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UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
FACULTAD DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA I
Recopilado por:
Cristina Lucía Mora Arango
Elkin Galeano Jaramillo
Edison Osorio Durango
Medellín, Septiembre de 2012
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PROGRAMA DEL CURSO DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA I
2012
Objetivo general: reconocer y evaluar los parámetros de calidad aplicados a las
materias primas de origen natural con interés farmacéutico.
Temas del curso:
Unidad 1. INTRODUCCIÓN.
Presentación del curso, normas de seguridad en el laboratorio (3 horas).
Unidad 2. RECONOCIMIENTO DE LA FLORA MEDICINAL.
Reconocimiento de las diferentes especies de plantas medicinales que se
encuentran en el entorno del Campus Universitario o en el Huerto de plantas
medicinales del Jardín Botánico (3 horas).
Unidad 3. MANEJO DE LA INFORMACIÓN BIBLIOGRÁFICA EN FARMACOGNOSIA.
Búsqueda bibliográfica en bases de datos especializadas. Normas para reportar
adecuadamente las referencias bibliográficas (3 horas).
Unidad 4. RECONOCIMIENTO DE LA MORFOLOGÍA VEGETAL.
Reconocimiento de la morfología vegetal y tejidos internos en placas de colección
previamente preparadas. Reconocimiento morfológico externo de plantas
medicinales aprobadas en Colombia (6 horas).
Unidad 5. RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS PRIMARIOS DE INTERÉS EN
FARMACOGNOSIA.
Reconocimiento de compuestos pertenecientes al metabolismo primario (gránulos
de almidón, aleurona y aceites fijos) mediante pruebas químicas de coloración y
análisis microscópico de las estructuras, de acuerdo con la información reportada
en las Farmacopeas oficiales (3 horas).
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Unidad 6. ANÁLISIS MICROSCÓPICO DE MATERIAL VEGETAL.
Reconocimiento de elementos de valor diagnóstico en el material vegetal (cristales
de oxalato de calcio, gránulos de polen, pelos epidérmicos, vasos lignificados,
estomas), de acuerdo con la información reportada en las Farmacopeas oficiales
(3 horas).
Unidad 7. IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS.
Reconocimiento mediante pruebas químicas de compuestos fenólicos, terpénicos
y nitrogenados en muestras vegetales conocidas (6 horas).
Unidad 8. RECONOCIMIENTO DE ADULTERACIONES Y/O FALSIFICACIONES EN EL
MATERIAL VEGETAL.
Aplicación de ensayos físicos (organolépticos-macroscópicos), análisis
microscópico (identificación de elementos de valor diagnóstico) y pruebas
químicas de coloración en la identificación de adulteraciones y/o falsificaciones en
el material vegetal (3 horas).
Unidad 9. IDENTIFICACIÓN CROMATOGRÁFICA DE PLANTAS MEDICINALES.
Aplicación de las técnicas básicas de cromatografía de capa fina para la
identificación de plantas medicinales (3 horas).
Unidad 10. CONTROL DE CALIDAD DE PLANTAS MEDICINALES DE ACUERDO CON
FARMACOPEAS OFICIALES.
Pruebas de identidad general: identificación de características organolépticas,
características macro y microscópicas, perfil cromatográfico. Pruebas de pureza:
cuantificación de material extraño. Ensayos químicos: pruebas cualitativas
(6 horas).
Unidad 11. PRÁCTICA ESPECIAL.
Implementación de pruebas preliminares de actividad biológica: actividad
antioxidante, actividad larvicida, actividad fitotóxica (12 horas).
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PRESENTACIÓN
El Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia I incluye la revisión y
actualización de las prácticas experimentales contenidas en el Manual de
Laboratorio de Farmacognosia preparado por las profesoras Luz Mariela Sorza y
Gloria Amparo Valencia (2000) y en el Manual de Prácticas de Laboratorio de
Farmacognosia y Fitoquímica recopilado y revisado por los profesores Alejandro
Martínez, Gloria Amparo Valencia, Nora Jiménez, Monica Mesa y Elkin Galeano.
En la presente actualización se incluye el desarrollo de nuevas prácticas
experimentales que hacen parte del programa académico de Laboratorio de
Farmacognosia I y están dirigidas hacia la identificación de los diferentes factores
involucrados en la producción de drogas, aplicación de técnicas para el
reconocimiento de metabolitos primarios y secundarios, aplicación de pruebas
específicas para el control de calidad de materia prima de origen natural y
evaluación de la actividad biológica de extractos de interés farmacéutico.
5
CONTENIDO
Pág.
Programa de laboratorio de Faramacognosia I ……………………………………………….. 2
Práctica No 2. Reconocimiento de la flora medicinal……………………………………….. 6
Práctica No 3. Manejo de la información bibliográfica en farmacognosia…................................ 7
Práctica No 4. Reconocimiento de la morfología vegetal…………………………………… 8
Práctica No 5. Reconocimiento de metabolitos primarios
de interés en farmacognosia………......................................................................
16
Práctica No 6. Análisis microscópico de material vegetal…………………………………... 25
Práctica No 7. Identificación de metabolitos secundarios…………………………………... 28
Práctica No 8. Reconocimiento de adulteraciones y/o
falsificaciones en el material vegetal…………………………………………………
40
Práctica No 9. Identificación cromatográfica de plantas medicinales……………………... 45
Práctica No 10. Control de calidad de plantas medicinales
de acuerdo con farmacopeas oficiales………………………………………………
50
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Práctica No 2
RECONOCIMIENTO DE LA FLORA MEDICINAL
OBJETIVO
Reconocimiento de los ejemplares vegetales cultivados en el huerto de
plantas medicinales del Jardín Botánico y/o en la flora universitaria.
METODOLOGÍA
Para el desarrollo de esta práctica el estudiante en visita guiada a las instalaciones
del huerto de plantas medicinales del Jardín Botánico recibirá la información y
capacitación brindada por parte del profesor, relacionada con las características
botánicas y la actividad terapéutica de las plantas medicinales. Una vez recibida la
capacitación el estudiante procederá a la presentación del respectivo informe que
debe contener una tabla en la que se incluyan las plantas observadas con el
nombre científico, nombre común, uso terapéutico, droga aprobada y una breve
descripción botánica.
CONSULTA
Consultar sobre las 10 especies de plantas medicinales de mayor comercialización
en Colombia, sus condiciones de cultivo y el uso terapéutico aprobado por el
INVIMA.
BIBLIOGRAFÍA DE CONSULTA
FONNEGRA G. Ramiro, JIMÉNEZ R. Silvia Luz. Plantas Medicinales Aprobadas
en Colombia. Editorial Universidad de Antioquia. Segunda edición. 2006.
Ministerio de Protección Social. Vademecum Colombiano de Plantas Medicinales.
Colombia. MPS. 2008.
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Práctica No 3
MANEJO DE LA INFORMACIÓN BIBLIOGRÁFICA EN FARMACOGNOSIA
OBJETIVOS
Capacitar al estudiante el manejo de las bases de datos documentales y la
información consignada en la Biblioteca Central.
Explicar de manera práctica los modelos de búsqueda de información aplicada
a los temas de farmacognosia y plantas medicinales.
Aprender a reportar adecuadamente las referencias bibliográficas.
METODOLOGÍA
Para el desarrollo de esta práctica el estudiante en visita guiada a las instalaciones de
la biblioteca central recibirá la información y capacitación sobre manejo de bases de
datos documentales por parte de los profesores encargados.
Una vez recibida la capacitación el estudiante debe hacer entrega de un informe con
el siguiente contenido:
1. Consultar la monografía de una planta medicinal asignada por el profesor, teniendo
en cuenta los siguientes aspectos: nombre científico, descripción botánica,
descripción microscópica, uso terapéutico aprobado, droga aprobada, reacciones
adversas, advertencias y contraindicaciones. Esta información se encuentra en las
farmacopeas oficiales y textos de referencia en farmacognosia.
2. Aplicar los conocimientos sobre la forma adecuada de reportar libros, artículos de
revistas y documentos electrónicos en cada uno de los informes de laboratorio.
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Práctica No 4
RECONOCIMIENTO DE LA MORFOLOGÍA VEGETAL
OBJETIVOS
Identificar los tejidos internos de las plantas monocotiledóneas y
dicotiledóneas, realizando observación microscópica sobre cortes
histológicos previamente preparados de raíces, tallos y hojas.
Aplicar los criterios para clasificar las plantas en monocotiledóneas y
dicotiledóneas a partir del análisis de las características de morfología
externa de las raíces, tallos, hojas y flores.
MARCO TEÓRICO
La morfología vegetal es la parte de la botánica que estudia las formas y
estructuras de las diferentes partes del cuerpo de la planta teniendo en cuenta
aspectos histológicos y fisiológicos en el proceso de modificación y transformación
de las plantas.
Para estudiar la estructura interna de un órgano, generalmente se realizan cortes
transversales y se utilizan colorantes para diferenciar los tejidos.
Raíz
Es el órgano generalmente subterráneo en las plantas, en general las funciones
del sistema radical son: absorción y conducción de sustancias, sostén y fijación de
la planta, almacenamiento de sustancias, reproducción vegetativa en algunas
especies.
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Raíz de plantas dicotiledóneas:
En el corte transversal de la raíz de una planta dicotiledónea a nivel de la zona
pilífera, se pueden identificar los siguientes tejidos:
1. Epidermis: capa de una célula de espesor en la parte externa de la raíz, no
posee cutícula.
2. Córtex: grupo de tejidos que ocupa el mayor volumen de la raíz, el cual está
comformado por: exodermis, parénquima cortical y endodermis.
2.1. Exodermis: células parenquimáticas subepidérmicas que se asemejan a la
endodermis.
2.2. Parénquima cortical: células de pared celular delgada, especializadas en el
almacenamiento de sustancias.
2.3. Endodermis: capa de células prismáticas que rodean el cilindro central, se
pueden identificar las células que hacen parte de las bandas de Caspary y las
células de paso.
3. Estela: corresponde al cilindro central del cuerpo primario de la raíz y está
conformada por el periciclo, los tejidos vasculares primarios y el cambium vascular
3.1. Periciclo: tejido parenquimático de una o varias células de espesor ubicado
inmediatamente después de la endodermis hacia el centro de la raíz, en el
proceso de diferenciación, a partir de estas células se originan las raíces laterales
de la planta.
10
3.2. Tejidos vasculares primarios: constituidos por células del xilema y del floema.
3.3. Cambium vascular: tejido meristemático de varias células de espesor con
paredes delgadas que bordean el xilema y lo separan del floema.
En la figura 1, se presenta un corte transversal de una raíz dicotiledónea a nivel de
la zona pilífera, deben identificar los diferentes tejidos de acuerdo con la
información anterior.
Figura 1. Fotografía del corte transversal a nivel de la zona pilífera de la raíz de una
planta dicotiledónea en la que se observa el tejido parenquimático y los diferentes tejidos
que conforman el cilindro central.
Raíz de plantas monocotiledóneas:
En el corte transversal de la raíz de una planta monocotiledónea a nivel de la zona
pilífera, se pueden identificar los mismos tejidos presentes en las dicotiledóneas a
excepción del cambium vascular. El xilema en las raíces de las plantas
monocotiledóneas posee muchos brazos y en el cilindro central se puede observar
una porción de tejido parenquimático que conforma la médula.
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A continuación en la figura 2, se observa el corte transversal de una raíz
monocotiledónea a nivel de la zona pilífera, con el fin de que se identifiquen los
tejidos correspondientes.
Figura 2. Fotografía del corte transversal a nivel de la zona pilífera de la raíz de una
planta monocotiledónea. Se observan las diferencias en cuanto a la disposición del xilema
y floema al interior del cilindro central.
Tallo
El tallo es el órgano de la planta generalmente aéreo que desempeña las
siguientes funciones: produce y sostiene ramas y flores, conduce sustancias a
través del xilema y el floema.
Tallo de plantas dicotiledóneas:
En el corte transversal del tallo de una planta dicotiledónea se pueden identificar
los siguientes tejidos, desde la parte externa hasta la más interna:
1. Epidermis: primera capa de una sola célula de espesor cubierta por una
cutícula impermeable de cutina.
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2. Córtex: está conformado por los tejidos comprendidos entre la epidermis y la
parte más externa del haz vascular como colénquima, parénquima cortical,
clorénquima, esclerénquima.
3. Estela: es la parte central del tallo, conformada por los tejidos vasculares, el
cambium vascular y la médula.
3.1. Tejidos vasculares: estructuras ovaladas conocidas como haces vasculares
conformadas por esclerénquima, floema (elementos del tubo criboso y células
compañeras), cambium vascular y xilema (elementos del vaso, traqueidas y fibras
del xilema).
3.2. Médula: región central constituida por tejido parenquimático.
En la figura 3 se presenta el corte transversal del tallo de una planta dicotiledónea,
en el cual se deben identificar los principales tejidos.
Figura 3. Fotografía del corte transversal del tallo de una planta dicotiledónea en la que
se identifica de manera representativa el tejido colénquima, los haces vasculares y la
médula.
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En el corte transversal del tallo de una planta monocotiledónea, en general se
observan los mismos tejidos que en el tallo de una planta dicotiledónea, con la
diferencia de que en estos tallos el tejido esclerenquimático se presenta
internamente a la epidermis y los haces vasculares se encuentran dispersos en el
tejido parenquimático y están rodeados por una vaina de esclerénquima que le
proporciona mayor resistencia a la planta. A continuación se presenta la imagen
para identificar los principales tejidos.
Figura 4. Fotografía del corte transversal del tallo de una planta monocotiledónea en la
que se observa el tejido esclerénquima y la distribución de los haces vasculares.
Hoja
La hoja es el órgano vegetativo de la planta, generalmente en forma laminar que
tiene como función principal el proceso de la fotosíntesis, respiración, transpiración
y gutación.
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En el corte transversal de una hoja se observan los siguientes tejidos:
1. Epidermis: capa de células que protege la hoja ubicadas en la superficie del
haz y del envés, recubierta por una cutícula impermeable. En la epidermis se
pueden identificar células epidérmicas comunes, células de guarda (oclusivas) y
células adyacentes (subsidiarias).
2. Mesófilo: es el tejido más abundante de la hoja, en el cual se realiza la
fotosíntesis y está conformado por parénquima en empalizada y parénquima
esponjoso.
2. 1. Parénquima en empalizada: una o dos capas de células cilíndricas ubicadas
en la parte superior de la hoja, presentan gran cantidad de cloroplastos.
2.2. Parénquima esponjoso: formado por células esféricas y células de forma
irregular que se distribuyen dejando espacios intercelulares denominados meatos
o cámaras subestomáticas.
3. Nervaduras: son la continuación del xilema y el floema del tallo. En un corte
transversal de la hoja, en cada nervadura se observa el haz vascular con el xilema
hacia el haz y el floema hacia el envés.
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Figura 5. Fotografía del corte transversal de la hoja. Se observa el tejido epidérmico, las
células del mesófilo y los tejidos vasculares de las nervaduras.
METODOLOGÍA
Para el desarrollo de la práctica se divide el estudio en:
1. Aspectos correspondientes al análisis de la morfología interna (histología).
El profesor pondrá a disposición de los estudiantes una serie de placas
previamente preparadas en las cuales deben identificar utilizando el microscopio
las estructuras y tejidos internos presentes en las raíces, tallos y hojas de plantas
monocotiledóneas y dicotiledóneas. El estudiante debe identificar y dibujar las
estructuras claramente diferenciadas en cada uno de los cortes observados e
incluir el análisis de resultados en el informe.
2. Aspectos correspondientes al análisis de la morfología externa
(cuerpo de la planta).
De acuerdo con las características morfológicas externas observadas en las
plantas asignadas, realizar la clasificación y consignar la información
correspondiente en formato de tabla, incluyendo los siguientes aspectos para cada
una de ellas: nombre común, nombre científico, análisis de las hojas: complejidad,
filotaxia, características del peciolo y de las nervaduras; clasificación del tallo:
herbáceo, leñoso; clasificación de la raíz: fibrosa, pivotante; número de verticilos
florales y clasificación de acuerdo con las características externas en
monocotiledóneas o dicotiledóneas.
CONSULTA
Consultar la clasificación de las raíces, tallos y hojas de acuerdo con las
características de su morfología externa.
BIBLIOGRAFÍA
URIBE Álvarez Frank. Botánica General. Editorial Universidad de Antioquia.
Segunda edición. 1991.
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Práctica No 5
RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS PRIMARIOS DE INTERÉS EN
FARMACOGNOSIA
OBJETIVOS
Aprender a identificar microscópicamente sustancias características de
plantas, formadas por moléculas pertenecientes al metabolismo primario.
Identificar la presencia de almidón en diferentes fuentes vegetales
mediante reacciones químicas y pruebas microscópicas.
Identificar microscópicamente la presencia de gránulos de aleuronas en
diferentes fuentes vegetales.
Identificar microscópicamente la presencia de gránulos de aceites fijos en
diferentes fuentes vegetales.
MARCO TEÓRICO
El metabolismo primario es el grupo de procesos metabólicos esenciales “vitales”
para los organismos vivos, estos procesos están asociados a 4 grandes grupos de
reacciones anabólicas/catabólicas:
1. Metabolismo de los carbohidratos:
Los carbohidratos, también llamados hidratos de carbono ó glúcidos, son un grupo
de moléculas formadas principalmente por carbono, oxígeno e hidrógeno. Algunos
micro-organismos tienen la capacidad de bio-sintetizar carbohidratos conteniendo
azufre, fosforo y nitrógenos en sus estructuras.
Clasificación de los carbohidratos: consultar y complementar el siguiente
diagrama.
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El almidón: Está formado por unidades de glucosa y se encuentra en los cereales
como maíz, arroz y trigo, y en tubérculos como papas, ñame y yuca.
Frecuentemente se encuentra formado en un 25% por amilosa y un 75% por
amilopectina. A continuación se presentan las estructuras químicas de dos
polisacáridos de importancia en los vegetales: celulosa y almidón.
Figura 6. Estructuras químicas de la celulosa y el almidón.
2. Metabolismo de los lípidos:
Los lípidos, son un grupo de ácidos grasos no volátiles, químicamente se
encuentran generalmente como cadenas alifáticas saturadas o insaturadas, en
O
H
HH
H
OH
OH
H OH
CH2OH
O
O
H
HH
H
OH
H OH
CH2OH
O
O
H
HH
H
OH
H OH
CH2OH
O
O
H
HH
H
OH
H OH
CH2OH
R
O H
HH
H
OH
OH
H OH
CH2OH
O
O H
HH
H
OH
H OH
CH2OH
O
O H
HH
H
OH
H OH
CH2OH
O
O
H
HH
H
OH
H OH
CH2OH
R
Celulosa
Almidón
18
general lineales; solubles en solventes orgánicos apolares (como cloroformo,
hexano), y son casi insolubles en agua. Los mamíferos los acumulamos como
grasas, los peces como ceras y en las plantas en forma de aceites. Los
fosfolípidos y esteroles constituyen alrededor de la mitad de la masa de las
membranas biológicas.
Consultar y complementar el siguiente diagrama sobre la clasificación de los
lípidos:
A continuación se presentan las estructuras químicas de compuestos lipídicos de
mayor importancia a nivel biológico.
Figura 7. Estructuras químicas de los principales lípidos de importancia biológica.
OHColesterol
O
OHÁcido graso libre
OO
O
O
O
O
Triglecerido
O
O
O
O
P
O
OHO N
+
Fosfolípido
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3. Metabolismo de las proteínas:
Las proteínas son biomóleculas formadas básicamente por carbono, hidrógeno,
oxígeno y nitrógeno. Pueden además contener azufre y en algunos tipos de
proteínas: fósforo, hierro, magnesio y cobre entre otros elementos. Pueden
considerarse polímeros de unas de aminoácidos unidos mediante enlaces
peptídicos.
Consultar y complementar el siguiente diagrama sobre la clasificación de las
proteínas:
A continuación se encuentran las estructuras químicas de tres aminoácidos
importantes en el metabolismo vegetal (Ala, Arg, His) y un modelo de la estructura
secundaria de una proteína.
O
NH2
CH3 OH
Alanina (Ala)
NH
O
NH
NH2
NH2
OH
Arginina (Arg)
O
NH2
N
NH
OH
Histidina (His)
Figura 8. Estructuras químicas de algunos aminoácidos y estructura secundaria de una
proteína.
Aleuronas: las aleuronas, del griego aleuron que significa harina, son un grupo de
gránulos proteicos presentes principalmente en las semillas de las plantas,
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localizado en la parte externa del endospermo y que tienen la función de ser
material de reserva para el crecimiento del embrión, se encuentran principalmente
en los cereales y algunas raíces.
METODOLOGÍA
Material vegetal:
Maíz: _____________________ (nombre científico)
Yuca: _____________________
Arroz: _____________________
Papa: _____________________
ANÁLISIS QUÍMICO:
Cortar o rallar 15 g de material vegetal sin cáscara y extraer con 10 ml de agua
(sin calentar). Filtrar y realizar las siguientes reacciones por separado en tubos de
ensayo:
2 ml almidón + lugol _____________________________________________
2 ml almidón + 6 ml H20: Medir pH ____________________________________
ANÁLISIS MICROSCÓPICO:
Tomar 1 gota de la solución filtrada para los análisis químicos y observar al
microscopio cada una de las muestras de almidón preparada (maíz, yuca, papa y
arroz).
Almidón de papa: Se observa como gránulos pequeños circulares con hilum
céntrico y gránulos grandes de forma elípticas con hilum excéntrico. El tamaño
promedio de los gránulos es de 15 μm con una desviación estándar de ±10 μm;
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Almidón de maíz: Se observa como gránulos irregulares y poligonales con hilum
concéntrico de forma mixta: se puede observar como un punto en forma de
asterisco, una línea o una cruz. El tamaño promedio de los gránulos es de 12 μm
con una desviación estándar de ±6 μm.
Almidón de yuca: Se observa como gránulos elípticos o redondeados, con hilum
concéntrico de forma puntual. El tamaño promedio de los gránulos es de 10 μm
con una desviación estándar de ±5 μm.
Almidón de arroz: Se observa como gránulos poliédricos y poligonales pequeños,
en algunos casos formando agregados entre 2-150 unidades, con hilum
concéntrico de forma puntual difícil de observa al microscópio convencional. El
tamaño promedio de los gránulos es de 5 μm con una desviación estándar de ±4
μm.
Muestras de plantas medicinales que contienen almidón: canela, ruibarbo,
valeriana, ginseng, jengibre, regaliz.
RESULTADOS
Análisis
Almidón
papa maíz arroz yuca Muestra
Color
Textura
Olor
Sabor
pH
Tamaño de
los gránulos
Hilum
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1. Detección de celulosa: Colocar 2 a 3 mg de la droga en polvo sobre un
portaobjetos. Verter 1 ó 2 gotas de solución de cloruro de zinc yodado (Disolver 20
g de cloruro de zinc y 6.5 g de yoduro de potasio en 10.5 ml de agua), dejar
reposar 2 minutos y agregar 1 gota de yodo (0.1 mol/L), dejar reposar 1 minuto,
remover el exceso de reactivo con una tira de papel filtro y agregar 1 gota de
H2SO4 60%. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio, las paredes de
celulosa se observan en colores desde el azul al violeta.
Muestras vegetales donde se pueden evidenciar las paredes de celulosa:
eucalipto, canela, lino, sen, entre otras.
A continuación se presentan las fotografías de las placas microscópicas de los
montajes correspondientes para la observación de celulosa en semillas de lino
molidas.
Figura 9. Fotografía de las paredes de celulosa presentes en las semillas de lino.
2. Detección de granos de aleurona: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo
sobre un portaobjetos. Verter 2 ó 3 gotas de solución de yodo/etanol. Los gránulos
de aleurona se observan de color amarillo-café o café con un tamaño promedio
entre 10-20 μm. Agregar luego unas 2 ó 3 gotas de trinitrofenol en etanol y los
granúlos se tornarán amarillos.
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Muestras de plantas medicinales que presentan gránulos de aleurona: lino,
nuez moscada, anís estrellado.
A continuación se presentan las fotografías de las placas microscópicas de los
montajes correspondientes para la observación de celulosa de gránulos de
aleurona presentes en semillas de lino molidas:
Figura 10. Fotografía de los gránulos de aleurona presentes en las semillas de
lino.
Detección de lípidos y aceites esenciales: mezclar bien la muestra en polvo,
colocar 2 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos. Verter 2 ó 3 gotas de
solución de Sudan III y dejar actuar durante 2 ó 3 minutos. Escurrir el líquido y
lavar bien con alcohol 70 %. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio con
los objetivos de 10x y 40x. Los lípidos aparecen como gotas de color rojo.
24
Muestras vegetales para la detección de lípidos y aceites esenciales: lino,
canela, eucalipto, jengibre.
A continuación se presentan las fotografías de las placas microscópicas de los
montajes correspondientes para la observación de aceites fijos presentes en
semillas de lino molidas:
Figura 11. Fotografía de las gotas de aceite fijo presentes en las semillas de lino.
Consulta
1. Funciones biológicas en la célula vegetal de los carbohidratos, lípidos y
proteínas.
2. Aplicaciones en Farmacognosia de los carbohidratos, lípidos y proteínas.
3. Esquema de las reacciones realizadas en el laboratorio.
BIBLIOGRAFÍA
Evans, W.C. Trease & Evans Pharmacognosy. Ed. Saunders. 16o Edición. China.
2009.
HEINRICH M., BARNES J. Gibbons S., WILLIAMSON E. Fundamentals of
Pharmacognosy and Phytotherapy. Ed. Churchill Livingstone. Spain. 2004.
25
Práctica No 6
ANÁLISIS MICROSCÓPICO DE MATERIAL VEGETAL
OBJETIVO
Reconocer elementos de valor diagnóstico en el material vegetal: cristales
de oxalato de calcio, gránulos de polen, pelos epidérmicos, vasos
lignificados, estomas, de acuerdo con las monografías de plantas
medicinales textos de referencia y farmacopeas oficiales.
MARCO TEÓRICO
El planteamiento sistemático de la identificación de drogas en polvo puede
realizarse por varios caminos, sin embargo cuando se trata de drogas
organizadas, todos los métodos dependen del reconocimiento microscópico de los
tipos celulares característicos: fibras tabicadas, pelos epidérmicos, tricomas; así
como de los contenidos de las células: almidón, cristales de oxalato de calcio,
gránulos de aleurona. Estas estructuras pueden considerarse como elementos de
valor diagnóstico porque resultan de gran valor para la identificación del material
vegetal como materia prima.
Existen reactivos específicos que permiten destacar cada una de las estructuras,
para la observación de los gránulos de almidón se realiza el montaje en agua y en
solución de lugol, los cristales de oxalato de calcio se observan con mayor
facilidad en las placas de hidrato de cloral, mientras que el montaje con
fluoroglucina y ácido clorhídrico facilita la observación de los tejidos lignificados.
Cuando se trata de una mezcla de drogas es imprescindible una mayor
experiencia y práctica. Cuando se ha realizado un tanteo de la identificación deben
llevarse a cabo posteriores observaciones y ensayos químicos confirmativos, la
mayoría de las drogas de farmacopea, poseen en la actualidad ensayos para su
reconocimiento mediante cromatografía de capa fina (CCF).
26
METODOLOGÍA
Bajo la orientación del profesor el estudiante procederá a realizar las siguientes
actividades:
1. Ensayos preliminares para la identificación de las características organolépticas
del material vegetal para identificar el color, el olor y el sabor.
Color: es importante analizar el color del material vegetal, cuando se trata de
raíces el color va desde blanco amarillento hasta pardo, en el caso de las
cortezas, en general el color es castaño y en el caso de hojas y flores, el color
depende de la especie.
Olor: el olor se puede expresar como aromático, cítrico, mentolado y cuando no es
posible establecer comparacion, se describe como característico.
Sabor: los sabores se pueden describir como: auténticos (amargo, dulce, ácido,
salado) o insípidos.
2. Preparación de placas o montajes respectivos de las plantas medicinales secas
y en polvo sobre porta objetos, utilizando según el caso agua, hidrato de cloral y
floroglucina. Recuerde colocar el cubreobjetos antes de la observación.
Observacion de almidon: montar placa en agua, observar los diferentes gránulos y
ensayar si se trata de almidón mediante la adición de agua de yodo (Lugol),
colocando 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos, verter 2 ó 3
gotas de Solución de Lugol diluida (1:5) en agua. Colocar el cubreobjetos y
observar al microscopio a 10x y 40x. Los granos de almidón se colorean de azul-
violáceo intenso.
Observación de tricomas epidermicos y oxalato de calcio: una solución de hidrato
de cloral (80 g de hidrato de cloral en 20 ml de agua) se utiliza como agente
27
clarificante. Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos y
agregar de 2 -8 gotas que impregnen todo el material vegetal y calentar
suavemente. El hidrato de clorar disuelve contenido celular y sustancias
extracelular (granos de almidón, granos de aleurona) y permite una mejor
visualización de tejidos celulares como: pared celular, fibras, vasos, cristales de
oxalato de calcio, tricomas, estomas y polen.
Observación de lignina: colocar 2 a 3 mg de la droga en polvo sobre un
portaobjetos y humedecer este material vegetal con una solución alcohólica de
floroglucina (1% en etanol del 90%) y dejarlo secar a temperatura ambiente.
Agregar 1 gota de HCl concentrado, poner el cubreobjetos y observar los vasos
lignificados en colores desde el rosado hasta el color rojo carmín. Observar la
presencia de fibras, parénquima, esclereidas, pelos.
La información de los montajes anteriores puede complementarse mediante la
aplicación de otros ensayos que permiten la observación de otros tejidos y
estructuras como paredes de celulosa, granulos de aleurona y oleorresinas.
3. Observar las estructuras presentes en los ejemplares seleccionados de las
plantas medicinales, identificar los elementos de valor diagnóstico en cada una de
las plantas y realizar el dibujo correspondiente.
CONSULTA
El estudiante debe consultar las estructuras internas a nivel microscópico de las
siguientes drogas en polvo: canela, ruibarbo, jengibre, regaliz, sen, digital,
caléndula y sauco.
BIBLIOGRAFÍA
Gattuso M.A.,Gattuso S.J. “Manual de procedimientos para el análisis de drogas
en polvo”. Cooperación Iberoamericana Ciencia y Tecnología para el desarrollo.
Universidad Nacional del Rosario. Argentina. 1999.
28
Práctica No 7
IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS
OBJETIVO
Realizar pruebas químicas rápidas de coloración y precipitación para la
identificación de compuestos fenólicos, terpénicos y nitrogenados en
muestras vegetales conocidas.
MARCO TEÓRICO
Los compuestos denominados metabolitos secundarios son subproductos de rutas
metabólicas normales que ocurren en ciertas especies, siendo particulares dentro
de un grupo taxonómico, estado de vida o tejido presentando una distribución
restringida dentro del Reino Vegetal dando origen a la quimiotaxonomía. Su
ocurrencia depende de condiciones externas tales como ataques de patógenos,
depredadores, cambios térmicos o lumínicos, deficiencias nutricionales o
presencia de otros organismos intra o interespecíficos.
El metabolismo secundario es una característica fundamental de la
especialización, es decir que el compuesto resultante, puede no ser importante
para la célula pero sí para el organismo como un todo. Los metabolitos
secundarios pueden ser bioactivos, pero no jugar un papel esencial en los
procesos fisiológicos del organismo. Algunos metabolitos secundarios son
“residuos bioquímicos”, es decir, productos de actividad enzimática de sustratos
no apropiados o productos de destoxificación o de desecho que pueden ser de
importancia para la supervivencia y la buena condición de los organismos. Con
pocas excepciones, los metabolitos secundarios pueden clasificados dentro de
cinco grupos, de acuerdo con su base biosintética: fenilpropanos, acetogeninas,
terpenoides, esteroides y alcaloides.
29
Reconocimiento de metabolitos: el reconocimiento de metabolitos secundarios
se realiza por medio de pruebas fitoquímicas preliminares, las cuales son una
prueba cualitativa de caracterización consistente en una reacción química que
produce alteración rápida en la estructura molecular de un compuesto, por
ejemplo, la modificación de un grupo funcional, la apertura de un sistema anular, la
formación de un aducto o un complejo, lo cual genera como resultado una
manifestación sensible como el cambio de coloración, la formación de un
precipitado o el desprendimiento de un gas, lo cual indica la presencia o ausencia
de un metabolito secundario en particular.
1. Alcaloides: los alcaloides son sustancias básicas que contienen nitrógeno en
un anillo heterocíclico, son derivados de aminoácidos, presentan distribución
taxonómica limitada y se encuentran en plantas superiores como sales de un
ácido orgánico.
Figura 11. Estructura química de la nicotina
Atendiendo a su solubilidad, propiedad empleada para extraerlos y purificarlos, la
base del alcaloide es soluble en solventes orgánicos y pueden formar sales
solubles en solventes polares cuando se encuentra en ácidos minerales diluidos.
2. Flavonoides: los flavonoides son compuestos polifenólicos con quince átomos
de carbono, cuya estructura química consta de 2 anillos de benceno unidos por
una cadena lineal de tres carbonos. El núcleo de los flavonoides se representa por
el sistema C6 – C3 – C6.
30
Figura 12. Estructura química de una catequina.
3. Cardiotónicos: las agliconas cardiotónicas químicamente estan constituidas
por el sistema esteroidal (ciclo pentano perhidrofenantreno) con los grupos metilos
en las posiciones C–18 y C-19, 7, un grupo hidroxilo en el carbono 3 y un anillo
lactónico α-β insaturado de cuatro carbonos unido al carbono 17 del núcleo
esteroidal, como se observa en la estructura química de la digoxina que aparece a
continuación.
Figura 13. Estructura química de la digoxina.
Estos compuestos han presentado actividad estimulante sobre el músculo
cardiaco, cuando están en forma de glicósidos.
4. Saponinas: las saponinas son un grupo de glicósidos solubles en agua que
tienen la propiedad de hemolizar la sangre y disminuir la tensión superficial del
31
agua formando espuma abundante. Las saponinas por hidrólisis dan origen a las
llamadas sapogeninas.
Figura 14. Estructura química de la diosgenina.
La sapogenina puede tener el sistema anular esteroidal o el de un triterpeno
pentacíclico. Los anillos E y F de la saponina estereoidal conforman el llamado
sistema espirostanal. El enlace glicosídico siempre se forma con el oxigeno del
carbono 3.
5. Cumarinas: las cumarinas son un grupo muy amplio de principios activos
fenólicos y tienen en común la estructura química de 1-benzopiran-2-ona. Se
caracterizan porque presentan fluorescencia bajo la luz ultravioleta a 365 nm.
Figura 15. Núcleo químico de las cumarinas.
Estructuralmente se clasifican en cumarinas simples, furanocumarinas y
pironacumarinas.
32
6. Taninos: los taninos son polímeros de polifenoles, sustancias con alto peso
molecular, comprendido entre 500 a 3000 g/mol. Se consideran productos de
excreción de muchas plantas, involucrados como mecanismos de defensa de las
mismas, contra organismos parásitos. Se clasifican en:
Taninos hidrosolubles o pirogálicos: son ésteres fácilmente hidrolizables formados
por una molécula de azúcar (glucosa) unida a un número variable de moléculas de
ácidos fenólicos (ácido gálico o su dímero, el ácido elágico). Son comunes en
plantas dicotiledóneas.
Figura 16. Estructura química de los taninos hidrolizables.
Taninos no hidrosolubles ó condensados: tienen una estructura química similar a
la de los flavonoides. Por hidrólisis generan azúcar y ácido elágico, algunos
taninos condensados son conocidos como pro-antocianidinas porque por hidrólisis
ácida producen antocianidinas y leucoantocinidinas.
33
Figura 17. Estructura química de los taninos no hidrolizables o proantocianidinas.
7. Esteroides: los esteroides son compuestos cuya estructura presenta el núcleo
ciclopentano perhidrofenantreno, metilos en los carbonos 10 y 13 y un radical
lineal en el carbono 17.
Figura 18. Estructura química del ergosterol.
Los esteroides son compuestos fundamentales en la estructura celular de
animales, vegetales, hongos y bacterias.
8. Quinonas y antraquinonas: las quinonas son dicetonas cíclicas insaturadas
que por reducción se convierten en polifenoles, siendo reversible esta reacción.
Las quinonas derivan su nombre del miembro más simple de la serie: la p-
benzoquinona obtenida en 1838 por Woskresensky, como producto de oxidación
34
del ácido quínico. Las quinonas se pueden clasificar en benzoquinonas,
naftoquinonas y antraquinonas (las más numerosas).
Figura 19. Núcleo químico de las antraquinonas.
9. Antocianinas: las antocianinas son pigmentos flavonoides que se comportan
como indicadores ácido – base debido a la reacción:
Figura 20. Reacciones químicas de las antocianinas en diferente pH.
Estos pigmentos suelen presentarse en forma de glucósidos, lo que explica su
solubilidad en agua y la fácil extracción con solventes acuosos. Se encuentran
en la savia de las plantas, y a menudo en forma de sólidos amorfos o cristalinos
en las hojas de tejido leñoso y frutos. Su color esta algunas veces enmascarado
por otros pigmentos vegetales como la clorofila.
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METODOLOGÍA
Sobre el extracto de la planta seleccionada, el estudiante realizara pruebas
químicas de coloración y/o precipitación, para identificar la presencia del
metabolito respectivo.
1. Reconocimiento de alcaloides
Los alcaloides son bases nitrogenadas, las cuales pueden convertirse en sus
respectivas sales mediante la adición de un ácido diluido y formar precipitados al
reaccionar con los reactivos específicos para alcaloides. En esta práctica
utilizaremos los reactivos de: Mayer y Dragendorff.
Obtención del extracto: tomar aproximadamente 5 g del material vegetal fresco
macerar en un mortero y adicionar un volumen suficiente de ácido clorhídrico al
5%, calentar al baño maría durante 10 minutos, enfriar y filtrar.
Prueba cualitativa: colocar en dos tubos de ensayo aproximadamente 0.5 ml del
filtrado ácido y agregar a uno de los tubos 2 gotas del reactivo de Dragendorff y al
otro tubo 2 gotas del reactivo de Mayer. Si se observa turbidez o precipitado en
ambos tubos se considera como prueba presuntiva de la presencia de alcaloides.
2. Reconocimiento de esteroides y/o triterpenoides
Obtención del extracto: en un beaker limpio y seco, tomar una pequeña cantidad
de material vegetal seco y molido, adicionar diclorometano en cantidad suficiente
hasta que cubra la muestra (realice esta prueba bajo campana extractora de
gases) agitar con varilla de vidrio para realizar una mejor extracción,
posteriormente filtrar sobre sulfato de sodio anhidro.
Prueba cualitativa (Ensayo de Lieberman Burchard): en un tubo de ensayo limpio y
seco tomar 1 ml del filtrado orgánico y agregar por la pared del tubo 1 ml de
anhídrido acético y con precaución 1-2 gotas de ácido sulfúrico concentrado. La
36
aparición de coloraciones: verdes, azules, rojas o violeta es prueba positiva para
esteroides y/o triterpenoides en la muestra.
3. Reconocimiento de saponinas
Obtención del extracto: tomar aproximadamente 5 g del material vegetal fresco y
macerar en un mortero, adicionar suficiente cantidad de agua que cubra la
muestra, filtrar a través de gasa.
Prueba cualitativa: pasar 4 ml del filtrado a un tubo de ensayo y agitar
vigorosamente durante un minuto, si se forma abundante espuma que permanece
estable durante 5 minutos es prueba presuntiva de la presencia de saponinas en
la muestra.
4. Reconocimiento de compuestos fenólicos y taninos
Obtención del extracto: tomar aproximadamente 5 g del material vegetal fresco,
macerar en un mortero hidratando la muestra para facilitar el rompimiento de los
tejidos, pasar la muestra completamente macerada a un beaker y adicionar
cantidad suficiente de agua para cubrir la muestra, calentar en baño maría de 10
minutos y filtrar en caliente.
Prueba cualitativa: tomar 1 ml del filtrado en un tubo de ensayo y adicionar 2 gotas
de solución de tricloruro férrico (FeCl3 al 1%). La aparición de un color verde, azul
o negro es prueba positiva para compuestos fenólicos.
En un segundo tubo de ensayo tomar 1 ml del filtrado y agregar unas gotas de la
solución de gelatina-sal, si se presenta turbidez o formación de precipitado es
prueba presuntiva de la presencia de taninos en la muestra.
37
5. Reconocimiento de flavonoides, leucoantocianidinas y cardiotónicos:
Obtención del extracto: macerar en un mortero aproximadamente 10 g del material
vegetal finamente picado, adicionar suficiente cantidad de etanol, calentar al baño
maría durante 5 minutos, enfriar y filtrar.
Prueba cualitativa para flavonoides (Ensayo de Shinoda): tomar un 1 ml del filtrado
etanólico en un tubo de ensayo, agregar varias limaduras de magnesio y por la
pared del tubo dejar caer lentamente HCl concentrado (37%). La aparición de
colores: naranja, rojo, violeta ó rosado, indican es prueba presuntiva de la
presencia de flavonoides en el material vegetal.
Prueba cualitativa para leucoantocianidinas: tomar 2 ml del filtrado en un tubo de
ensayo y adicionar 1 ml de ácido clorhídrico concentrado (37%). Calentar en baño
maría durante 15 minutos. La aparición de coloraciones rojas es prueba presuntiva
de la presencia de leucoantocianidinas en la muestra.
Prueba para la detección de cardiotónicos y lactonas α, β insaturadas: adicionar 1
ml de filtrado en un tubo de ensayo y agregar 0.5 ml de reactivo de Kedde
(mezclar 1 ml de solución A con 1 ml de solución B para preparar este reactivo
antes de usarlo). La aparición de coloraciones violetas o púrpuras es prueba
presuntiva de la existencia de cardiotónicos en la muestra.
6. Reconocimiento de quinonas
Obtención del extracto: pesar 0,5 g de material vegetal en polvo en un beaker de
100 ml, adicionar 20 ml de etanol al 95% y calentar en baño maría durante 5
minutos hasta ebullición, filtrar en caliente,
Hidrólisis: tomar 5 ml del filtrado y adicionar 3 ml de H2SO4 al 10%, calentar en
baño maría durante 15 minutos hasta ebullición, enfriar la muestra.
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Extracción con tolueno: adicionar 5 ml de tolueno al extracto previamente
hidrolizado, agitar suavemente sin emulsionar, utilizando la cabina de extracción.
Prueba cualitativa: tomar 2 ml de la fase orgánica en un segundo tubo de ensayo,
adicionar 1 ml de la solución previamente preparada de hidróxido de sodio al 5%
en amoníaco al 2%. La aparición de un color rojo cereza en la capa acuosa indica
presencia de quinonas en la muestra.
7. Reconocimiento de antocianinas
Obtención del extracto: en un erlenmeyer colocar 100 g de muestra fresca
finamente desmenuzada, añadir 200 ml de agua, calentar a ebullición durante 5
minutos y filtrar.
Prueba cualitativa: adicionar 2 ml del filtrado en un tubo de ensayo y añadir 1 ml
de NaOH diluido. Observar la coloración formada.
En otro tubo de ensayo adicionar 2 ml del filtrado y añadir 6 gotas de algún ácido
mineral diluido (HCl ó H2SO4 al 10%). Observar la coloración formada.
Las antocianinas se reconocen por producir diferentes color es a diferentes pH.
8. Reconocimiento de cumarinas
En un tubo de ensayo grande adicionar 1 g de material vegetal fresco y macerado
y agregar cantidad suficiente de etanol comercial hasta cubrir la muestra. Con un
trozo de papel filtro blanco cubrir la boca del tubo de ensayo y sujetarlo con pinzas
o una banda elástica. Agregarle unas gotas de NaOH diluido en el papel filtro y
calentar hasta ebullición durante 5 minutos, posteriormente enfriar y retirar el papel
filtro. Observar bajo luz ultravioleta a 365 nm la aparición de una coloración
fluorescente que puede ser: verde, amarilla o roja.
39
CONSULTA
Consultar las reacciones químicas que se presentan en cada una de las pruebas
de identificación de metabolitos secundarios.
BIBLIOGRAFÍA
DOMÍNGUEZ X.A. Métodos de investigación Fitoquímica. Ed.Limusa. México.
1973.
Arango A. Gabriel J., Quijano T. Jairo. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.
Marcha Fitoquímica Semicuantitativa. Universidad de Antioquia. Medellín.
40
Práctica No 8
RECONOCIMIENTO DE ADULTERACIONES Y/O FALSIFICACIONES EN EL
MATERIAL VEGETAL
OBJETIVO
Aplicar los ensayos físicos (organolépticos-macroscópicos), análisis
microscópico (identificación de elementos de valor diagnóstico) y pruebas
químicas de coloración en la identificación de adulteraciones y/o
falsificaciones en el material vegetal.
Identificar una muestra problema de material vegetal en polvo mediante sus
características organolépticas, macro y microscópicas y pruebas químicas.
MARCO TEÓRICO
El material vegetal es clasificado de acuerdo a sus características sensoriales,
macroscópicas y microscópicas. Un examen para determinar estas características
es en primer paso establecer la identidad y el grado de pureza del material, para
después llevarse a cabo posteriores análisis. Siempre que sea posible, patrones
del material o muestras de calidad farmacopéica debe de estar disponible como
referencia.
Una inspección visual provee una simple y rápida medida para identificar el
material, pureza y, posiblemente, calidad. Si una muestra es encontrada ser
significativamente diferente, en términos de color, consistencia, olor o textura, de
las especificaciones, se considera una no conformidad de los requerimientos. Sin
embargo, los juicios deben ser cautelosos con relación al olor y la textura, debido
a las diferencias que existen entre personas o por la misma persona a diferentes
tiempos. Siendo entonces esta una habilidad sensorial que se afina con la
experiencia.
La identificación macroscópica de una planta medicinal está basada en la forma,
41
tamaño, color, características superficiales y textura. Sin embargo, mientras esas
cualidades son juzgadas subjetivamente y sustituciones o adulteraciones pueden
ser muy parecidas al material genuino, a menudo es necesario respaldarse en
análisis microscópicos y/o fisicoquímicos.
La inspección microscópica del material vegetal es indispensable por la
identificación del material en polvo, el material debe de ser tratado con reactivos
químicos. Los ensayos microscópicos se deben asociar con otros métodos
analíticos para garantizar una completa identificación, en los casos en los que la
comparación con material de referencia revela algunas características no descritas
en los requerimientos, estos pueden ser atribuidos a material extraño, antes que
un a un constituyente normal.
METODOLOGÍA
1. Ensayos preliminares para la identificación de las características organolépticas
del material vegetal para identificar el color, el olor y el sabor.
2. Detección histoquímica de tejido vegetal y su contenido.
Realizar las placas para la detección de celulosa, aleuronas, lípidos y aceites
esenciales, las cuales se describieron en la práctica No 4 y las pruebas para la
detección de almidón, oxalato de calcio y lignina descritas en la práctica No 6,
complementar esta información si es necesario con el montaje de las siguientes
placas:
Detección de concreciones de carbonato de calcio (cistolitos) y de cristales de
oxalato de calcio: colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos.
Verter 2 ó 3 gotas de ácido clorhídrico 2M, con la precaución de que el reactivo
esté en contacto con todos los componentes del polvo. Colocar el cubreobjetos y
observar inmediatamente al microscopio a 10x. La presencia de carbonato de
calcio está indicada por la aparición de burbujas. Los cristales de oxalato de
calcio, que en general tardan más tiempo en disolverse, no desprenden burbujas.
42
Detección de lípidos y aceites esenciales: colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo
sobre un portaobjetos. Verter 2 ó 3 gotas de solución de Sudan III (0.5 g Sudan III
calentados a reflujo en etanol o isopropil alcohol) y dejar actuar durante 2 ó 3
minutos. Escurrir el líquido y lavar bien con alcohol 70 %. Colocar el cubreobjetos
y observar al microscopio a 10x y 40x. Los lípidos aparecen como gotas de color
rojo.
Detección de taninos: colocar 2 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos y
verter 2 ó 3 gotas de solución de cloruro férrico al 5 %. Colocar el cubreobjetos y
observar al microscopio a 10x y 40x. La presencia de taninos se evidencia por la
aparición de masas oscuras de color pardo, azul o negro.
Detección de celulosa: Colocar 2 a 3 mg de la droga en polvo sobre un
portaobjetos. Verter 1 ó 2 gotas de solución de cloruro de zinc yodado (disolver 20
g de cloruro de zinc y 6.5 g de yoduro de potasio en 10.5 mL de agua), dejar
reposar 2 minutos y agregar 1 gota de yodo (0.1 mol/l), dejar reposar 1 minutos,
remover el exceso de reactivo con una tira de papel filtro y agregar 1 gota de
H2SO4 60%. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio, las paredes de
celulosa se observan en colores desde el azul al violeta.
Procedimiento: combinar la solución A, solución B y la Solución C y agregar 2.5
ml de HCl con agitación (No filtrar). Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre
un portaobjetos y adicionar 2 ó 3 gotas del reactivo y calentar suavemente. Cubrir
con el cubreobjetos y observar los elementos lignificados de amarillo, súber de
marrón, lípidos de color rojo y almidón de color azul -violeta.
43
3. Pruebas químicas rápidas
Solubilidad en agua: tomar en un tubo de ensayo aproximadamente un gramo de
muestra, adicionar agua en cantidad suficiente para cubrir la muestra; mezclar y
dejar en reposo durante 15 minutos. Al cabo de este tiempo observar concluir.
Los extractos acuosos y jugos concentrados se disuelven casi completamente, y
drogas como la goma arábiga, tragacanto y semillas de lino, ponen de manifiesto
su naturaleza gomosa o mucilaginosa.
Presencia de carbonato de calcio: tomar en un tubo de ensayo una pequeña
cantidad de la muestra y adicionar unas gotas de ácido sulfúrico diluido, si hay
presencia de carbonato de calcio como adulterante, tiene lugar una efervescencia
seguida de disolución.
Presencia de aceites fijos y/o aceites esenciales: para la prueba de aceites fijos se
debe comprimir una pequeña cantidad de muestra en un pequeño trozo de papel
kraft, si aparece una mancha oleosa que persiste luego de someterla a
calentamiento a una temperatura de 50°C, la muestra contiene aceite fijo. Ejemplo:
semillas de lino y maní.
Los aceites esenciales se reconocen por su olor aromático y a la temperatura de
50°C desaparece la mancha oleosa, la detección del aroma también se puede
apreciar al calentar la muestra en el baño maría.
Prueba para saponinas, taninos y antraquinonas: en un tubo de ensayo tomar
aproximadamente 0,5 g de muestra, adicionar aproximadamente 15 ml de agua,
agitar durante un minuto. Si aparece espuma abundante sospechar la presencia
de drogas que contienen saponinas, hervir suavemente y anotar si aparece
desprendimiento de aceite esencial (por su olor aromático). Filtrar y dividir el
filtrado en tres tubos de ensayo, dos para la prueba de taninos y uno para la
44
prueba de antraquinonas (5 ml). Realizar las pruebas de identificación
correspondientes de acuerdo con el procedimiento descrito en la práctica No. 7.
BIBLIOGRAFÍA
WHO. Quality control methods for medicinal plant material. Geneva: WHO. 1998.
ISBN 92 4 154510 0.
TREASE G.E., EVANS W.C. Tratado de Farmacognosia. Editorial Bailliere Tindall.
12a Edición. Mexico. 1989.
45
Práctica No 9
IDENTIFICACIÓN CROMATOGRÁFICA DE PLANTAS MEDICINALES
OBJETIVO
Aplicar las técnicas básicas de separación cromatográfica para la
identificación de compuestos que sirvan como indicadores o marcadores
que permitan corroborar la autenticidad de plantas medicinales.
MARCO TEÓRICO
La cromatografía (Chromo= color y Graphie=escritura, escribir en colores) fue
desarrollada en el año de 1903 por el botánico ruso Mikhail Tswett, posteriormente
Ismailov y Scraiber utilizaron láminas de vidrio para colocar capas muy delgadas
de alúmina y luego aplicaron extractos vegetales y en 1956 Egon Stahl
estandarizó los procedimientos, equipos y adsorbentes y le dio el nombre de
cromatografía de capa fina a esta técnica de separación de mezclas complejas
que ha resultado ser simple, económica y eficiente.
En la cromatografía en capa fina, la muestra se aplica en la fase estacionaria y es
adsorbida en la superficie del material y la fase móvil asciende por capilaridad a
través de la placa, de modo que la separación ocurre de acuerdo con la constante
de afinidad de los componentes de la muestra por la fase móvil. Los componentes
del sistema cromatográfico que se describirán a continuación son: fase
estacionaria y fase móvil.
Fase Estacionaria (Adsorbente): es una de las dos fases que conforman un
sistema cromatográfico. Puede ser un sólido, un gel o un líquido. En el caso de
cromatografía en capa fina lo más común es utilizar las placas de sílica gel 60 GF-
254.
46
Fase Móvil (eluente): es el fluido que se filtra a través de la fase estacionaria, en
una dirección definida, en el caso de la cromatografía en capa fina se utiliza un
solvente o mezcla de solventes.
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (CCF)
Es la técnica de separación en la que la fase estacionaria está sobre un plano
formando una capa de partículas sólidas extendida sobre un soporte, tal como una
placa de vidrio o aluminio (Thin Layer Chromatography, TLC), la muestra es
aplicada en puntos o en banda, para posteriormente ser eluída dentro de un
tanque cromatográfico como se ilustra en la figura.
Figura 21. Representación gráfica del proceso de cromatografía en capa fina.
Si los componentes de la muestra no son coloreados, se requiere de métodos que
permitan visualizarlos, este procedimiento se conoce como revelado de la placa.
Existen dos tipos de reveladores:
Reveladores químicos: a través de inmersión o aspersión de reactivos específicos
se obtienen derivados coloreados o fluorescentes de los componentes de la
muestra.
Reveladores físicos (ópticos): se utiliza la irradiación de la placa cromatográfica
con luz ultravioleta en longitudes de onda de 254 nm y 365 nm.
La cromatografía en capa fina como método cualitativo y cuantitativo requiere
contar con un estándar de referencia para comparar su valor de factor de retardo
47
(Rf) y el color de la banda del estándar al ser revelada con agentes químicos
específicos.
El factor de retardo o factor de retención (Rf) es un valor relativo para cada
sustancia y depende de las condiciones cromatográficas experimentales (fase
móvil, fase estacionaria, eluente y tiempo de saturación de la cámara). Se define
como el cociente entre la distancia recorrida por el centro de la banda y la
distancia re corrida simultáneamente por la fase móvil como se ilustra en la figura.
Figura 22. Esquema para ilustrar el cálculo del factor de retención (Rf)
cromatográfico.
Rf para la mancha 1 = a / X
Rf para la mancha 2 = b / X
Rf para la mancha 3 = c / X
Los valores de Rf siempre son menores o iguales a uno (Rf = 1).
METODOLOGÍA
1. Reconocimiento cromatográfico del flavonoide Rutina.
Muestras propuestas: flores de pensamiento (Viola tricolor), flores de caléndula
(Calendula officinalis), flores de sauco (Sambucus nigra).
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Obtención de los extractos: pesar 1 g del material vegetal seco y molido y extraer
con etanol durante 10 minutos sobre un baño de agua a 60°C. Filtrar y rotaevaporar.
Fase estacionaria: Silica Gel GF-254.
Fase móvil: Acetato de etilo: Acido fórmico: Acido acético: Agua (100 : 11 : 11 : 26).
Revelador químico: revelador de productos naturales (NP-PEG), ácido
difenilbórico (solución 1) y polietilenglicol (solución 2).
Revelador físico: luz UV 365nm.
Procedimiento experimental: el extracto concentrado se aplica en las placas
cromatográficas correspondientes, se puede utilizar el flavonoide rutina como
estándar de referencia. Posteriormente se introduce la placa en la cámara que
contiene la fase móvil y se deja eluir hasta alcanzar el frente del solvente, para
finalizar se observa con luz ultravioleta a 365 nm y se miden los Rf de cada uno de
los componentes.
2. Reconocimiento cromatográfico del fenilpropano Anetol.
Muestras propuestas: Anis estrellado, hinojo, eneldo.
Obtención de los extractos: pesar 1 g del material vegetal seco y molido y extraer
con 10 ml de diclorometano durante 15 minutos en la campana de extracción. Filtrar y
rotaevaporar.
Fase estacionaria: Silica Gel GF-254.
Fase móvil: Tolueno: Acetato de etilo (93 : 7).
Revelador químico: Vainillina- Acido sulfúrico
Revelador físico: luz UV 365nm.
Procedimiento experimental: el extracto concentrado se aplica en las placas
cromatográficas correspondientes, se puede utilizar el fenilpropano anetol como
estándar de referencia. Posteriormente se introduce la placa en la cámara que
contiene la fase móvil y se deja eluir hasta alcanzar el frente del solvente, para
finalizar se observa con luz ultravioleta a 365 nm y se miden los Rf de cada uno de
los componentes.
49
3. Reconocimiento cromatográfico del alcaloide Boldina.
Muestra propuesta: Hojas de Boldo
Obtención del extracto: pesar 1 g del material vegetal seco y molido y extraer durante
15 minutos con 15 ml H2SO4 0.1 N en la campana de extracción, filtrar y lavar el
filtrado hasta obtener un volumen final de 20 ml, adicionar 1 ml de NH4OH. Realizar
dos extracciones cada una con 10 ml de éter dietílico, recoger esta fase orgánica y
secarla sobre sulfato de sodio anhidro, filtrar y rotaevaporar. Redisolver en 0.5 ml de
metanol.
Fase estacionaria: Silica Gel GF-254.
Fase móvil: Tolueno: Acetato de etilo: Dietilamina (70 : 20 : 10).
Revelador químico: solución spray del reactivo de Dragendorff.
Revelador físico: luz UV 365nm.
Procedimiento experimental: el extracto concentrado se aplica en las placas
cromatográficas correspondientes, se puede utilizar el alcaloide boldina como
estándar de referencia. Posteriormente se introduce la placa en la cámara que
contiene la fase móvil y se deja eluir hasta alcanzar el frente del solvente, para
finalizar se observa con luz ultravioleta a 365 nm y se miden los Rf de cada uno de
los componentes.
CONSULTA
Consultar sobre los valores de Rf correspondientes a cada uno de los compuestos
presentes en las plantas medicinales propuestas: rutina, boldina y anetol.
BIBLIOGRAFÍA
WAGNER H., BLADT S., ZGAINSKI M. Plant Drug Analysis. Springer Verlag.
1984.
50
Práctica No 10
CONTROL DE CALIDAD DE PLANTAS MEDICINALES DE ACUERDO CON
FARMACOPEAS OFICIALES
OBJETIVO
Realizar las principales pruebas de identidad general, pruebas de pureza y
ensayos químicos para el aseguramiento de la calidad de diferentes plantas
medicinales.
MARCO TEÓRICO
Cada planta medicinal y específicamente la parte utilizada (droga) contiene
principios activos o principales constituyentes con un perfil característico que
puede ser usado para el control de calidad desde el punto de vista químico y para
el aseguramiento de la calidad de los productos fitoterapéuticos.
La monografía de una planta medicinal es aquel documento en el que se
especifican de manera detallada las características del material vegetal y los
límites de aceptación para el aseguramiento de la calidad en cada una de las
pruebas, las cuales se pueden clasificar en: pruebas de identidad general, pruebas
de pureza y ensayos químicos.
Las pruebas de identidad general están constituidas por los ensayos que permiten
la determinación de las características macro y microscópicas de las plantas
medicinales y las que representan el perfil cromatográfico y los compuestos
mayoritarios en cada droga vegetal.
Los ensayos fisicoquímicos o pruebas de pureza se realizan de acuerdo con la
legislación y los requerimientos nacionales e incluyen una amplia gama de
pruebas como: pruebas microbiológicas (de acuerdo con la guía WHO)
determinación de cenizas totales, cenizas insolubles en ácido, determinación de
51
sustancias extractivas acuosolubles y solubles en alcohol, residuos de pesticidas
metales pesados, residuos radioactivos, cuantificación de material extraño y
cenizas sulfatadas.
Dentro de los análisis químicos se establecen los límites inferiores en el porcentaje
de los principales compuestos de acuerdo con las técnicas instrumentales, al igual
que los métodos cromatográficos que permiten la cuantificación de los diferentes
compuestos y como resultado se presentan los principales compuestos y los
rangos de porcentajes en los que están presentes en el material vegetal.
En la presente práctica el estudiante consultará la monografía oficial de una planta
medicinal asignada y realizará las pruebas de control de calidad correspondientes.
METODOLOGÍA
Plantas medicinales propuestas: alcachofa (Cynara scolymus L.), eucalipto
(Eucalyptus globulus St. Lag.), hinojo (Foeniculum vulgare Mill.), manzanilla
(Chamomilla recutita L.), quina (Cinchona succirubra Pavon), romero (Rosmarinus
officinalis L.).
1. Pruebas de identidad general.
Reconocimiento macroscópico: realizar la descripción completa de la morfología
externa de la planta medicinal asignada y verificar si cumple con los parámetros
farmacopéicos.
Reconocimiento microscópico: identificar a nivel microscópico los principales
elementos de valor diagnóstico presentes en el material vegetal: gránulos de
almidón, cristales de oxalato de calcio, pelos epidérmicos y tricomas para
comparar con la descripción reportada en las farmacopeas oficiales.
52
Perfil cromatográfico: reproducir las condiciones de cromatografía en capa fina con
el fin de identificar los principales compuestos presentes en el material vegetal
objeto de análisis.
2. Pruebas fisicoquímicas.
Porcentaje de materia extraña: en el caso de drogas completas una cantidad
pesada (100-500 g, acorde con el tipo de droga) de una muestra tomada
cuidadosamente es esparcida en forma de capa fina en un papel. Esta es
examinada a una magnificación de 6X y la materia extraña es sacada y pesada
para calcular su porcentaje. Consultar la metodología detallada en la BP 2003,
apéndice XID.
3. Identificación de metabolitos secundarios.
A partir del extracto de la planta medicinal, realizar las pruebas cualitativas de
coloración para la identificación de compuestos fenólicos, terpénicos y
nitrogenados, de acuerdo con el procedimiento indicado en la práctica No 7 para
cada uno de los metabolitos.
CONSULTA
Consultar el procedimiento detallado para realizar las siguientes pruebas
fisicoquímicas en el material vegetal: determinación de cenizas, determinación de
sustancias extraíbles, determinación de humedad y pérdida por secado.
BIBLIOGRAFÍA
WHO. Quality control methods for medicinal plant material. Geneva: WHO. 1998.
ISBN 92 4 154510 0.
WHO. Monographs on Selected Medicinal Plants. Volume 1-4. 1999.
WAGNER H., BLADT S., ZGAINSKI M. Plant Drug Analysis. Springer Verlag.
1984.
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Aprobadas en Colombia. Editorial Universidad de Antioquia. Segunda edición.
2006.
(4). HEINRICH M., BARNES J. Gibbons S., WILLIAMSON E. Fundamentals of
Pharmacognosy and Phytotherapy. Ed. Churchill Livingstone. Spain. 2004.
(5). KUKLINSKI Claudia. Farmacognosia. Estudio de las drogas y sustancias
medicamentosas de origen natural. Ed. Omega. Barcelona. 2000.
(6). Ministerio de Protección Social. Vademecum Colombiano de Plantas
Medicinales. Colombia. MPS. 2008.
(7). URIBE Álvarez Frank. Botánica General. Editorial Universidad de Antioquia.
Segunda edición. 1991.
(8). WAGNER H., BLADT S., ZGAINSKI M. Plant Drug Analysis. Springer Verlag.
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