento oportunista por partedel hongo, debido a que los patgenos primarios alinfectar a individuos inmunosuprimidos, se comportancon mayor agresividad, originando infecciones sistmicas,diseminadas, de evolucin aguda y mal pronstico.En este tipo de micosis es necesario considerar al binomiohusped parsito. Las infecciones oportunistas seproducen cuando los mecanismos de defensa especficose inespecficos del hospedero son ineficaces, mientras quelas sistmicas o diseminadas se producen cuando fallanlos mecanismos celulares de defensa en los neutrfilos.

La mayora de las micosis oportunistas siguen siendo


ocasionadas por las especies clsicas: Candida albicans,Aspergillus fumigatus, Cryptococcus neoformans. Sinembargo, por las razones expuestas anteriormente han

emergido nuevos hongos oportunistas.El Instituto Nacional de Salud como entidad tcnicanormativa en procedimientos de laboratorio pone adisposicin del personal del sector, el MANUAL DEPROCEDIMIENTOS Y TCNICAS DE LABORATORIO PARA LAIDENTIFICACIN DE LOS PRINCIPALES HONGOS CAUSANTESDE MICOSIS OPORTUNISTAS, cuyo objetivo es establecer losprocedimientos de laboratorio para la identificacin de lasprincipales especies de levaduras y hongos filamentosospertenecientes a los gneros: Candida spp., Rhodotorularubra, Geotrichum spp., Trichosporon spp., Cryptococcusneoformans, Malassezia furfur, Aspergillus spp., Fusariumsolani, Scedosporium apiospermum, Mucor spp., Rhizopusoryzae yAbsidia corymbifera.

Este documento tcnico representa el esfuerzo del personaldel laboratorio de micologa de la institucin.


SECCIN1

Generalidades


9INS-CNSP-44

1.1. OBJETIVO

Establecer los procedimientos de laboratorio para realizar el ais-lamiento e identificacin de los principales hongos emergentes y ree-mergentes de importancia mdica como: Candida albicans y C. no albi-

cans, Cryptococcus neoformans, Rhodotorula rubra, Geotrichum spp.,Trichosporon spp., Aspergillus spp., Malassezia furfur, Scedosporiumapiospermum, Mucor spp., Rhizopus oryzae, Fusarium solani yAbsidiacorymbifera.

1.2. CAMPO DE APLICACIN

El presente manual es aplicable a las entidades que conforman elsistema nacional de la red de laboratorios.

1.3. REFERENCIAS

1.3.1. Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientosde laboratorio para la obtencin y envo de muestras(I). Lima: Instituto Nacional de Salud; 1995. Serie deNormas Tcnicas N. 15.

1.3.2. Instituto Nacional de Salud. Bioseguridad en laboratoriosde ensayo, biomdicos y clnicos. 3ra ed. Lima: InstitutoNacional de Salud; 2005. Serie de Normas TcnicasN. 18.

1.3.3. Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientosbacteriolgicos en infecciones intrahospitalarias. Lima:Instituto Nacional de Salud; 2001. Serie de NormasTcnicas N. 28.

1.3.4. Negroni R, Guelfand L. Manual de procedimientos para

laboratorios de micologa mdica. Acta Bioqumica

GENERALIDADES


10Instituto Nacional de Salud

Procedimientos y tcnicas de laboratorio para la identifcacin de los principales hongos oportunistas

Clnica Latinoamericana 1999 Suplemento 1. BuenosAires: Federacin Bioqumica de la Provincia de BuenosAires; 1999.

1.3.5. Campbell M, Stewart J. Processing of individualspecimens. En: The Medical Mycology Handbook. NewYork: John Wiley & Sons; 1980. p. 139 - 40.

1.3.6. Koneman E, Roberts G. Micologa. Prctica de laboratorio.3ra ed. Buenos Aires: Editorial Mdica Panamericana;1992.

1.3.7. Pemn J, Martn-Mazuelos E, Rubio-Calvo MC. Guaprctica. Identificacin y diagnstico en micologa

mdica. Revista Iberoamericana de Micologa; 2001.1.3.8. Arango M, Castaeda E. Micosis humanas. Procedimientos

diagnsticos. Exmenes directos. Bogot: Corporacinpara Investigaciones Biolgicas e Instituto Nacional deSalud; 1995.

1.3.9. Ballest R, Salvatella R. Manual de toma de muestra paraestudio bacteriolgico, parasitolgico y micolgico.Seleccin, recoleccin, conservacin y transporte.

Montevideo: Departamento de Laboratorio Clnico.Hospital de Clnicas. Facultad de Medicina; 2004.

1.3.10. Lpez Martnez R, Mndez L, Hernndez F, Castan R.Micologa mdica. Procedimientos para el diagnsticode laboratorio. Mexico DF: Editorial Trillas; 1995.

1.3.11. Torres Rodriguez, J. Nuevos hongos patgenosoportunistas emergentes. Rev. Iberoam. Micol. 1996.13: S30 S38.

1.3.12.

Hazen K. New and emerging yeast pathogens. ClinMicrobiol Rev 1995; 8(4): 462-78.

1.3.13. Sullivan D, Coleman D. Minireview Candida dubliniensis:Characteristics and Identification. J Clin Microbiol 1998;36(2): 329-34.

1.3.14. Fridkin S, Jarvis W. Epidemiology of nosocomial fungalinfections. Clin Microbiol Rev 1996; 9(4): 499-511.

1.3.15. Casquero J, Zurita S. Manual de procedimientos de

laboratorio para el diagnstico de micosis oportunistas


11INS-CNSP-44

Seccin 1

y profundas. Lima: Instituto Nacional de Salud; 1997.Serie de Normas Tcnicas N. 23.

1.3.16.

Hoog GS, Guarro J, Gen J, Figueras MJ. Atlas clinical offungi. 2nded. Reus: Universitat Rovira I Virgili; 2000.

1.3.17. San Juan R, Berenguer J, Aguado JM. Hongos filamentososemergentes: Scedosporium [documento en internet].Espaa; 2004. Disponible en: www.seimc.org/control/revi_Mico/pdf/Honemerg.pdf

1.3.18. Crespo V, Ojeda A, Vera A, Crespo A, Snchez F.Aislamiento e identificacin de Malassezia spp. enpitiriasis versicolor, dermatitis seborreica y piel sana.

Rev Iberoam Micol 199; 16: 16-21.1.3.19. Giusiano GE. Malassezia. Estado del conocimiento y

perspectivas en su estudio. Rev Argent Microbiol 2006;38(1): 41-48.

1.3.20. Guillot J, Guho E, Lesourd M, Midgley G, ChvrierG, Dupont B. Identification of Malassezia species. Apractical approach. J. Mycol Med 1996; 6: 103-10.

1.3.21. Guho E, Midgley G, Guillot J. 1996. The genus

Malassezia with description of four new species. Antonievan Leeuwenhoek 1995; 69: 337-55.

1.3.22. Haley L, Callaway C. Laboratory methods in medicalmycology. Atlanta: U.S. Department of Heath, Educationand Welfare. Public Health Service. CDC; 1978.

1.3.23. Bodey G. Candidiasis. Pathogenesis, diagnosis, andtreatment. 2nded. New York: Raven Press; 1993.

1.3.24. Laszlo A, Weyer K, Barrera L, Balandrano S, Ridderhof

J, Smithwick R, et al. Baciloscopa directa de BAAR. Unprograma de capacitacin para laboratorios. Atlanta:OMS/UICTER/CDC/OPS/INDRE/APHL; 2000.

1.3.25. Canelo C. Determinacin de las variedades neoformansy gattii en cepas de Cryptococcus de origen clnicoconservadas en el Instituto Nacional de Salud. [Tesispara optar el titulo profesional de bilogo con mencinen microbiologa y parasitologa]. Lima: UniversidadNacional Mayor de San Marcos; 1999.




1.4. DEFINICIONES

1.4.1. Hemocultivo: cultivo microbiolgico de la sangre.

1.4.2. Levadura: hongo unicelular redondeado u ovoide que sereproduce sexual o asexualmente.

1.4.3. Hongo: organismo eucariote que pertenece al reino fungi.

1.4.4. Hifas cenocticas: hifas no septadas o no tabicadas.

1.4.5. Hifas: elemento estructural fundamental de los hongos,puede ser unicelular como las levaduras o pluricelularadoptando la forma de filamento septado o aseptado. El

conjunto de hifas forma el micelio.1.4.6. Cpsula: envoltura hialina y gelatinosa que rodea a una

clula, formada generalmente de polisacridos.

1.4.7. Candidiasis diseminada: infeccin producida por el g-nero Candidaque se expande a diversos rganos.

1.4.8. Blastoconidia: conidio holoblstico que se produce enforma solitaria, sincrongena o en cadenas.

1.4.9. Pseudomicelio: conjunto de pseudohifas.1.4.10. Tubo germinativo: primordio hifal a partir de un conidio.

1.4.11. Clamidoconidio: conidio tlico, redondo de pared gruesa yde gran tamao, producido por modificacin de una clulahifal preexistente, considerada de reproduccin o de resis-tencia. Tambin se le denomina como clamidospora.

1.4.12. Artroconidias: conidio tlico producido por fragmenta-cin de la hifa y que se libera por un proceso de rexlisis

o de esquizlisis.1.4.13. Hongos filamentosos: hongos de aspecto algodonoso

que en general se desarrollan como saprofitos.

1.4.14. Macroconidia: el mayor de dos tipos de conidios pro-ducidos de la misma manera por el mismo hongo. Esteconidio presenta un tamao mayor de cinco micras yque generalmente tiene septos.

1.4.15. Filide: estructura conidigena generalmente en forma

de botella en la cual se producen los conidios en forma


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Seccin 1

baspeta; el primer conidio es holoblstico y los siguien-tes son enteroblsticos.

1.4.16. Conidio: propgulo originado por un proceso de repro-duccin asexual.

1.4.17. Conidiforo: hifa especializada sobre la cual se originandirecta o indirectamente los conidios.

1.4.18. Esclerote: masa densa de hifas o pseudoparnquimasque forma una unidad reproductora.

1.4.19. Mtula: rama estril situada debajo de las filides en losgneros Aspergillus sp. yPenicillium sp.

1.4.20. Esporodoquio: estructura anloga a los apotecios, peroproductora de conidios.

1.4.21. Dematiceo: hongo provisto de pigmento marrn oscu-ro o negro, perteneciente a la familia dematiaceae.

1.4.22. Anlide: clula conidigena generalmente en forma debotella, caracterizada por presentar una cicatriz en for-ma de anillo despus de cada conidiacin.

1.4.23. Esporangiforo: hifa especializada portadora de un es-

porangio.

1.4.24. Esporangio: estructura generalmente vesiculosa quecontiene a las esporangiosporas.

1.4.25. Apfisis: parte abultada de un esporangiforo inmedia-tamente por debajo de la columnela.

1.4.26. Estoln: hifa horizontal al sustrato, presente en los mu-corales, que comunica a dos esporangiforos y de lacual se pueden originar los rizoides.

1.4.27. Rizoide: rama corta y delgada de un talo semejante auna raz vegetal.

1.4.28 Rexlisis: con referencia a la secesin conidial, ruptu-ra circuncisial de la pared celular por debajo del septobasal del conidio. La ruptura puede resultar por tensinmecnica, actividad litica, enzimtica o ambas.

1.4.29 Esquizolisis: proceso enzimtico de separacin conidialconidio-clula conidegena o conidio-conidio, a travs

de la fisin de un septo doble.




1.4.30 Holoblstico: reproduccin asexual por blastoconidiosqueinvolucra a toda la fngica a travs de un proceso blstico.

1.4.31 Enteroblstico: conidio producido por un proceso blsti-co en donde slo participa la pared del hongo.

1.4.32 Reproduccin asexual: multiplicacin celular por mito-sis y que en los hongos da por resultado la produccinde conidios.

1.4.33 Apotecio: ascocarpo abierto plano o en forma de copa.

1.5. RESPONSABILIDADES

1.5.3. La Jefatura del INS, aprueba el presente MANUAL DEPROCEDIMIENTOS Y TCNICAS DE LABORATORIO PARALA IDENTIFICACIN DE LOS PRINCIPALES HONGOS OPOR-TUNISTAS CAUSANTES DE MICOSIS HUMANAS, medianteresolucin jefatural.

1.5.4. La Oficina General de Informacin y Sistemas, supervisala elaboracin, revisin y actualizacin del presente pro-cedimiento.

1.5.5. El director general del CNSP, supervisa la aplicacin delpresente procedimiento en la unidad orgnica a su cargo.

1.5.6. El director ejecutivo de la direccin ejecutiva de enfer-medades transmisibles cumple y hace cumplir lo esta-blecido en este procedimiento.

1.5.7. El personal profesional y tcnico del laboratorio de mi-cologa del CNSP, elaboran el presente procedimiento.

1.5.8. Autorizada la publicacin e impresin del presenteprocedimiento, la DG CNSP, difundir el documentoa los integrantes del sistema nacional de la red delaboratorios.

1.5.9. Los responsables de los establecimientos de salud sonlos encargados de disponer, supervisar y designar alpersonal calificado para aplicar las disposiciones esta-blecidas en el presente procedimiento.

1.5.10. El personal designado debe de aplicar las instrucciones

contenidas en el presente procedimiento.


SECCIN2

Procedimientospara obtencin,transporte yconservacin demuestras


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Un adecuado proceso de obtencin de especmenes clnicos per-mitir el establecimiento definitivo del diagnstico por parte del labora-torio al recuperar e identificar al agente etiolgico. Todas las muestrasdeben de transportarse en recipientes hermticos que impidan la con-taminacin del personal y medio ambiente en caso de derrame.

2.1. OBTENCIN, TRANSPORTE Y CONSERVACIN DE MUES-TRA DE SANGRE PARA HEMOCULTIVO

2.1.1. Revisar el Manual de procedimientos de laboratorio para laobtencin y envo de muestras (I). Serie de Normas Tcni-cas N. 15. 2da ed. 1997. Captulo II. 2.2 Procedimiento deobtencin de sangre mediante uso de jeringa, p. 17 9.

2.1.2. Considerar las medidas de asepsia al obtener la mues-tra, para evitar contaminaciones en los hemocultivos.

2.1.3. En el caso de adultos recoger de dos a tres muestrasde 8 a 9 mL de sangre venosa de diferentes puncionesy separadas por 30 minutos o una hora entre s. En elcaso de nios, obtener un slo espcimen de 1 a 5 mL,en lactantes 1 a 2 mL y neonatos de 0,5 a 1 mL.

2.1.4. La tcnica de extraccin en el sistema de lisis centrifu-gacin es similar, pero hay que considerar las especifi-caciones del fabricante. Para los nios, existen comer-

cialmente tubos peditricos (Isolator 1,5).

PROCEDIMIENTOS PARAOBTENCIN, TRANSPORTE Y

CONSERVACIN DE MUESTRAS




2.1.5. Obtenida la muestra de sangre, sta debe de ser inocu-lada de inmediato en el sistema de hemocultivo que ellaboratorio trabaja.

2.2. OBTENCIN, TRANSPORTE Y CONSERVACIN DE MUES-TRA DE ORINA PARA CULTIVO

2.2.1. Revisar el Manual de procedimientos bacteriolgicos eninfecciones intrahospitalarias. Serie de Normas Tcni-cas N. 28. Seccin 3.3. Obtencin de muestra de orinapara cultivo.

2.2.2. Se recomienda colectar en un recipiente de boca ancha,con tapa rosca y estril un volumen no menor a 10 mLhasta 20 a 25 mL para un adecuado estudio micolgico.

2.2.3. El paciente debe retener la orina por lo menos tres ho-ras. La primera parte de la miccin se elimina, por con-tener flora de arrastre de la porcin distal de la uretra,de la misma forma desechar la parte final, por su escasocontenido microbiano.

Se recoge la parte media de la miccin matinal, la msrepresentativa del estado de las vas urinarias y la msidnea para el cultivo.

Este tipo de procedimiento lo realiza el paciente, quienpreviamente debe de realizar la limpieza de sus genita-les con agua y jabn.

2.2.4. En el caso de los varones deben de retraer el prepucio ylas mujeres separar los labios para evitar contaminacinexgena.

2.2.5. En el caso de que la obtencin de muestra se realice atravs de la instalacin de un catter o sonda vesical,realizarlo previa higiene del meato uretral y genitalesexternos. Este mtodo de obtencin es el adecuadocuando se sospecha de candidiasis urinaria. Sin embar-go, se debe de considerar que ello implica cierto peligrode sobreinfeccin de vas altas y produccin de micro-

traumas especialmente en el varn.


Seccin 2

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Se emplea la sonda vesical cuando no se obtienen re-sultados por los anteriores mtodos o cuando se deseacorroborar un diagnstico.

En pacientes con sonda permanente, la muestra se ob-tiene por puncin asptica de la sonda, nunca de la bol-sa recogida.

2.2.6. Para obtener la muestra de lactantes se debe usar unabolsa colectora estril la cual se coloca en los genitalesmantenindola hasta la miccin. No olvidar realizar lahigiene de la zona incluyendo la regin anal.

Si no se produce la miccin dentro de los 30 minutosposteriores a la colocacin de la bolsa, sta debe de sersustituida. La miccin puede ser facilitada con la ingestade lquidos. Este tipo de muestra no es adecuada para eldiagnstico de candiduria.

2.2.7. La obtencin de muestras a travs de puncin o aspira-cin suprapbica se indica en lactantes cuando no es po-sible conseguirla a travs de otro mtodo, pero est con-traindicada en pacientes con problemas de hemostasia.

Despus del aseo, antisepsia y anestesia local, se pun-ciona directamente la vejiga. Cualquier hallazgo micro-biolgico tiene valor.

2.2.8. Las muestras genitourinarias deben de procesarse inme-diatamente despus de obtenidas debido a que el rpi-do desarrollo de las levaduras a temperatura ambientepuede dar una falsa concentracin en la muestra. Si nose puede proceder con el anlisis, refrigerar la muestra

por un mximo de 12 horas.

2.3. OBTENCIN, TRANSPORTE Y CONSERVACIN DE MUES-TRA DE BIOPSIA

2.3.1. Se realiza en el quirfano o consultorio bajo las msrigurosas reglas de asepsia.

2.3.2. Obtenida la muestra, sta se divide en dos porciones

(1mm cada una), una es colocada en un recipiente estril




con tapa de rosca conteniendo solucin salina isotnicaestril para el examen micolgico y la otra en formol al10% en solucin salina buferada para histopatologa.

La muestra para el estudio micolgico debe de ser re-mitida de inmediato al laboratorio. Sin embargo, de noser procesada al momento, conservar a 4 C por dos acuatro horas.

2.4. OBTENCIN, TRANSPORTE Y CONSERVACIN DE MUES-TRAS DE ESPUTO Y SECRECIONES BRONQUIALES.

2.4.1. Debido a que las muestras de esputo pueden contenerMycobacterium tuberculosis, se deben adoptar precau-ciones al momento de su emisin para minimizar el ries-go de contagio:

- A veces los pacientes con TBC van al laboratorio parala toma de muestra de esputo, por ello nunca tomela muestra dentro del laboratorio. Es ms seguro to-marla fuera de este para evitar la generacin de ae-

rosoles.- Debe preferirse la expectoracin espontnea (espu-

to) como muestra de estudio para el diagnstico delaboratorio de micosis broncopulmonares. Este esun espcimen representativo y puede repetirse sininconvenientes. Sin embargo, tiene la desventaja dearrastrar microorganismos colonizantes de boca yfaringe.

Para pacientes que no pueden expectorar fcilmente sepuede usar la nebulizacin con solucin salina hipert-nica o con ayuda de fisioterapia para inducir la salida delesputo.

La utilidad diagnstica del esputo se medir de acuerdocon su calidad valorada en funcin del nmero de leuco-citos polimorfonucleares-PMN (ms de 25 PMN) y clulasepiteliales (menos de diez clulas por campo) presentesen la muestra.


Seccin 2

21INS-CNSP-44

2.4.2. Indicar al paciente que se realice la higiene bucal concepillo y pasta dental, complementariamente hacer en-

juagues con agua y bicarbonato de sodio (una cuchara-

da sopera de bicarbonato de sodio en un litro de aguahervida que luego se entibia). Emitir la muestra en fras-co estril y de boca ancha.

Las muestras deben de transportarse al laboratorio enun plazo no mayor a dos horas desde su obtencin.

Una vez recibido el espcimen en el laboratorio se debe-r procesar de inmediato o en su defecto conservar enrefrigeracin a 4 C hasta por cuatro a seis horas.

Para tener un mejor diagnstico se recomienda procesartres muestras diferentes de esputo, siendo lo ideal cincoespecmenes emitidos en das sucesivos.

2.4.3. El lavado broncoalveolar (LBA) se obtiene por fibrobron-coscopa, reduciendo la presencia de contaminantes deboca y vas respiratorias superiores. El LBA se considerasignificativo cuando el recuento de clulas epitelialesplanas es inferior a 1% y se observa predominio de ma-

crfagos alveolares o clulas inflamatorias. Una vez recibido el espcimen en el laboratorio se debe-

r procesar de inmediato o en su defecto conservar enrefrigeracin a 4 C por cuatro a seis horas.

2.4.4. El aspirado bronquial se obtiene mediante un fibrobron-coscopio, se aspira secreciones del rbol bronquial, pre-via colocacin de 5 a 10 mL de suero fisiolgico.

El aspirado esta indicado cuando el volumen de lquidorecuperado en el lavado broncoalveolar es insuficiente yexiste sospecha de infeccin fngica pulmonar.

Una vez recibido el espcimen en el laboratorio se debe-r procesar de inmediato o en su defecto conservar enrefrigeracin a 4 C por cuatro a seis horas.

2.4.5. El cepillado bronquial se obtiene a travs de un fibro-broncoscopio, introduciendo a travs de l un cepillocon el que se frotan las paredes, permitiendo obtener




muestras con una elevada proporcin de clulas desca-madas de las paredes del rbol bronquial.

Hay que considerar que la muestra no se encuentra pro-tegida por lo que puede contaminarse al pasar por elcanal del broncoscopio. Se emplea para el diagnsticocitolgico. No es una muestra recomendada para el es-tudio de infecciones fngicas.

2.5. OBTENCIN, TRANSPORTE Y CONSERVACIN DE MUES-TRA DE CATTER INTRAVASCULAR.

2.5.1. Desinfectar con alcohol la zona cutnea alrededor de lainsercin del catter.

2.5.2. Retirar el catter.

2.5.3. Aspticamente, cortar 5 cm del extremo distal e introdu-cir en un contenedor estril con tapa rosca.

2.5.4. Rotular y enviar al laboratorio.

2.5.5. Procesar de inmediato, conservando a temperatura am-biente por 15 minutos. De lo contrario, conservar a 4 Cpor un mximo de 24 horas, en este caso sumergir lamuestra en solucin salina estril.

2.6. OBTENCIN, TRANSPORTE Y CONSERVACIN DE MUES-TRA DE EXUDADO DE PERICATTER.

2.6.1. Obtener la muestra pasando una torunda en una zonade 2 cm alrededor de la insercin del catter.

2.6.2. Introducir la torunda en un medio de transporte (solu-cin salina estril 0,85%).

2.6.3. Rotular y enviar al laboratorio.

2.6.4. Procesar de inmediato, conservando a temperatura am-biente por 15 minutos. De lo contrario, conservar lamuestra a 4 C por un mximo de 24 horas.


Seccin 2

23INS-CNSP-44

2.7. OBTENCIN, TRANSPORTE Y CONSERVACIN DE MUES-TRA DE LQUIDO CEFALORRAQUDEO.

2.7.1. Desinfectar la zona por punzar con yodopovidona al 2%.

2.7.2. El mdico debe de realizar la puncin en los espaciosintervertebrales L3 L4, L4 L5 L5 S1.

2.7.3. Al llegar al espacio subaracnoideo, retirar el estilete ydejar fluir libremente la muestra.

2.7.4. Recoger un volumen mnimo del espcimen de 5 mL enun tubo estril con tapa rosca.

2.7.5. Transportar al laboratorio a temperatura ambiente. Deno procesar de inmediato conservar a temperatura am-biente por un mximo de 24 horas, debido a que lasbajas temperaturas afectan principalmente a C. neofor-mans.


SECCIN3

Procedimientospara eldiagnsticomicolgico


27INS-CNSP-44

PROCEDIMIENTOS PARA ELDIAGNSTICO MICOLGICO

Se describen bsicamente dos tipos de estudios, el examen di-recto y el cultivo.

Para asegurar una recuperacin de hongos a partir de muestrasclnicas, stas deben de procesarse de inmediato mediante su inocula-cin sobre medios de cultivo.

3.1. EXAMEN DIRECTO

Este procedimiento no sustituye al cultivo. Brinda informacinpreliminar o presuntiva al ser una tcnica rpida que puede ser til alclnico y en algunos casos llegar a ser diagnstica.

Es as, que la presencia de hifas cenocticas en pacientes concetoacidosis diabtica puede ser de gran valor para iniciar tratamientocontra posible mucormicosis.

Entre los principales exmenes directos tenemos:

3.1.1. Hidrxido de potasio (KOH)Disuelve rpidamente las clulas permitiendo digerirmaterial proteico, observando con mayor nitidez los ele-mentos fngicos, su efecto de clarificar puede incremen-tarse al calentar a la llama ligeramente la preparacin.

Adicionalmente, se puede emplear colorantes para pig-mentar la pared de los hongos y mejorar la visualizacin.

La observacin de hifas, permite sugerir la presencia de

invasin mictica.




3.1.2. Tinta china

Es un mtodo de contraste. Permite visualizar la cpsula

de polisacrido de Cryptococcus neoformans, mediantela presencia de un halo claro y ntido alrededor de lalevadura.

Existen artefactos (hemates, burbujas de aire, leucoci-tos, gotas de grasa y partculas de talco) que puedeninterferir y confundir al analista.

La sensibilidad de la tcnica es de 50% en pacientes sinVIH y se puede incrementar hasta 88% en pacientes VIH

con meningitis criptococsica.3.1.3. Coloracin Giemsa

Es de utilidad para el diagnstico de histoplasmosis,neumocistosis y otras micosis. Permite visualizar blas-toconidias intracelulares al polimorfonuclear, como lafase tisular del H. capsulatum.

3.1.4. Coloracin Gram

Es til para observar blastoconidias y pseudomicelios delas especies del gnero Candida, Malassezia y Crypto-coccus, las cuales son Gram positivas con variaciones enla intensidad de la coloracin.

3.2. CULTIVO DE MUESTRA DE SANGRE

3.2.1. En laboratorios pequeos que tienen un bajo flujo deeste tipo de muestras y no permite tener medios es-peciales es aceptable inocular 0,5 mL de sangre hepa-rinizada directamente en la superficie de un medio decultivo.

Como medio de cultivo se debe emplear una botella bi-fsica que contenga 60 mL de caldo infusin cerebrocorazn y agar cerebro corazn.

Se inocula 10 mL de sangre en el medio bifsico, reci-biendo ventilacin a travs de una aguja con tapn de


Seccin 3

29INS-CNSP-44

algodn, colocando el medio de cultivo en forma verti-cal. Se incuba a 30 C por 30 das.

Examinar en forma diaria, hasta observar el crecimientode microorganismos. Despus de examinar diariamentelos cultivos, se debe de mezclar la fase lquida del mediode cultivo con el agar.

3.2.2 Otro sistema de recuperacin de hongos es el sistemade lisis centrifugacin, que tiene la capacidad de lisarleucocitos sanguneos con ulterior liberacin al mediode microorganismos fagocitados, pero para su correctarealizacin hay que considerar las especificaciones del

fabricante (anexo A).

3.2.3 Para las tcnicas automatizadas seguir las recomenda-ciones de los fabricantes de como inocular dos frascosen cada extraccin (aerbico y anaerbico), pero en casode nios emplear un frasco peditrico por extraccin.

El volumen de sangre inoculado por frasco es esencialpara incrementar la sensibilidad de la tcnica.

3.3. CULTIVO DE MUESTRA DE ORINA

3.3.1 El urocultivo convencional es el mtodo idneo para elestudio de infeccin del tracto urinario, permitiendo di-ferenciar cualitativa y cuantitativamente una contamina-cin de una candiduria significativa.

3.3.2 Inocular 1 10 L de orina no centrifugada en una placaPetri que contenga agar sabouraud dextrosa con anti-bitico (ASD).

3.3.3 Incubar a 35 - 37 C por 48 72 horas en aerobiosis.

3.3.4 En la infeccin del tracto urinario, el valor del recuentode colonias en la orina no esta bien establecido. En gene-ral, se acepta que un recuento mayor a 10 000 UFC/mL,indicara infeccin urinaria o candidiasis diseminada, unrecuento inferior no es significativo de infeccin.




Algunos investigadores sealan que hay que valorarcualquier recuento de levaduras como anormal y realizarnuevamente el cultivo antes de descartar una infeccin.

En general, ante un cultivo positivo, se puede considerarlas siguientes situaciones:

- Candiduria inferior a 1000 UFC/mL: generalmentecorresponde a ausencia de infeccin, con excepcinsi la muestra fue obtenida por puncin suprapbica.

- Candiduria entre 1000 y 10 000 UFC/mL: de signifi-cado clnico dudoso y puede resultar de una conta-

minacin sobre todo si existe flora mixta.En ciertos pacientes (nios, diabticos, cateteriza-dos), un recuento bajo puede ser de valor, sin em-bargo considerar una nueva muestra.

- Candiduria entre 10 000 y 50 000 UFC/mL: sugie-re la existencia de infeccin urinaria. La presenciade leucocitos y clnica del paciente pueden ayudar avalorar la candiduria. Al encontrar en el cultivo flora

fngica mixta o asociada con bacterias, sospechar decontaminacin.

- Candiduria superior a 50 000 UFC/mL: indica infec-cin.

3.3.5 Agentes etiolgicos diferentes al gnero Candidaobligaa la realizacin de recuentos de colonias y puede sem-brarse inclusive el sedimento urinario.

3.4. CULTIVO DE BIOPSIA

3.4.1 Transvasar la muestra a una placa Petri estril. Realizarlavados con solucin salina estril con antibiticos (clo-ramfenicol al 0,05%).

3.4.2 Seccionar y triturar la muestra en trozos de 1 a 2 mmcon ayuda de pinza y bistur estril para obtener un es-pcimen homogeneizado.


Seccin 3

31INS-CNSP-44

3.4.3 Flamear al mechero cuatro lminas portaobjetos y en lacara flameada realizar improntas para hacer examen enfresco y coloraciones como Gram y Giemsa.

3.4.4 Inocular la muestra, sumergindola ligeramente en lasuperficie del medio de cultivo agar Sabouraud dextrosa(ASD). Incubar un tubo a temperatura ambiente y otro a37 C. Controlar diariamente por un lapso de ocho se-manas.

3.5. CULTIVO DE CATTER Y EXUDADO DE PERICATTER

3.5.1 Los mtodos ms empleados son las tcnicas semicuan-titativa de Maki y cuantitativa de Brum - Buisson.

3.5.2 La tcnica semicuantitativa de Maki, consiste en:

Rodar cuatro veces con la ayuda de una pinza estril5 cm del segmento distal del catter sobre la superficiede las placas Petri conteniendo agar sangre y ASD.

3.5.3 La tcnica cuantitativa de Brum Buisson, consiste en:

- Introducir el extremo distal del catter, en un mediode cultivo lquido.

- Agitar en un vrtex durante un minuto.

- Sembrar 50 L en placas de agar sangre y ASD(1).

(1)Incubacin:

Agar sangre: a 35 - 37 C, 72 h

Medio liquido: a 35 - 37 C, 72 h

ASA: a 30 C, para detectar el crecimiento de Rhodo-turula spp., por 15 das

Agar Sabouraud Dextrosa-palmitico 3%: a 35 - 37 C,para permitir el crecimiento de Malassezia spp., por15 das




Si se sospecha la infeccin por hongos filamentosos,prolongar la incubacin a 30 das.

3.6 CULTIVO DE ESPUTO Y SECRECIONES BRONQUIALES

3.6.1 Colocar la muestra de esputo en tubos de ensayo conASD y agar infusin cerebro-corazn. Emplear como m-nimo seis tubos por muestra, tres de ellos se incubarna temperatura ambiente y los otros tres a 37 C. Los me-dios de cultivo deben de contener cloramfenicol 0,5g/L.Evitar el uso de cicloheximida debido a que puede inhibirel desarrollo de mohos, principalmente Aspergillus spp.,Penicillium marneffei, y Cryptococcus neoformans.

3.6.2 El LBA se debe de colocar en recipiente estril y contapa rosca. La muestra se centrifuga (1500 g 3000rpm por 30 minutos) y a partir del sedimento se realizael cultivo.

3.6.3 El valor diagnstico del hallazgo de los diferentes hon-gos es diverso. Son importantes los aislamientos de Pa-racoccidioides brasiliensis e Histoplasma capsulatum;

otros como Aspergillus spp. y Fusarium spp. tienenvalor cuando se les observa en el examen directo y seles asla en forma reiterada a partir de especmenes se-riados. Finalmente, algunos hongos como Candida spp.son considerados como causantes de infeccin respira-toria si son observados por histopatologa de biopsiaso piezas quirrgicas. Cryptococcus neoformans puedecausar micosis pulmonar principalmente en pacientesVIH.

3.6.4 Los cultivos se deben controlar hasta 45 das.

3.7 CULTIVO DE LQUIDO CEFALORRAQUDEO

3.7.1 La muestra se obtiene por puncin lumbar, y luego esdepositada en un tubo de vidrio o frasco estril con taparosca. El volumen requerido para un adecuado diagns-tico de hongos debe ser de 5 mL.


Seccin 3

33INS-CNSP-44

3.7.2 Centrifugar la muestra a 1500 g 3500 rpm por 15minutos. El sobrenadante puede ser empleado para rea-lizar pruebas serolgicas de deteccin de antgeno de C.

neoformans.

3.7.3 El sedimento debe ser sembrado sobre ASD o agar in-fusin cerebro corazn o agar semilla de girasol (agarniger seed). Emplear de cuatro a seis tubos conteniendoel medio de cultivo por muestra. Incubar a temperaturaambiente y 37 C por cuatro semanas.

La proporcin de resultados positivos aumentan en for-ma directamente proporcional al volmen de muestra.

3.7.4 Lectura e interpretacin de los cultivos

Durante la primera semana de incubacin realizar laslecturas a diario de los medios de cultivo, luego pue-de realizarse dos veces por semana hasta completar eltiempo de incubacin establecida.

Una vez realizado el aislamiento primario sembrar enmedios de cultivo selectivos para su tipificacin.


SECCIN4

Identifcacinde principaleslevaduras


37INS-CNSP-44

IDENTIFICACIN DEPRINCIPALES LEVADURAS

La taxonoma y eptetos binomiales son decididos por consenso,pero cuando existen desacuerdos resultan mltiples nombres para elmismo organismo. Esto parece ser que proseguir debido a que mu-chas veces el teleomorfo de una levadura no es evidente, haciendo msapropiado el nombre por su fase anamrfica.

El laboratorio de micologa identifica levaduras que tienen signi-ficancia clnica. Para lo cual se dispone de mltiples sistemas bioqu-

micos rpidos; y tambin se deben seguir realizando sencillas pruebasque son tiles en la identificacin tales como: observar la micromor-fologa, produccin de pigmento, asimilacin de carbohidratos, pro-duccin de ureasa, susceptibilidad a la cicloheximida, desarrollo depelcula, desarrollo a 37 y 42 C.

4.1 IDENTIFICACIN DE Candida albicans, C. glabrata, C.parapsilosis, C. krusei, C. tropicalis, Rhodotorula ru-

bra, Trichosporon spp., Geotrichum spp., Cryptococcusneoformans.

4.1.1 Objetivo

Describir los procedimientos para la identificacin de lascepas de Candida albicans, C. glabrata, C. parapsilosis,C. krusei, C. tropicalis, Rhodotorula rubra., Trichospo-ron spp., Geotrichum spp. Cryptococcus neoformans.




4.1.2 Campo de aplicacin

Comprende la identificacin de especies de Candida al-

bicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. krusei, C. tropi-calis, Rhodotorula rubra, Trichosporon spp., Geotrichumspp., Cryptococcus neoformans.

4.1.3 Consideraciones generales

a) Determinar si el aislamiento corresponde a una cepade Candida albicans, C. glabrata, C. parapsilosis,C. krusei, C. tropicalis, Rhodotorula rubra, Trichos-poron spp., Geotrichum spp., Cryptococcus neofor-

mans.b) El medio de cultivo que se emplea para el aislamiento

primario es el ASD con antibitico.

Las colonias de levaduras son ligeramente abom-badas o planas, de consistencia mantecosa, lisa orugosa, con olor agradable, tornndose pastosas amedida que envejecen.

c) Las colonias de Rhodotorula rubra se caracterizanpor presentar pigmentos carotenoides que confierea la colonia un color naranja o rojo anaranjado.

d) Microscpicamente las clulas de Rhodotorula rubrase encuentran dotadas de una fina cpsula visible alexamen directo con tinta china.

e) Microscpicamente las clulas de Cryptococcus neo-formansse caracterizan por presentar una cpsula

de polisacrido visible al examen directo con tintachina.

4.1.4 Identificacin de especies del gnero Candida. Mor-fologa de las colonias

Se caracterizan por presentar colonias cremosas de co-lor blanco amarillento, lustrosas, poco elevadas y debordes bien definidos.


Seccin 4

39INS-CNSP-44

a) Examen microscpico

Se observan clulas redondas u ovaladas de tres asiete micras de dimetro, que se reproducen porblastoconidias y forman pseudomicelio en la mayorade las especies.

b) Pruebas fisiolgicas para identificacin

Tubo germinativo

Permite diferenciar las especies de Candida albicans

de las no albicans.

Desarrollo de C. albicanssobre agar sabourauddextrosa.

Desarrollo de C. glabratasobre agar sabourauddextrosa.




Procedimiento

Suspender un inculo de la cepa pura de Candidacon24 horas de desarrollo en 0,5 mL de suero humano ode conejo. Incubar a 35 37 C por 2h y 30 min.

Colocar 2 3 gotas de la suspensin en una lminaportaobjeto y cubrir con lmina cubreobjeto y obser-var al microscopio con objetivo de 40X Interpreta-cin: La prueba es positiva al visualizar una estructu-ra elongada que se origina apartir de la levadura.

Realizar esta prueba empleando cepas controles enparalelo a la cepa en estudio.

Control positivo: C. albicans.Control negativo: C. glabrata.

Desarrollo a 42 C

C. albicans y C. dubliniensistienen comportamientofisiolgico y morfolgico similar y la prueba que losva a diferenciar en el laboratorio de microbiologa esel desarrollo a 42 C en agar papa dextrosa.

Procedimiento

Sembrar la cepa aislada en tubo o placa Petri quecontenga agar papa dextrosa e incubar a 42 C por48 horas.

Tubo germinativo negativo.Cepa de Candida glabrata.

Tubo germinativo positivo.Cepa de Candida albicans.


Seccin 4

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Interpretacin:

Positivo: C. albicans. con desarrollo ptimoNegativo: C. dubliniensis sin desarrollo

Produccin de clamidosporas, blastoconidias yartrosporas.

Procedimiento

Sembrar la colonia en con estras en paralelo sobreel medio de cultivo (agar harina de maz, agar arroz,agar clamidospora).

Para la lectura colocar una lmina cubreobjeto estrilsobre el rea sembrada e incubar a temperatura am-biente por tres a cinco das.

Colocar la placa Petri al microscopio y sin retirar la l-mina cubreobjeto observar con objetivo de 10X y 40X.

Control positivo: C. albicans.Control negativo: C. glabrata.

4.1.5 Identificacin de Rhodotorula rubra.

a) Morfologa de las colonias

Se caracterizan por ser de color rojo anaranjado onaranja, de aspecto cremoso o rugoso, brillante y desuperficie lisa.

Clamidospora de Candida albicans.




b) Examen microscpico

Se observan levaduras redondas, ovoides de 2 6,5

micras de dimetro, en ocasiones forman pseudomi-celio rudimentario, al examen directo con tinta chinase visualiza una fina cpsula.

Desarrollo de Rhodotorula rubrasobre agar Sabouraud dextrosadespus de 72 horas de crecimiento a temperatura ambiente.

Fina cpsula de Rhodotorula rubravisible al examen directocon tinta china.


Seccin 4

43INS-CNSP-44

4.1.6 Identificacin de Trichosporon spp.


Son de rpido desarrollo, liso, plegado, aterciopela-do, ceroso, de color blanco amarillento crema. Latextura plegada es ms prominente en el tiempo.


Se visualiza artroconidias y blastoconidias. Las blas-toconidias son unicelulares y de forma variable y na-cen en brotes en los ngulos de las artroconidias. Laprincipal caracterstica es la de presentar artroconi-dias usualmente en forma cbica o de barril.

Desarrollo de Trichosporon spp.sobre agar Sabourauddextrosa despus de 72 horas de crecimiento a 37 C.

Artroconidias de Trichosporon sp. (objetivo de 100X).




4.1.7 Identificacin de Geotrichum spp.


Son de crecimiento rpido, en el perodo de una se-mana presentan un color blanco grisceo, que pos-teriormente cambia a un color amarillento con as-pecto ceroso, polvoriento a rugoso. La temperaturaptima de crecimiento es 25 C, la mayora de lascepas no desarrollan o lo hacen dbilmente a 37 C.


Se observa artroconidias unicelulares, en cadena,hialinas que resultan de la fragmentacin de hifas nodiferenciadas por fisin a travs de un doble septo,estas estructuras tienen forma rectangular y redon-deada en los extremos, semejante a un barril. Care-cen de blastoconidias, conidiforos y pseudohifas.

4.1.8 Identificacin de Cryptococcus neoformans.


Son mucoides y brillantes. Sobre el ASD desarrollanun color blanco amarillento, son poco elevadas y debordes continuos, mientras que sobre el agar nigerseed (agar semilla de girasol) desarrollan un color

marrn.

Artroconidias de Geotrichum spp. (objetivo de 100X).


Seccin 4

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Levaduras redondas de 7 a 15 m de dimetro, enalgunos casos pueden producir blastoconidias. Suprincipal caractersticas es la de presentar una cp-sula que la circunda, visible al examen directo con la

tinta china.

Control positivo: Cryptococcus neoformans.Control negativo: Candida albicans.

Desarrollo de Cryptococcus neoformanssobre agarSabouraud dextrosa despus de 72 horas de creci-

miento a 37 C.

Cpsula de polisacrido visible al examen directo con tinta

china (objetivo de 100X).




4.1.9 Identificacin mediante criterios bioqumicos y enzi-mticos

4.1.9.1 Asimilacin de carbohidratos

Los patrones de asimilacin de azcares (glu-cosa, lactosa, sacarosa, maltosa, galactosa yrafinosa) permiten identificar las diferentesespecies de Candida spp, Rhodotorula rubra,Trichosporon spp.y Geotrichum spp.

Interpretacin:

Positivo: viraje del color del medio de cultivo

hacia el amarillo.

Caractersticas bioqumicas de

Candida albicans.

Caractersticas bioqumicas deRhodotorula rubra.

Glu Sac Mal Raf Lac Gal Ure

Glu Lac Sac Gal Mal Raf


Seccin 4

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Negativo: no se produce viraje de color, per-maneciendo el color del medio de cultivo enmorado o prpura.

Remitirse al Manual de procedimientos de la-boratorio para el diagnstico de micosis opor-tunistas y profundas. Serie de Normas TcnicasN. 23. Captulo VI. 6.1 Identificacin de Candi-da sp.6.1.3 Asimilacin de carbohidratos.

Leyenda:Glu : glucosa Sac : sacarosaGal : galactosa Raf : rafinosaLac : lactosa Ure : ureaMal : maltosa FP : formacin de pelcula

Caractersticas bioqumicas de Candida glabrata.

4.1.9.2 Auxonograma del carbono en placa

Se fundamenta en el empleo de diversos nu-trientes hidrocarbonados o nitrogenados sobreun medio sinttico base, para observar el cre-cimiento selectivo de una levadura alrededorde los nutrientes necesarios para su desarrollo.Los medios de cultivo se comercializan deshi-dratados como medio base de levaduras, sien-

do los ms usados:

Glu Sac Mal RafLac Gal




- Medio sin carbono:sulfato amnico (5g/1),fosfato monopotsico (1g/1), sulfato demagnesio (0,5g/1), agar (20g/1)

- Medio sin nitrgeno: glucosa (20g/1), fos-fato monopotsico (1g/1), sulfato de mag-nesio (0,5g/1), agar (20g/1)

Como fuente de carbono se pueden empleartodos los azcares y alcoholes. Como sustratonitrogenado se puede usar peptona, asparagi-na, rea, sulfato de amonio, nitrato de potasioy aminocidos diversos.

Preparacin de medios y reactivos(ver anexo c)

Procedimiento

- Verter en placa Petri 25 mL del medio basea 50 C.

- Agregar 1 mL de la suspensin de levaduras(cultivo de tres das) a la escala N. 1 de Mc

Farland. Homogeneizar.- Dejar solidificar el agar, colocar los discosimpregnados con los azcares y distribuir-los a distancias razonables.

- Incubar a 37 C por tres das y hacer la lec-tura.

- Los halos de crecimiento alrededor de losdiscos indican la asimilacin del azcar.

4.1.9.3 Produccin de ureasa

Se basa en la capacidad de producir la enzimaureasa, la cual desdobla la urea en dixido decarbono y amonio, incrementando el pH delmedio y produciendo un cambio de color rojo prpura en el indicador rojo de fenol.

Procedimiento

- Se utiliza el medio de Christensen, en elcual se inocula una asada de la levadura enestudio. Los medios se incuban a 37 C du-


Seccin 4

49INS-CNSP-44

rante 6 h o a temperatura ambiente durantetres das.

InterpretacinLa prueba se considera positiva cuando se al-caliniza el medio lo que produce un cambio decolor original (amarillo) a rosa o rojo.

Una reaccin positiva a la prueba ureasa es su-gestiva de pertenecer al gnero Cryptococcus,la cepa de C. neoformansson productoras deureasa.

Positivo: Cryptococcus neoformans.Negativo: Candida albicans.

4.1.9.4 Formacin de pelcula

Algunas especies de Candida, Geotrichum yTrichosporonproducen una pelcula y gas so-bre la superficie del medio de cultivo (caldoSabouraud).

Procedimiento

- Inocular una asada de la colonia de levadu-ra, en un tubo de vidrio que contenga caldoSabouraud.

- Incubar a temperatura ambiente (25 C) por

tres das.

Urea (-)Urea (+)




Interpretacin

- Se considerar como prueba positiva si se

produce una pelcula sobre la superficie delmedio de cultivo.

4.1.9.5 Susceptibilidad a cicloheximida

Permite distinguir aquellas levaduras que sonresistentes o sensibles a la cicloheximida o ac-tidione.

Procedimiento

- Se realiza subcultivando la cepa sobre agarmicosel o agar micobitico.

- Incubar a temperatura ambiente por tresdas.

Interpretacin

- Cepas que se desarrollen sobre el medio decultivo se considerarn como resistentes.

Caldo negativode C. albicans Caldo positivode C. tropicalis


Seccin 4

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Cepa resistente ala cicloheximidaC. guillermondii

Cepa sensible a lacicloheximidaC. tropicalis

4.1.9.6 Prueba de reduccin del nitrato

La capacidad que tienen algunas cepas de le-vaduras de producir nitritos apartir de nitratos(presencia de enzimanitrato reductasa Sc.)

Procedimiento

- Coger con ayuda de un hisopo de algodn,dos a tres colonias aisladas de un cultivo de48 -72 h de crecimiento en cualquier mediode cultivo habitual.

- El hisopo inoculado se presiona con firmezacontra el fondo de un tubo vaco para quese desprendan los microorganismos conte-nidos en la fibra de algodn.

- Incubar el tubo con el hisopo a 45 C pordiez minutos.

- Sacar el hisopo y agregar al tubo, dos gotasde alfa naftlamida (reactivo A) y dos gotasde cido sulfanlico (reactivo B).

- Reintroducir el hisopo en el tubo para que

absorba los reactivos.




Interpretacin:

- El desarrollo de un color rojo brillante en elhisopo es positivo.

- Negativo slo cuando el hisopo retiene elcolor de la colonia.

Positivo: Cryptococcus. albidus var albidus Negativo: C. neoformans

4.1.9.7 Prueba de la fenoloxidasa

Capacidad de C. neoformansde formar un pig-mento marrn o negro, denominado melanina,a partir de compuestos difenlicos. La produc-cin de este pigmento mediante la prueba dela L dopa citrato frrico, es realizada por laenzima fenoloxidasa.

La reaccin positiva se evidencia con la produc-cin de un pigmento marrn oscuro o negroalrededor de la colonia de C. neoformans.

Procedimiento

- Inocular una a dos colonias de la levaduraen estudio, sobre la superficie de cada cua-drado de papel Whatman N. 1.

- Incubar en cmara hmeda a 28 C de 3 a18 h.

- Para la produccin de un pigmento marrno negro.

InterpretacinPositivo: Cryptococcus neoformans.Negativo: Candida albicans.

4.1.9.8 Otras tcnicas de identificacin

4.1.9.8.1 Identificacin bioqumica enzim-tica

Entre estas metodologas tenemos a

los medios de cultivo que emplean


Seccin 4

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sustratos cromognicos que permi-ten el aislamiento e identificacin dealgunas especies del gnero Candi-

da. Entre los medios cromognicoscomercialmente disponibles tene-mos al: CHROMagar Candida, Cro-mogen albicans, Candida ID, Albi-cans ID2, CandiSelect, FluoroplateCandida, Agar SDCA - MUAG.

Se describen sistemas enzimticosque usan un sustrato cromognicopara detectar las enzimas MUGAL

y PRO por lo que no requieren eluso de lmpara ultravioleta, entreellos tenemos a Candida albicansScreen, Murex C. albicans CA50.

Tambin hay sistemas enzimticosdisponibles que permiten la identifi-cacin rpida de C. albicansa partirde una colonia desarrollada sobrecualquier medio de cultivo conven-

cional, stos sistemas detectan unao dos enzimas - galactosamini-dasa y L prolina aminopeptidasa,presentes slo en C. albicans. Paradetectar estas enzimas los sistemascomerciales pueden utilizar sustra-tos fluorognicos y cromognicos.

Entre otras metodologas de identi-ficacin se encuentran los sistemasenzimticos que emplean sustratosfluorognicos, requiriendo para elloel uso de una lmpara ultravioletade 365 nm, es el caso del BactiCardCandida.

El medio CHROM agar Candida, esimportante para identificar las espe-cies del gnero Candidaen funcin

de los colores como:




C. albicans, C. tropicalis, C. krusei yC. slabrota.

Procedimiento- La siembra se realiza apartir de

cepas muestras biolgicas y seincuban a temperaturas de 30 a37 C durante 48 horas.

Interpretacin

- C. albicans, son lisas y de color

verde esmeralda.- C. dubliniensis, de color verde

oscuro.

- C. tropicalis colonia de colorazul oscuro con un halo prpura-marron en el medio de cultivo.

- C. krusei. colonias rugosa conel centro rosado y el borde

blanco.- C. glabrota, colonia de color vio-

leta morado.

Desarrollo de Candida albicans (a), Candida krusei (b) y Candida tropicalis(c) sobre

CHROM agar Candida.

a

b

c


Seccin 4

55INS-CNSP-44

4.1.9.8.2 Identificacin por asimilacin denutrientes

Existen diferentes sistemas de iden-tificacin semiautomatizados ba-sados en paneles o galeras quecontienen los nutrientes, como porejemplo: Auxacolor, Uni Yeast- Tek, API 20 C AUX, Galeria ID32C, Sistema Vitek.

Entre los sistemas automticos tene-mos: Sistema Vitek 2, Biolog YT Mi-

croPlate, Rapid Yeast IdentificationPanel MicroScan.

Tambin hay sistemas de identifica-cin rpida de levaduras mediantepruebas bioqumicas y enzimticas,como: Rapid Yeast Plus System,Fungiscreen4H.Api 20 CAUX

La galeria API 20 CAUX se componede 20 cpulas con sustratos deshi-dratados que permiten realizar 19pruebas de asimilacin. Las cpulasse inoculan con un medio mnimosemislido y las levaduras slo sereproducen si son capaces de utili-zar el sustrato correspondiente.




La lectura de estas reacciones sehace por comparacin con un controlde crecimiento y la identificacin se

obtiene, a partir de un cdigo num-rico, mediante un catlogo analticoo un programa informtico.

4.1.9.8.3 Identificacin mediante aspectosinmunolgicos

Estas metodologas permiten la r-pida identificacin de aislamientosde C. albicansy C. krusei, mediante

aglutinacin de partculas de ltex,usando anticuerpos monoclonales es-pecficos para ambas especies. Entrelos kits disponibles tenemos a: Bichro ltex albicans, krusei - color.

4.2 IDENTIFICACIN DE Malassezia furfur.

4.2.1 Objetivo

Describir los procedimientos para la identificacin decepas de Malassezia furfur.


Comprende la identificacin de cepas de Malasseziafurfur.


Las levaduras de Malassezia furfur por ser lipoflicas,se desarrollan en medios de cultivo que contengan ensu composicin aceites naturales u otras sustancias gra-sas, siendo el mtodo ms comn el cultivo en ASD quecontiene cicloheximide o actidione y aceite de oliva, sinembargo existen medios de cultivo alternativos como elagar de Dixn que en su formulacin incluye al glicerolmono oleato que estimula el crecimientoin vitrode lalevadura. La identificacin se basa en comparar carac-tersticas morfolgicas y fisiolgicas.


Seccin 4

57INS-CNSP-44

4.2.4 Identificacin de Malassezia furfur.


Se caracterizan por ser redondas de consistencia cre-mosa y de color blanco amarillento.


Se observa clulas globosas, elipsoidales a cilndri-cas que se reproducen por gemacin.

Aplicar el procedimiento descrito en el Manual deprocedimientos de laboratorio para el diagnstico demicosis oportunista y profundas. Serie de NormasTcnicas N. 23. Captulo V. 5.1 Reactivos. 5.1.1 Hi-drxido de Potasio.

4.2.4.1 Prueba de la catalasa

Consiste en determinar la presencia de la enzi-ma catalasa.

Colocar una gota de perxido de hidrgeno (aguaoxigenada) 10 vol. en una lmina portaobjeto y

agregar una suspensin de la levadura.

Positivo: presencia de burbujas.Negativo: ausencia de burbujas.

4.2.4.2 Asimilacin del tween20, 40, 60 y 80.

Preparar soluciones de 0,1; 0,5; 1; 5 y 10% detween20, 40, 60 y 80 en agar peptona glucosa(1 y 2%) e incubar a 32 C por siete das.

El inculo se prepara a una suspensin de 107mL-1en agua destilada estril.

4.2.4.3 Desarrollo a diferentes temperaturas.

Se siembra la cepa en el agar de Dixn y se in-cuba a 32, 37 y 40 C durante siete das.


SECCIN5

Identifcacinde principaleshongosflamentosos


61INS-CNSP-44

IDENTIFICACIN DEPRINCIPALES HONGOS

FILAMENTOSOS

5.1 IDENTIFICACIN DE Aspergillus fumigatus, A. flavus,A. niger, Fusarium solani, Scedosporium apiospermum,Mucor spp.Rhizopus oryzae y Absydia corymbifera.

5.1.1 Objetivo

Describir los procedimientos para la identificacin delas cepas de Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger,

Fusarium spp., Scedosporium apiospermum, Mucor spp.y Rhizopus oryzae.


Comprende la identificacin de cepas de Aspergillusfumigatus, A. flavus, A. niger, Fusarium sp., Scedospo-rium apiospermum, Mucor sp.y Rhizopus oryzae.


Determinar si el aislamiento corresponde a una cepa de As-pergillus fumigatus, A. flavus, A. niger, Fusarium spp. Sce-dosporium apiospermum, Mucor spp.o Rhizopus oryzae.

5.1.4 Identificacin de Aspergillus fumigatus, A. flavus,yA. niger.

5.1.4.1. Morfologa de las colonias de Aspergillus fu-migatus.

Las colonias desarrollan con rapidez sobre ASD

Czapek a 25 C.




La textura de las colonias es aterciopelada,afelpada, vellosa o algo plegada, con margenblanquecino o beige.

El color inicialmente es blanco virando enaproximadamente siete das a un verde azula-do por la produccin de conidias. El reverso dela colonia es incoloro.

Caracteristica macroscpica de A. fumigatus.

5.1.4.2. Caractersticas microscpicas de las colo-nias de Aspergillus fumigatus.

Presentan conidiforo corto, liso de hasta300 m de longitud y de 5 a 8 m de dimetro,vescula de 20 a 30 m de dimetro con fili-des (6 a 8 m de largo), uniseriada, ocupando2/3 de la vescula.

Los conidios en cadenas forman una compactacolumna sobre la vescula, son de color verde,finamente rugosos, globosos o subglobosos y

de 2 a 3 m de dimetro.


Seccin 5

63INS-CNSP-44

5.1.4.3 Morfologa de las colonias de Aspergillusflavus.

Las colonias desarrollan rpidamente sobreASD o agar Czapek a 25 y 37 C en cinco a sietedas. El color es verde amarillo. La textura de

las colonias es pulverulenta con surcos radia-les, rugosas o granulosas, ocasionalmente al-godonosas en el centro o margen de la colonia.El reverso de la colonia es incoloro.

Caracteristicas microscpicas de A. fumigatus.

Caracteristicas macroscpicas de A. flavus.




5.1.4.4 Caractersticas microscpicas de las colo-nias de Aspergillus flavus.

Los conidiforos no ramificados de pared grue-sa, hialinos, rugosos, de 1 mm de longitudy de 10 a 20 m de dimetro. Las vesculasson globosas o subglobosas de 10 a 65 m dedimetro produciendo filides uniobiseriadasalrededor de la vescula.

Los conidios son de color verde amarillentos,lisos o finamente rugosos, esfricos osubesfricos con un dimetro de 3,5 a 4,5

m de dimetro. Los esclerotes pueden estarpresentes.

5.1.4.5 Morfologa de las colonias de Aspergillus ni-ger.

Colonias de rpido desarrollo sobre ASD o agarCzapek a 25 y 37 C.

El color de las colonias al principio es blanco aamarillo, luego es negro.

La textura de las colonias es granular. El rever-so de la colonia es incoloro o crema.

Caracteristicas microscpicas de A. flavus.


Seccin 5

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5.1.4.6 Caractersticas microscpicas de las colo-nias de Aspergillus niger.

Los conidiforos son de pared lisa, hialina o pig-mentada y miden de 1,5 a 3 mm de largo y de15 a 20 m de dimetro. La vescula es globosacon 50 - 100 m de dimetro y produce filidesalrededor de ella. Las filides son biseriadas, las

ramas primarias miden 30 m de largo y puedenestar tabicadas, mientras que las secundariasson cortas y miden 8 m de longitud, a partirde las cuales brotan los conidios, los cuales songlobosos y rugosos con 4 a 5 m de dimetro,de color castao o marrn a negro.

Caracteristicas macroscpicas de A. niger.

Caracteristicas microscpicas de A. niger.




5.1.5 Identificacin de Fusarium solani.

5.1.5.1 Morfologa de las colonias.

Las colonias tienen un rpido desarrollo a 25y 37 C (siete das). El color de las colonias esblanco, crema, pardo claro o pardo rojizo mez-cladas con zonas de color prpura; raramenteen cepas de aislamientos clnicos pueden pre-sentar masas mucosas verdes azuladas, forma-das por macroconidias que nacen de esporo-doquios.

La textura es algodonosa o lanosa. La colonia

puede ser inhibida por la cicloheximida.

5.1.5.2 Caractersticas microscpicas de las colo-nias

Se caracteriza por presentar conidiforos deesporodoquios cortos, ramificados. Conidifo-ros de hifas areas generalmente no ramifica-dos, muy largos, reducidos a una simple filidems o menos cilndrica, en cuyo pice se puede

encontrar un conidio no desprendido.

Caractersticas macroscpicas de F.solani.


Seccin 5

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Macroconidias en masas mucosas, hialinos,mayormente con tres septos, ligeramente cur-vados, fusiformes, pero con extremos mas o

menos redondeados 28 50 x 4 6 m. Mi-croconidias en masas mucosas, hialinos, lisos,generalmente unicelulares, pueden ser lige-ramente curvados, elipsoidales o subcilindri-cos de 7 16 x 2,5 4,5 m. Presencia declamidosporas terminales e intercalares, lisaso verrugosas, parduzcas y de hasta 10 m deancho.

5.1.6 Identificacin deScedosporium apiospermum.

5.1.6.1. Morfologa de las colonias.

Crecimiento moderadamente rpido a 25 C,y tambin desarrollar a 40 C (siete das), decolor blanco y textura algodonosa, pero a me-dida que se incrementa la esporulacin el colorcambia a gris o gris pardusco. El reverso de lascolonias es amarillo plido a marrn oscuro o

negro dependiendo de la edad del cultivo.

Caracteristicas microscpicas de F. solani.




Las cepas aisladas de muestras clnicas rara-mente desarrollan la fase sexual. Crece sobremedios de cultivo que contienen clorhexidina.

5.1.6.2. Caractersticas microscpicas de las colonias.Clulas conidigenas (anlides) casi cilndri-cas, se desarrollan directamente sobre hifasindiferenciadas o a partir de conidiforos es-casamente ramificados. Los conidios se acu-mulan en masas mucosas sobre las anlides o

Caracteristicas macroscpicasde S. apiospermum.

Caracteristicas microscpicas de S. apiospermum.

A


Seccin 5

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solitarios y ssiles desarrollndose de las hifasdel micelio, lisos, de color pardo amarillento,ovales o elipsoidales (5 12 x 4 6,5 m) con

la base truncada.

Presenta anillos hialinos acentuados (figura A).

5.1.7 Identificacin de Mucor spp.

5.1.7.1. Morfologa de las colonias.

Las colonias desarrollan rpidamente a 25 C,cubriendo la superficie del medio de cultivo;crecen pobremente a 37 C.

El color de las colonias es blanquecino al inicio,con el tiempo cambia a marrn. El reverso dela colonia es blanquecino. La textura es algo-donosa.

Caracteristicas macroscpicas de Mucor spp.

5.1.7.2. Caractersticas microscpicas de las colonias.

Presentan hifas aseptadas y gruesas. Se carac-teriza por presentar esporangiforos, esporan-gios. Carecen de apfisis, estoln y rizoides.Las columnelas son hialina, siendo visibles siel esporangio se encuentra intacto. Los espo-

rangios son esfricos o redondos (50 300 m




dimetro) y de color gris a negro, estando lle-nos de esporas.

5.1.8 Identificacin de Rhizopus oryzae.


Colonias de crecimiento rpido a 37 C a loscuatro das llegan a ocupar totalmente la placaPetri. Inicialmente son blancas pero luego cam-bian a gris parduscas. No desarrollan a 45 C.

5.1.8.2 Caractersticas microscpicas de las colo-nias.

El micelio carece de septos. Presentan esto-

lones y rizoides. Los esporangiforos no sonramificados, tienen una longitud de 2 mm, ge-neralmente estn en grupos, formando verti-cilios en cuya base se sitan los rizoides. Lasapfisis pueden estar presentes pero son pocoevidentes. Presentan esporangios esfricoscuyo ancho es de 50 a 300 m, los cuales sonde color gris pardusco a negro. La columela essubesfrica abarcando entre 50 a 70% del es-porangio. Las esporangiosporas son angulares

y con estras longitudinales, grisceas, subes-

Caracteristicas microscpicas de Mucor spp.


Seccin 5

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fricas o elipsoidales con dimensiones de 6 a8 x 4 a 5 m.

5.1.9 Identificacin de Absidia corymbifera.


Colonias que desarrollan rpidamente a loscuatro das, incubando a 37 C, abarcando latotalidad de la placa Petri. Son colonias de tex-tura algodonosa y de color blanco a pardo.

5.1.9.2 Caractersticas microscpicas de las colo-

nias.Se caracteriza por presentar hifas aseptadas.Desarrollan rizoides y estolones. Los esporan-giforos nacen a partir de los estolones y entrelos rizoides, nicos o en grupo


ANEXOS

Anexos


75INS-CNSP-44

ANEXO A

TCNICA DE LISIS CENTRIFUGACIN

1) Emplear guantes estriles en todo el procedimiento.

2) Desinfectar el tapn de goma del tubo Isolator 10con alcohol yo-dado, sin inundar la cavidad. Dejar secar.

3) Abrir el sistema vacoutainery colocar la aguja al portatubos.

4) Insertar el tubo Isolator 10en el portatubos hasta la lnea marcada.5) Localizar el rea de venopuncin y limpiar con algodn impregna-

do con alcohol al 70%.

6) Repetir la limpieza, pero con algodn impregnado con yodo povi-dona al 2%. Dejar actuar por un minuto.

7) No volver a palpar la vena.

8) Realizar la venopuncin.

9) Empujar el tubo hasta el fondo del portatubos o hasta que la san-

gre fluya al interior del tubo.10) Cuando se llene el tubo (10 mL) retirarlo del portatubo.

11) Invertir el tubo cuidadosamente por 4 5 veces, facilitando la lisiscelular y evitar la coagulacin de la sangre.

12) Retirar la aguja del portatubo y desechar apropiadamente.

13) Transportar al laboratorio en forma segura.

14) Procesar de inmediato, de lo contrario colocar el tubo a temperatu-ra ambiente.




15) Centrifugar empleando rotores de 35 de inclinacin a 3000 g por30 minutos.

16) Retirar cuidadosamente los tubos de la centrfuga y colocarlos en

un gradilla, evitando la mezcla del sobrenadante y sedimento.17) Desinfectar el tapn de goma con alcohol yodado, sin inundar la

cavidad. Dejar secar.

18) Colocar la gradilla en la prensa Isostaty cubrir cada tapn con unacpsula estril Isostat.

19) Colocar cada tubo con su cpsula, debajo de la prensa y empujarrpidamente el asa de la prensa hacia abajo.

20) Colocar el asa en posicin original y realizar la maniobra con cada

tubo.21) Retirar la gradilla de la prensa.

22) A partir de aqu, se emplear una cabina de seguridad biolgica.

23) Introducir la punta de una pipeta en el tubo a travs de la membra-na de la cpsula, manteniendo el tubo comprimido.

24) Introducir la pipeta hasta que el bulbo haga contacto con la cpsula.

25) Absorber cuidadosamente el sobrenadante.

26) Distribuir equitativamente el sedimento en placas Petri contenien-

do agar Sabouraud dextrosa y con la punta de la pipeta sembrar enzigzag.

27) Desechar la pipeta.

28) Colocar las placas sembradas hacia arriba a 35 C y a las 24 horasse invierte su posicin.

29) Examinar diariamente por siete das.


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ANEXO B

PREPARACIN DE REACTIVOS

B.1 HIDRXIDO DE POTASIO

Pesar:

- Hidrxido de potasio 10 g

- Agua destilada 100 mL

Mezclar para disolver totalmente el KOH.

Guardar a temperatura ambiente en frasco de color mbar.

Se puede agregar glicerina al 10% para tener preparacionesde mayor duracin reduciendo la evaporacin.

Tambin se puede agregar dimetilsulfxido (DMSO) al 40%para reducir o eliminar la necesidad de calentar el preparado.

B.2 TINTA CHINA

En una lmina portaobjeto colocar:

- Tinta china 1 gota- Agua destilada o solucin fisiolgica 1 - 2 gotas- Emulsificar la muestra.- Colocar laminilla cubreobjeto.




B.3 AZUL DE LACTOFENOL

Es empleado para examinar muestras obtenidas a partir de los

cultivos. El fenol mata al hongo, el cido lctico es un agenteaclarante que preserva la estructura del hongo, la glicerina pre-viene la desecacin y el azul de algodn colorea la quitina y ce-lulosa del hongo.

Solucin A:

Fenol (cristales) 20 g Acido lctico 20 g Glicerina 40 mL

Mezclar.

Solucin B:

Azul de algodn 0,05 g Agua destilada 20 mL

Mezclar las soluciones A y B. Conservar a temperatura ambientehasta por seis meses.

B.4 COLORACIN GIEMSA

SOLUCIN CONCENTRADA DEL COLORANTE

Pesar:

Giemsa en polvo 0,6 g Metanol 50,0 mL Glicerina neutra 50,0 mL

Pulverizar cristales del colorante antes de pesar. Macerar el polvo en un mortero con 30 mL de glicerina.

Transferir la mezcla a un frasco limpio y completar el volu-men de glicerina.

Colocar al bao Mara a 55 C por dos horas.

Utilizar 20 mL de alcohol para remover el colorante adheridoal mortero.

Retirar el frasco del bao Mara, dejar enfriar y adicionar el alco-

hol que fue usado para lavar el mortero y el resto del alcohol.


Anexos

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Dejar madurar el colorante durante dos semanas y luego fil-trar.

Guardar el filtrado en frasco mbar.

SOLUCIN TAMPN pH 7,2

Na2HPO4 6,77 gKH

2PO

4 2,59 g

Agua destilada 1 L

SOLUCIN DE TRABAJO

Solucin concentrada del colorante 2 mLSolucin tampn 6 mLMezclar la solucin antes de usarla

B.5 COLORACIN GRAM

SOLUCIN DE CRISTAL VIOLETA

SOLUCIN A

Cristal violeta 4,0 gEtanol 20,0 mL

Disolver el colorante en etanol y diluir la solucin al 1:10 enagua destilada.

SOLUCIN B

Oxalato de amonio 0,8 gAgua destilada 80,0 mL

Disolver el oxalato en el agua destilada. Mezclar una parte dela solucin A con cuatro partes de la solucin B.

SOLUCIN DE YODO (LUGOL)

Yodo 1 gYoduro de potasio 2 g

Disolver el yodo y el yoduro en 5 mL de agua destilada ycompletar a un volumen de 240 mL con agua destilada.




CONTRACOLORANTE (COLORANTE DE FONDO)

Safranina O al 2,5% en alcohol al 95% 10 mLAgua destilada 100 mL

Fijar el frotis con calor o metanol.

Agregar el cristal violeta. Dejar un minuto.

Lavar con agua.

Aplicar lugol. Dejar un minuto.

Lavar con agua.

Decolorar con etanol al 95% por 30 segundos.

Agregar Safranina O. Dejar por 10 segundos.

Lavar con agua y dejar secar.

Examinar al microscopio empleando los objetivos de 40X y100X.

B.6 REDUCCIN DEL NITRATO

MEDIO 5X.

KNO3 5 gNaH2PO4H2O 11,7 gNa2HPO4 1,14 gSolucin de cloruro de benzalconio al 17% 1,2 mLAgua destilada 200 mL

Preparacin

Rehidratar con agua destilada los componentes.

Calentar suavemente hasta disolver.

Distribuir en un frasco. Autoclavar a 121 C por 15 minutos.

Dejar enfriar antes de su empleo y refrigerar (4 C a 10 C)para su conservacin.

Reactivos

Reactivo B

Acido sulfanlico 0,16 gAcido actico 5M* 20 mL


Anexos

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Reactivo A.

- naftilamina 0,1 gAcido actico 5M* 20 mL

*: El cido actico 5M es preparado adicionando una partede cido actico glacial a 25 partes de agua destilada.

B.7 SOLUCIN DE L DOPA CITRATO FRRICO.

Bufferfosfato

A. Fosfato de sodio dibsico.

Na2HPO4(0,067 M) 0,951 g Agua destilada 100 mL

B. Fosfato de potasio monobsico

KH2PO4(0,067 M) 0,912 g Agua destilada 100 mL

Se mezclan volmenes iguales de A y B (pH final 6,8)

Solucin de L dopa (L B 3,4 - dihidroxifenilalanina)

Suspender la L dopa en una a tres gotas de dimetilsulfxidoAgregar agua destilada hasta alcanzar una concentracin fi-nal de 3 mg/mL

Solucin de citrato frrico.

Disolver el citrato frrico en agua destilada hasta alcanzaruna concentracin de 1 mg/mL. Calentar suavemente hastadisolver.

Solucin de L dopa - citrato frrico.

Solucin de L dopa 1 mLSolucin de citrato frrico 0,5 mLBuffer fosfato 3,5 mL

Esta solucin debe tener un color azul claro.


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ANEXO C

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

C.1 AUXONOGRAMA DEL CARBONO EN PLACA (ASIMILA-CIN DE CARBOHIDRATOS)

Medio base: se usa como soporte de los discos de azcares y

para observar el crecimiento de las levaduras para su posterioridentificacin.

Pesar:

Extracto de levadura 0,67 g Agar noble 20 g Agua destilada 1000 mL

Disolver los ingredientes en agua destilada.

Poner en ebullicin por un minuto. Autoclavar a 121 C por 15 minutos.

Conservar en refrigeracin a 4 C.

Discos de azcares para el auxonograma del carbono

Discos de papel filtro estril de 5 mm de dimetro.

Carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa, galacto-sa y rafinosa); 20 g de cada uno.

Agua destilada 100 mL por carbohidratos.




Procedimiento

Disolver cada tipo de azcar en 100 mL de agua.

Esterilizar por filtracin. Sumergir en las distintas soluciones de azcares durante 24

horas.

Colocar los discos de papel en una placa Petri y colocar enestufa a 37 C por 24 horas.

Guardar los discos en un frasco estril de boca ancha.

C.2 AGAR ACEITE DE OLIVA

Pesar:

Agar Sabouraud dextrosa 6,5 g Tween80 2 mL Aceite de oliva 2 mL Vitamina A 10 gotas Cloramfenicol 0,5 g Agua destilada 100 mL

Disolver el agar Sabouraud dextrosa en agua destilada.

Agregar los dems ingredientes.

Esterilizar a 121 C por 15 minutos.

Almacenar a 4 C.

C.3 AGAR DE DIXON MODIFICADO

Pesar:

Extracto de Malta 36 g Peptona 6 g Agar 12 g Buey de bilis disecada 20 g Tween40 10 mL Monooleato de glicerol 2 mL Acido oleico 2 mL Agua destilada 1000 mL

Disolver los ingredientes por 15 minutos en un poco de

agua.


Anexos

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Agregar el volumen restante y ebullir.

Autoclav

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