Manual de organica

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UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE QUÍMICA FARMACÉUTICA

DEPARTAMENTO DE FARMACIA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y FITOQUÍMICA 200 8

Recopilado y revisado por: ALEJANDRO MARTINEZ M.

GLORIA AMPARO VALENCIA P. NORA JIMENEZ U.

MONICA MESA ELKIN GALEANO J.

Medellín, Mayo de 2008

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PROGRAMA DEL CURSO DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y

FITOQUÍMICA 200 8 Objetivo general ♦ Al finalizar el curso el estudiante estará en capacidad de evaluar, extraer,

aislar, caracterizar e ident ificar sustancias naturales de origen biológico. Temas del curso 1. INTRODUCCIÓN. Duración: 6 Horas

♦ Presentación del curso ♦ Entrega de Equipos ♦ Normas de laboratorio

2. RECONOCIMIENTO DE LA FLORA UNIVERSITARIA. TAXONOMIA

VEGETAL. PRESENTACIÓN DE UN EJEMPLAR CON SU CLASIFICACIÓN. Duración: 6 Horas

3. RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS. Duración: 6 Horas 4. TECNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO, SEPARACIÓN Y

PURIFICACIÓN (CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA Y EN COLUMNA). Duración: 12 Horas

5. RECONOCIMIENTO DE ADULTERACI ONES Y/O FALSIFICACIONES

(OBSERVACIÓN DE DROGAS PULVERIZADAS). Duración: 6 Horas

6. RECONOCIMIENTO CROMATOGRÁFICO DE PLANTAS MEDICINALES APROBADAS EN COLOMBIA. Duración: 6 Horas

7. FENILPROPANOS (ACEITES ESENCIALES). Duración: 12 Horas 8. TECNICAS GENERALES DE E XTRACCIÓN Y VALORACION DE UNA

DROGA Duración: 12 Horas 9. MARCHA FITOQUIMICA. Duración: 18 Horas

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10. PRACTICA ESPECIAL. Duración: 60 Horas ♦ Revisión bibliográfica y elaboración de un anteproyecto. Duración: 12 Horas ♦ Trabajo en el Laboratorio (Desarrollo exper imental). Duración: 36 Horas ♦ Póster: Elaboración 6 Horas, Presentación: 6 Horas ♦ Contenido: Elaboración de un fitofármaco. Aislamiento y caracterización de

metabolitos secundarios.

PRESENTACIÓN Este MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y FITOQUÍMCA 2008, corrige y modifica parcialmente el manual publicado en marzo de 2003 (ISBN 958 -655-682-4).

CONTENIDO Pág. PRACTICA No. 1

RECONOCIMIENTO DE LA FLORA UNIVERSITARIA, TAXONOMÍA VEGETAL, PRESENTACIÓN DE UN EJEMPLAR CON SU CLASIFICACIÓN

-

PRACTICA No. 2

RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS 19

PRACTICA No. 3

TÉCNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO, SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN (CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Y EN COLUMNA)

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PRACTICA No. 4

RECONOCIMIENTO DE ADULTERACIONES Y/O FALSIFICACIONES (OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE DROGAS PULVERIZADAS)

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PRACTICA No. 5

RECONOCIMIENTO CROMATOGRÁFICO DE PLANTAS MEDICINALES APROBADAS EN COLOMBIA

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RECONOCIMIENTO POR CCF DEL AJENJO 38 RECONOCIMIENTO POR CCF DEL AJO 38 RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA ALCACHOFA 39 RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA ALBAHACA 40 RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA HIERBABUENA 40 RECONOCIMIENTO POR CCF DEL HINOJO 41 RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA MALVA 42 RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA MANZANILLA 43

4

MATRICARIA RECONOCIMIENTO PO R CCF DEL ROMERO 43 RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA SABILA 44 RECONOCIMIENTO POR CCF DE FLORES DE SAUCO 45 RECONOCIMIENTO POR CCF DE HOJAS DE TORONJIL 45 RECONOCIMIENTO POR CCF DE VALERIANA 46 PRACTICA No. 6

FENILPROPANOS (ACEITES ESENCIALES) 47

PRACTICA No. 7

TÉCNICAS GENERALES DE EXTRACCIÓN Y VALORACIÓN DE UNA DROGA: VALORACION DE ALCALOIDES DEL TROPANO, VALORACION DE RUTINA, VALORACION DE ANETOL

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PRACTICA No. 8

MARCHA FITOQUÍMICA 68

PRACTICA No. 9

PRACTICA ESPECIAL -

Pautas para la elaborac ión del informe de laboratorio 80

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PRACTICA N° 2 RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS

OBJETIVO Distinguir y clasificar los diferentes metabolitos secundarios presentes en el tejido vegetal por medio de pruebas químicas de coloración y precipitación. Consultar: Domínguez, X. A., “Métodos de Investigación Fitoquímica”, Ed.Limusa,México, 1973.Capítulo 3. MARCO TEÓRICO Metabolitos Primarios: Son los productos químicos necesarios para la vida, resultantes del metabolismo vital de todo ser vivo, son: lo s carbohidratos, los lípidos, las proteínas y los ácidos nucleicos. Metabolitos Secundarios: Otros compuestos llamados metabolitos secundarios son subproductos de rutas metabólicas normales que ocurren en ciertas especies, siendo particulares dentro de un grupo taxonómico, estado de vida o tejido presentando una distribución restringida dentro del Reino Vegetal dando origen a la quimiotaxonomía. Su ocurrencia depende de condiciones externas tales como ataques de patógenos, predadores, cambios térmicos o l umínicos, deficiencias nutricionales o presencia de otros organismos intra o interespecíficos. El metabolismo secundario es una característica fundamental de la especialización, es decir que el compuesto resultante, puede no ser importante para la célula pero sí para el organismo como un todo. Los metabolitos secundarios pueden ser bioactivos, pero no jugar un papel esencial en los procesos fisiológicos del organismo. Algunos metabolitos secundarios son “residuos bioquímicos”, es decir, productos de activ idad enzimática de substratos no apropiados o productos de destoxificación o desecho de importancia para la supervivencia y la buena condición de los organismos. Con pocas excepciones, los metabolitos secundarios pueden clasificados dentro de cinco grupos, de acuerdo con su base biosintética: fenilpropanos, acetogeninas, terpenoides, esteroides y alcaloides. Reconocimientos de Metabolitos: El reconocimiento de metabolitos secundarios se realiza por medio de pruebas fitoquímicas preliminares, las cuales son una prueba química de caracterización consistente en una reacción química que produce alteración rápida en la

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estructura molecular de un compuesto, por ejemplo, la modificación de un grupo funcional, la apertura de un sistema anular, la formación de un ad ucto o un complejo, lo cual da por resultado una manifestación sensible como el cambio de un color, la formación de un precipitado o el desprendimiento de un gas, dándonos indicios de la presencia o ausencia de un metabolito secundario en particular. • Reconocimiento de Alcaloides: Los alcaloides son sustancias básicas que contienen nitrógeno en un anillo heterocíclico, son derivados de aminoácidos, presentan distribución taxonómica limitada y se encuentran en plantas superiores como sales de un ácido org ánico.

N

N

CH3

Nicotina

Atendiendo a su solubilidad, propiedad empleada para extraerlos y purificarlos, la base del alcaloide es soluble en solventes orgánicos y pueden formar sales solubles en solventes polares cuando se encuentra en ácidos minerales diluidos. • Reconocimiento de Flavonoides:

O

OH

(+)-Catequina

Los Flavonoides son compuestos polifenólicos con quince átomos de carbono, cuya estructura consta de 2 anillos de benceno unidos por una cadena lineal de tres carbonos. El esqueleto de los flavonoides se representa por el sistema C6 – C3 – C6. • Reconocimiento de Cardiotónicos: Una aglicona cardiotónica, estructuralmente esta constituida por el sistema anular esteroidal (ciclo pentano perhidrofenantreno) con los grupos metilos C–18 y C-19,

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un grupo hidroxilo en el carbono 3 y un anillo lactónico α-β insaturado de cuatro carbonos unido al carbono 17 del núcleo esteroidal.

3

O

CH3

OHCH3

OH

O

O

OCH3

OH

OH

Digoxin

Estas agliconas toman el nombre de cardenólidas por presentar acti vidad estimulante sobre el músculo cardiaco, cuando están en forma de glicósidos. • Reconocimiento de Saponinas: Las saponinas son un grupo de glicósidos solubles en agua, que tienen la propiedad de hemolizar la sangre y disminuir la tensión superficial d el agua, formando espuma abundante. Las saponinas por hidrólisis se desdoblan en carbohidratos y una aglicona llamada sapogenina.

CH3

CH3

OH

O

CH3O

CH3

Diosgenina

La sapogenina puede tener el sistema anular esteroidal o el de un triterpeno pentacíclico. Los anillos E y F de la saponina estereoidal conforman el llamado sistema espirostanal. El en lace glicosídico siempre se forma con el oxigeno del carbono 3.

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• Reconocimiento de Cumarinas: Las cumarinas son un grupo muy amplio de principios activos fenólic os y tienen en común la estructura química de 1 -benzopiran-2-ona. Se caracterizan porque presentan fluorescencia bajo la luz ultravioleta a 365 nm.

O O • Reconocimiento de Taninos: Los taninos son productos de excreción de muc has plantas, involucrados en mecanismos de defensa de las mismas, contra organismos parásitos. Se encuentran más comúnmente en hojas, ramas y debajo de la corteza. Químicamente los taninos son polímeros de polifenoles, sustancias con alto peso molecular (comprendido entre 500 a 3000), se clasifican en: Taninos Hidrosolubles o Pirogálicos: Son ésteres fácilmente hidrolizables formados por una molécula de azúcar (en general glucosa) unida a un número variable de moléculas de ácidos fenólicos (ácido gálico o su dímero, el ácido elágico). Son comunes de observar en plantas Dicotiledóneas.

O

OH

OH

OH

OH

O

COOH

OH OH

OH

Ác. Gálico

Ác. Elágico

OOH

OH OH

OH

OH

Leucoantocinidina

Flavan 3,4-diol

Leucopelargonidin

Taninos no Hidrosolubles ó Condensados : Tienen una estructura química similar a la de los flavonoides. Por hidrólisis dan azúcar y ácido elági co, algunos taninos condensados son conocidos como pro -antocianidinas porque por hidrólisis ácida producen antocinidinas y leucoantocinidinas.

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• Reconocimiento de Esteroides y/o Triterpenoides:

CH3

CH3

CH3 CH3

CH3

OH

CH3

Ergosterol

Los esteroides son compuestos cuya estructura presenta el sistema anular del ciclopentano perhidrofenantreno, metilos en los carbonos 10 y 13 y un radical lineal en el carbono 17. • Reconocimiento de Quinonas: Las quinonas son dicetonas cíclicas insaturadas que por reducción se convi erten en polifenoles, siendo reversible esta reacción. Las quinonas derivan su nombre del miembro más simple de la serie: la p -benzoquinona obtenida en 1838 por Woskresensky, como producto de oxidación del ácido quínico.

O

OAntraquinona

Las quinonas, por el sistema aromático que dan al reducirse se pueden clasificar en Benzoquinonas, Naftoquinonas, Antraquinonas (las más numerosas) y Fenantroquinonas (las menos numerosas). • Reconocimiento de Antocianinas: Las antocianinas son pigmentos fla vonoides que se comportan como indicadores ácido – base debido al proceso:

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HO-

H+

HO-

H+

O+

OH

OH

OH

OH

pH < 3

Catión cianina

OOH

OH

OH

O

pH 8.5

Base cianina

OOH

OH

O-

O

pH > 11

Anión cianina

Pelargonidina

Estos pigmentos suelen presentarse en forma de glucósidos, lo que explica su solubilidad en agua y la fácil extractabilidad por solventes acuosos. Se encuentran en la savia de las plantas, y a menudo en forma de sólidos amorfos o cristalinos en las hojas de tejido leñoso y frutos. Su color esta algunas veces enmascarado pro otros pigmentos, como la clorofila. Procedimiento Experimental 1. Recolectar y preparar las muestras frescas 2. Reconocimiento de alcaloides Desmenuzar finamente en un mortero, unos 10 g. de muestra fresca y colocarlos en un erlenmeyer. Añadir un volumen suficiente de HCl al 5% para que toda la muestra esté en contacto con la solución ácida. Calentar con agitación al baño maría durante unos 5 minutos. Enfriar. Filtrar. Colocar en 4 tubos de ensayo 2 ml de filtrado ácido frío. Añadir a cada uno 2 gotas de los reactivos de Dragendorff, Mayer, Valser y Reineckato de amonio. Si se observa turbidez o precipitados en por lo menos 3 tubos, se considera que la muestra contiene alcaloides. Nota: antes de realizar el ensayo con la muestra biológica, ensayar con un estándar de quinina en solución ácida. 3. Reconocimiento de Flavonoides. Leucoantoc ianidinas y Cardiotónicos En un erlenmeyer colocar unos 10 g. de muestra fresca finamente desmenuzada. Añadir un volumen suficiente de alcohol etílico que cubra toda la muestra y le confiera fluidez. Calentar al baño maría durante unos 5 minutos, con agita ción. Enfriar. Filtrar. Si hay presencia de clorofilas, al filtrado añadirle un volumen igual de solución de acetato de plomo al 4% que contenga ácido acético al 0.5 %,

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agitar, dejar reposar 15 minutos y filtrar. Con el filtrado realizar ensayos de reconocimiento de flavonoides, leucoantocianidinas y cardiotónicos. a) Ensayo para flavonoides Colocar varias limaduras de magnesio en un tubo de ensayo. Añadir unos 2 ml del filtrado y por la pared del tubo, gota a gota dejar caer varias gotas de HCl concentrado. La aparición de colores naranja, rosado, rojo o violeta es prueba positiva para la existencia de flavonoides en la muestra. Nota: antes de realizar el ensayo con la muestra biológica, ensayar con un estándar de rutina o quercetina en solución acuo -alcohólica. b) Ensayo para Leucoantocianidinas Colocar unos 2 ml del filtrado en un tubo de ensayo. Añadir 1 ml de ácido clorhídrico concentrado. Calentar en baño de agua hirviendo durante 15 minutos. La aparición de coloraciones rojas es prueba positiva d e la existencia de leucoantocianidinas en la muestra. c) Ensayo para Cardiotónicos En un tubo de ensayo colocar 1 ml de filtrado. Añadir 0.5 ml de Reactivo de Kedde (mezclar 1 ml de solución A con 1 ml de solución B para preparar este reactivo antes de su uso). La aparición de coloraciones violetas o púrpuras es prueba positiva de la existencia de cardiotónicos en la muestra. 4) Ensayo para saponinas Desmenuzar con ayuda de un mortero unos 10 g de muestra fresca, con ayuda de unos pocos ml de agua. Filtr ar. Agitar en un tubo de ensayo tapado, unos 4 ml de filtrado acuoso, vigorosamente durante un minuto. La formación de una espuma abundante y estable es prueba presuntiva de la presencia de saponinas en la muestra. 5) Ensayo para taninos Desmenuzar con ay uda de un mortero unos 10 g de muestra fresca, con ayuda de unos pocos ml de agua. Filtrar. Tomar 1 mL de filtrado acuoso en un tubo de ensayo. añadir 1 ml del Reactivo Gelatina -Sal. Si se forma un precipitado, centrifugar a 2000 RPM durante 5 minutos. Des echar el sobrenadante. Redisolver

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el precipitado en 2 mL de Urea 10M. Añadir 2 -3 gotas de solución de cloruro férrico al 10%. La formación de precipitado al agregar el reactivo de gelatina, y la aparición de colores o precipitados verdes, azules o negros e s prueba positiva de la presencia de taninos en la muestra. 6) Ensayo para Triterpenoides y/o esteroides Moler la muestra vegetal seca. Agregar un volumen suficiente de cloroformo o diclorometano y extraer por agitación. Filtrar. Si el filtrado es turbio contiene humedad, secarlo agregando sulfato de sodio anhidro y filtrar. En un tubo de ensayo limpio y completamente seco, colocar 1 ml de filtrado orgánico. Añadir 1 ml de anhídrido acético. Por la pared del tubo y con mucha precaución, dejar resbalar 1-2 gotas de ácido sulfúrico concentrado. La formación de colores azules, violetas, rojos o verdes es prueba positiva de que la muestra contiene Esteroides y/o Triterpenoides. 7) Ensayo para Quinonas Ensayo con una fracción : Colocar en un tubo de ensayo unos 5 ml de filtrado acuoso. Añadir 1 ml de peróxido de hidrógeno al 20% y 1 ml de ácido sulfúrico al 50%. Calentar la mezcla en un baño de agua hirviendo durante 15 minutos. Enfriar. Añadir 5 ml de tolueno. Agitar sin emulsionar. Recuperar la fase toluénica. Trasvasar 2 ml fase toluénica a un tubo de ensayo. Añadirle 1 ml de una solución de NaOH al 5% con amoniaco al 2%. Agitar sin emulsionar. Si la capa acuosa toma una coloración rosada a roja intensa es prueba positiva de la presencia de quinonas en la mues tra. Ensayo directo: Colocar 5 g de muestra fresca (ó 1 g de muestra seca y molida), en un sistema de reflujo, agregar 25 ml de HCl 5%. Reflujar 5 minutos. Dejar enfriar y filtrar. Con el filtrado acuoso proceder como se describe para el ensayo con una fracción acuosa.

8. Reconocimiento de Antocianinas En un erlenmeyer colocar unos 100 g. de muestra fresca finamente desmenuzada. Añadir unos 200 ml de agua. Calentar a ebullición durante unos 5 minutos. Filtrar.

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Ensayo En un tubo de ensayo colocar 2 ml de f iltrado. Añadir 1 ml de NaOH diluido. Observar el color formado. En otro tubo de ensayo colocar otros 2 ml de filtrado. Añadir unas 6 gotas de un ácido mineral diluido. Observar el color formado. - Las antocianinas se reconocen por producir diferentes color es a diferentes pH. 9. Reconociemiento de Cumarinas. En un tubo de ensayo grande colocar 1 g de material vegetal fresco y macerado y agregar cantidad suficiente de etanol comercial que cubra el material vegetal. Cubrir la boca del tubo de ensayo con un pa pel filtro blanco y sujetarlo con unas pinzas para tubo de ensayo o con una banda elástica. Agregarle unas gotas de NaOH diluido en el papel filtro que cubre la boca del tubo de ensayo. Calentar hasta ebullición el tubo de ensayo por 5 minutos, enfriar y r etirar el papel filtro. Observar bajo luz ultravioleta a 365 nm la aparición de una coloración fluorescente que puede ser: verde, amarilla, roja en el papel filtro. Nota: El papel filtro normalmente se observa azul fluorescente bajo la luz ultravioleta de 365 nm. Plantas con alcaloides: Datura sp. (borrachero), hojas y flores. Catharantus roseus (cortejo), hojas. Hojas de tabaco, té. Plantas con flavonoides: Pétalos de rosas rojas y amarillas. Pétalos de lirio africano. Plantas con saponin as: Hojas de Agave sp.(penca sábila). Fruto de Solanum quitoense (lulo). Cáscara de Dioscorea ssp. (ñame). Plantas con taninos: Hojas de plantago (llantén). Hojas de guayaba Té (Thea sinensis ), hojas. Uvas (Vitis vinifera ). Plátano o guineo (Musa ssp.). Agallas de alepo (Querquis ssp. ). Corteza de casco de vaca ( Bahuinia picta ). Plantas con esteroides: Semillas de Glicine max (soya). Aceite de oliva (Olea europeae ). Plantas con cardiotónicos: Azuceno de la habana, hoj as. Plantas con antocianinas: Repollo morado.

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Hojas de guardaparque. Moras. Uvas sin hollejo. Plantas con quinonas: Ruibarbo (rizomas) 6. Reactivos y materiales necesarios por grupo 150 ml HCl al 5% 1 ml peróxido de hidrógeno al 20% 50 ml Acetato de plomo al 4% con ácido acético al 0.5% 2 ml Urea 10M gotas de FeCl3 al 10% 2 ml de ácido sulfúrico al 50% 2 ml de solución NaOH al 5% con amoniaco al 2% R. Dragendorff, Valser, Mayer y Reineckato de amonio. R. gelatina-sal R. Kedde soluciones A y B 200 ml etanol 50 ml diclorometano 5 ml benceno 2 ml anhídrido acético Acido sulfúrico concentrado Acido clorhídrico concentrado 5 papeles de filtro limaduras de magnesio sulfato de sodio anhidro centrifuga 2000 RPM y 2 -4 tubos cuchillo.

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Práctica 3 TÉCNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO, SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN

(CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Y EN COLUMNA)

OBJETIVOS • Seleccionar de una serie eluotrópica el eluente que mejor separe los

carotenoides presentes en diferentes muestras vegetales. • Con el mejor eluente, fraccionar cromatográficamente el extracto de

carotenoides, hasta aislar compuestos puros y caracterizarlos por métodos de coloración, cromatográficos y espectrales.

• Identificar los carotenoides presentes en el material vegetal asignado para análisis.

BASE DEL MÉTODO La muestra aplicada en la fase estacionaria es adsorbida en la superficie del material por la acción de fuerzas electrostáticas (fuerzas de Van der Waals, puentes de Hidrógeno, efectos inductivos, etc.) y para su posterior liberación de acuerdo a la constante de afinidad de por los constituyentes de la muestra por la fase móvil. MARCO TEÓRICO

CROMATOGRAFÍA

La cromatografía (chromo= color y graphie=escritura, escribir en colores) fue inventada el 1903 por el botánico ruso Mikhail Tswe tt. Ismailov y Scraiber utilizaron láminas de vidrio para colocar capas muy delgadas de alúmina y luego aplicaron extractos vegetales, dando así la primera forma de cromatografía de capa fina. Egon Stahl (1956) dió el nombre de cromatografía de capa fina, estandarizó los procedimientos, equipos y adsorbentes dando un auge a esta técnica simple, económica y eficiente.

TERMINOLOGÍA • Fase Estacionaria (Adsorbente)

Es una de las dos fases que forman un sistema cromatográfico. Puede ser un sólido, un gel o un lí quido. Si es un líquido, puede estar distribuido en un sólido, el cual puede o no contribuir al proceso de separación. El líquido puede también estar químicamente unido al sólido (Fase Ligada) o inmovilizado sobre él (Fase Inmovilizada). Los adsorbentes má s utilizados son

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• Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones) • Óxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó básica) • Tierra Silícea ó Kieselguhr • Celulosa (Nativa o micro -cristalina) • Poliamidas.

Estos sorbentes varian en tamaño de partícula, día metro del poro, homogeneidad y pureza.

• Fase Móvil (eluente) Es el fluido (solvente o mezcla de solventes) que se filtra a través o a lo largo del lecho estacionario (fase estacionaria), en una dirección definida. Puede ser un líquido (Cromatografía Líquid a), un gas (Cromatografía de Gases) o un fluido supercrítico (Cromatografía con Fluido Supercrítico). Cuando se utiliza un líquido como fase móvil mediante una serie eluotrópica (Tabla 1) se escoge la mejor combinación de solventes miscibles para una buena separación cromatográfica de una muestra en sus componentes.

Tabla 1. Serie eluotrópica de solventes Hidrocarburos «ligeros» (éter de petróleo, hexano, heptano. etc.) Ciclohexano Tetracloruro de carbono Tricloroetileno Tolueno Benceno Diclorometano Cloroformo Eter etílico Acetato de etilo Acetona n-Propanol Etanol Metanol Agua

• Muestra Mezcla consistente en cierto número de componentes, cuya separación se pretende en el lecho cromatográfico al ser arrastrados o eluidos por la fase móvil.

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• Componentes de la Muestra Los constituyentes químicamente puros de la muestra. Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es decir, no retardados), retenidos parcialmente (es decir, eluidos a tiempos diferentes) o retenidos permanentemente.

CLASIFICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA Clasificación de acuerdo a la forma del lecho cromatográfico § Cromatografía en Columna § Cromatografía Plana

Clasificación de acuerdo al estado físico de la fase móvil § Cromatografía de Gases (GC) § Cromatografía Líquida (LC) § Cromatografía con Fluido Supercrítico (SFC)

Clasificación de acuerdo al mecanismo de separación § Cromatografía de Adsorción § Cromatografía de Reparto § Cromatografía de Intercambio Iónico § Cromatografía de Exclusión § Cromatografía de Afinidad

Técnicas especiales § Cromatografía con Fase Invertida § Cromatografía con Fase Normal § Análisis Isocrático § Elusión con Gradiente § Cromatografía Bidimensional

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA (CC) Es una técnica de separación en la que el lecho estacionario está contenido dentro de un tubo de vidrio vertical. La muestra es aplicada líquida o sólida (adsorbida por fase la estacionaria). Posteriormente se agrega el eluente por la parte superior del tubo cromatográfico y se recogen volúmenes definidos por el analista de eluente luego de ser eluído por el tubo cromatográfico, separando una muestra en sus componentes como se ilustra en la figura 1:

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Figura 1. Diagrama de una cromatografía en columna.

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (CCF) Es la técnica de separación en la qu e la fase estacionaria está sobre un plano formando una capa de partículas sólidas extendida sobre un soporte, tal como una placa de vidrio o aluminio ((Thin Layer Chromatography, TLC), la muestra es aplicada en puntos o en banda, para posteriormente ser e luída dentro de un tanque cromatográfico como se ilustra en la figura 2.

Marca defin

Marca deinicio Muestra Eluente

Figura 2. Diagrama de una cromatografía en capa fina

Recolector de fracciones

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Si los componentes de la muestra (manchas) no son coloreados, se requiere de métodos que nos permitan visualizarlos componente presentes. Este procedimiento también se conoce este como “revelado de la placa”. El revelado de las placas se puede realizar mediante dos métodos:

• Método químico (por inmersión o rociado de reactivos coloreantes). Se obtienen derivados coloreados o fluo rescentes de los componentes de la muestra.

• Método físico (ópticos). Generalmente se utiliza mediante la radiación con luz UV a la placa cromatográfica a 254nm y/o 365nm.

La cromatografía en capa fina como método cualitativo y cuantitativo, siempre requiere contar con un estándar de referencia para comparar su valor de factor de retardo (Rf) y el color de la mancha del estándar al ser revelada con agentes químicos, con los datos experimentales obtenidos. El factor de retardo (Rf) es un valor relativo par a cada sustancia y depende de las condiciones cromatográficas con que se haya trabajado (fase móvil, fase estacionaria, eluente y el tiempo de saturación). Se define como el cociente entre la distancia recorrida por el centro de la mancha y la distancia re corrida simultáneamente por la fase móvil como se ilustra en la figura 3.

Distanciarecorrida porla fase móvil(X)

Destancia recorridapor cada muestra

a

b

c

Figura 3. Factor de retardo de una muestra.

Rf para la mancha 1 = a / X Rf para la mancha 2 = b / X Rf para la mancha 3 = c / X Los valores de Rf siempre son menores o iguales a uno (Rf = 1).

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CAROTENOIDES Los tetraterpenoides más conocidos son los pigmentos liposolubles amarillos -rojos denominados carotenoides, los cuales se encuentran ampliamente distribuidos en el reino vegetal y en diversos tipos de tejidos. Se conocen al go más de 400 carotenoides. A los pigmentos hidrocarbonados se les denomina CAROTENOS, y a los oxigenados XANTOFILAS. Se conocen también tetraterpenos incoloros como el fitoeno y el fitoflueno, pero han sido menos estudiados que los carotenoides. La única diferencia estructural entre los tetraterpenoides coloreados e incoloros es el mayor número de enlaces dobles conjugados en los primeros. Los tetraterpenoides, a diferencia de otras clases de terpenoides, no poseen sistemas anulares complejos y son acíclic os, mono- o biciclicos. Los miembros acíclicos contienen básicamente el siguiente esqueleto:

Debe notarse que la molécula es simétrica a cada lado de la línea punteada y puede racionalizarse como la unión de dos radicales diterpénicos tipo fitilo. Las variaciones se introducen por enlaces dobles y grupos funcionales tales como hidroxilos, epóxidos, carboxilos, etc. A medida que se aumenta el número de enlaces dobles se incrementa la posibilidad de isomerismo CIS-TRANS, y muchos de los problemas de la q uímica de los carotenoides proviene de la dificultad para distinguir y separar isómeros geométricos de este tipo. La mayoría de los carotenoides nativos son todo trans, y al nombrarlos se asume por defecto que tienen la configuración trans a menos que se c ite la geometría cis. La ciclización puede ser a uno o ambos lados de la cadena. Cuando solo hay ciclización en uno de los extremos se les denomina carotenoides del tipo IONONA:

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Algunos pigmentos como la bixina y la crocetina tienen menos de 40 carbono s pero se clasifican como carotenoides porque las peculiaridades de su estructura sugieren que se derivan de la degradación de carotenoides, en lugar de producirse a partir de unidades más pequeñas. Los apo -carotenoides son compuestos C -27 o C-30 derivados probablemente de la degradación de Xantofilas. Hasta el momento no ha sido asignada ninguna función general a los carotenoides. Existen indicios de que son receptores de luz para el fototropismo. Como los pigmentos florales podrían participar en la atracc ión de insectos, pero principalmente se cree que funcionan como pigmentos de cloroplastos de las hojas. Hasta cierto grado la luz absorbida por los carotenoides puede transferirse a la ferredoxina o la clorofila, donde es usada para la fotosíntesis. Tambié n se tienen evidencias de que los carotenoides protegen a la clorofila contra la fotodestrucción por luz de corta longitud de onda p. ej: Longitudes de onda cercanas a 400 nm donde tanto las clorofilas como los carotenoides absorben intensamente. Las plant as albinas carecen de carotenoides y clorofilas bajo condiciones normales de crecimiento, pero bajo luz débil son capaces de acumular clorofila. En condiciones normales de luz la clorofila se destruye rápidamente porque los carotenoides no están presentes para protegerla. El carotenoide más ampliamente distribuido es el ? -caroteno, el cual constituye casi el 0.1% de las hojas verdes secas. La luteína es la xantofila más importante de hojas y puede encontrarse en mayores concentraciones que el ? -caroteno. La mayoría de carotenoides tienen la misma cadena central del ? -caroteno y difieren solamente en las porciones correspondientes a los dos anillos.

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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL REACTIVOS Y MATERIALES NECESARIOS POR GRUPO • 30g de muestra vegetal fresca triturada o rallada (Tomate de aliño rojo,

Pimentón verde-rojo, zanahor ia, Pimentón rojo, ahuyama, mango cáscara roja, pasta de tomate, salsa de tomate, espinacas, etc.)

• Erlenmeyer 250 ml • Sílica gel para columna • 1 columna de cromatografía • n-hexano puro (ó éter de petróleo) • Acetato de etilo puro • Metanol ó etanol para extraer

(destilado) • Algodón o gasa • Papel filtro • Sulfato de sodio anhidro 15g. • Capilares

• Tubos de ensayo limpios • Lápiz de grafito • Tanque para cromatografía • Baño María • Rotaevaporador • Mortero con pistilo • Licuadora • Espectrofotómetro UV -Visible • Etanol puro 50mL.

NOTA= Consultar los carotenoides presentes en el material vegetal asignado para esta práctica y su color antes de ir a la sección de clase.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL OBJETIVOS

• Seleccionar de una serie eluotrópica , el eluente que mejor separe los carotenoides presentes en diferentes muestras vegetales.

• Con el mejor eluente, fraccionar cromatográficamente el extracto de carotenoides, hasta aislar compuestos puros y caracterizarlos por métodos de coloración, cromatográficos y espectrales.

• Conocer otros sistemas cromatográficos para la separación de carotenoides.

a. Deshidratación En un erlenmeyer seco se colocan unos 30 g. de tejido fresco triturado finamente en un mortero. Se añade un volumen suficiente de etanol al 95% para que recubra la muestra. Se cal ienta a ebullición sobre un baño maría durante 5 minutos. Se

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filtra en caliente con un algodón, procurando que la masa semisólida quede libre del solvente. b. Extracción A la masa semisólida se adiciona un volumen suficiente de diclorometano (también puede usarse cloroformo) en una campana de extracción y se remueve con una varilla de vidrio para que el solvente extraiga los carotenoides . Debe tenerse precaución con el manejo de estos solventes pues son bastante volátiles y algunos son muy tóxicos. El extracto se filtra. El residuo sólido se puede reextraer varias veces con el fin de obtener el mayor rendimiento posible. Los extractos filtrados se juntan, se trasvasan a un embudo de separación y se añade si es necesario un volumen de solución de NaCl satur ada. La fase orgánica se recupera, se seca con sulfato de sodio anhidro y se filtra. El filtrado con los carotenoides se concentra hasta un volumen aproximado de 5 ml, mediante aplicación de calor suave (40 -50 °C) y vacío. El extracto concentrado de carotenoides se tapa y se guarda para protegerlo de la luz, la humedad, el calor y el aire. c. Selección de otra fase móvil El extracto de carotenoides se a nalizar por CCF con la serie eluotrópica siguiente:

• n-Hexano • n-Hexano/Acetato de Etilo 4:1 • n-Hexano/Acetato de Etilo 2:1 • n-Hexano/Acetato de Etilo 1:2 • n-Hexano/Acetato de Etilo 1:4 • Acetato de etilo

Utilizar como reveladores en su orden los siguientes, dibujando lo más precisamente posible, y anotando en cada caso las observaciones como colores, fluorescencia, manchas:

• A simple vista • Luz UV 254 nm • Luz UV 366 nm • Vapores de yodo

d. Fraccionamiento cromatográfico y análisis espectral Con el mejor eluente seleccionado previamente , proceder a realizar el fraccionamiento a escala mayor

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del extracto por cromato grafía en columna CC ó cromatografía en capa preparativa CCP. Las fracciones coloreadas se recogen (ó se raspan en el caso de la CCP), se enumeran y se les determina su espectro visible en el rango de 3 50 a 550 nm. Es importante tener en cuenta que para de terminar el espectro cada compuesto debe estar disuelto en hexano, y no tener residuos de otros solventes. La Tabla 2 muestra los Rf y los máximos de absorción (en éter de petróleo) de varios carotenoides comunes. La figura 2 muestra el espectro visible d el licopeno obtenido de una muestra de tomate rojo.

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Tabla 2. Valores Rf y máximos de absorción de varios carotenoides

CAROTENOIDE Rf SISTEMA1 MÁXIM0S ABSORCIÓN (nm)

α-Caroteno 0.80 1 422, 444, 473 β-Caroteno 0.74 1 425h, 451, 482 γ-Caroteno 0.41 1 437, 462, 494 ε-Caroteno 0.84 1 419, 444, 475 Licopeno 0.13 1 446, 472, 505 Luteína 0.35 2 420, 447, 477

Zeaxantina 0.24 2 423, 451, 483 Violaxantina 0.21 2 443, 472 Criptoxantina 0.75 2 425, 451, 483 Capsantina 0.16 2 ---------------- Neoxantina - - 415, 437, 466 Rubixantina - - 432, 462, 494 Fucoxantina - - 425, 450, 478

Figura 2. Espectro Visible del Licopeno obtenido de tomate rojo

1 Sistema 1: Benceno/Eter de petróleo 9:1, Sistema 2: Diclorometano/Acetato de etilo 4:1

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INFORME Debe incluir nombre vulgar y científico de la muestra analizada, parte de la planta analizada, familia vegetal, análisis de los valores Rf y los espectros visible comparándolos con los reportados en la literatura. Informar cuáles carotenoides se logró identificar. Reactivos y materiales necesarios por grupo Muestra vegetal fresca triturada o rallada (Tomate de aliño rojo, pimentón verde-rojo, zanahoria, pimentón rojo, ahuyama, mango, pasta de tomate, salsa de tomate, etc.) Erlenmeyer 250 ml Sílica gel para columna 1 columna de cromatografía N-hexano puro (ó éter de petróleo) Acetato de etilo puro Etanol para deshidratar Algodón Papel filtro Sulfato de sodio anhidro 15 g. Capilares Tubos de ensayo limpios y secos reactivo de Carr —Price Lápiz de grafito Frasco para cromatografía Rotavapor Mortero con pistilo Licuadora Espectrofotómetro UV -Vísible Bibliografía 1. Robinson T., "The Organic Constituents of Higher Plants", 5th. ed., Cordus Press, North Amherst MA U.S.A., 1983. Pp. 162 -5. 2. Harborne J.B., "Phytochemical Methods", Chapman & Hall, 1973, 119 -128 pp. 3. Stahl E., “Thin layer Chromatog raphy, 1969. 1.Merck Co. Inc., Reactivos de coloración para cromatografía en capa fina y en

papel.

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2. Dalmases, P., Bonet, J. J., “Técnicas de Cromatografía Líquido -Sólido en Columna”, Afinidad 111 -126 (1984).

Cromatograma CCF de un extracto de carotenoide s del pimentón (sílica gel, n-hexano/acetato de etilo 4:1)

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Práctica 4 RECONOCIMIENTO DE ADULTERACIONES Y/O FALSIFICACIONES

(OBSERVACIÓN DE DROGAS PULVERIZADAS) El planteamiento sistemático de la identificación de drogas en polvo puede realizarse por var ios caminos; sin embargo, cuando se trata de drogas organizadas, todos los métodos dependen del reconocimiento microscópico de los tipos celulares característicos, así como de los contenidos de las células. Cuando se trata de una mezcla de drogas es impres cindible una mayor experiencia y práctica. Cuando se ha realizado un tanteo de la identificación, deben llevarse a cabo posteriores observaciones y ensayos químicos confirmativos; la mayoría de las drogas de farmacopea, poseen en la actualidad ensayos para su reconocimiento mediante cromatografía de capa fina (CCF). ENSAYOS PRELIMINARES: 1. ANOTAR EL COLOR.

Blanco: gomas arábiga, tragacanto. Amarillo: regaliz, jengibre, escila. Marrón claro: Ipecacuana, nuez vomica, opio, hinojo, genciana, cilantro, cardamomo, lino. Castaño canela: canela. Castaño oscuro: clavo, sábila. Rojo: quina. Anaranjado: ruibarbo Verde: sen, digital, estramonio.

2. ANOTAR EL OLOR.

Los siguientes son especialmente característicos: Jengibre, hinojo, genciana, opio, cilantro, cardamomo, canela, clavo, nuez moscada.

3. ANOTAR EL SABOR:

Aromático: Cilantro. cardamomo, canela, clavo. Aromático y picante: Jengibre.

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Amargo: cuasia, genciana, áloes, quina, escila. Dulce: regaliz. Astringente: catecú.

4. Mezclar una pequeña cantidad de polvo con unas gotas de agua y abandonarlo un tiempo. Los extractos acuosos y jugos concentrados como el aloe se disuelven casi completamente, mientras se pone de manifiesto la naturaleza gomosa o mucilaginosa de drogas como l a goma arábiga, tragacanto y semillas de lino.

5. Mezclar una pequeña cantidad de polvo con ácido sulfúrico diluido, si existe carbonato cálcico (tiza) tiene lugar una efervescencia seguida de disolución.

6. Comprimir una pequeña cantidad de polvo entre pa pel de filtro. Una mancha oleosa, que se extiende pero que persiste cuando el papel es calentado en una estufa aparece cuando los polvos contienen aceite fijo (Ej.: lino, maní, etc). El aceite esencial desaparece por calentamiento en estufa. (todos los aromáticos)

7. Agitar una pequeña cantidad de polvo en un tubo de ensayo lleno de agua hasta la mitad y si aparece espuma abundante sospechar la presencia de drogas saponinas como el clavo, nuez moscada; hervir suavemente y advertir el olor si hay desprendimi ento de aceite esencial. Filtrar y dividir en dos porciones que pueden ser ensayadas respecto a taninos y derivados antraquinónicos de la siguiente manera:

a) Ensayo de taninos: Se agregan gotas de FeCl 3 muy diluido, se producen coloraciones que van desde el azul oscuro hasta el negro pasando por el verde oscuro. También se puede realizar la prueba de la gelatina; en la que precipitan los taninos al agregar una solución de gelatina al 1% que contenga 10% de cloruro sódico.

Ausencia de taninos: pimienta, j engibre, cuasia, estrofanto. Presencia de taninos: borraja. salvia, ratania, canela, quina, clavo y ruibarbo.

b) Ensayo de antraquinonas:

Mediante la agitación del extracto acuoso con HCl diluido, y calentamiento para producir la hidrólisis, las antraqui nonas liberadas se extraen con tolueno y dan un color rosa-rojo cuando la solución se agita con amoniaco diluido. Positivo para: áloes. ruibarbo, cáscara sagrada, sen.

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA

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Si los ensayos preliminares han demostrado que la droga se d isuelve en agua, deben realizarse ensayos con otros líquidos, como alcohol, aceite de oliva, hasta que se encuentre uno en el que la droga sea insoluble. En la mayoría de los casos, sin embargo, puede adoptarse el siguiente procedimiento: 1. OBSERVACION DE ALMIDON

Montar placa en agua, observar y dibujar cualquier gránulo que se observe y ensayar si se trata de almidón o no mediante adición de agua de yodo.

2. OBSERVACIÓN DE TRICOMAS EPIDERMICOS Y OXALATO DE CALCIO

Montar en hidrato de cloral (disuelve almidón, proteínas, clorofila,, resinas, aceites esenciales y produce la expansión de células retraídas), hervir suavemente hasta que clarifique y observar. Para estar seguro de que el oxalato cálcico, no ha pasado inadvertido, debe utilizarse luz polariza da.

OBSERVACIÓN DE LIGNINA Humedecer el polvo con una solución alcohólica de floroglucina (1% en etanol del 90%) y dejarlo hasta que casi se seque. Añadir HCl concentrado, poner cubreobjetos y observar. Adviértase la presencia o ausencia de vasos lignific ados, fibras, parénquima, esclereidas, pelos. Si los vasos o fibras no se tiñen de rojizo, sospechar presencia de jengibre o ruibarbo. De los ensayos preliminares y de los tres montajes anteriores se obtendrá una considerable información. El examen puede c ontinuarse mediante la aplicación de otros ensayos microquímicos: Cloro yoduro de cinc (Reactivo de Schultze); ensayo para paredes de celulosa. Por lo general es conveniente desengrasar los polvos grasos, decolorar los fuertemente coloreados y preparar una fibra bruta cuando contienen mucho almidón. La aplicación de los conocimientos de anatomía de los órganos vegetales en que se presentan las drogas hará posible el reconocimiento. Esto deberá ampliarse con la utilización de referencias o tablas de caracter es diagnósticos de drogas en polvo. La identidad de un polvo no ha de considerarse como establecida hasta que haya sido comparada con uno de reconocida autenticidad. TABLAS RECOMENDADAS:

• Wallis y Mirimanoff.

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• Jacksori Snowcson; Powered Vegetable Drugs. Londres: Thornes (1968) DROGA CARACTERÍSTICAS Aloé Presencia: Montado en lactofenol, muestra fragmentos

amarillentos o cristales aciculares. Parcialmente soluble en agua y completamente soluble en alcohol al 60%. Confirmar con ensayos químicos.

Ausencia: Tejido vegetal, almidón, Oxalato de Calcio. Lino Presencia: Células epidérmicas isodiamétricas . colénquima,

esclerénquima lignificado, células pigmentadas poligonales con contenido pardo -rojizo, abundancia de aceite y granos de aleurona 3-18 microgramos. Ausencias almidón, vasos y súber

Presencia de Oxalato de Calcio y ausencia de almidón y pelos epidérmicos:

• clavo • cilantro • alcaravea • escila • cáscara de naranja y limón.

Presencia de pelos epidérmicos, ausencia de almidón y oxalato de calcio: • nuez vómica • hoja de digital • catecú • lobelia • azafrán

Presencia de almidón, ausencia de oxalato de calcio y pelos epidérmicos. • tragacanto • nuez moscada • jengibre • valeriana

Presencia de pelos y oxalato de calcio, ausencia de almidón. • hojas de sen • estramonio • beleño • anís • hammamelis

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• manzanilla romana Presencia de oxalato de Calcio y almidón, ausencia de pelos epidérmicos. a) Detección de vasos lignificados con floroglucina y HCl si los hay.

• cuasia • regaliz • jalapa

si no los hay • ruibarbo • cardamomo • canela

b) Presencia de esencias en c ardamomo y canela. En general:

• semillas de cardamomo • cuasia • ruibarbo • regaliz • rawolfia • ipecacuana • genciana • canela

• cáscara sagrada • quina • podofilo • cerezo • quilaya • ratania • jalapa

BIBLIOGRAFIA:

1. Evans, W. C. "Farmacognosia. Trease -Evans". 13a Ed. Interamerica na McGraw Hill, Madrid -Auckland-Bogotá, 1991.

2. Gattuso, M.A.; Gattuso, SJ. "Manual de procedimiento para el análisis de

drogas de drogas en polvo", UNR Editora, Rosario, 1999. Cyted.

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Análisis microscópico de algunas drogas Observaciones:

• Las fotografías son tomadas a placas montadas con fluoroglucina/HCl, vistas con ocular 6.3X

• Solo para montar la placa de lino: presionar con el cubreobjetos hasta lograr que el material quede como una delgada capa

• La observación de diferentes estructuras de una mis ma planta algunas veces requiere el montaje de varias placas.

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Bibliografía

• Deyson, G. Caractères analytiques des poudres végétales. Paris, CDU et

SEDES réunis, 1976 • Evans, W. C. "Farmacognosia. Trease -Evans". 13a Ed. Interamericana

McGraw Hill, Madrid -Auckland-Bogotá, 1991. • Gattuso, M.A.; Gattuso, SJ. "Manual de procedimiento para el análisis de

drogas de drogas en polvo", UNR Editora, Rosario, 1999. Cyted.

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Práctica 4b

CONTROL DE CALIDAD DE PLANTAS MEDICINALES ANALISIS MACRO Y MICROSCÓPICO DE MATERIAL VEGETAL

OBJETIVO

• Identificar los diferentes marcadores taxonómicos descritos en las farmacopeas para el control de calidad de un material vegetal como materia prima para productos fitoterapéuticos utilizando agentes químicos de tinción.

• Identificar una muestra problema de material vegetal en polvo mediante sus características organolépticas, macro y microscópicas.

BASE DEL MÉTODO El análisis histoquímica del material vegetal en polvo ayuda en el proceso de control de calidad, evi denciándose la presencia de material extraño (arena), adulteraciones o falsificaciones. Este análisis es de apoyo a los demás análisis farmacopéicos. MARCO TEÓRICO El material vegetal es clasificado de acuerdo a sus características sensoriales, macroscópicas y microscópicas. Un examen para determinar estas características es en primer paso establecer la identidad y el grado de pureza del material, para después llevarse a cabo posteriores análisis. Siempre que sea posible, patrones del material o muestras d e calidad farmacopeica debe de estar disponible como referencia. Una inspección visual provee una simple y rápida medida para identificar el material, pureza y, posiblemente, calidad. Si una muestra es encontrada ser significativamente diferente, en términ os de color, consistencia, olor o textura, de las especificaciones, se considera una NO conformidad de los requerimientos. Sin embargo, los juicios deben ser cautelosos con relación al olor y la textura, debido a las diferencias que existen entre personas o por la misma persona a diferentes tiempos. Siendo entonces esta una habilidad sensorial que se afina con la experiencia. La identificación macroscópica de una planta medicinal está basada en la forma, tamaño, color, características superficiales, textur a, características al quebrarla y apariencia superficial de un corte. Sin embargo, mientras esas cualidades son juzgadas subjetivamente y sustituciones o adulteraciones pueden ser muy

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parecidas al material genuino, a menudo es necesario respaldarse en anál isis microscópicos y/o fisicoquímicos. La inspección microscópica del material vegetal es indispensable por la identificación del material quebrado o en polvo; el material debe de ser tratado con reactivos químicos. Un examen microscópico solo NUNCA prove e una completa identificación. Solo cuando esta asociado con otros métodos analíticos que frecuentemente suplen invaluable evidencia. Si la comparación con material de referencia revela algunas características no descritas en los requerimientos, estos pue den ser atribuidos a material extraño, antes que un constituyente normal.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

REACTIVOS Y MATERIALES NECESARIOS POR GRUPO • 10g de muestra vegetal fresca o seca en polvo. • 3 Porta objetos • 3 Cubre objetos • 1 microscópico por cada 3 gru pos

• Tamiz malla #20. • Reactivos de coloración

A cada grupo de estudiante se le asignará una monografía farmacopéica, la cuál deberán de analizar para el posterior desarrollo en el laboratorio de las técnicas macro y microscópicas descritas. 1. Pruebas organolépticas: Anotar el color, olor y sabor de la muestra asignada. 2. Con base en la monografía asignada y el material vegetal entregado, encontrar todos los tejidos descritos dentro de la monografía siguiendo cuidadosamente el procedimiento descrito de coloración o limpieza. Dibujar cada una de las características visualizadas al microscopio. 3. Comparar el material vegetal problema asignado con las monografías disponibles, visualizar los marcadores taxonómicos descritos y concluir. DETECCIÓN HISTOQUÍ MICA DE TEJIDO VEGETAL Y SU CONTENIDO 1. Hidrato de cloral: Una solución de hidrato de cloral (80 g de hidrato de cloral en 20

mL de agua) se utiliza como agente clarificante. Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos y agregar de 2 -8 gotas que impregnen todo el material

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoquímica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff 47vegetal y calentar suavemente. El hidrato de clorar disuelve contenido celular y sustancias extracelular (granos de almidón, granos de aleurona) y permite una mejor visualización de tejidos celulares como: pared celular, fibras, vasos, cristales de oxalato de calcio, tricomas, estomas y polen.

2. Glicerol: Se utiliza como medio para la visualizar material vegetal al microscopio y

para prevenir el secado de soluciones acuosas o de hidrato de cloral. Se agregan 2 ó 3 gotas a la muestra en el portaobjetos y se coloca el cubreobjetos.

3. Detección de concreciones de carbonato de calcio (cistolitos) y de cristales de

oxalato de calcio: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos. Verter 2 ó 3 gotas de ácido clorhídr ico 2M, con la precaución de que el reactivo esté en íntimo contacto con todos los componentes del polvo. Colocar el cubreobjetos y observar inmediatamente al microscopio a 10x. La presencia de carbonato de calcio está indicada por la aparición de burbujas . Los cristales de oxalato de calcio, que en general tardan más tiempo en disolverse, no desprenden burbujas.

4. Detección de almidón: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un

portaobjetos. Verter 2 ó 3 gotas de Solución de Lugol diluida (1:5) en agua . Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio a 10x y 40x. Los granos de almidón se colorean de azul -violáceo intenso. (Esta reacción en reversible al ser calentado el portaobjetos)

5. Detección de lípidos y aceites esenciales: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo

sobre un portaobjetos. Verter 2 ó 3 gotas de solución de Sudan III (0.5 g Sudan III calentados a reflujo en etanol o isopropil alcohol) y dejar actuar durante 2 ó 3 minutos. Escurrir el líquido y lavar bien con alcohol 70 %. Colocar el cubr eobjetos y observar al microscopio a 10x y 40x. Los lípidos aparecen como gotas de color rojo.

6. Detección de taninos: Colocar 2 a 3 mg de la droga en polvo sobre un

portaobjetos. Verter 2 ó 3 gotas de solución de cloruro férrico al 5 %. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio a 10x y 40x. La presencia de taninos se traduce en la aparición de masas oscuras de color pardo, azul o negro.

7. Detección de celulosa: Colocar 2 a 3 mg de la droga en polvo sobre un

portaobjetos. Verter 1 ó 2 gotas de solució n de cloruro de zinc yodado (Disolver 20 g de cloruro de zinc y 6.5 g de yoduro de potasio en 10.5 mL de agua), dejar reposar 2 minutos y agregar 1 gota de yodo (0.1 mol/L), dejar reposar 1 minuos, remover el exceso de reactivo con una tira de papel filtro y agregar 1 gota de H 2SO4 60%. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio, las paredes de celulosa se observan en colores desde el azul al violeta.

8. Detección de vasos lignificados (esclereidas, vasos, fibras, parenquima):

Colocar 2 a 3 mg de la d roga en polvo sobre un portaobjetos y mezclarlos con un pequeño volumen de floroglucinol, dejar reposar hasta casi sequedad, agregar 1

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoquímica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff 48gota de HCl 25%. Cubrir con un porta objeto y observar los vasos lignificados en colores desde el rosado hasta el color c ereza (rojo carmin).

9. Detección de suber: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos.

Verter 2 ó 3 gotas de solución de Sudan III y dejar actuar durante 2 ó 3 minutos o calentar suavemente. Los vasos suberizados o cuticulizados se observ al de color rojo al rojo-naranja.

10. Detección de granos de aleurona: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre

un portaobjetos. Verter 2 ó 3 gotas de solución de yodo/etanol. Los granos de aleurona se observan amarillentos café o café. Agregar luego unas 2 ó 3 gotas de trinitrofenol en etanol y los granos de tornarán amarillos.

11. Detección universal: Solución A – Diluir 20 mL de una solución saturada de Sudan

III en ácido láctico con 30 mL de ácido láctico. Solución B – Disolver 0.55 g de sulfato de anilina en 35 mL de agua. Solución C – Disolver 0.55 g de yoduro de potasio y 0.05 g de yodo en 5 mL de agua y agregar 5 mL de etanol. Procedimiento – Combinar la solución A, solución B y la Solución C y agregar 2.5 mL de HCl con agitación (No filtrar). Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos. Verter 2 ó 3 gotas del reactivo y calentar suavemente. Cubrir con un porta objeto y observar los elementos lignificados de amarillo, súber de marrón, lípidos de color rojo y almidón de color azul -violeta.

12. Detección de estomas: Los estomas son unas aberturas que regulan la entrada y

salida de gases. Estas aberturas están rodeadas por células especializadas llamadas oclusivas que al cambiar de tamaño y forma, modifican el diámetro de la abertura estomátic a y de este modo regulan el intercambio gaseoso.

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoquímica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff 49

Imagen tomada de: British pharmacopoeia, Appendix XI H. Stomata. 2003.

1- Anomocíticos (irregulares): Los estomas están rodeados por un número variado de células. 2 - Anisocíticos (desiguales): Los est omas están rodeados por tres células, de las cuáles una es marcadamente más pequeña que las otras. 3 - Diacíticos (Atravesando): Los estomas están incrustados entre dos células vecinas. 4 - Paracíticos (Paralelos): Los estomas tienen paralelamente a ello s una o más células vecinas. BIBLIOGRAFÍA

1. British Pharmacopoeia, 2003. 2. USP 27, NF 22. 2003. 3. Quality control methods for medicinal plant materials, WHO Geneva, 1998


Práctica 5 RECONOCIMIENTO CROMATOGRÁFICO DE PLANTAS MEDICINALES

APROBADAS EN COLOMBIA

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE AJENJO, Artemisia absinthium L., Asteraceae

Introducción La droga la constituyen las hojas y flores. Las hojas contienen 0.3% de principios amargos (Absinthina y anabsinthina), mientras que las flores cont ienen un 0.15%. Extracción 1 g. de droga pulverizada se extrae durante 10 minutos con 10 ml de Metanol a 60°C sobre un baño de agua. La mezcla se filtra y el filtrado se evapora hasta un volumen aprox. de 2 ml Fase estacionaria : Sílica gel 60F-254 Fase móvil: Cloroformo:Metanol 95:5 Revelador: Liebermann-Burchard/UV 365 nm

Rf SUSTANCIA COLOR 0.3-0.4 Absinthina amarillo ocre

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DEL AJO, Allium sativum, Liliaceae

Introducción El bulbo o diente contiene cisteína, cistina, sulfóxido de metionina, cicloaliína, aliína (= Sulfóxido de S -alilcisteína), y deoxialiína (=S -alil-cisteína), junto con otros aminoácidos azufrados y sulfóxidos de cisteína. Extracción 25 g. de dientes frescos finamente desmenuzados se extraen en frío (con ayuda de hielo seco) con 2 porciones de 100 ml de metanol al 80%. Se purifica por cromatografía en columna, controlando las fracciones con Reactivo de Ninhidrina. Fase estacionaria: Sílica gel 60 Fase móvil: n-Butanol : n-Propanol : Acido acético glacial : Agua 30 : 10 : 10 : 10 Revelador: Ninhidrina


Rf SUSTANCIA COLOR 0.5 Alicina Naranja

0.7 Aliína Azul-violeta

RECONOCIMIENTO DE LA ALCACHOFA POR

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Introducción La droga la constituyen las hojas, las cuales contienen sesquiterpenlactonas como cinaropicrina, grossheimina y cinarina; ácidos fenolcarboxilicos como 1,3 -dicafeoilquínico, clorog énico y neoclorogénico; y luteolina -7-O-glucósido, un flavonoide. Extracción 1 g. de droga pulverizada se extrae durante 10 minutos con 10 ml de metanol sobre un baño de agua. La mezcla se filtra y se evapora hasta un volumen de aprox. 2 ml Fase estacionaria: Sílica gel 60F-254 Fase móvil: Acetato de etilo:Acido fórmico:Acido acético:Agua 100 : 11 : 11 : 27 Revelador: Polietilénglicol para productos naturales/UV 365 nm

Rf SIJSTANCIA COLOR 0.7 Cinarina Azul fluorescente

0.6 Luteolina-7-0-gluc. Amarillo

0.45 Acido clorogénico Azul fluorescente

0.4 Rutina Amarillo


RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE LA ALBAHACA, Ocimum basilicum , Lamiaceae

Introducción La droga la constituyen las hojas, las cuales contienen 0.1 -0.45% de aceite esencial. El aceite esencial contiene principalmente metilchavicol 55% y linalool. Extracción a) Por arrastre con vapor de agua Método oficial de la Farmacopea Europea III, pág. 62. b) Con Diclorometano 1 g. de droga pulverizada se extrae por agitación durante 15 minutos con 10 ml de diclorometano. El filtrado obtenido se evapora a sequedad. El residuo se disuelve en 1 ml de Tolueno, y se aplican 50 -100 µL. en la placa cromatográfica. Fase estacionaria : Sílica gel 60 Fase móvil: Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Revelador: Vainillina- Acido sulfúrico

Rf SUSTANCIA COLOR 0.3 Linalool Azul intenso

0.9 Metilchavicol Rojo violeta

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE LA HIERBABUENA, Mentha viridis L., Lamiaceae

Introducción La droga la constituyen las hojas y ramas jóvenes, las cuales contienen 1.2% de aceite esencial. El aceite contiene principalmente L -Carvona 42-67%, mentol, acetato de dihidrocarveol, alcohol dihidrocuminílico, pineno, limoneno y felandreno.

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoquímica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff 53 Extracción 1) Destilación por arrastre con vapor de agua Se utiliza el método oficial de la Farmacopea Europea III pág. 62 con 50 g de muestra, 500 ml de agua, 2 horas d e destilación a un flujo de 3 -3.5 ml /min. 2) Extracción con diclorometano Como se describió para la albahaca Fase estacionaria : Sílica gel 60 Fase móvil: Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Revelador: Vain illina-Acido sulfúrico

Rf SUSTANCIA COLOR 0.25 Alcohol dihidrocumínico Azul intenso

0.46 Carvona Rojo-Violeta

0.7 Acetato de dehidrocarveol Azul intenso

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE HINOJO, Foeniculum vulgare , Apiaceae

Introducción La droga la constituyen los frutos, los cuales contienen 2 -7% de aceite esencial. El aceite esencial contiene principalmente anetol (50 -80% en la variedad dulce, 60 -80% en la variedad vulgare), metilchavicol, safrol, anisaldehído y fenchona (0.4 -0.8% en la variedad dulce, 12 -22% en la variedad vulgare). Extracción 1) Destilación por arrastre con vapor de agua Según el método oficial de la Farmacopea Europea III, pág. 62, utilizando 10 g. de muestra, 200 ml de agua, 2 horas de destilación a una rat a de 2-3 ml /min. 2) Extracción con diclorometano Tal como se describió para la albahaca. Fase estacionaria : Sílica gel 60 Fase móvil: Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Reveladores: 1.Vainillina -Acido sulfúrico 2. PMA-Permanganato de potasio 3. Acido sulfúrico concentrado


Rf SUSTANCIA REVELADOR COLOR 0.6 Fenchona 3 Azul oscuro

0.9 Anetol 1 2 3

Rojo-Violeta Rojo-Pardo Azul oscuro

Nota: La fenchona no se detecta en estas condiciones para el anís, lo que permite diferenciar las dos plantas.

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE LA MALVA, Malva sylvestris , Malvaceae

Introducción La flor contiene la malvina, un pigmento que le confiere el color característico. Extracción 1 g. de droga pulverizada se extrae por agitación durante 15 minutos con 6 ml de Metanol:Acido Clorhídrico (9 partes de metanol, 1 parte de ácido al 25%). Se utilizan 25 µl del filtrado para la cromatografía. Fase estacionaria : Sílica gel 60F-254 Fase móvil: n -Butanol : Acido acético glacial : Agua 40 : 10 : 20 Reveladores: Ninguno Rf SUSTANCIA COLOR 0.4 Malvina (=Malvidin -3,5-di-

glucósido Violáceo

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE LA MANZANILLA MATRICARIA, Matricaria chamomilla , Asteraceae

Introducción La droga la constituyen las flores, las cuales contienen 0.5 -1.5% de aceite esencial. El aceite esencial a su vez contiene chamazuleno 0 -15%, bisabolol 10 -25%, bisabolol óxidos A y B (ambos 10 -25%), poliínas 1 -40%, farneseno 15%.

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoquímica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff 55Extracción a) Destilación por arrastre con vapor de agua Según método oficial de la F. Eur. III pág. 62 con: 50 g de muestra, 500 ml de agua destilada de una solución de cloruro de sodio al 1%, 4 horas de destilación a 3 -4 ml/minuto. b) Extracción con Díclorometano Tal como se ha descrito para la albahaca. Fase estacionaria : Sílica gel 60 Fase móvil: T olueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Revelador: Vainillina -Acido sulfúrico

Rf SUSTANCIA COLOR 0.2 Oxidos A y B de bisabolol Amarillo/Verde

0.25 Alcohol terpenoide Violeta

0.35 Bisabolol Violeta

0.5-0.6 Poliínas Pardo

0.95 Azuleno Rojo violeta

0.99 Farneseno Azul-Violeta

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DEL ROMERO, Rosmarinus officinalis , Lamiaceae

Introducción Las hojas contienen 1 -2% de aceite esencial, el cual contiene principalmente 1,8 -cineol 15-30%, borneol 10-20%, acetato de bornilo, camfeno 5 -10%, alfa- y beta-pineno. Extracción a) Destilación por arrastre con vapor de agua Según método oficial de la Farm. Eur. III pág. 62. b) Extracción con diclorometano Tal como se describió para la albahaca. Fase estacionaria : Sílica gel 60 Fase móvil: Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Revelador: Vainillina -Acido sulfúrico


Rf SUSTANCIA COLOR 0.25 Borneol Azul oscuro

0.45 Cineol Azul intenso

0.7 Acetato de bornilo Azul intenso

0.99 Alfa- y beta-pineno Violeta

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE LA SABILA, Aloe vera , Liliaceae

Introducción La droga la constituye el jugo desecado de las hojas el cual contiene 14 -28% de principios antracénicos tal es como aloína, aloesinas A y B, aloinósidos A y B, etc. Extracción 0.5 g. de droga pulverizada se extraen con 5 ml de Metanol, calentando durante 5 minutos sobre un baño de agua. El filtrado se aplica directamente sobre la placa cromatográfica. Fase estacionaria: Sílica gel 60F -254 Fase móvil: Acetato de etilo : Metanol : Agua 100 : 13.5 : 10 Reveladores: 1) Hidróxido de potasio/ UV 365 nm 2) Poiietilénglicol PN/UV 365 nm

Rf SUSTANCIA REVELADOR COLOR 0.3 Aloinósidos A y B 1 y 2 Amarillo

0.47 Aloína 1 y 2 Amarillo

0.95 Aloé-emodina 1 Rojo

--- Aloesinas A y B

1 Azul fluorescente


RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE FLORES DE SAUCO, Sambucus nigra , Caprifoliaceae

Introducción La droga la constituyen las flores, las cuales contienen glicósidos de quercetina 1.5 -3% como hiperósido, isoquercitrina y rutina. Extracción 1 g. de droga pulverizada se extrae con 10 ml de metanol durante 5 minutos sobre un baño de agua a aproximadamente 60 °C. El filtrado se utiliza para la cromatografía.

Fase estacionaria : Sílica gel 60F -254 Fase móvil: Acetato de etilo : Acido fórmico : Acido acético : Agua 100 : 11 : 11 : 27 Reveladores: 1) R. productos naturales/UV 365 nm 2) Polietilénglicol para productos naturales/UV 365 nm

Rf SUSTANCIA COLOR 0.4 Rutina Amarillo

0.7 Isoquercitrina Amarillo

0.9 Acido cafeico Azul fluorescente

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

DE HOJAS DE TORONJIL, Melissa officinalis , Lamiaceae Introducción Las hojas contienen 0.01 -0.25% de aceite esencial, el cual está constituido principalmente de Citronelal 39%, Citral 30%, citronelol, linal ool, geraniol y cariofileno. Extracción a) Por arrastre con vapor de agua Según el método oficial de la Farmacopea Europea III pág. 62, con: 40 g. de muestra, 400 ml de agua, destilando a 2 -3 ml/min durante 2 horas.

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoquímica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff 58 b) Extracción con Diclorometano Como se describió para la albahaca. Fase estacionaria : Sílica gel 60 Fase móvil: Cloroformo Revelador: Anisaldehído/Acido sulfúrico

Rf SUSTANCIA COLOR 0.7 Citronelal Azul intenso

0.45 Citral Azul violáceo

0.25-0.4 Geraniol, linalool y Citronelol

Azul violáceo

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE RAICES DE VALERIANA, Valeriana officinalis , Valerianaceae

Introducción La droga la constituyen las raíces o rizomas que contienen los valepotriatos como: valtrato, isovaltrato, IVDH_Valtrato, didrovaltrato y acevaltrato, cuya concentración cambia de una variedad a otra. Además contiene 0.25% de aceite esencial en los rizomas frescos, el cual contiene valerenal, valeranona y ácido valerénico. Extracción 0.2 g. de droga pulverizada se extraen con 5 ml de diclorometano durante 5 minutos a unos 60 0C con agitación ocasional. El residuo de la filtración se lava con otros 2 ml de diclorometano. Los extractos combinados se evaporan a sequedad, y el residuo d e disuelve en 0.2 ml de acetato de etilo. Se aplican en la cromatoplaca 10 microlitros de esta solución. Fase estacionaria : Sílica gel 60 Fase móvil: Tolueno : Acetato de etilo 75 : 25 Revelador: HCl concentrado : Acido acético glacial 2:8

Rf SUSTANCIA COLOR 0.73 Valtrato/Isovaltrato Azul

0.65 Didrovaltrato Pardo

0.55 Acevaltrato Azul

0.4 IVDH-Valtrato Azul

<0.4 Valtrahidrinas Azul

Origen Productos de degradación


Práctica 6

ACEITES ESENCIALES

INTRODUCCIÓN El característico olor, aroma, de ciertas plantas es debido al aceite esencial o volátil allí presente y usado desde la antigüedad como fuente natural de fragancias y perfumes. Actualmente los aceites esenciales son usado en la perfu mería, en la industria alimenticia o como fuente de materias primas. Algunos con propiedades adicionales son usados como carminativos, aromatizantes, anestésicos locales y últimamente otros con propiedades antieméticas e insecticidas. Los aceites esencial es o esencias vegetales son mezclas de un numero variables de sustancias olorosas. En un aceite esencial pueden encontrarse hidrocarburos alicíclicos y aromáticos , así como sus derivados oxigenados, alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres, sustancias azuf radas y nitrogenadas. Los componentes mas frecuentes se derivan del ácido mevalónico; se les cataloga como monoterpenos de 10 unidades de carbono y sesquiterpenoides con 15 unidades de carbono. Todos los aceites esenciales oficinales se extraen por destila ción, con excepción del de limón y el de cade. La destilación de las esencias por medio de agua o vapor se ha practicado durante mucho tiempo, pero las modernas plantas industriales poseen muchas ventajas sobre las antiguas destilerías, en las que con frec uencia se producía la carbonización y descomposición de la esencia. En la moderna destilería de aceites esenciales, la materia prima esta contenida en cestos o bandejas perforados. El destilador contiene agua en el fondo, la cual se calienta mediante ser pentines por los que circula vapor, o también haciendo pasar a su través vapor de agua a presión. Algunas esencias como las de cayeput, alcaravea, trementina y de leño sándalo australiano, son rectificadas. Esta consiste, generalmente en una segunda desti lación en corriente de vapor, que libera la esencia de resinas y otras impurezas. La luz y el oxigeno atmosférico parecen ejercer un efecto adverso sobre la mayoría de los aceites esenciales, por lo que deben de seguirse estrictamente las directrices ofici ales respecto del almacenamiento. Las esencias utilizadas en perfumería, se pueden extraer por arrastre con vapor, como se describió anteriormente. Pero algunos requieren de otro tipo de tratamiento, como son el enflorado, digestión en grasas calientes, mé todos neumáticos o por medio de disolventes. El rendimiento de esencia obtenido de una planta varía de unas cuantas milésimas por ciento del peso vegetal hasta 1 -3%. La composición del aceite puede cambiar con la época de la recolección, el lugar geográfic o o pequeños cambios genéticos. En gimnospermas y angiospermas es donde aparecen las principales especies que contienen aceites esenciales, distribuyéndose entre unas 60 familias. Son particularmente ricas en esencias las pináceas, lauráceas, mirtáceas, l abiáceas, umbelíferas, rutáceas, y compuestas.

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoquímica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff 60 2. Destilacion Por Arrastre Con Vapor De Aceites Esenciales OBJETIVO Separar los aceites esenciales de: Comino, clavos de olor. corteza de canela, anís, eucalipto, etc. y tratar de caracterizar sus const ituyentes, después de aislarlos por cromatografía de columna y/o capa fina. PROCEDIMIENTO El mas antiguo y sencillo método para obtener aceites esenciales es la destilación por arrastre con vapor, a partir de material vegetal, lo más fresco posible. Usand o matraces de 1 a 6 litros, en el laboratorio se pueden destilar por arrastre con vapor continuo 100 a 500 g. de planta fresca, con buena recuperación de la esencia.

Fig. 1. Equipo para extraer aceites esenciales por arrastre con vapor En el matraz 1 co locar suficiente agua (mas o menos 1 litro por cada Kg de material vegetal) y unos núcleos de ebullición; si se cuenta con un equipo generador de vapor, como una olla a presión la cual a través del conducto de la válvula se puede conducir el vapor hacia el compartimento donde se encuentra el material vegetal. En el compartimento 2 se ubica la muestra picada en pequeños trozos. El agua se somete a calentamiento, logrando así la generación de vapor, que a medida que asciende y atraviesa el material vegetal v a extrayendo el aceite esencial. En el embudo de separación 3, se recoge el destilado; este se puede recoger sobre una

1 11 2 3 4 5 6

78 9

1 10 2 3 4 5 6

7 8 9

1 10

1

2

3

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoquímica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff 61 solución saturada de cloruro de sodio, con el fin de disminuir la formación de la emulsión aceite en agua. También es de utilidad el ad icionarle un poco de éter etílico o diclorometano al embudo, con el fin de observar mas fácilmente las dos fases y así favorecer la separación. Nota: la unión entre el embudo de separación y el condensador, debe permitir la liberación de presión, de lo co ntrario el equipo puede romperse por exceso de presión. Una vez cese la destilación, separe las dos fases. La fase etérea se seca con sulfato de sodio anhidro y se concentra a 40 -45ºC ( no es necesaria la presión reducida). Una vez el aceite este libre de solvente, pese y calcule el rendimiento con base en el material vegetal de partida. 2. Extracción de aceites esenciales con solventes OBJETIVO Separar los aceites esenciales con solventes no polares y caracterizar sus componentes por métodos espectrofo tométricos. PROCEDIMIENTO Se extraen 30 g. de muestra seca y molida en un dispositivo Sohxlet con un volumen suficiente de éter de petróleo. Las fases etéreas se juntan, se filtran, se secan con Na2SO4 anhidro, se filtran de nuevo y se evaporan a sequedad con calentamiento suave. El residuo de evaporación debe tener el olor característico de la muestra antes de extraerla. Este es el aceite esencial crudo (AEC) el cual se pesa para calcular su rendimiento.


ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO Y AISLAMIENTO DE COMPONENTES PRINCIPALES

EXTRACCIÓN. Se extraen 30 g. de muestra seca y molida en un dispositivo Sohxlet con un volumen suficiente de éter de petróleo. Las fases etéreas se juntan, se filtran, se secan con Na2SO4 anhidro, se filtran de nuevo y se evaporan a seq uedad con calentamiento suave. El residuo de evaporación debe tener el olor característico de la muestra antes de extraerla. Este es el aceite esencial crudo (AEC) el cual se pesa para calcular su rendimiento. ANÁLISIS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA. El AEC se redisuelve en unos ml de éter de petróleo o cloroformo y se analiza por CCF con sílica gel y c/u de los siguientes eluentes:

a) Diclorometano b) Tolueno: acetato de etilo 93:7

Para revelar cada una de las cromatoplacas se utilizan los siguientes revelad ores: a) Luz ultravioleta (254 y 375 nm) b) Olfato c) Vapores de yodo d) 2,4- Dinitrofenilhidrazina (0.4 g. en 100 ml HCl 2 N) e) Vainillina/ácido sulfúrico NOTA: De acuerdo con los resultados de este análisis se escoge el sistema cromatográfico en el cual el componente principal del aceite se observe bien separado de los demás componentes. FRACCIONAMIENTO POR CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA El AEC se aplica disuelto en un pequeño volumen del eluente escogido y se aplica a una placa cromatográfica de sílica gel. Se eluye con el eluente escogido. Los componentes mayoritarios pueden reconocerse por revelado con luz ultravioleta de 254 nm (compuestos con enlaces dobles conjugados), o cortando una tira lateral de la placa y revelándola con alguno de los revelado res c, d ó e, citados arriba. EXTRACCION DE LOS COMPONENTES POR CCF Los componentes mayoritarios se raspan con la ayuda de la lámpara UV ó el revelador, se extraen con una mezcla 1:1 de alcohol:cloroformo. Se filtra y se lleva a sequedad. El residuo debe ser el componente puro o con algunas impurezas. En el caso que se observe que el compuesto está muy impuro puede purificársele por otra CCF preparativa.

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoquímica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff 63 ANALISIS DEL COMPONENTE PURO. a) Ensayos de coloración. Si se obtiene una buena cantidad del compuest o puro se pueden realizar ensayos para fenoles, aldehídos y cetonas, alcoholes, etc. b) Análisis Espectral. Al componente puro se le determinan los espectros infrarrojo, ultravioleta, etc.


PRACTICA 7. TECNICAS GENERALES DE EXTRACCIÓN Y VALORACION DE U NA DROGA

a. Valoración de alcaloides del tropano

El término alcaloide (de álcali), fue propuesto por el farmacéutico W. Meissner en 1819, se aplicó a los compuestos de origen vegetal con propiedades alcalinas, este carácter básico es debido a la presenci a de nitrógeno amínico en su estructura. No existe una definición exacta para el termino alcaloides, pero se pueden considerar como compuestos orgánicos de origen natural ( vegetal: familias Lauraceae, Ranunculaceae, Magnoliaceae, Annonaceae, Menispermacea e, Papaveraceae, Fumariaceae, Rutaceae, Apocynaceaae, Loganiaceae, Solanaceae , Rubiaceae; animal: ranas de la familia Mantellidae quienes presentan alcaloides tóxicos en piel ; bacteriano: la Pseudomona aeruginosa produce la Piocianina , hongos: el Psilocybe produce Psilocyna y Psilocybina, etc.), nitrogenados, derivados generalmente de aminoácidos, mas o menos básico, de distribución restringida, con propiedades farmacológicas importantes a dosis bajas (gran variedad de actividad sobre SNC y SNA) y que presentan gran diversidad estructural .

Figura 1. Algunos ejemplos de variabilidad estructural de los alcaloides Para su estudio, algunos autores dividen los alcaloides en cuatro clases (figura 2): 1. Alcaloides Verdaderos : los cuales cumplen estrictamente con las características

de la definición de alcaloide: tienen siempre un nitrógeno heterocíclico, son de carácter básico y existen en la naturaleza normalmente en estado de sal, biológicamente son formados a partir de aminoácidos.

isoquinoleina

N N NN N

pirrolidina piperidina piridina indolicidina quinolicidina

N

N

N N

tropano

tetrahidro

quinoleina indol

N

N N

N N

N

O

O

ON

imidazol purina

diterpénico

N NN

N

Nespermidinaesteroidal

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoquímica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff 65 2. Protoalcaloides: son aminas simples con nitrógeno extracíclico, de carácter básico

y que son productos del metabolismo de los aminoácidos. 3. Pseudoalcaloides : presentan todas las características de la definición de alcaloide

pero no son derivados de aminoácidos. 4. Alcaloides imperfectos : se derivan de bases púricas y no precipitan con los

reactivos específicos para alcaloides. No son alcaloides los aminoácidos, las betalaínas, los péptidos, los amino azúcares, las vitaminas nitrogenadas, las porfirinas, algunas bases c omo la tiamina ampliamente distribuida en los seres vivos y los alkil aminas de bajo peso molecular.

Los alcaloides se han clasificado en función de su estructura (heterocíclica y no heterocíclica), actualmente existen varias formas de clasificarlos 1,6 según sus propiedades farmacológicas, distribución botánica ó de acuerdo a su origen biosintético .

figura 2. Aspectos biogenéticos para la clasificación de los alcaloides EL NITROGENO es necesario para la construcción de aminoá cidos que posteriormente se convertirán en proteínas, y de nucleotidos que harán parte de los ácidos nucleicos, en las plantas la función de los alcaloides no es aun clara, se ha sugerido que estas sustancias pueden actuar en los v egetales como:

Acetil CoA Malonil CoA Proteinas N2 Aminoacidos Aminoácidos Aminoácidos modificados Mevalonato Policetidos Alcaloides Imperfectos NH3 Aminas Protoalcaloides Isoprenoides Policetidos Alcaloides Aminados Aminados Verdaderos Pseudoalcaloides

- CO2

No cíclicas

Cíclicas

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoquímica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff 66 • Fuente de almacenamiento del nitrógeno sobrante • Productos de desecho del nitrógeno sobrante • Protectores por su sabor amargo evitan el ataque de insectos, los alcaloides

generalmente se localizan en los tejidos periféricos de los órganos de la planta (recubrimiento de las semillas, corteza del tallo, raíz o fruto, epidermis de la hoja) .

• Rreguladores del crecimiento se ha demostrado que los alcaloides derivados de la putrescina se incrementan notablemente en algunas plantas cuando se encuentran en suelos deficientes de potasio 2,3, no obstante la pérdida de alcaloides en el vástago de plantas que normalmente los acumulan en las partes aéreas, ( Nicotiana y Daturas) no ha impedido el desarrollo, lo cual sugiere que los alcaloides no son esenciales para los vegetales. Los alcaloides se reconocen en el laboratorio por su capacidad de combinarse con el yodo o los metales pesados (bismuto, mercurio, tunsgteno) cuando se encuentran en forma de sal en extractos ácidos formando precipitados; en la práctica, se utilizan los siguientes reactivos para su detección: yodo-yoduro de potasio (Reactivo de Wagner), mercurio tetrayoduro de potasio (reactivo de Mayer), tetrayodo bismuto de potasio (reactivo de Dragendorff), solución de ácido pícrico (reactivo de Hager), ácido sílico túngtico (reactivo de Bertrand), p-dimetilamino benzaldehido (reactivo de Ehrlich); reacción de Vitali-Morin (para alcaloides en estado base). La extracción y aislamiento se fundamentan en la diferencia de solubilidad que presentan los alcaloides según se encuentren en forma de sal (sales de ácidos orgánicos y combinaciones con otras sustancias solubles en solvente polares: agua, soluciones ácidas e hidroalcoholicas ) ó de base (solubles en solventes orgánicos no polares: diclorometano, acetato de etilo ), generalmente son incoloros, pero las conjugaciones en la molécula producen coloraciones que van desde el amarillo hasta el rojo , además la mayoría son sólidos a temperatura ambiente, pero hay excepciones (la nicotina que es líquida).

Alcaloide base Alcaloide sal La extracción puede realizarse mediante métodos generales como : 1. Extracción en medio alcalino : en donde una solución alcalina desplaza los

alcaloides de sus combinaciones salinas y las bases liberadas son solubilizadas en un solvente orgánico medianamente polar

2. Extracción en medio ácido : Extracción de los alcaloides en forma de sales con agua acidulada, alcohol o solución hidroalcohólica acidulada, seguido de una alcalinización y extracción de los alcaloides base con un solvente orgánico no

R 3 N.. H X

-+

R 3 NH X+ -

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoquímica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff 67 miscible (alcaloides y compuestos nitrogenados. Universidad de Antioquia, G. J. Arango 2000)


EXTRACCIÓN DE ALCALOIDES EN MEDIO ALCALINO (FIGURA 3)

1. Alcalinización2. Extracción con solvente orgánico apolar

Marco libre de alcaloidesMayer (-)

extracción con ácido diluido

1. Alcalinización2. Extracción solvente org. no polar

Fase acuosa alcalina

deshidratación evaporación en vacío

Alcaloides Totales (AT)

Fase orgánica (alcaloides bases)

Solución ácida(alcaloides sales)

Solución orgánica(libre de alcaloides)

Solución de alcaloides bases (+ impurezas)

DROGA SECA Y DESENGRASADA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y FITOQUÍMICA 2008

69

1. Maceración en alcohol al 70%2. Concentración del macerado

1. Alcalinización2. Ext. con solvente organico medianamente apolar

Fase acuosa(alcalina)

Ext. con sol. ácida dil.

1. alcalinización2. extracción con solvente organico inmisible

Fase acuosa alcalina (impurezas)

evaporación

Alcaloides totales

Fase orgánica(alcaloides bases)

Fase acuosa(Alcaloides sales)

Fase orgánica (impurezas)

Fase orgánica(alcaloides bases)

Solución acuosa(alcaloides sales)

DROGA EN POLVO, SECA Y DESENGRASADA

VALORACION DE ALCALOIDES DEL TROPANO (Flores y hojas de Datura sp.)

La hioscina (escopolamina) y la hiosciamina son los alcaloides principales de las especies de Datura (Solanaceae), pertenecen al grupo de los alcaloides tropán icos de


70

conocida actividad farmacológica, estos alcaloides se encuentran en algunos géneros de la familia Solanáceas : Atropa, Datura, Duboisia, Hyoscyamus , Mandragora, Scopolia, etc. Además se encuentran en otros géneros de familias como el Erythroxylum (Erythroxylaceae).

ACITIVIDAD BIOLOGICA La Atropina ( l(-)-hiosciamina) se encuentra en Atropa belladona , Datura stramonium y la escopolamina ( l(-)hioscina) en Hyosciamus n iger, los isómeros l(-) de ambos alcaloides son 100 veces mas potente s que los isómeros d (+). Se absorben bien en el intestino y a través de la conjuntiva alcanzando el sistema nervioso central en un lapso de tiempo entre 30 – 60 minutos, en donde provocan bloqueo competitivo reversible de las acciones de los colinomim éticos (acetilcolina y análogos) en los receptores muscarínicos (farmacología básica y clínica de B. G. Katzung 1999) Efecto en los organos Sistema Nervioso Central: Estimulan o deprimen dependiendo de la dosis empleada, a dosis tóxicas estimulan con ap arición de irritabilidad inquietud, desorientación, alucinaciones y delirio, si la dosis incrementa el esta de intoxicación pro gresa hacia la depresión profunda, coma, parálisi s respiratoria depresión cadiovascular y eventualmente la muerte . Gastrointestinales: reducen la secreción salival . Cardiovasculares: producen boqueo colin érgico en el nódulo sinusal el cual genera taquicardia y cuya intensidad depende la dosis . Efectos oculares : bloquea la acción parasimpátic a en las fibras circulares del iris y el músculo ciliar produciendo midriasis (pupila dilatada) y cicloplej ía (desenfoque para visión lejana e incremento de la presión intraocular) ( Fundamentos de farmacología en terapéutica C.A. Isaza 1992). PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Extracción de alcalo ides por el método ácido . En un erlenmeyer de 250 ml se colocan 10 g de material vegetal seco y molido con suficiente cantidad de etanol del 95% (v/v) que cubra la muestra (aproximadamente 100 ml), se macera a temperatura ambiente por 24 horas, también pu ede realizarse un

N

CH3

OO Ph

OH

N

CH3

OO Ph

OH

ON

CH3

O

OH

C6H5

COOMe

L-Hiosciamina : Atropina Ester del acido trópico con la tropina


71

reflujo durante 2 horas si no se dispone del tiempo para la maceración a temperatura ambiente. El extracto etan ólico se filtra, el residuo sólido se lava con 3 porciones de etanol de 10-15 ml y se descarta, la reunión de los filtrados se concentra a un pequeño volumen o se evapora a sequedad, luego se le adicionan 15 ml de H 2SO4 0.5 N y 10 ml de agua destilada. La fase acuosa ácida se extrae con tres porciones de 10 ml de hexano para desengrasar, la fase orgánica hex ánica se descarta y las acuosas ácidas se alcalinizan con NH 4OH al 25% hasta obtener un pH entre 10 y 11, posteriormente se extraen con tres porciones de 10 ml de diclorometano. Los extractos dicloromet ánicos reunidos son secados sobre sulfato de sodio anhidro y llevados a seque dad en rotaevaporador, el residuo alcalo ídico se redisuelve en 3 – 5 gotas de etanol y 5.0 ml de H2SO4 0.02N (medidos exactamente con pipeta volumétrica), se adicionan 15 ml de agua destilada y 2 -3 gotas del indicador rojo de metilo (viraje de pH entre 4. 2 - 6.3). Esta solución ácida (color rosa) es valorada por retroceso, por adición de una solución de NaOH 0.01 N desde una bureta hasta que el color de la solución cambie a amarillo.


72

DIAGRAMA DE FLUJO

VALORACIÓN DE ALCALOIDES DEL TROPANO Base del método: extracción de alcaloides en medio ácido

Nota: 1. Si al agregar el indicador rojo de metilo no se observa cambio de color a rojo y la

solución permanece de color amarillo, debe agregarse mayor cantidad de ácido ya que los alcaloides de la mues tra han consumido todo el ácido agregado, y es necesario establecer el medio ácido para proceder con la retrovaloración.

2. Según el libro Farmacognosia de Trease and Evans 13 edición, Editorial

Interamericana Mc Graw-Hill 1991 página 606, el Estramonio pu ede contener entre 0.2 y 0.45% de alcaloides siendo los principales la hiosciamina y la hioscina (escopolamina), la droga BP contiene no menos de 0.25% de alcaloide.

Extraer ETOH al 95 % (100 ml) por 24 horas a 25 C ó reflujo de 2h Filtrar, Lavar con ETOH (porciones de 10 ml)

Concentrar, Adicionar 15 ml H2SO4 0.5 N y 10 ml H2OFiltrar si es necesario

Extraer con 15 ml Hexano (3 porciones)

DESECHAR

FASE ORGANICA (hexano)

Alcalinizar con NH4OH 25% (pH: 10 -11)Extraer con 15 ml CH2Cl2 (3 porciones)

DESECHAR

FASE ACUOSA

Retrovaloración: Sln NaOH 0.01 NPunto final: cambio a color amarillo

Agregar 15 ml H2OAgregar 2 - 3 gotas Indicador Rojo de Metilo (pH: 4.2 - 6.3)

Filtrar sobre Na2SO4LLevar a sequedad en RVP balon pequeño

Redisolver en gotas de ETOH y 5.0 ml H2SO4 0.02 N

FASE ORGANICA (CH2Cl2) inferior

FASE ACUOSA

FILTRADO

DESECHAR

RESIDUO SOLIDO

Material vegetal Seco y Molido (10 g)


73

Cálculos

Tener en cuenta que: 1. Asumir el punto final de la titulación como el punto d e equivalencia para tomar el

volumen de base utilizada en el proceso de neutralización. 2. Calcular el volumen de Volumen de H 2SO4 0.02N neutralizado por el alcaloide base 3. El H2SO4 es un ácido diprótico, entonces por cada meq de ácido reaccionan 2

equivalentes de base NaOH. 4. Cada 1 ml. de ácido o de base 0.01 N es equivalente a 2.892 mg. del alcaloide

calculado como L - hiosciamina. PM = 289.2 g/n En el punto de equivalencia:

1 Meq de Acido = 2 Meq de base N H2SO4 x V H2SO4 = 2 (N NaOH x V NaOH) V H2SO4 libre (exceso) = 2 (N NaOH x V NaOH)

N H2SO4 V H2SO4 que reacciona con el alcaloide base = 5.0 ml - V H2SO4 libre (exceso)

% Alcaloides en la muestra

= 2 (5.0 ml - ((V NaOH x N NaOH)/ N H2SO4)) x 2.892 mg/ml x 100

Peso de muestra (mg)

Datos: N H2SO4 = 0.02 N NaOH = 0.01 V H2SO4 = 5.0 ml V NaOH = ?

b. Cuantificación de rutina en flores de saúco y en partes aéreas de pensamiento

Introducción La rutina es un glicósido flavonoide que se encuentra ampl iamente distribuido en plantas y productos fitofarmacéuticos. Esta amplia distribución, junto con la facilidad en su detección a nivel de laboratorio mediante la cromatografía en capa fina (CCF) y la espectroscopia Ultravioleta (UV), la hacen un indicador adecuado para el


74

reconocimiento y el control de calidad de productos fitofarmacéuticos terminados o sus materias primas vegetales correspondientes. Procedimiento

• Preparar una solución estándar de rutina en metanol de concentración 100 ppm • Tomar 1.2 ml de solución completar a 10 ml y determinar el espectro UV entre

200 y 400 nm. • Seleccionar la longitud de onda de trabajo. • Para obtener la curva de calibración, tomar alícuotas de la solución estándar y

llevar a 10 ml según la tabla siguiente. Leer absorbanc ias de cada solución a la longitud de onda de trabajo. Realizar una curva de Absorbancia vs. Concentración en ppm.

Alícuota (ml) Volumen final

(ml) Absorbancia a

360 nm Concentración de rutina

(ppm) 0.6 10.0 0.9 10.0 1.2 10.0 1.5 10.0 1.8 10.0

La gráfica muestra una curva de calibración obtenida experimentalmente con alícuotas

tomadas a partir de una solución estándar de rutina de concentración aproximada a

100 ppm.

Curva de calibración de estándar de rutina

y = 0,0352x + 0,037R2 = 0,9906

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 5 10 15 20 25

Concentración en metanol (ppm)

Abs

orba

ncia

a 3

60 n

m


75

2. Extracción de la droga

• 1 g de droga seca y en polvo (pesar con balanza de precisión ± 1 diezmilésima de gramo), se extrae con 10 ml de metanol, con agitación, calentamiento en baño de agua a 60 °C, durante 10 minutos. Filtrar, lavar el filtrado dos veces con 10 ml de metanol (preferiblemente cali ente), evaporar a sequedad y pesar el extracto obtenido.

3. Separación mediante CCF

• Redisolver el extracto en 2 ml de metanol caliente y sembrar una banda en una cromatoplaca de sílica gel GF -254 (20x10 cm, 1 mm espesor de capa), colocando al lado una apl icación del estándar de rutina disuelto en metanol. Evaporar a sequedad el resto de extracto y pesar para determinar por diferencia el peso de extracto sembrado en CCF.

• Desarrollar en la mezcla Acetato de etilo/Acido fórmico/Acido acético/Agua 100:11:11:2.7.

• La rutina se observa con un rf aproximado de 0.3, de color amarillo. • Retirar la placa luego de desarrollar, dejarla secar en un extractor de vapores y

analizarla con una lámpara UV a 254 nm. • Demarcar la banda correspondiente a la rutina en la muestra, raspar y extraer

con metanol caliente 3 veces (porciones de 5 a 10 ml). Los filtrados se concentran a sequedad y se redisuelven en 3 ml de metanol, medidos con exactitud. Ayudarse con una pipeta Pasteur para evitar pérdidas.

4. Lectura espectrofotométri ca y cuantificación

• Leer absorbancia a 360 nm y determinar concentración mediante interpolación con la curva de calibración.

• Determinar el porcentaje de rutina en la muestra y comparar con lo reportado para muestras auténticas.

c. Cuantificación de r utina en un jarabe de saúco

Introducción La rutina es un glicósido flavonoide que se encuentra ampliamente distribuido en plantas y productos fitofarmacéuticos. Esta amplia distribución, junto con la facilidad en su detección a nivel de laboratorio median te la cromatografía en capa fina (CCF) y la espectroscopia Ultravioleta (UV), la hacen un indicador adecuado para el reconocimiento y el control de calidad de productos fitofarmacéuticos terminados o sus materias primas vegetales correspondientes. En este caso se propone un método de cuantificación en un jarabe.


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Procedimiento

• Preparar una solución estándar de rutina en metanol de concentración 100 ppm • Tomar 1.2 ml de solución completar a 10 ml y determinar el espectro UV entre


llevar a 10 ml según la tabla siguiente. Leer absorbancias de cada solución a la longitud de onda de trabajo. Realizar una curva de Absorbancia v s. Concentración en ppm.


(ml) Absorbancia a

360 nm Concentración de rutina (ppm)

0.6 10.0 0.9 10.0 1.2 10.0 1.5 10.0 1.8 10.0

2. Extracción de la droga

• A partir de la información dada en la etiqueta por el fab ricante tomar un volumen equivalente a 1 g de droga seca y en polvo (medir exactamente con material volumétrico). Evaporar a sequedad con ayuda de vacío y calentando a 60°C. El residuo se extrae con 10 ml de metanol, con agitación, calentamiento en baño de agua a 60°C, durante 10 minutos. Filtrar, lavar el filtrado dos veces con 10 ml de metanol (preferiblemente caliente), evaporar a sequedad y pesar el residuo obtenido.


• Redisolver el residuo en 2 ml de metanol caliente y sembrar una banda en una cromatoplaca de sílica gel GF -254 (20x10 cm, 1 mm espesor de capa), colocando al lado una aplicación del estándar de rutina disuelto en metanol.

• Desarrollar en la mezcla Acetato de etilo/Acido fórmico/Acido acético/Agua 100:11:11:2.7.

• La rutina se observa con un rf aproximado de 0.3, de color amarillo. • Retirar la placa luego de desarrollar, dejarla secar en un extractor de vapores y

analizarla con una lámpara UV a 254 nm. • Demarcar la banda correspondiente a la rutina en la muestra, raspa r y extraer

con metanol caliente 3 veces (porciones de 5 a 10 ml). Los filtrados se concentran a sequedad y se redisuelven en 3 ml de metanol, medidos con exactitud.


77

4. Lectura espectrofotométrica y cuantificación • Leer absorbancia a 360 nm y determinar concentración mediante interpolación

con la curva de calibración.

Figura 1. Espectro UV de rutina en metanol

d. Cuantificación de anetol en semillas de anís e hinojo

Introducción El anetol es un fenilpropano que se encuentra distribuido en varia s plantas aromáticas. Esta amplia distribución, junto con la facilidad en su detección a nivel de laboratorio mediante la cromatografía en capa fina (CCF) y la espectroscopia Ultravioleta (UV), la hacen un indicador adecuado para el reconocimiento y el con trol de calidad de productos fitofarmacéuticos terminados o sus materias primas vegetales correspondientes. Procedimiento

• Preparar una solución estándar de anetol en metanol de concentración 100 ppm • Tomar 1.2 ml de solución completar a 10 ml y determinar el espectro UV entre


llevar a 10 ml según la tabla siguiente. Leer absorbancias de cada solución a la longitud de onda de trabajo. Las absorbancias deben estar en el rango de 0.3 a


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0.8, si no es así se deberán preparar diluciones calculando absorbancias de 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 y 0.7. Realizar una curva de Absorbancia vs. Concentración en ppm.


(ml) Absorbancia a

360 nm Concentración de rutina

(ppm) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0

2. Extracción de la droga • 1 g de droga seca y en polvo (pesar con balanza de precisión ± 1 diezmilésima

de gramo), se extrae con 10 ml de diclorometano, con agitación, durante 15 minutos. Filtrar, lavar el filtrado dos veces con 10 ml de diclorometano, evaporar a sequedad y pesar el extracto obtenido.


• Redisolver el extracto en 1 ml de tolueno y sembrar una banda en una cromatoplaca de sílica gel GF -254 (20x10 cm, 1 mm espesor de capa), colocando al lado una aplicación del estándar de anetol disuelto en tolueno ó diclorometano. Evaporar a sequedad el resto de extracto no sembrado y pesar. Por diferencia determinar el peso de ext racto sembrado.

• Desarrollar en la mezcla Tolueno/Acetato de etilo 93:7. • Retirar la placa luego de desarrollar, dejarla secar en un extractor de vapores y

analizarla con una lámpara UV a 254 nm. El anetol se observa a un Rf aproximado de 0.95.

• Demarcar la banda correspondiente al anetol en la muestra, raspar y extraer con diclorometano 3 veces (porciones de 5 a 10 ml). Los filtrados se concentran a sequedad y se redisuelven en 3 ml de metanol, medidos con exactitud.

4. Lectura espectrofotométrica y cuanti ficación

• Leer absorbancia a 260 nm y determinar concentración mediante interpolación con la curva de calibración.

• Determinar el porcentaje de anetol en la muestra y comparar con lo reportado para muestras auténticas.


79

Figura 2. Espectro UV de anetol en metanol


80

Práctica 8

MARCHA FITOQUÍMICA OBJETIVO Efectuar el estudio químico sistemático de las plantas con el fin de detectar varias clases de sustancias vegetales presentes en ellas como son los alcaloides, los flavonoides, las quinonas, las sapon inas, los taninos, los compuestos fenólicos, los triterpenoides, los esteroides, los cardiotónicos y las leucoantocianidinas , las que con mayor frecuencia se ha comprobado están relacionadas con actividades biológicas específicas, o se utilizan como materi as primas para el desarrollo de productos farmacéuticos comerciales . Para propósitos de la presentación de los resultados se deben utilizar las siguientes convenciones:

Resultado Asignación Negativo - Dudoso +/- Positivo + Francamente positivo ++ No determinado ND


81

1. Salado ("Salti ng out") 2. Partición con CHCl 3

Alcalinizar, Partición con CHCl3 ó CH2Cl2

HCl diluido

H2O

MUESTRA SECA Y PULVERIZADA (50 g)

FRACCIÓN A (AA, CF, TA, FL, TE, QU, CA, AL, LE)

INSOLUBLES (FRACCIÓN B) SOLUBLES

FASE CHCl 3 (FRACCIÓN C) FASE ACUOSA BÁSICA

FASE CHCl3 (FRACCIÓN D) FASE ACUOSA (FRACCIÓN E)

Ensayar FL, LE, CF, AA, TA

Ensayar AL (en medio ácido)

Ensayar CA, TE

Ensayar FL, LE, CA, TE, AL

Ensayar AL, FL, CF, TA


82

CONVENCIONES

AA = AMINOACIDOS

CF..= COMPUESTOS FENOLICOS

TA = TANINOS

FL = FLAVONOIDES

TE = TRITERPENOIDES Y/O EST EROIDES

QU = QUINONAS

CA = CARDIOTONICOS

AL = ALCALOIDES

LE = LEUCOANTOCIANINAS


83

OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DE LA FACCIÓN A

Filtrar en frío

10 ml (caliente) 10 ml

FILTRADO ACUOSO

Llevar a sequedad *

1 ml

1. Macerar con etanol 70%, 24 horas 2. Reflujar 1 hora 3. Filtrar caliente

DROGA O MUESTRA (50 g) SECA Y PULVERIZADA

FILTRADO (FRACCIÓN A) Residuo, lavarlo con alcohol

Ensayar AA

Redisolver en 20 ml de agua caliente y filtrar

FRACCIÓN A RESIDUAL

40 ml

RESIDUO

DESECHAR

FILTRADO

RESIDUO

DESECHAR Ensayar FL y LE

RESIDUO

DESECHAR

FILTRADO ACUOSO

Ensayar CF y TA

* NOTA: Para llevar a sequedad utilice calentamiento con temp eratura no mayor de 50 °C.


84

ANÁLISIS DE LAS FRACCIONES A RESIDUAL Y B

Llevar a sequedad

FRACCIÓN A RESIDUAL

Añadir 30 ml de HCl 5%. Calentar a 60 °C durante 15 minutos. Filtrar en caliente.

Lavar con 20 ml de HCl 5% y filtrar

RESIDUO

RESIDUO INSO LUBLE

RESIDUO

DESECHAR

FILTRADO ACUOSO ACIDO I

FILTRADO

Disolver con 30 ml de cloroformo o diclorometano

Deshidratar con Na 2SO4 anhidro y filtrar

FILTRADO (FRACCIÓN B)

Ensayar TE, CA, QU, FL.


85

OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DE LA FACCIÓN C

Resto

FILTRADO ACUOSO ACIDO I

Lavar con 10 ml de H 2O

FASE orgánica

RESIDUO

DESECHAR

FASE ACUOSA BÁSICA

FASE ACUOSA


Alcalinizar con gotas de NH 4OH conc. (pH 10 -11)

FASE orgánica

FILTRADO (FRACCIÓN C)

Partición con 2x15 ml de cloroformo (o diclorometano)

Llevar a sequedad

Redisolver en 10 ml de HCl 5% con calor y filtrar

Ensayar CA y TE. FILTRADO

Ensayar AL.

RESIDUO

DESECHAR

5 ml


86

OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DE LAS FRACCIONES D Y E

FASE ACUOSA BÁSICA

Lavar con 20 ml de solución semisaturada de NaCl

FASE orgánica FASE ACUOSA (FRACCIÓN E)

FASE ACUOSA


FASE orgánica

FILTRADO (FRACCIÓN D)

Hacer partición con 2x15 ml de CHCl 3 ó CH2Cl2

Redisolver D1 en 4 ml de etanol y ensayar FL, CA, LE.

RESIDUO

DESECHAR Repartir en tres porciones iguales de 5 ml c/u: D1, D2 y D3. L levar a sequedad.

Redisolver D2 en 1 ml de CHCl 3 y ensayar TE.

Redisolver D3 en 5 ml de HCl 1% y ensayar AL.

Neutralizar con HCl y ensayar FL, LE, AL (en medio ácido), CF (pH ligeramente ácido) y TA (pH neutro).

FIN


87


88

ENSAYOS SOBRE LAS FRACCIONES A -E 1. ENSAYO DE SHINODA (O DE LA CIANIDINA) PARA FLAVONOIDES Y OTRAS

SUSTANCIAS CON EL NUCLEO γ-BENZOPIRONA. Precaución 1: Antes de realizar el ensayo, si se trata de muestras que contienen demasiadas clorofilas, estas se deben eliminar precipitándolas co n acetato de plomo en solución. Precaución 2: Si la muestra está en solución clorofórmica o diclorometánica, se debe evaporar para eliminar el solvente y redisolverla en 1 ml de alcohol. Precaución 3: Realizar la prueba en la campana de extracción de gas es y sujetando el tubo de ensayo con una pinza. Ensayo: Tomar 1 ml de solución en un tubo de ensayo limpio. Añadir algunas li maduras de Mg. sujetar el tubo con una pinza. Añadir cuidadosamente por la pared del tubo, unas gotas de HCl concentrado (37%). La aparición de coloraciones naranja a violeta es prueba positiva para la presencia de flavonoides. Para fines de comparación realizar la prueba con 0.5 ml de una solución patrón de morina. 2. ENSAYO DE ROSENHEIM (PARA LEUCOANTOCIANIDINAS): Ensayo: Tomar 1.0 ml de solución acuosa en un tubo de ensayo limpio. Añadir 0.5 ml de HCl concentrado. Mezclar. Calentar durante 10 minutos a 100 0C y enfriar. Pasar a un tubo de ensayo de 10 x 75 mm. Añadir 0.4 ml de alcohol amílico y agi tar. Dejar separar las fases. La prueba se considera positiva si aparece coloración en la fase amílica que vaya desde el carmesí oscuro al rosado débil. 3. ENSAYO DEL FeCl 3 (PARA COMPUESTOS CON HIDROXILOS FENOLICOS): Ensayo: Tomar 1.0 ml de solución acuosa o alcohólica en un tubo d e ensayo limpio. Añadir 1 gota de FeCl 3 al 1% acuoso o alcohólico. Mezclar. La aparición de coloraciones violeta, verdes, azules u oscuras se considera prueba positiva. Para fines de comparación realizar la prueba con 0.5 ml de solución pa trón de ácido tánico.


89

4. ENSAYO DE LA GELATINA -SAL (PARA TANINOS): Ensayo: Tomar 1.0 ml de solución acuosa neutra en un tubo de ensayo limpio. Aña dir 1.0 ml de solución de gelatina -sal. La formación de un precipitado se considera prueba positiva. Centrifugar si es ne cesario para observar el precipitado. Precaución: Algunas otras sustancias también producen precipitados con este reactivo, para eliminar tales interferencias, es recomendable uti lizar el procedimiento de Sanabria, Pág. 73. 5. ENSAYO DE LIEBERMANN -BURCHARD (PARA TRITERPENOIDES Y/O

ESTEROIDES CON GRUPOS DIENO CONJUGADOS REALES O POTENCIALES):

Precaución 1: El ensayo se realiza con muestras disueltas en cloroformo ó Diclorometano únicamente. Precaución 2: Al adicionar el ácido sulfúrico hacerlo en la ca mpana de extracción. La reacción libera calor, utilizar pinza para tubo de ensayo. Si la solución ó el tubo de ensayo no están completamente secos puede haber salpicaduras. Ensayo: Tomar 0.5 ml de solución clorofórmica anhidra en un tubo de ensayo limpio y seco. Añadir 0.5 ml de Anhídrido acético. Añadir cuidadosamente por la pared del tubo, una gota de Acido sulfúrico concentrado. Observar y anotar los cambios de coloración. Se considera positiva la prue ba cuando aparecen coloraciones violeta, verde o az ul. 6. ENSAYO DE BORNTRANGER (PARA NAFTO - Y ANTRAQUINONAS) Precaución: Realizar esta prueba en la campana de extracción ya que el benceno y el tolueno son sustancias muy tóxicas. Ensayo: Tomar 3 ml de solución clorofórmica y llevarlos a sequedad. Rediso lver en 5 ml de alcohol: H 20 (1:7). Añadir 1 ml de agua oxigenada de 20 volú menes, 1 ml de ácido sulfúrico al 50% y calentar la mezcla en un baño de agua hirviendo durante 10 -15 minutos. Dejar enfriar y extraer en un embu do de separación con 5 ml de benc eno ó tolueno. Retirar 2 ml de la fase orgánica y agitarla en otro tubo con 1.0 ml de solución de NaOH al 5% en NH 4OH al 2%. La prueba se considera positiva cuando aparecen coloraciones que van del rosado al rojo intenso en la ca pa alcalina.


90

7. ENSAYO DE KEDDE (PARA CARDIOTONICOS) Precaución: La formación del color violáceo no dura sino algunos pocos segundos. Ensayo: Tomar 1 ml de la fase orgánica. Llevar a sequedad. Redisolver en 1 ml de alcohol. Añadir 0.5 ml de reactivo de Kedde recién prepa rado (Mezcla de partes iguales de las soluciones A y B). Se considera positiva la prueba si aparece una coloración púrpura o violácea. Como referencia se puede compa rar con el color producido con 1 ml de KOH al 5% en alcohol. 8. ENSAYOS PARA ALCALOIDES Precaución 1: Todos los ensayos deben hacerse siempre con la muestra disuelta o redisuelta en HCl 5% acuoso. Precaución 2: La solución acuosa ácida debe estar libre de turbiedades y precipitados antes de hacer los ensayos para alcaloides. Precaución 3: Luego de realizados los ensayos, se deben desechar las muestras en un frasco dispuesto para ello en el laboratorio, esto con el fin de no contaminar el ambiente con metales pesados. Ensayos: Tomar 0.5 ml de solución acuosa ácida en 4 tubos de ensayo limpios. Añadir a cada tubo 1 gota de los reactivos de Dragendorff, Mayer, Valser y Reineckato de amonio. Se considera prueba positiva cuando aparecen preci pitados en por lo menos 3 tubos. Para fines de comparación realizar el ensayo con 0.5 ml de una solución p atrón de sulfato de quinina. 9. ENSAYO DE NINHIDRINA (PARA AMINOACIDOS). Ensayo: Colocar 1 gota de solución, en una tirilla de papel filtro. Secar. Añadir 1 gota de reactivo de ninhidrina (Solución al 0.002% en alcohol). Calentar sobre una plancha de calentamiento a 1050C. El desarrollo de coloraciones violeta, azul o rosada se considera prueba positiva.


91

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA 1. SANABRIA G. Antonio: “Análisis Fitoquímico Preliminar”, Departamen to de

Farmacia, Universidad Nacional, Bogotá, 198 3. 2. ARANGO A. Gabriel J. QUIJANO T. Jairo: “Marcha Fitoquímica Semicuantitativa”,

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Antioquia, Medellín. 3. DOMINGUEZ X.A., “Métodos de Investigación Fitoquímica”, Ed. Limusa, México,

1979.


92

PAUTAS PARA LA ELABORACIÓN DEL INFORME DE LABORATORIO

El informe de laboratorio incluirá el desarrollo y presentación de cada uno de los siguientes puntos:

TITULO

El titulo debe describir en forma somera el alcance del expe rimento realizado procurando que no sea excesivamente largo y detallado como tampoco que sea muy corto y demasiado general.

Cuando un experimento se trabaje con una determinada especie vegetal o animal, el titulo debe incluir el nombre científico de la misma, de acuerdo con las normas universales estableci das; además el nombre vulgar, y la familia a la cual pertenece la muestra. En este caso, también debe incluirse el nombre de la parte de la especie analizada (por ejemplo: raíz, fruto, hojas, partes aéreas, etc.).

Por otro lado, el titulo debe incluir los nombres de las prin cipales técnicas de laboratorio empleadas (ejemplo “Purificación por cromatografía en columna de . . .”, “... identificación por espectroscopia ultravioleta de . . . “, etc.) .

Un modelo de título es: “Aislamiento y caracterización del componente principal del aceite esencial de

hojas de ajenjo, Artemisia absinthium , Compositae, mediante cromatografía en capa fina y técnicas espectrales”

En este título se reconocen las siguientes partes: Los logros alcanza dos: Aislamiento y caracterización de una sustancia. La parte de la planta analizada : Las hojas El nombre común de la planta : El ajenjo El nombre científico de la planta : Artemisia absinthium ( en itálicas) La familia vegetal : Compositae (en inglés), ó Compuestas (en español) La técnica de aislamiento : Cromatografía en capa fina . La técnica de caracterización : Métodos espectrales . DATOS En esta parte del informe deben incluirse todas las medicio nes y observaciones

realizadas en el laboratorio y que permiten hacer un análisis e interpretación de los fenómenos observados. Por ejemplo, los dibujos de las cromatoplacas obtenidas en un análisis por cromatografía en capa fina con sus manchas y colores correspondientes ; los valores de absorbancia o transmitancia de un pigmento carotenoide al analizarlo por espectroscopia ultravioleta, los espectros


93

infrarrojo o ultravioleta determinados; los resultados de reacciones coloreadas para reconocer algún metabolito secun dario, etc.

ANALISIS DE RESULTADO S

En este ítem se incluirá la forma como se interpretaron los resultados obtenidos por comparación con datos obtenidos con patrones o reportados en la literatura científica, citando como una nota al pié la referencia bibliográfica correspondiente. Al citarse un dato u observación de los reportados en la li teratura, debe siempre citarse la correspondiente referencia, la cual debe aparecer en el ítem Bibliografía, y en el texto debe señalarse dicha referencia, por ejemplo: “ANALISIS DE RESULTADOS

La sustancia aislada mostró un máximo de absorción en su es pectro ultravioleta en 206 nm, lo cual esta de acuerdo con lo reportado por Silverstein (1978) para sustancias con enlaces dobles aislados....”

″.... De acuerdo con este análisis la sustancia mas pro bable es el B—caroteno, ya que se necesitaría determinarle por lo menos el correspondiente espectro de masas para confirmar este hecho....”

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

En este ítem se debe incluir solamente aquellos hechos demos trados en la observación experimental de cada práctica, y las sugerencias que se considere de interés sobre las conclusio nes obtenidas.

Las conclusiones no deben ir reseñadas bibliográficamente, puesto que son inherentes a la interpretación que dé el es tudiante al experimen to realizado.

Por ejemplo unas conclusiones pueden ser:

“...el principal componente del aceite de clavo el eugenol”.

“De acuerdo con los sistemas utilizados en la práctica el mejor sistema eluente para separar por cromatografía en capa fina los caroteno ides de la zanahoria (Daucus caraota ) es la mezcla diclorometano/éter de petróleo 50:50...”.

Las conclusiones no deben incluir eventos tales como cortes de energía, falta de recursos, daño de aparatos, excusas mé dicas, etc.


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BIBLIOGRAFIA

Este ítem debe relacionar en el orden alfabético (por apelli dos del primer autor) solamente aquellos documentos, libros, revistas, folletos, comunicaciones personales, etc. que sean inherentes al informe, es decir los que efectivamente fueron consultados por el es tudiante para la elaboración del informe.

Por otro lado, si el estudiante encuentra un mismo dato re portado en varias fuentes bibliográficas, debe reportar solo aquella que considere más conveniente de acuerdo con su criterio. Por ejemplo, si encontró en el libro A que el fruto del tomate maduro contiene licopeno, y en otro libro B encontró que el mismo contiene β-caroteno (pigmento amarillo) y licopeno (pigmento rojo) junto con otros pigmentos carotenoides... etc. , debe reportar solo el libro que le informe más sobre lo reali zado en la práctica, es decir el B, en este caso. Si no es posible discernir entre uno y otro, siempre debe reportarse el más reciente en su publicación.

Para propósitos de presentar las referencias bibliográficas en cada informe s e deben tomar los siguientes modelos:

Para libros:

Autor(es); “Título”, volumen, Editor o Editorial, Número de edición, ciudad, año, paginas consultadas.

Ejemplo:

HARBORNE J.B.: “PHYTOCHEMICAL METHODS”, Chapman and Hall Ltd., New York, 1973, pp 119 —120.

Para revistas:

Autor(es); título del artículo (en minúsculas), nombre de la revista (en may4sculas), volumen, número, paginas consultadas, (año).

Por ejemplo el siguiente modelo:


95

Garg V.K., Nes W.R.; “Codisterol and other ∆5-Sterols in the seeds of Cucurbita maxima “ PHYTOCHEMISTRY 23 (12), 2925 —2929 (1974).

Para documentos publicados en Universidades:

Autor(es), título, Facultad o Departamento, Universi dad, ciudad, año, páginas consultadas.

Por ejemplo:

Martínez M. A.; “Manual de practi cas para el laborato rio de Fitoquímica”, Facultad de Química Farmacéutica, Universidad de Antioquia, Medellín, 1988, pp. 15—18. Para referencias bibliográficas de Internet: Se deben citar solamente páginas web de entidades académicas y científicas reconocidas, acompañadas de la primera página impresa con la correspondiente dirección http y la fecha de consulta. No se aceptan como referencias bibliográficas las comunicaciones personales, excepto las impresas enviadas por correo electrónico. Nota: Cuando se reporten referencias bibliográficas incompletas ó que se compruebe que no son consistentes con lo escrito en el informe, este se calificará sobre una base del 70% de la calificación máxima.

Evaluación: • Práctica 1: Informe al profesor, 5% • Práctica 2: Informe 7%, quiz 3% • Práctica 3: Informe 7% y quiz 3% • Práctica 4: Informe 7%, quiz 3% • Práctica 5: Informe 7%, quiz 3% • Práctica 6: Informe, 10% • Práctica 7: Informe, 10% • Práctica 8: Informe 7% y quiz 3% • Práctica especial: Anteproyecto 5%, Póster 20%.


96

Bibliografía 1. Domínguez, X. A., Métodos de Investigación Fitoquímica, Edit. Limusa, Mexico,

1973. 2. Wagner, H., Bladt, S., Zgainski, E. M., Plant Drug Analysis. A Thin Layer

Chromatography Atlas, Springer -Verlag, Berlin-Heidelberg-New York-Tokyo, 1984. 3. Evans, W. C., Farmacognosia Trease -Evans, 13 edic., Interamericana McGraw -Hill,

Madrid-Auckland-Bogotá, 1991. 4. Harborne, J. B., Phytochemical Methods. A Guide to Modern Techniques of Plant

Analysis, Chapman & Hall, London -Weinheim-New York, 1998. 5. Gattuso, M. A., Ga ttuso, S. J., Manual de Procedimientos para el Análisis de Drogas

en Polvo, UNR Editora, Cyted, Rosario (Argentina), 1999. 6. Ramírez, S., Fonnegra, R., Plantas Medicinales Aprobadas en Colombia,

Universidad de Antioquia, Medellín, 1999. 7. http://matematicas.udea.edu.co/~carlopez/laboratorio/pagelab.html 8. http://farmacia.udea.edu.co/~ff 9. http://matematicas.udea.edu.co/~carlopez 10. Stahl, E., Thin Layer Chromatography 11. Martínez, A., Farmacognosia y Fitoquímica Experimental, Universidad de Antioquia,

Medellín, 1991. 12. Revistas especializadas: Phytochemistry, Planta Medica, Journal of Natur al

Products, Journal of Food and Agricultural Chemistry, etc. 13. Bases de datos: Napralert 14. República de Colombia, Ministerio de Salud, Decreto ley Nº 677, Ley del

medicamento de 1994. 15. Quality Control Methods for Medicinal Plant Materials, World Health Org anization,

Geneva, 1998. 16. Sharapin, N., Fundamentos de Tecnología de Productos Fitoterapeúticos, Roberto

Pinzón ed., Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo, Cyted, Santafé de Bogotá D. C., 2000.

17. CD Farmacognosia y Fitoquímica, versión 2.0, Alejandro Martínez , Universidad de Antioquia, Medellín, 200 5.

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