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matK 증폭용 primer 개발 및 염기서열 분석을 통한 유전자...

Date post: 29-Jan-2021
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大韓本草學會誌 제33권 제3호(2018년 5월) Kor. J. Herbol. 2018;33(3):25-35 ISSN 1229-1765(Print), ISSN 2288-7199(Online) http://dx.doi.org/10.6116/kjh.2018.33.3.25. matK 증폭용 primer 개발 및 염기서열 분석을 통한 葶藶子 유전자 감별 문병철 #* , 김욱진, 양선규, 박인규, 여상민, 노푸름 한국한의학연구원 K-herb 연구단 Molecular authentication of Lepidii seu Descurainiae Semen by the development of matK amplification primers and analysis of sequences Byeong Cheol Moon #* , Wook Jin Kim, Sungyu Yang, Inkyu Park, Sang Min Yeo, Pureum Noh K-herb Research Center, Korea Institute of Oriental Medicine, Daegeon 34054, Republic of Korea ABSTRACT Objectives : Lepidii seu Descurainiae Semen has been frequently adulterated with the seeds of several inauthentic plant species. However, the accurate identification of these plant seeds is very difficult. To develop a reliable genetic authentication tool for Lepidii seu Descurainiae Semen, we analyzed matK sequence. Methods : To obtain the matK sequences of plant materials, genomic DNA was extracted from 24 samples and PCR amplification was carried out using matK-AF/matK-8R universal primer set and matK-LDSF/matK-LDSR primer set. For identifying species-specific nucleotides and phylogenetic analysis, matK regions were sequenced and comparatively analyzed by the ClustalW and Maximum Likelihood method. Results : We developed a new primer set to amplify matK region in Lepidii seu Descurainiae Semen and closely related plant samples. From the comparative analysis of matK sequences, we identified species-specific marker nucleotides for D. sophia, L. apetalum, L. latifolium, E. cheiranthoides, E. macilentum, and D. nemorosa, respectively. Furthermore, phylogenetic analysis revealed clear classification depending on the species. These results indicated that the matK sequence obtained a new primer set in this study was useful to identify Lepidii seu Descurainiae Semen in species level. Conclusions : We developed a primer set and identified species-specific marker nucleotides enough to distinguish authentic Lepidii seu Descurainiae Semen and adulterants at the species level based on the matK sequences. These genetic tool will be useful to prevent adulteration and to standardize the quality of Lepidii seu Descurainiae Semen. 1) Key words : Lepidii seu Descurainiae Semen, Descurainia sophia (L.) Webb ex Prantl, Lepidium apetalum Willd., Maturase K (matK), Molecular identification. Ⅰ. 서 葶藶子는 십자화과(Brassicaceae) 식물인 다닥냉이(Lepidium apetalum Willd.) 또는 재쑥(Descurainia sophia (L.) Webb ex Prantl)의 잘 익은 씨로, 한의학에서는 사폐평천(瀉肺平 喘)과 행수소종(行水消腫)의 효능이 있어 기침 해소, 천식방지, 부종 감소 및 배뇨 촉진 등을 위해 광범위하게 이용되는 약재 이다 1,2,3) . 중국과 대만의 경우에도 대한민국약전외한약(생약) 규격집과 같이 다닥냉이와 재쑥의 종자를 葶藶子로 규정하고 있지만 재쑥의 잘 익은 씨를 南葶藶子라고 하며 다닥냉이의 잘 익은 씨를 北葶藶子로 구분하여 이용하고 있다 1) . 하지만 북한의 조선인민민주주의공화국약전은 다닥냉이와 꽃다지 (Draba nemorosa L.)의 잘 익은 씨를 葶藶子로 이용하고 있 1) . 우리나라의 경우에도 2013년 대한민국약전외한약(생약) 규격집이 개정되기 이전까지는 북한과 같이 꽃다지와 다닥냉 이의 종자를 葶藶子로 이용하였으나 최근 개정을 통해 재쑥과 *#Corresponding and First author : Dr. Byeong Cheol Moon, K-herb Research Center, Korea Institute of Oriental Medicine, 1672 Yuseong-daero, Yuseong-gu, Daejeon 34054, Republic of Korea. ·Tel : +82-42-868-9530 ·Fax : +82-42-861-9421 ·E-mail : [email protected] ·Received : 24 March 2018 ·Revised : 30 April 2018 ·Accepted : 25 May 2018
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  • 大韓本草學會誌 제33권 제3호(2018년 5월)Kor. J. Herbol. 2018;33(3):25-35

    ISSN 1229-1765(Print), ISSN 2288-7199(Online)http://dx.doi.org/10.6116/kjh.2018.33.3.25.

    matK 증폭용 primer 개발 및 염기서열 분석을 통한 葶藶子 유전자 감별문병철#*, 김욱진, 양선규, 박인규, 여상민, 노푸름

    한국한의학연구원 K-herb 연구단

    Molecular authentication of Lepidii seu Descurainiae Semen by the development of

    matK amplification primers and analysis of sequences

    Byeong Cheol Moon#*, Wook Jin Kim, Sungyu Yang, Inkyu Park, Sang Min Yeo, Pureum Noh

    K-herb Research Center, Korea Institute of Oriental Medicine, Daegeon 34054, Republic of Korea

    ABSTRACT

    Objectives : Lepidii seu Descurainiae Semen has been frequently adulterated with the seeds of several inauthentic

    plant species. However, the accurate identification of these plant seeds is very difficult. To develop a reliable genetic

    authentication tool for Lepidii seu Descurainiae Semen, we analyzed matK sequence.

    Methods : To obtain the matK sequences of plant materials, genomic DNA was extracted from 24 samples and PCR

    amplification was carried out using matK-AF/matK-8R universal primer set and matK-LDSF/matK-LDSR primer set.

    For identifying species-specific nucleotides and phylogenetic analysis, matK regions were sequenced and comparatively

    analyzed by the ClustalW and Maximum Likelihood method.

    Results : We developed a new primer set to amplify matK region in Lepidii seu Descurainiae Semen and closely related

    plant samples. From the comparative analysis of matK sequences, we identified species-specific marker nucleotides

    for D. sophia, L. apetalum, L. latifolium, E. cheiranthoides, E. macilentum, and D. nemorosa, respectively. Furthermore,

    phylogenetic analysis revealed clear classification depending on the species. These results indicated that the matK

    sequence obtained a new primer set in this study was useful to identify Lepidii seu Descurainiae Semen in species

    level.

    Conclusions : We developed a primer set and identified species-specific marker nucleotides enough to distinguish

    authentic Lepidii seu Descurainiae Semen and adulterants at the species level based on the matK sequences. These

    genetic tool will be useful to prevent adulteration and to standardize the quality of Lepidii seu Descurainiae Semen.1)

    Key words : Lepidii seu Descurainiae Semen, Descurainia sophia (L.) Webb ex Prantl, Lepidium apetalum Willd.,

    Maturase K (matK), Molecular identification.

    Ⅰ. 서 론

    葶藶子는 십자화과(Brassicaceae) 식물인 다닥냉이(Lepidium apetalum Willd.) 또는 재쑥(Descurainia sophia (L.) Webb

    ex Prantl)의 잘 익은 씨로, 한의학에서는 사폐평천(瀉肺平

    喘)과 행수소종(行水消腫)의 효능이 있어 기침 해소, 천식방지,

    부종 감소 및 배뇨 촉진 등을 위해 광범위하게 이용되는 약재

    이다1,2,3). 중국과 대만의 경우에도 대한민국약전외한약(생약)

    규격집과 같이 다닥냉이와 재쑥의 종자를 葶藶子로 규정하고 있지만 재쑥의 잘 익은 씨를 南葶藶子라고 하며 다닥냉이의 잘 익은 씨를 北葶藶子로 구분하여 이용하고 있다1). 하지만 북한의 조선인민민주주의공화국약전은 다닥냉이와 꽃다지

    (Draba nemorosa L.)의 잘 익은 씨를 葶藶子로 이용하고 있다1). 우리나라의 경우에도 2013년 대한민국약전외한약(생약)

    규격집이 개정되기 이전까지는 북한과 같이 꽃다지와 다닥냉

    이의 종자를 葶藶子로 이용하였으나 최근 개정을 통해 재쑥과

    *#Corresponding and First author : Dr. Byeong Cheol Moon, K-herb Research Center, Korea Institute of Oriental Medicine, 1672 Yuseong-daero, Yuseong-gu, Daejeon 34054, Republic of Korea. ·Tel : +82-42-868-9530 ·Fax : +82-42-861-9421 ·E-mail : [email protected] ·Received : 24 March 2018 ·Revised : 30 April 2018 ·Accepted : 25 May 2018

  • 26 大 韓 本 草 學 會 誌 ― Vol. 33 No. 3, 2018

    다닥냉이의 종자로 규정하고 있다3,4).

    葶藶子는 길이 약 0.8~1.5㎜ (재쑥 0.8~1.2㎜, 다닥냉이 1.0~1.5㎜), 너비 약0.5~1.0㎜ (재쑥 약 0.5㎜, 다닥냉이

    0.5~1.0㎜) 크기가 작은 종자 약재로 형태적으로 유사한 콩

    다닥냉이(Lepidium virginicum L.), 쑥부지깽이(Erysimum

    cheiranthoides L.), 그리고 아직 국명이 명명되지 않은 E.

    macilentum Bunge의 종자와 구별이 매우 어렵고, 기존의

    공정서에 수재되어 있던 꽃다지의 종자가 유통될 가능성이 높

    아 사용에 있어 주의가 필요한 한약재로 알려져 있다3,5,6). 葶藶子의 기원식물인 재쑥은 우리나라 전역에 넓게 분포하고 있지만 다닥냉이는 우리나라 북부지역에 분포하는 식물로 현재

    남한지역에서는 확인되지 않고 있다. 하지만 다닥냉이와 형태

    적으로 매우 유사한 동속의 콩다닥냉이는 우리나라 전역에 분

    포하고 있어 이들의 종자가 국산 葶藶子로 유통될 가능성이 매우 높다. 따라서 이러한 유사종의 혼입에 의한 혼·오용 방

    지를 위해 한약재 관능검사해설서에서는 꽃다지와 냉이류 종

    자의 위품혼입과 구별에 주의를 당부하고 있고, 문 등은 이들

    식물에 대한 체계적인 형태적 특징 분석을 통해 기원식물 수

    준에서의 감별법을 제시하기도 하였다3,7). 중국의 경우에도

    葶藶子는 다양한 위품과의 약용부위 유사성으로 인해 형태학적 특성이나 현미경 관찰을 통한 특성 분석으로 정품과 종 단

    위에서 정확하게 구별하기 어려워 HPLC 지문분석법, HPCE

    (High Performance Capillary Electrophoresis) 분석법 등을

    이용한 이들의 이화학적 특성 분석을 통해 위품을 구별하는

    연구가 진행되고 있다8,9). 하지만 정확한 유통품에 대한 혼·

    오용 실태와 혼입되는 위품에 대한 현황파악이 어려워 체계적

    이고 정확한 감별법 개발의 어려움이 있는 실정이다.

    최근 유전자 분석기술의 발달로 인해 생물종이 가지고 있는

    고유의 유전자 정보를 이용하여 약전에 수재된 정품의 한약재와

    위품의 구별은 물론 다양한 한약재를 종 단위에서 감별할 수

    있는 DNA 바코드 연구가 활발하게 진행되고 있다10,11). 한약재

    감별에 주로 이용되는 DNA 바코드 구간으로는 주로 핵에 존

    재하는 internal transcribed spacer (ITS), 엽록체 게놈에

    존재하는 matK, rbcL, psbA-trnH, trnL-F 등이 많이 이

    용되고 있으며, 이들 유전자 부위 중에서 ITS, matK, rbcL

    부위가 범용성 식물 DNA 바코드로 알려져 있다12,13,14,15,16,17).

    이들 범용성 DNA 바코드는 일반적으로 universal primer를

    이용하여 대부분의 생물종에서 PCR 증폭이 가능하고 종간의

    염기서열 차이를 통해 각각의 종을 구별할 수 있으며, 구조적

    으로 안정되어 염기서열 분석이 용이한 구간을 일컫는다17).

    하지만 범용성 DNA 바코드 구간이라고 하여 모든 생물종에

    적용이 가능한 것은 아니다. 따라서 이들 범용성 DNA 바코드의

    한계점을 극복하기 위해 각각의 대상종을 정확하게 구별해야

    하는 한약재 감별과 같은 분야에서는 품목별로 이들 범용성

    DNA 바코드 구간을 PCR 증폭할 수 있는 새로운 primer를

    개발하거나 엽록체 게놈 분석과 같은 방법을 통해 품목별로

    적합한 새로운 DNA 바코드 구간 개발을 통해 감별에 활용하고

    있다 18,19,20,21).

    본 연구에서는 한약재 葶藶子의 약전 수재 기원종인 재쑥과 다닥냉이를 유통위품인 꽃다지, 콩다닥냉이, 쑥부지깽이 및

    E. macilentum을 DNA 바코드 염기서열 비교를 통해 구별하기

    위해 葶藶子 및 유사종의 matK 유전자 부위를 증폭할 수 있는

    새로운 primer를 개발하였다. 또한 개발된 matK 유전자 증

    폭용 primer를 통해 확보한 葶藶子 및 유사종에 대한 matK 염기서열 비교 분석을 통해 약전 수재 기원종인 재쑥과 다닥

    냉이, 그리고 유사종을 종 단위에서 구별할 수 있는 종 특이적

    염기서열을 발굴하고 검증하였다. 본 연구를 통해 개발된

    matK DNA 바코드 기반의 葶藶子 유전자 종 감별법은 葶藶子 유통품의 진위감별과 혼입된 위품의 종을 정확하게 구별하는데

    유용하게 활용될 것으로 판단된다.

    Ⅱ. 재료 및 방법

    1. 실험 재료

    본 실험에 이용된 葶藶子 기원식물 및 유사종 식물 시료는 경상도, 전라도, 충청도, 제주도 등의 각각 다른 국내 자생지

    에서 수집하였으며, 국내에 분포하지 않는 식물 종은 중국 길

    림성 지역의 독립된 자생지에서 수집하였다. 유전자 분석 이용

    한 식물 시료는 표 1에 정리한 바와 같이 재쑥 4개체, 다닥냉이

    3개체, 콩다닥냉이 5개체, 쑥부지깽이 3개체, E. macilentum

    4개체, 그리고 꽃다지 5개체를 이용하였다. 수집된 식물체는

    본초학, 생약학, 식물분류학 등의 전문가로 구성된 분류·동

    정자문회의의 동정을 거쳐 그 종을 최종 확정지었으며, 시료를

    채취한 식물체는 압착표본을 제작하여 한약표준표본관(Index

    herbariorum code KIOM)에 표본번호를 부여하여 보관하였

    으며, 채취한 유전자 분석용 시료는 –70℃의 초저온냉동고에 보관하여 사용하였다.

    2. DNA 추출

    -70℃의 초저온 냉동고에 보관된 유전자 분석용 생체시료와

    유통 약재 약 100mg을 분취하여 기 보고된 김 등의 방법을

    이용하여 total genomic DNA를 추출·정제하였다22). 추출

    법을 간략히 기술하면 분취한 생체시료와 유통약재를 Lysing

    matrix ATM tube (MP Biomedicals, USA)에 넣어 PrecellysTM

    Grinder (Bertin Technologies, France)로 마쇄한 후, 파쇄된

    용액을 취해 DNasey Plant Mini Kit (Qiagen, USA)을 이용

    하여 제조사가 제공한 추출법에 따라 추출·정제하였다. 정제된

    DNA는 1.5% agarose gel 상에 전기영동 후, EcodyeTM

    Nucleic Acid Staining Solution (Biofact, Korea)으로 염색

    하여 UV light에서 DNA의 양과 품질을 확인하였으며, UV

    spectrophotometer (Nanodrop ND-1000, DE, USA)를 이

    용하여 260 nm와 280 nm에서 흡광도를 측정하여 최종 정량

    하였다.

    3. 葶藶子 matK 유전자 증폭용 primer 개발6종 24개체의 시료로부터 추출한 total gDNA 약 20 ng을

    주형으로 약 1,250 bp의 matK 부위를 증폭하는 universal

    primer matK-AF와 matK-8R 각 20 pmole을 이용하여 김

    등이 기 제시한 방법과 조건으로 PCR 증폭하고 반응이 끝난

    각각의 증폭산물을 1.5% agarose gel에 전기영동하여 증폭

  • matK 증폭용 primer 개발 및 염기서열 분석을 통한 葶藶子 유전자 감별 27

    여부를 확인하였다22). 전기영동이 끝난 agarose gel을 EcodyeTM

    Nucleic Acid Staining Solution (Biofact, Korea)으로 염색

    하여 각 시료의 matK 부위 증폭여부와 크기를 확인하였다.

    葶藶子 matK 유전자 증폭용 primer를 제작하기 위해 NCBI GenBank에 등록된 십자화과 식물 흑개(Brassica nigra,

    AB354272 and LC064387), 갓(Brassica juncea, AB354274

    and LC064390), 유체(Brassica napus, AB354273 and

    LC064393), 백개(Sinapis alba, AB354277 and LC064389),

    꽃다지(AP009373)의 matK 염기서열을 내려 받아 이들의 염기

    서열을 비교하고 변이가 없고 염기서열이 잘 보존된 구간을

    이용하여 primer를 제작하였다. 제작된 葶藶子 matK 증폭용 정방향 primer matK-LDSF와 역방향 primer matK-LDSR

    각 20 pmole을 이용하여 약 20 ng의 total gDNA를 주형으로

    SolgTM 2×PCR Smart Premix (Solgent, Korea) 최종 50 ㎕

    의 반응용액에서 PCR 증폭하였다. PCR 증폭반응은 DNA

    Engine Dyad Thermal Cycler (Biorad, USA)에서 김 등22)이

    기 보고한 조건과 같은 조건으로 수행하였다.

    Name

    Collection Locality Voucher NoCollection

    dateLane in

    GelScientific Name(Family)

    Herbal Name(Korean, Chinese)

    Descurainia sophia (L.) Webb ex Prantl*

    (Brassicaceae)

    Lepidii seu Descurainiae

    Semen

    (Jeong-Ryek-Ja, Ting-Li-Zi)

    Gunwi, Gyeongbuk, Korea KIOM-CNB2016-028 2014. 05 1

    Cheongju, Chungbuk, Korea KIOM-MBC2016-008 2016. 04 2

    Eumseong, Chungbuk, Korea KIOM-MBC2016-013 2016. 04 3

    Geumsan, Chungbuk, Korea KIOM-MBC2016-038 2016. 05 4

    Lepidium apetalum Willd.*

    (Brassicaceae)

    Antu, Yanbian, Jilin, China KIOM-MBC2016-0881 2016. 06 5

    Helong, Yanbian, Jilin, China KIOM-MBC2016-0882 2016. 06 6

    Yanji, Yanbian, Jilin, China KIOM-MBC2016-0883 2016. 06 7

    Lepidium latifolium L. (Brassicaceae)

    -a

    Daeduk, Daejeon, Korea KIOM-MBC2016-023 2016. 05 8

    Gokseong, Jennam, Korea KIOM-KWJ2016-002 2016. 04 9

    Jecheon, Chungbuk, Korea KIOM-YSG2016-015 2016. 05 10

    Sancheong, Gyeongnam, Korea KIOM-MBC2016-026 2016. 05 11

    Taean, Chungnam, Korea KIOM-MBC2016-052 2016. 05 12

    Erysimum cheiranthoides L.

    (Brassicaceae)-a

    Danyang, Chungbuk, Korea KIOM-MBC2016-2281 2016. 05 13

    Danyang, Chungbuk, Korea KIOM-MBC2016-2282 2016. 05 14

    Danyang, Chungbuk, Korea KIOM-MBC2016-2283 2016. 05 15

    Erysimum macilentum Bunge

    (Brassicaceae)-a

    Gurye, Jeonnam, Korea KIOM-MBC2016-0401 2016. 05 16

    Gurye, Jeonnam, Korea KIOM-MBC2016-0402 2016. 05 17

    Andong, Gyeongbuk, Korea KIOM-YSG2016-0081 2016. 05 18

    Andong, Gyeongbuk, Korea KIOM-YSG2016-0082 2016. 05 19

    Draba nemorosa L.(Brassicaceae)

    -a

    Yuseong, Daejeon, Korea KIOM-YSG2016-010 2016. 04 20

    Eumseong, Chungbuk, Korea KIOM-MBC2016-012 2016. 04 21

    Gurye, Jeonnam, Korea KIOM-MBC2016-020 2016. 04 22

    Anseong, Gyeonggi, Korea KIOM-KWJ2016-0057 2016. 05 23

    Hapcheon, Gyeongnam, Korea KIOM-MBC2016-029 2016. 05 24

    * : indicates the official plant species for Lepidii seu Descurainiae Semen in current Korean Herbal pharmacopoeia and Chinese pharmacopoeia.

    a : indicates that there are no appropriate herbal name in current Korean and Chinese national pharmacopoeia.

    Table 1. Information of plant materials used in this study.

    4. matK 염기서열 분석 기반 종 특이적 nucleotide

    발굴 및 감별능 검증

    시료로부터 추출한 게놈 DNA와 matK-LDSF 및 matK-

    LDSR primer를 이용하여 matK 유전자를 증폭하고 반응이

    끝난 증폭산물은 1.5% agarose gel 상에서 증폭 여부를 확인

    하여 단일 DNA 절편으로 확인된 증폭산물은 Gel Extraction

    kit (Qiagen, USA)로 정제 후 pGEM-Teasy vector (Promega,

    USA)에 삽입하였다. 삽입된 증폭 산물은 XL1-Blue MRF'

    competent cell (Stratagene, USA)에 형질 전환하여

    Amplicillin과 X-gal/IPTG가 첨가된 LB agar배지에 배양

    하였다.

    종 특이적 marker nucleotide 발굴을 위해 표 1의 시료로

    부터 증폭한 시료별 3개의 white colony로부터 T7과 SP6

    primer와 ABI3730 automatic DNA sequencer (Applied

    Biosystems, USA)를 이용하여 염기서열 정보를 확보하고 이

    들의 비교 분석을 통해 PCR 오류, 염기서열 해독 오류, 종내

    지역별 변이 등을 확인 후 각 시료의 표준 염기서열을 최종 확

  • 28 大 韓 本 草 學 會 誌 ― Vol. 33 No. 3, 2018

    정하였다. 최종 확정된 葶藶子 기원종 및 유사종 6종 24개체의 matK 염기서열은 Bioedit program (version 7.0.9)의

    ClustalW 방법으로 전체 염기서열을 정렬하고 비교하였다23).

    종 특이적 marker nucleotide 탐색을 위해 정렬된 전체 matK

    염기서열로부터 종내 개체간 차이가 확인되지 않고 종별 특이

    성을 갖는 염기의 삽입/결실(insertion and deletion) 및 치환

    (substitution)을 정렬된 위치별로 분석하여 정리하였다.

    matK 유전자 염기서열을 이용한 유전자 감별법의 감별능을

    검증하기 위하여 2개의 葶藶子 유통품을 구입하여 상기와 동일한 방법으로 matK 유전자를 증폭하고 각 10개의 증폭산물이

    삽입된 white colony로부터 염기서열을 해독하여 확보하였다.

    확보된 이들 염기서열을 상기 marker nucleotide 발굴과 같은

    방법으로 표 1의 전체시료와 비교하고 종 특이적 marker

    nucleotide의 위치별 삽입/결실과 치환을 확인하여 그 종을

    확인하였다.

    5. matK 염기서열 기반 분자계통학적 유연관계 분석

    葶藶子 기원종 및 유사종 6분류군 24개체의 유연관계 분석을 위해 각 시료로부터 확보한 matK 전체 염기서열을 MEGA

    version 7의 ClustalW 방법으로 정렬하고 Maximum likelihood

    (ML) 모델 test를 수행하였다24). 같은 프로그램의 Tamura

    3-parameter model과 Subtree-Pruning-Regrafting 알

    고리즘으로 Bootstraping method 1,000회 반복을 통해 최종

    tree를 도출하고 6분류군 24개체의 유집 형성 유무와 유연관

    계를 비교 분석하였으며, 군외군(outgroup)으로는 같은 십자

    화과에 속하는 개자(Brassica juncea, AP009373)의 염기서열

    정보를 NCBI GenBank에서 내려 받아 사용하였다.

    Ⅲ. 결 과

    1. matK 유전자 부위 증폭 및 염기서열 특성 분석

    葶藶子 약전 기원종과 유사종 감별을 위하여 6종 24개의 시료로부터 추출한 gDNA를 이용하여 범용성 matK 증폭용

    primer인 matK-AF와 matK-8R로 증폭한 결과 모든 시료

    에서 matK 유전자를 증폭할 수 없었다(Fig. 1A). 따라서 본

    연구에서는 葶藶子 약전 기원종 및 유사종으로부터 matK 유전자 부위 증폭을 위해 재료 및 방법에 기술된 방법을 이용하여

    새로운 葶藶子 matK 유전자 부위를 증폭할 수 있는 primer를 제작하였다(Table 2). 본 연구를 통해 제작한 葶藶子 matK 증폭용 primer (matK-LDSF and matK-LDSR)를 이용하여

    matK 유전자 부위를 PCR 증폭하여 확인한 결과, 전체 6종

    24개 시료 모두에서 약 1.6 kb의 DNA 절편이 증폭되었다

    (Fig. 1B). 6종 24개체 시료로부터 증폭된 약 1.6 kb의 matK

    유전자의 염기서열 해독을 위해 pGEM-Teasy vector (Promega,

    USA)에 삽입한 뒤, 시료별로 3개 이상의 삽입된 증폭산물의

    염기서열을 확보하고 이들을 비교하여 증폭, 해독 등의 실험

    과정에서 발생할 수 있는 오류 보정을 통해 각 시료의 matK

    유전자 염기서열로 확정하였다. 최종 확정된 matK 염기서열은

    쑥부지깽이를 제외한 5종은 모두 1,641 bp로 확인되었으며,

    쑥부지깽이는 이들보다 1개의 염기가 결실된 1,640 bp로 구성

    되어 있는 것으로 확인되었다(Fig. 2).

    Barcode region Primer name Sequence(5'→3'`) Length Temp Ref.

    Universal matK regionmatK-AF CTATATCCACTTATCTTTCAGGAG 24 bp

    55℃Jarvinen et al.,

    200425)matK-8R AAAGTTCTAGCACAAGAAAGTCGA 24 bp

    matK region amplified in this study

    matK-LDSF TGAGGTATCTATTGCTTTCGT 21 bp55℃ This study

    matK-LDSR ACCCAATTATTCATGATTGACCA 23 bp

    Table 2. Primer sequence information of matK gene used in this study for the amplification of plant materials related to Lepidii seu DescurainiaeSemen.

    Figure 1. Results of PCR amplification for mat K gene. (A) PCR products of mat K gene amplified by universal mat K-AF and mat K-8R. (B)PCR products mat K gene amplified by mat K-LSDF and mat K-LSDR developed in this study.

  • matK 증폭용 primer 개발 및 염기서열 분석을 통한 葶藶子 유전자 감별 29

    2. matK 유전자 염기서열 기반 종 감별용 marker

    nucleotide 발굴 및 검증

    葶藶子 약전 기원종 및 유사종의 종내 유전적 변이와 종 감별이 가능한 종 특이염기서열을 확인하기 위해 6종 24개체

    시료로부터 확보한 전체 matK 염기서열을 정렬하고 비교하여

    염기의 삽입/결실과 치환을 분석한 결과, 전체 matK 염기서

    열은 1,641 bp의 범위에서 정렬되었으며 정렬된 각 위치에서

    염기서열의 종내 삽입/결실과 치환 변이는 확인되지 않은 반면

    종 특이적인 변이는 다양한 위치에서 확인되었다(Fig. 2). 대한

    민국약전 수재 기원종인 재쑥의 matK 염기서열을 기준으로

    다닥냉이, 콩다닥냉이, 쑥부지깽이, E. macilentum, 꽃다지

    염기서열을 비교한 결과, 각각의 종을 다른 종과 구별할 수

    있는 종 특이 marker nucleotide는 재쑥에서 15개 위치의 염

    기치환이 확인되었으며, 다닥냉이에서 4개 위치의 염기치환,

    콩다닥냉이와 E. macilentum에서 각각 1개의 염기치환, 쑥

    부지깽이에서 1개의 염기결실과 4개의 염기치환, 그리고 꽃

    다지에서 다수의 염기치환이 확인되었다(Fig. 2, Table 3). 이

    들 종 특이적 marker nucleotide를 이용한 葶藶子 약전 기원종 및 유사종의 종 단위 감별을 상술하면, 재쑥은 정렬된 374

    번 위치 염기가 아데닌(A)인 반면 다닥냉이, 콩다닥냉이, 쑥

    부지깽이, E. macilentum 및 꽃다지는 티민(T)으로 재쑥과

    구분할 수 있었다(Table 3). 또한 375번 위치의 염기서열은 재

    쑥은 아데닌(A), 쑥부지깽이는 티민(T), E. macilentum은 구

    아닌(G)으로 다닥냉이, 콩다닥냉이 및 꽃다지의 시토신(C)과

    구별할 수 있어 재쑥, 쑥부지깽이 및 E. macilentum을 종 단

    위에서 각각 구별할 수 있었다(Table 3). 이와 같은 다양한 위

    치의 matK 유전자 종 특이적 염기서열 변이는 본 연구에서

    분석한 葶藶子 약전 기원종 2종과 유사종 4종 모두를 종 단위에서 구별할 수 있는 종 특이적인 marker nucleotide를 제공

    할 수 있는 것으로 확인되어 葶藶子 유전자 감별에 활용 가능한 DNA 바코드 부위임을 알 수 있었다.

    Figure 2. Comparison of matK sequences among 24 plant samples of 6 species with authentic and adulterants of Lepidii Seu DescurainiaeSemen. Dots (·) and represent identical nucleotide sequence to D. sophia CNB2016-028 sequence. Dashes (-) represent gaps to maximizedalignment. The result of sequence alignment was presented by only 600 bp in part of the 5’-end matK genes.

  • 30 大 韓 本 草 學 會 誌 ― Vol. 33 No. 3, 2018

    Sample name 23 38 44 58 93 95 105 106 194 243 254 261 270 271 281 301 319 335 358 366

    D. sophia G T G G C C C G G A T T G C C C T G A A

    L. apetalum · · · · · · · C · · · · · G · · · · · ·

    L. latifolium · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·

    E. cheiranthoides · · · · · · · · · · · · C · · · · · · ·

    E. macilentum · · · · · · · · · · · · C · · · · · · ·

    D. nemorosa A A A A T T T · T C C G T · A T G A C C

    Sample name 369 374 375 378 394 397 401 419 449 461 469 489 525 545 551 569 572 593 619 623

    D. sophia C A A T G T C C A A C T A C A G G C T A

    L. apetalum · T C · · · · T · · · · · · · · A · C ·

    L. latifolium · T C · · · · T · · · · · · C · A · C ·

    E. cheiranthoides · T T · · · · T · · · · · · G · A · C ·

    E. macilentum · T G · · · · T · · · · · · G · A · C ·

    D. nemorosa A T C G A A G T G C T A C T · C A G C T

    Sample name 629 641 650 668 684 702 718 719 720 773 792 801 802 810 824 826 838 846 873 874

    D. sophia T T T C T T C G C C T A C G C T C A A C

    L. apetalum C · · · · · · A A · · G · · · · · G · C

    L. latifolium C · · · · · · A A · · G · · · · · G · C

    E. cheiranthoides C · · · · · · A A · - G · · · · · G · A

    E. macilentum C · · · · · · A A · · G · · · · · G · C

    D. nemorosa C C C T G G G C A T · G A T T G T G C C

    Sample name 882 888 906 907 911 938 962 964 965 968 984 988 1013 1021 1029 1037 1058 1056 1084 1137

    D. sophia A C G C T A G T G C C C A G A G A A C C

    L. apetalum · · · G · · · · · A T T · · · · · · T ·

    L. latifolium · · · G · · · · · A T · · · · · · · T ·

    E. cheiranthoides · T · G · · · · · A T · · · · C · · T ·

    E. macilentum · T · G · · · · · A T · · · · · · · T ·

    D. nemorosa T A A G C C A A A A T · T C C · C G T T

    Sample name 1170 1173 1189 1197 1203 1239 1289 1305 1335 1350 1386 1438 1477 1478 1479 1490 1515 1584 1312

    D. sophia C A G C G A C A G T G T A A A G A A A

    L. apetalum · · · · · · · · C · T G G · · · G · ·

    L. latifolium · · · · · · · · · · T G G · · · G · ·

    E. cheiranthoides · · · · · · T · · · · G · · · · G · ·

    E. macilentum · · · · · · · · · · · G · · · · G · ·

    D. nemorosa T G A A T G · G · A A G C G G T G G C

    Numbers indicate the number of nucleotide positions in aligned matK sequence of all species. Dots (·) represent identical nucleotide sequence to D. sophia. Dash (-) indicates the deletion of nucleotide. Shaded nucleotides represent species-specific marker nucleotide sequences.

    Table 3. Summary of species-specific marker nucleotides for species identification from the comparison of the matK gene sequences.

    이들 matK 염기서열과 종 특이적인 marker nucleotide를

    이용하여 실제 유통되고 있는 葶藶子의 기원 확인과 위품 혼입여부를 검증하기 위해 葶藶子 유통품을 구입하여 유전자 감별을 수행하였다. 두 개의 유통품으로부터 추출한 게놈 DNA와

    본 연구를 통해 개발한 matK-LDSF와 matK-LDSR primer를

    이용하여 matK 유전자를 증폭하고 이들 증폭산물을 pGEM-

    Teasy vector에 삽입하여 각 10개의 클론을 취한 뒤 삽입된

    증폭산물의 염기서열을 해독하였다. 해독한 염기서열을 葶藶子 유통품, 재쑥, 다닥냉이, 콩다닥냉이, 쑥부지깽이, E. macilentum

    및 꽃다지 염기서열과 비교한 결과, 葶藶子 유통품(sample 1

    and sample 2 in Fig. 3)에서 재쑥과 동일한 염기서열(Seq-1

    in Fig. 3)과 E. macilentum과 동일한 염기서열(Seq-2 in

    Fig. 3)이 동시에 확인되었다. 즉, 유통품으로부터 확보한 두

    개의 염기서열 비교와 374번과 375번 위치의 종 특이적 염기

    서열 확인을 통해 유통품은 葶藶子 약전 기원종인 재쑥에 E. macilentum이 혼입되어 있음을 확인할 수 있었다 (Table 3

    and Fig. 3). 따라서 matK 염기서열 분석을 통한 葶藶子 유전자 감별법은 생체 식물시료 뿐만 아니라 유통약재에서 위품의

    혼입여부를 종 단위에서 감별할 수 있을 것으로 판단된다.

  • matK 증폭용 primer 개발 및 염기서열 분석을 통한 葶藶子 유전자 감별 31

  • 32 大 韓 本 草 學 會 誌 ― Vol. 33 No. 3, 2018

    Figure 3. Confirmation of adulterant species in commercial Lepidii Seu Descurainiae Semen by the comparative analysis of matK sequences (D. sophia, KIOM-CNB2016-028; L. apetalum, KIOM-MBC2016-0881; L. latifolium, KIOM-MBC2016023; E. cheiranthoides, KIOM-MBC2016-2281; E. macilentum, KIOM-MBC2016-0401; D. nemorosa, KIOM-YSG2016-010; Sample 1 and 2, Commercial Lepidii Seu Descurainiae Semen). Dots (·) and represent identical nucleotide sequence to D. sophia sequence. Dashes (-) represent gaps to maximized alignment. The full lined and dotted lined boxes represent the samples revealed identical nucleotide sequences, respectively.

  • matK 증폭용 primer 개발 및 염기서열 분석을 통한 葶藶子 유전자 감별 33

    3. 분자계통학적 유연관계 분석

    다양한 지역에서 수집한 葶藶子 약전 기원종과 유사종 6종 24개체 시료의 matK 유전자 증폭산물 전체 염기서열 정보를

    이용하여 이들의 분자계통학적 유연관계를 분석하였다. ClustalW

    방법으로 Maximum Likelihood (ML) tee를 작성하고 6개

    분류군에 대한 유연관계를 분석한 결과, 모든 시료는 종단위로

    유집되며 명확하게 분류되었고 같은 속 식물은 하나의 clade를

    형성하며 분류학적 특징을 나타내었다(Fig. 4). 즉, 약전 수재

    기원종인 다닥냉이는 콩다닥냉이와 가장 가까운 유전적 거리를

    가지며 또 다른 약전 기원종인 재쑥과 유전적으로 가까운 것

    으로 확인되었다. 쑥부지깽이와 E. macilentum은 하나의 그

    룹을 형성하며 약전 기원종이 포함된 다닥냉이, 콩다닥냉이

    및 재쑥 그룹과 자매군을 형성하였다. 하지만 약전에서 제외

    된 꽃다지의 경우 유전적으로 가장 멀리 떨어져 있어 약전에서

    제외시킨 결과를 지지하였다(Fig. 4).

    Figure 4. Phylogenetic relationships of authentic plant species and closely related adulterants of Lepidii Seu Descurainiae Semen based onmatK sequences.

    이상의 결과를 종합하면, 기존에 보고된 universal primer

    로 증폭할 수 없는 葶藶子 기원종 및 유사종의 matK 유전자를 본 연구를 통해 개발한 matK-LDSF와 matK-LDSR primer

    를 이용하여 확보한 1,640~1,641 bp matK 유전자 염기서

    열을 비교한 결과, 종 특이적 염기의 위치와 치환 또는 삽입/

    결실과 유연관계 분석을 통해 한약재 葶藶子 약전 기원종과 유사종을 종단위에서 정확하게 구별할 수 있는 것으로 판단된

    다. 유전자 정보를 이용한 한약재 葶藶子 약전 기원종과 유사종의 종 단위 유전자 감별법은 유통되는 한약재 감별은 물론

    파종 단계에서 정품을 재배할 수 있는 객관적이고 효율적인

    분자 마커로 활용할 수 있어 葶藶子 유사종 생산 및 유통 방지에 기여할 것으로 판단된다. 또한 분자계통학적 유연관계

    분석을 통해 꽃다지가 약전 수재 기원종에서 제외되는 것과

    쑥부지깽이류가 약전 수재 기원종인 재쑥과 다닥냉이의 유전

    적 거리가 먼 유사종임을 지지하였다. 하지만 콩다닥냉이를

    포함한 Lepidum속에서 다닥냉이 만을 기원종으로 인정하는

    부분에 대한 성분 비교 분석, 한의학적 효능주치 이론에 기반

    한 효능 평가 및 비교 등의 추가적인 연구와 고찰이 필요할 것

    으로 사료된다.

    Ⅳ. 고 찰

    본 연구 수행에 앞서 한약재 葶藶子 유통품의 기원을 확인하기 위하여 재쑥, 다닥냉이, 그리고 유통약재로부터 DNA를

    추출하고 국제생물바코드컨소시엄(CBOL)에서 권장하는 대표

    적인 범용성 DNA 바코드인 matK 유전자 염기서열을 확보하여

    NCBI GenBank에 등록된 염기서열 정보와의 비교분석을 통해

    그 종을 확인하고자 하였다. 앞의 결과에서 기술하였듯이 범

    용성 matK 증폭용 primer인 matK-AF와 matK-8R 조합

    으로 증폭되지 않아 본 연구팀에서 보유하고 있는 matK 유전자

    앞부분 약 400 bp 부위를 부분적으로 증폭할 수 있는 primer를

    이용하여 증폭된 DNA 절편을 pGEM-Teasy vector에 삽입

    하여 재쑥 및 다닥냉이 기원식물과 유통약재로부터 각각 5개와

    10개 클론의 염기서열 상호비교와 NCBI GenBank 검색으로

    비교한 결과, 葶藶子 유통품은 다닥냉이는 포함하고 있지 않았으며, 재쑥과 Erysimum속 식물 한 종이 혼입된 두 종의

    식물 종자로 구성되어 있다는 사실을 확인 할 수 있었다. 이

    러한 결과를 바탕으로 葶藶子 유통품에 포함된 위품의 종을 확인하기 위하여 葶藶子 약전 기원종과 이들의 유사종 그리고

  • 34 大 韓 本 草 學 會 誌 ― Vol. 33 No. 3, 2018

    Erysimum속 식물을 수집하여 이들의 matK 유전자 염기서

    열 분석을 진행하였다.

    葶藶子 유통품에 혼입된 유사품의 종을 확인하고 약전 기원종과 이들의 동속근연종, 그리고 위품과 구별할 수 있는 유

    전자 감별법 개발을 위해 약전 기원종인 다닥냉이와 재쑥, 다닥

    냉이의 동속근연종으로 국내에 전국적으로 분포하는 콩다닥

    냉이, 약전 개정으로 葶藶子 약전 수재 기원종에서 제외된 꽃다지, 그리고 Erysimum속의 쑥부지깽이와 국명이 아직 등록

    되지 않은 Erysimum macilentum을 다양한 지역에서 확보

    하고, Yang 등이 보고한 형태 감별 기준을 통해 동정하여 그

    종을 확정하고 유전자 감별법 개발을 위한 분석용 시료로 사

    용하였다3).

    십자화과에 속하는 葶藶子 약전 기원종 및 유사종에서 universal primer에 의해 matK 유전자가 증폭되지 않는 결과

    는 국제생물바코드컨소시엄(CBOL) 식물분과와 Hollingsworth

    등이 기 보고한 하나의 DNA 바코드로 모든 생물종에 적용하기

    어렵고 모든 식물종에서 증폭되지 않는다는 기존의 결과를 지지

    하는 결과이다16,17). 본 연구에서는 葶藶子 약전 기원종과 유사종 감별에 활용할 수 있는 보다 다양한 matK 유전자 염기

    서열 변이(치환 및 삽입/결실) 정보를 확보하기 위하여 약

    1.6 kb의 matK 유전자 부위를 증폭할 수 있는 葶藶子 matK 유전자 증폭용 primer를 십자화과 식물의 엽록체 게놈 염기

    서열 정보를 이용하여 개발하였다. 개발된 matK 유전자 증폭용

    primer는 葶藶子 약전 기원종과 이들의 유사종을 포함한 6종 24개체의 시료에서 모두 matK 유전자를 증폭하였으며, 葶藶子 약전 기원종과 유사종의 구별은 물론 이들을 종 단위에서 동

    정할 수 있는 종 특이적 염기서열 정보를 제공하였다(Table 3,

    Fig. 2 and 3). 뿐만 아니라, 실제 葶藶子 유통품에서 증폭한 matK 유전자 염기서열을 분석한 결과 두 개의 葶藶子 유통품 모두 약전 기원종인 재쑥과 E. macilentum이 혼합되어 있는

    것을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 따라서 본 연구를 통해 개발된

    matK-LDSF와 matK-LDSR primer는 葶藶子 약전 기원종과 유사종 구별에 필요한 matK 유전자 증폭에 유용하게 활용될

    것으로 판단되며, 십자화과에 속하는 한약재 개자, 운대자,

    내복자 등의 유전자 감별법 개발에도 이용할 수 있을 것으로

    기대된다.

    Ⅴ. 결 론

    본 연구는 한약재 葶藶子의 약전 기원종과 종자의 형태가 유사하여 혼·오용 되고 있거나 혼·오용 될 가능성이 매우

    높은 유사종에 대한 효과적 감별법 개발을 위하여 분자생물학

    적인 기법의 일환으로 matK 유전자 증폭 및 염기서열 분석을

    통해 다음과 같은 결론을 얻었다.

    1. 한약재 葶藶子 약전 기원종 및 유사종의 범용성 DNA 바코드인 matK 유전자는 universal matK-AF 및

    matK-8R primer 쌍으로 증폭되지 않았으며, NCBI

    GenBank 염기서열 정보를 통해 葶藶子 matK 유전자 부위를 안정적으로 증폭할 수 있는 새로운 primer 쌍

    matK-LDSF와 matK-LDSR을 개발하였다.

    2. 본 연구를 통해 개발한 葶藶子 증폭용 matK primer로 확보한 matK 염기서열 정보를 통해 葶藶子 약전 기원종인 재쑥 및 다닥냉이와 유사종인 콩다닥냉이, 쑥부지

    깽이, E. macilentum 및 꽃다지를 구별할 수 있는

    marker nucleotide를 15개, 4개, 1개, 5개, 1개, 그리고

    20개 이상의 위치에서 각각 발굴함으로써 matK 유전자

    염기서열과 종 특이적 염기의 삽입/결실 및 치환을 통해

    한약재 葶藶子의 기원검증과 위품의 혼·용 방지를 위한 유전자 감별법으로 활용할 수 있을 것으로 판단된다.

    감사의 글

    본 연구수행에 필요한 기원식물 표본을 제공해 주신 한국

    한의학연구원 한약표준표본관(Index Herbariorum code

    KIOM)과 분류·동정에 도움을 주신 분류·동정 자문위원님

    들께 감사드립니다. 본 연구는 한국한의학연구원 K-herb과

    제의 일환으로 진행 중인 ‘기원검증체계 구축을 통한 한약자원 국내생산 기반 기술 개발’과제(K17403)의 지원에 의해 수행되었습니다.

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