Manual de procedimientos Microbiologicos.docx

8/16/2019 Manual de procedimientos Microbiologicos.docx

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MANUAL DEDE ANÁLISISMICROBIOLÓGICOS


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INTRODUCCIÓN

El análisis microbiológico de alimentos es la disciplina de evaluaciónretrospectiva de la calidad microbiológica, características de alimentos y de

sus componentes o “inocuidad” alimentaria, es importante para determinar en

la Industria cuáles son los puntos críticos del proceso. La pérdida de calidad de

un producto puede ser debido a la presencia de microorganismos patógenos

para la salud o de microorganismos que alteren el producto de tal manera que

lo agan inadecuado para el consumo.

El ob!etivo principal de los controles microbiológicos es garanti"ar al

consumidor productos salubres e inocuos y evitar así el deterioro de los

mismos, determinando de manera cualitativa y cuantitativa que el productocumple con los requisitos de las normas microbiológicas para cada alimento.


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1. OBJETIVOS

Evaluar la Inocuidad de aguas y alimentos para asegurar que no contenga

patógenos o to#inas que causen trastornos al consumidor.

$eterminar y evaluar la vida comercial de los productos, la evaluación de

procesos y materias primas.

2. GUÍA METODOLOGICA DEL ÁREA DE MICROBIOLOGÍA

Recolección e !"e#$%'

• %egistro de muestras

• &ondiciones de esterilidad 'material en contacto con las muestras(• )ransporte de muestras ba!o custodia de re*rigeración

In(%e#o e !"e#$% &l l&)o%&$o%io'

• +lmacenamiento de muestras

• &odi*icación de muestras

ANÁLISIS

Selección e !eio# e c"l$i*o'

• re enriquecimiento de la muestra

• enriquecimiento de la muestra

• -edios de cultivo líquidos 'enriquecimiento y aislamiento(

• -edios de cultivo sólidos 'nutritivos y aislamiento(

• iembra por agotamiento

• Incubacion/ 012& 345 6 7 812& 68489 aerobiosis4anaerobiosis

Ien$i+ic&ción'

• %ecuento de colonias• &alculo de resultados

• +nálisis macroscópico de caldos

• %egistro de cálculos

• ruebas bioquímicas

• interpretación y registro de resultados

In+o%!e e %e#"l$&o#'

• ingreso de datos al sistema

•emisión de in*orme *inal


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• veri*icación de datos del registro con orden de servicio

• *irma y entrega de resultados


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,. TECNICA N-MERO MÁS ROBABLE /!oi+ic&o0

La técnica n:mero más probable es un método que se emplea para estimar densidades de población bacteriana, se reali"a a partir de diluciones consecutivas enun medio liquido adecuado para el crecimiento del microorganismo. e basa en elprincipio de que una :nica célula viva puede desarrollarse y producir reacción en elmedio de cultivo después de ser incubado a 01 3456 &2 y 812& por el tiempo indicado685 89 oras. El método debe tener la capacidad de reconocer un atributo especí*icodel microorganismo en el medio líquido que se emplee. La estimación de la densidadpoblacional se obtiene del patrón de ese atributo especí*ico evidenciado en lasdiluciones consecutivas en el medio de cultivo, posterior a ello los resultados secomparan con una tabla de ;- donde se cuanti*ica el estimativo para coli*ormestotales y *ecales.

3.1 COLIFORMES

Incubar 012& 345 6, durante 685 89 oras.


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)ambién es abitante normal del tracto intestinal del ombre y animales de sangre

caliente.

Los géneros del grupo coni*orme son Escherichia, Citrobacter, Enterobacter y

Klebsiella.

El empleo de las enterobacterias 'coli*ormes y no coli*ormes( como microorganismosindicadores se basa en que estas bacterias son destruidas por los tratamientos depasteuri"ación, térmicos o clorados de las aguas con gran *acilidad. or esto, lapresencia de altos valores de enterobacterias en los alimentos es síntoma de *allos enel proceso de elaboración o de conservación, *alta de igiene en los manipuladores,recontaminación después del proceso y a:n de contaminación *ecal que puedenacarrear riesgos para el consumidor.

La Escherichia coli es una bacteria de origen *ecal, por lo tanto se concluye que su

presencia en un alimento indica que éste a tenido contacto con, y por tanto está

contaminado por, materia de origen *ecal. La supervivencia de estas bacterias enmedios no entéricos es limitada por lo que su presencia indica una contaminación

reciente. or estas ra"ones, E. coli es el microorganismo índice ideal para la detección

de contaminaciones recientes.

,. ROCEDIMIENTO

La técnica del n:mero más probable utili"a una dilución m:ltiple de una poblaciónasta su e#tinción para obtener un valor apro#imado que se a probado enpoblaciones estimadas de microorganismos, especialmente en casos donde ladensidad encontrada es muy ba!a.

3. 4ILTRACIÓN OR MEMBRANA

Este procedimiento se emplea para acer análisis normali"ados de agua, soluciones

de a":car y ciertas bebidas. &onsiste en mane!ar *iltros de membrana, muy delgados,

con diámetros de poro de A.1 a D.A micra, los cuales permiten el paso rápido de

grandes vol:menes del producto que se anali"a mediante presión positiva o negativa,

pero evita el paso las bacterias. =na ve" retenidas en la membrana, se cultivan

colocando la membrana sobre un disco absorbente saturado de medio líquido o sobre

un medio sólido, para que las bacterias se nutran. osteriormente se incuban a la

temperatura correspondiente y se observa el crecimiento de las unidades *ormadoras

de colonia. Este método permite detectar pequeas cantidades de bacterias en un

gran volumen de muestra y la obtención de resultados en un tiempo más corto que el

empleado en los métodos de siembra en placa pro*unda y el n:mero más probable.

Las desventa!as están relacionadas con el eco que no se pueden traba!ar muestras

que contengan gran cantidad de microorganismos, tampoco productos que no sean

omogéneos o que tengan material suspendido y grasa, ya que impide el conteo *inal

de microorganismos.


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4.1 PROCEDIMIENTO

D. %etirar el embudo receptor de la muestra, la tapa y desenroscarlo de la unidad

base.

6. %evisar que el anillo plástico de la base esté en su lugar y colocar con ayuda de

unas pin"as estériles la membrana en la parte superior del recipiente base.

0. Enroscar el embudo receptor a la base que contiene la membrana. ;o apretar

demasiado porque el anillo platico puede romper los bordes de la membrana.

8. &onectar la manguera de la bomba de vacío a una de las salidas del recipiente

base.

1. Certer la muestra en el embudo colector y aplicar vacío pasar que *iltre lamuestra.

F. +l *inali"ar la *iltración desconectar la bomba de vacío, desenroscar el embudo

colector del recipiente base, retirar la membrana con ayuda de las pin"as y

colocarlas sobre las placas de petri con medio de cultivo. Incubar las ca!as a 01B &

3456B& por 68 a 89 oras.

G. ara reali"ar conteo, escoger ca!as entre 6A y 9A colonias.

9. El cálculo de n:mero de coli*ormes se ace aplicando la siguiente *órmula/

To$&l e coli+o%!e#5166!l. 7 ;o. $e colonias tipicas # DAA

ml. de muestra *iltrada


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Adicionar 100 ml del agua a analizar

Colocar la membrana en el fltro

Prender la bomba de vacio

Incubar a +/- 2ºC 24-48 ora!

"eer

#ran!$erir la membrana a la ca%a de &etri con el agar 'Pc(cromo( )*coli

Count $undido , mantenido a . - 4.ºC

Incubar !in invertir la! ca%a! a tem&eratura , tiem&o reuerido &ara cada microorgani!mo

Crecimiento

In$ormar comoC/100 ml

3in crecimiento

e&ortar conteo e!timado 0C/100 ml

3.2 ANALISIS DE MESO4ILOS8 COLI4ORMES TOTALES 9 E. COLI OR M:TODO4ILTRACIÓN OR MEMBRANA

. RECUENTO DE MESO4ILOS AEROBIOS EN ALIMENTOS SOLIDOS 9LI;UIDOS

RE4ERENCIAS'*


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.1 EQUIPOS Y MATERIALES

@A ml de agua peptonada. @ ml de agua peptonada. +gar late &ount. &a!as de petri estériles. ipetas estériles. Incubadora a 01B& 345 6B&. Hao de maría. &ontador de colonias.

5.2 GENERALIDADES

e trata de conocer el n:mero total de microorganismos presentes en el alimento. Este

n:mero no guarda relación con el de microorganismos patógenos por lo que no puede

usarse como índice de su presencia y sólo debe considerarse un indicador de lascaracterísticas igiénicas generales del alimento.

e aplica a todos los alimentos con e#cepción de los productos *ermentados o

madurados tales como queso, ciertos tipos de embutidos, yogurt, etc.

Los resultados de este análisis permiten/

• Ceri*icar e*ectividad de los procedimientos de limpie"a y desin*ección.

• $eterminar si las temperaturas aplicadas en los procesos *ueron las adecuadas.

• $eterminar el origen de la contaminación durante los procesos de elaboración de

los alimentos.• Ceri*icar condiciones óptimas de almacenamiento y transporte.

•


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*undido a bao maría y en*riado a 015812& . ;o deberá transcurrir un tiempomayor de D1 minutos entre la dilución de la muestra y la siembra en placas.

1. -e"clar el inóculo con el medio *undido. La manera más indicada es lasiguiente/

a. -over la ca!a de arriba acia aba!o 1 veces.b. %otar la ca!a 1 veces en el sentido de las agu!as del relo!.c. -over la ca!a 1 veces aciendo ángulo recto sobre el movimiento 'a(.d. %otar la ca!a 1 veces en el sentido contrario a las agu!as del relo!.

F. =na ve" solidi*icado el agar, invertir las placas de etri e incubar a 01B& 345 6B&por 68589 oras.

5.4 CÁLCULO E INTERRETACIÓN DE LOS RESULTADOSara reali"ar el conta!e, se escogen las placas que presenten entre 0A y 0AA colonias,

y se utili"a un contador de colonias se pone la placa de etri abierta con la super*icie

de vidrio acia arriba y, si es preciso, se divide en sectores marcando mediante un

lápi" graso a lo largo de los diámetros.

El cálculo del valor promedio del n:mero de unidades *ormadoras de colonias por

gramo de muestra se e*ect:a multiplicando el n:mero de colonias contadas en cada

dilución de las placas seleccionadas, por el *actor de dilución correspondiente.

Expresr !"s res#!$%"s &"'"( “=nidades ?ormadoras de &olonia” =?&4g o ml.

5.5 ALIMENTOS QUE REQUIEREN RECUENTO DE MES)FILOS AERO*IOS

• +limentos preparados comidas

rápidas

• +requipe

• +romáticas

• &árnicos cocidos

• &ocolates

• >alletas

• >elatina preparada

• >ranos de cereales

• Jelado

• Kugos y pulpas de *rutas

congeladas

• Lece en polvo

• Lece pasteuri"ada

• -e"clas crudas de arinas

• -e"clas precocidas de cereales

• asabocas

• %e*rescos líquidos en bolsa

• alsas

• opas y caldos

• )ortas


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Adicionar o ml del alimento en 50 ml de agua &e&tonada '10-1

6acer dilucione! 10-2

#omar 1ml de la diluci7n 10-1 , 10-2

#ran!$erir a la ca%a de &etri

Incubar a +/- 2ºC 24-48 ora! con la ca%a invertida

"eer

erter 1. ml de agar Plate Count $undido , mantenido a . - 4.ºC

9ezclar moviendo !uavemente la ca%a en oco en varia! direccione!

Crecimiento

In$ormar comoC/g o ml : ;colonia! < inver!o dil

3in crecimiento

e&ortar conteo e!timado = 10 C/g o ml


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RECUENTO DE MESÓ4ILOS AEROBIOS


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Los recuentos de moos y levaduras sirven como criterio de recontaminación en

alimentos que an su*rido un tratamiento igieni"ante y en alimentos tratados por el

calor.

+.3 PROCEDIMIENTO

D. +sépticamente pesar DAg4ml. de muestra y diluir en @Aml. de agua peptonada yomogeni"ar.

6. eg:n el n:mero de gérmenes esperado y sobre la base de la solución inicialde DAg. en @Aml. 'dilución DA5D(, preparar diluciones decimales de DA56, DA50,DA58, usando pipetas estériles para cada dilución, tomando Dml. de la soluciónanterior en @ml. de agua peptonada. -e"clar manualmente cada dilución

evitando la *ormación de espuma.

0. +sépticamente pipetear Dml. de cada dilución y sembrar en placa etripreviamente identi*icada. Colver a me"clar la dilución a usar, si ésta apermanecido más de 0 minutos sin agitar.

8. +gregar a cada una de las placas D65D1 ml. de agar abouraud previamente*undido a bao maría y en*riado a 09 B&. ;o deberá transcurrir un tiempomayor de D1 minutos entre la dilución de la muestra y la siembra en placas.

1. -e"clar el inóculo con el medio *undido. La manera más indicada es la

siguiente/a. -over la ca!a de arriba acia aba!o 1 veces.b. %otar la ca!a 1 veces en el sentido de las agu!as del relo!.c. -over la ca!a 1 veces aciendo ángulo recto sobre el movimiento 'a(.d. %otar la ca!a 1 veces en el sentido contrario a las agu!as del relo!.

F. =na ve" solidi*icado el agar, invertir las placas de petri e incubar a 66B& 345 6B&por 1 a G días. I;CI-+.

G. Jacer control de esterilidad del medio de cultivo incubando una ca!a que

contenga agar abouraud.

+.4 C,LCULO E INTERPRETACI)N DE RESULTADOS

ara reali"ar el conta!e, se escogen las placas que presenten entre 0A y 0AA colonias,

y se utili"a un contador de colonias se pone la placa de etri abierta con la super*icie

de vidrio acia arriba y se cuentan las colonias presentes en la ca!a.

El cálculo del valor promedio del n:mero de unidades *ormadoras de colonias por

gramo de muestra se e*ect:a multiplicando el n:mero de colonias contadas en cada

dilución de las placas seleccionadas, por el *actor de dilución correspondiente.


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Expresr !"s res#!$%"s &"'"( “=nidades ?ormadoras de &olonia” =?&4g o ml.

alletas




congeladas

• Lece en polvo• -e"clas crudas de arinas


• asabocas

• ueso *resco

• ueso *undido


• alsas

• opas y caldos

• uper*icie

• )ortas

• Mogurt


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Adicionar o ml del alimento en 50 ml de agua &e&tonada '10-1

6acer dilucione! 10-2

#omar 1ml de la diluci7n 10-1 , 10-2

#ran!$erir a la ca%a de &etri

Incubar a durante .-> d?a! con la ca%a invertida

"eer

erter 1. ml de agar 3abouraud $undido , mantenido a .-4. ºC

9ezclar moviendo !uavemente la ca%a en varia! direccione!

Crecimiento

In$ormar comoC/g o ml : ;colonia! < inver!o dil

3in crecimiento

e&ortar conteo e!timado = 10 C/g o ml

RECUENTO DE MO=OS 9 LEVADURAS


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-. COLIFORMES TOTALES

RE4ERENCIA' T>cnic&' NTC 4516

+sépticamente pesar DA o 61 g4ml. de muestra y diluir en @A o 661ml de agua

peptonada, omogeni"ar.

obre la base de la solución inicial de DAg4ml. en @A o 661ml. 'dilución DA 5D(,

preparar diluciones decimales de DA56 y DA50 usando pipetas estériles para cadadilución, tomando Dml. de la solución anterior en @ml. de agua peptonada. -e"clar manualmente cada dilución evitando la *ormación de espuma.

ipetear Dml. de cada una de las diluciones en tubos con caldo Lauryl, utili"ando

tres tubos por cada dilución.


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+gitar suavemente los tubos veri*icando que no ayan burbu!as en la campana de

$uram e incubarlos a 01B& 345 6B& por 68589 oras.

i a las 68 oras los tubos presentan producción de gas indica la presencia decoli*ormes totales, y se debe continuar con la prueba con*irmatoria incubando lostubos a 812& por 68 oras.

?.2 ALIMENTOS ;UE RE;UIEREN DETERMINACIÓN DE COLI4ORMESTOTALES

• +gua cruda

• +gua envasada

•

+limentos preparados comidasrápidas

• +repas

• +requipe

• +romáticas


• &árnicos crudos

• &ocolates

• >alletas


• Jelado


congeladas• Lece en polvo

• Lece pasteuri"ada

• -anipulador

• asabocas

• ueso *undido


• alsas

• )ortas

• Mogur

•

•

•

. COLIFORMES FECALES A 45°C

RE4ERENCIA' T>cnic&' INVIMA

•


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• ara obtener el ;- proceder de la siguiente manera/

• Cer en cada una de las tres diluciones seleccionadas el n:mero de tubos en los

que se con*irmo la presencia de coli*ormes.

•Huscar en la tabla del n:mero más probable y anotar el resultado correspondienteal n:mero de tubos positivos para cada dilución.

•

• Expresr !"s res#!$%"s &"'"( ;- de coli*ormes totales4g o ml.

• ;- de coli*ormes *ecales4g o ml.

@.2 ALIMENTOS ;UE RE;UIEREN DETERMINACIÓN DE COLI4ORMES4ECALES•

• +gua cruda

• +gua envasada

• +limentos preparados comidas rápidas

• +repas

• +requipe

• +romáticas



• &ocolates

• Ensalada de *rutas

• >alletas



• Jelado

• Kugos y pulpas de *rutas congeladas

• Lece en polvo

• -anipulador



• asabocas

• ollo bene*iciado• ueso *resco


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. DETERMINACION DE Pse#%"'"/s er#0/"s EN AGUA ENVASADA NM

RE4ERENCIA' )écnica/ I;CI-+

•

.1 EQUIPOS Y MATERIALES

@A ml de agua peptonada. @ml de agua peptonada. &aldo +sparagina simple concentración. &aldo +sparagina doble concentración. +gar &etrimide. olución amortiguadora de *os*atos. ipetas estériles. Incubadora a 01B& 345 6B&.•

.2 GENERALIDADES

• Pseudomona aeruginosa son bacilos >ram. negativos, que se encuentran

ampliamente distribuidos en la naturale"a, agua, suelo, ortali"as, aves y

productos marinos. Es la especie más importante en la alteración de los alimentos

re*rigerados debido a su carácter psicró*ilo.

., ROCEDIMIENTO

.,.1 %"e)& %e#"n$i*&

1. ipetear Dml de la muestra en una serie de 0 tubos que contienen @ml de caldoasparagina.

•

2. Incubar los tubos a 01B&345 6B& por 89 oras.•

,. asadas las 89 oras e#aminar los tubos ba!o la lu" ultravioleta con onda larga encuarto oscuro.

•

3. La producción de un pigmento verde constituye una prueba presuntiva positiva.•

.4 PRUE*A CONFIRMATORIA

1. &on*irmar los tubos de caldo asparagina, que ayan presentado *luorescencia,trans*iriendo A.Dml. de cada uno de ellos en agar &etrimide.

•

2. Incubar durante 0F oras a 01B& 345 6B&.•


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,. Las ca!as que presentan un crecimiento de colonias transparentes, punti*ormes,bordes irregulares y un vira!e del medio verde *luorescente, constituyen una pruebapositiva.

•

•

. RUEBAS BIO;UÍMICAS

•

1. e reali"a prueba con*irmatoria de o#idasa, catalasa y coloración de >ram.•

2. +notar el n:mero de tubos con*irmados como positivos en cada dilución y obtener el resultado en la tabla de ;-.

•

• Expresr !"s res#!$%"s &"'"( ;- de Pseudomona aeruginosa en DAAml.

')abla ;umero -ás robable(.

•

16. RECUENTO DE S$p!"&"s COAGULASA OSITIVA

• RE4RENCIA' )écnica/ @#C 4>>5*

•

1.1 EQUIPOS Y MATERIALES

@A ml de agua peptonada. @ ml de agua peptonada. +gar Haird arOer. &a!a de petri estériles. ipetas estériles. Incubadora a 01B& 345 6B&. Hao de maría. &ontador de colonias. Carilla de JocOey.•

1.2 GENERALIDADES

• Staphylococus aureus es un microorganismo *ácilmente destruido por tratamientos

térmicos con altas temperaturas y por todos los agentes saniti"antes. or lo cual la

presencia de esta bacteria o sus to#inas en alimentos procesados o en equipos

generalmente indica *alta de saniti"ación o contaminación cru"ada.

• Los alimentos se anali"an para detectar S.aureus por las siguientes ra"ones/


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• &on*irmar que este microorganismo *ue el agente causal de la into#icación

alimentaria.

•

•$eterminar qué alimentos o ingredientes de alimentos son *uente decontaminación de S. aureus.

•

• $emostrar contaminación post proceso los cuales usualmente se deben a contacto

umano con alimentos procesados o e#posición del alimento a super*iciesinadecuadamente saniti"adas.

•

16., ROCEDIMIENTO

1. +sépticamente pesar DA o 61 g4ml. de muestra y diluir en @A o 661ml de aguapeptonada y omogeni"ar.

•

2. ipetear A.Dml. de la dilución DA5D sobre la super*icie del agar Haird arOer.•

,. E#tender el inoculo sobre la super*icie del agar con la ayuda de la varilla deJocOey, asta que la super*icie quede seca.

•

3. Invertir las placas e incubarlas a 01B& 345 6B& durante 89 oras.•

. Las colonias sospecosas se identi*ican por la técnica de aglutinación en láte#, conlas colonias con*irmadas como positivas reali"ar el cálculo del recuento e in*ormar.

•

• E!emplo/

•

• %ecuento en DA56 01 colonias presuntivas 0.1AA u*c

• &olonias sospecosas/ 0.1AA

• &olonias positivas/ 8

• &olonias e#aminadas/ 1

•

• &alculo/ 01AA # 841 P 69AA u*c4g o 4ml

•

• +usencia de colonias e#presar los resultados como/ Esta*ilococo coagulasa

positivo QDAA u*c4g o4ml

•

• Expresr !"s res#!$%"s &"'"( “=nidades ?ormadoras de &olonia” =?&4g o4 ml.

• ;


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•

• +limentos preparados comidas rápidas

• +repas

• +requipe• +romáticas



• Ensalada de *rutas

• >alletas


• Jelado

• Lece en polvo



• asabocas

• ollo bene*iciado

• ueso *resco

• ueso *undido

• alsas

• opas y caldos

• )ortas

• Mogur

•

•

11. RECUENTO DE *&!!#s &ere#s

RE4ERENCIA'T>cnic&' NTC 4679

11.1 EQUIPOS Y MATERIALES

@A ml de agua peptonada. @ ml de agua peptonada. +gar Bacillus cereus seg:n -ossel.

&a!a de petri estériles. ipetas estériles. Incubadora a 01B& 345 6B&. Hao de maría. &ontador de colonias. Carilla de JocOey.•

11.2 GENERALIDADES

• Hacillus cereus es un microorganismo aerobio >ram. positivo esporulado, com:n

en el suelo, vegetales y alimentos crudos. &uando Bacillus cereus se encuentra


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en un n:mero alto, mayor de DAF colonias4g. en un alimento puede ocasionar into#icación alimentaria.

•

11.3 PROCEDIMIENTO

+sépticamente pesar DAg. de muestra y diluir en @Aml. de agua peptonada y

omogeni"ar.

•

ipetear A.Dml. de la dilución DA5D sobre la super*icie del agar Bacillus cereus

seg:n -ossel.

•

E#tender el inoculo sobre la super*icie del agar con la ayuda de la varilla de

JocOey o punta esteril, asta que la super*icie quede seca o de!ar impregnar elmedio por espacio de D1 a 6A minutos antes de incubar.

•

Invertir las placas e incubarlas a 01B& 345 6B& durante D9568 oras.

•

Identi*icar las colonias presuntivas por medio de/

•

• Jidrolisis de la caceina/ la aparición de una "ona clara alrededor de la estria

reali"ada en +gar lece indica idrolisis de la caseína.• Jidrolisis de almidon/ cubrir la super*icie con solución de lugol. La aparición de

alo alrededor de la estría indica la idrolisis del almidón.

•

• Jidrolisis de la gelatina/ verter sobre la super*icie de la placa de +gar gelatina,

cloruro de mercurio al D1R y eliminarlo después de cinco minutos con aguapotable. La reacción es positiva cuando una "ona clara rodea la estria.

•

• ;


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SI NO

10g en 50ml de 62 &e&tonada

dil 10-1

9ezclar

#ran!$erir 0*1ml en agar 9o!!el

)


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•

•

•

•

•

•

•

•

•

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