Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)y Universidad Autónoma de Madrid (UAM)
Universidad Autónoma de MadridCantoblanco28049 MADRIDTel.: (+34) 91 397 5070Fax: (+34) 91 397 4799http: //www.cbm.uam.es
Biología celularCell Biology
Biología del desarrolloDevelopmental Biology
Inmunología y virologíaImmunology and virology
NeurobiologíaNeurobiology
Regulación de la expresión génicaRegulation of gene expresion
Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)y Universidad Autónoma de Madrid (UAM)
Universidad Autónoma de MadridCantoblanco
28049 MADRIDTel.: (+34) 91 397 5070Fax: (+34) 91 397 4799http: //www.cbm.uam.es
0102
Coordinadores de esta Memoria /Report Coordinators
José Manuel CuezvaCrisanto Gutierrez
Memoria Científica Scientific Report
Comentarios del directorIntroductory remarks
PersonalPersonnel
.......4
.......8
ÍndiceIndex Biología del Desarrollo
Developmental Biology
Biología CelularCell Biology
A. 1 Análisis Genético de mecanismosmorfogenéticos en Drosophila
Genetic Analysis of morphogeneticmechanisms in Drosophila
Antonio García-Bellido
A. 2 Mecanismos de señalización en eldesarrollo
Signalling mechanisms in development
Isabel Guerrero
A. 3 Comunicación intercelular en eldesarrollo del Drosophila
Cell-cell signalling in Drosophiladevelopment
Fernando Jiménez Díaz-Benjumea
A. 4 Biología molecular del desarrollo
Molecular biology of development
Juan Modolell
A. 5 Control genético de la morfogénesis
Genetic control of morphogenesis
Ginés Morata
.......14
.......16
.......18
.......20
.......22
.......28
.......30
.......32
.......34
.......36
.......38
.......40
A
B
B. 1 Citoesqueleto y nucleoesqueleto
Cytoskeleton and nucleoskeleton
Isabel Correas
B. 2 Mecanismos de regulación de labiogénesis mitocondrial y alteraciónmitocondrial en cáncer
Mechanisms that regulate thebiogenesis of mitochondria andmitochondrial alterations in cancer
José M. Cuezva
B. 3 Terapia génica experimental
Experimental gene therapy
Marta Izquierdo
B. 4 Desarrollo neuronal yneurodegeneración
Neuronal development andneurodegeneration
Francisco Moreno
B. 5 Señalización celular por PKC atípicasen inmunidad y cáncer
Cell signaling through the atypical PKCpathways in immunity and cancer
Jorge Moscat
.......26
B. 6 Tráfico regulado de proteínas demembrana
Regulated membrane proteintrafficking
Ignacio V. Sandoval
B. 7 Terapia génica experimental
Experimental gene therapy
Antonio Talavera
B. 8 Química de proteínas y proteómica
Protein chemistry and proteomics
Jesús Vázquez
Inmunología y VirologíaImmunology and Virology
C. 1 Transmisión de señales a través delreceptor para el antígeno de células T
Signal transduction through the T cellantigen receptor
Balbino Alarcón
C. 2 Bases moleculares de la patogenia ydel potencial anti-tumoral de losparvovirus
Molecular bases of parvoviruspathogenesis and anti-tumour potential
José M. Almendral
C. 3 Bases moleculares de la citopatologíaviral
Molecular bases of viral cytopathology
Luis Carrasco
C. 4 Variabilidad genética de virus RNA
Genetic variability of RNA viruses
Esteban Domingo
C. 5 Activación del sistema inmune
Activation of the immune system
Manuel Fresno
C. 6 Estabilidad e ingeniería de proteínasvíricas
Stability and engineering of viralproteins
Mauricio García Mateu
C. 7 Replicación del DNA y ciclo celular
DNA replication and cell cycle
Crisanto Gutierrez
C
.......44
.......48
.......46
.......50
.......52
.......56
.......54
.......64
SeminariosSeminars ....136
Seminarios “Severo Ochoa”.Avances en Biología MolecularSeminars “Severo Ochoa”.Advances in Molecular Biology .....138
Servicios Técnicosde Apoyo a la InvestigaciónResearch and Support Facilities .....140
.......66
.......68
.......70
.......72
Lecciones conmemorativasMemorial Lectures .....142
C. 8 Inmunología de los antígenos dehistocompatibilidad
Immunology of histocompatibilityantigens
José A. López de Castro
C. 9 Enzimas retrovirales: análisis estructuraly funcional de la retrotranscriptasa delvirus de la inmunodeficiencia humana
Retroviral enzymes: structural andfunctional analysis of humanimmunodeficiency virus reversetranscriptase
Luis Menéndez Arias
C.10 Regulación de la expresión génica enendotelio vascular
Regulation of gene expression invascular endothelium
Juan Miguel Redondo
C.11 Desarrollo del sistemalinfohematopoiético embrionario
Embryonic development of thelymphohematopoietic system
Miguel Angel Rodríguez Marcos
C.12 Virus de la peste porcina africana
African swine fever virus
María Luisa Salas
C.13 Desarrollo de nuevas estrategias parael control y prevención deenfermedades virales: el virus de lafiebre aftosa como modelo
Development of new strategies tocontrol and prevent viral diseases: thefoot-and-mouth virus as a model
Francisco Sobrino
C.14 Desarrollo del sistemalinfohematopoyético humano
Development of the humanlymphohematopoietic system
María Luisa Toribio
C.15 Replicación y transcripción del DNAdel bacteriófago ø29
Replication and transcription ofbacteriophage ø29
Margarita Salas
D. 5 Regulación de la expresión génica enenfermedades neurodegenerativas
Regulation of the gene expression inneurodegenerative diseases
Cecilio Giménez
D. 6 Bases moleculares de la adaptaciónal ejercicio y de la plasticidad muscular
Molecular bases of the adaptation toexercise and of skeletal muscleplasticity
Rafael Manso
D. 7 Biología de células troncales neuraleshumanas. Potencial para reposicióncelular y terapia génica enneurodegeneración
Biology of human neural stem cells.Potential for gene therapy inneurodegeneration
Alberto Martínez Serrano
D. 8 Mecanismos de señalización yregulación de receptores acoplados aproteínas G
G protein-coupled receptors signalingand regulatory mechanisms
Federico Mayor, jr.
D. 9 Neurotransmisión y desarrollo
Neurotransmission and development
Galo Ramírez.
D.10 Neurodegeneración y envejecimiento:señalización mitocondrial del calcio yseñalización de insulina/leptina enenvejecimiento
Neurodegeneration and ageing:calcium signalling in mitochondria andinsulin/leptin signalling during ageing
Jorgina Satrústegui.
D.11 Neuropatología molecular de laenfermedad de Alzheimer
Molecular neuropathology ofAlzheimer's disease
Fernando Valdivieso.
E. 6 Mantenimiento y variabilidad delgenoma: enzimología de la reparaciondel DNA
Genome maintenance and variability:enzymology of DNA repair
Luis Blanco
E. 7 Regulación de la expresión génicaespecífica de tejido
Regulation of the tissue-specific geneexpression
José Luis Castrillo Díez
E. 8 Estructura y función del ribosoma
Ribosome structure and function
Juan Pedro García Ballesta
E. 9 Síntesis de proteínas y su regulaciónen eucariontes
Protein synthesis and its regulation ineukaryotes
César de Haro, José M. Sierra
E.10 Expresión génica en levaduras yStreptomyces
Gene expression in yeast andStreptomyces
Antonio Jiménez
E.11 Iniciación interna de la traducción enmRNAs eucarióticos
Internal initiation of translation ineukaryotic mRNAs
Encarnación Martínez-Salas
E.12 Estructura cromatínica y transcripción
Chromatin structure and transcription
Enrique Palacián
E.13 Envolturas celulares
Cell envelopes
Miguel Angel de Pedro Montalban
E.14 Bases moleculares de lasenfermedades metabólicas
Molecular basis of metabolic diseases
Magdalena Ugarte
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.......60
.......62
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.......80
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Responsables de LaboratorioPersons in charge of laboratories ....132Neurobiología
Neurobiology
D. 1 Bases moleculares de laneurotransmisión glicinérgica
Molecular basis of glycinergicneurotransmission
Carmen Aragón
D. 2 Función de las proteínasmicrotubulares en neuronas
Function of microtubular proteins inneurons
Jesús Avila de Grado
D. 3 Transducción de señales. Mecanismosde acción de neuromoduladores eimplicaciones farmacológicas
Signal transduction. Mechanisms ofaction of neuromodulators andpharmacological implications
Edgardo Catalán
D. 4 Bases moleculares de la plasticidadneuronal
Molecular basis of neuronal plasticity
F. Javier Díez Guerra
DRegulación de la expresión génicaRegulation of gene expression
E. 1 Parasitología molecular
Molecular parasitology
Carlos Alonso
E. 2 Expresión génica en linfocitos T
Gene expression in T lymphocytes
Miguel A. Alonso
E. 3 Biología molecular de extremófilos(microbiología aplicada)
Molecular biology of extremophylicmicroorganisms
Ricardo Amils
E. 4 División celular bacteriana y resistenciaa antibióticos
Bacterial cell division and antibioticsresistance
Juan Alfonso Ayala Serrano
E. 5 Biotecnología y genética de bacteriastermófilas extremas
Biotechnology and genetics of extremethermophilic bacteria
José Berenguer
E
Próximos a celebrar el 50 aniversario del
descubrimiento de la doble hélice, podemos
observar lo mucho y bueno que se ha
realizado en estos años en el campo de la
Biología Molecular. En este último bienio,
tras haberse determinado la secuencia del
DNA de muchos organismos, incluyendo el
ser humano, se han comenzado los estudios
de genómica funcional en muchos de esos
organismos. Nuevos descubrimientos como
las moléculas de RNA que pueden prevenir
la expresión génica pueden ser valiosas
herramientas para estos estudios. Pero no
solo se han conseguido avances en el área
de la expresión génica, sino también en las
otras áreas de la investigación: Biología del
Desarrollo, Virología, Inmunología,
Microbiología, Biología Celular, Señalización
Celular o Neurobiología; todas estas
disciplinas se desarrollan en nuestro Centro.
Existe pues una gran rapidez de
acontecimientos científicos en el campo de
la Biología Molecular que requiere de
nosotros un gran esfuerzo para ser
competitivos a nivel internacional.
Adicionalmente, cada día aparecen nuevas
técnicas y equipamientos, lo cual nos hace
depender de recursos materiales para los
que necesitamos cada vez una mayor
subvención, para estar en las mismas (o por
lo menos no muy diferentes) condiciones
que nuestros colegas extranjeros.
El esfuerzo de nuestros investigadores
y personal de apoyo ha sido y es modélico
y es la razón fundamental por la que nuestro
Centro tiene un cierto reconocimiento a nivel
Internacional. El aumento de recursos es
muy mejorable. Afortunadamente, tenemos
la ayuda de nuestros patronos, el CSIC y la
UAM, así como el apoyo esencial y
constante de la Fundación Ramón Areces
(a través de una ayuda institucional a la
Ciencia que se realiza en nuestro Centro).
Igualmente, la valía de nuestros
investigadores nos ha permitido obtener
ayudas competitivas de organismos públicos
(fundamentalmente del Ministerio de Ciencia
y Tecnología, y del Ministerio de Sanidad y
Consumo), y también de instituciones
privadas. Sin embargo, requerimos de más
recursos.
Un problema fundamental del CBMSO
es la carencia de espacio. Por ello las
Direcciones anteriores (Federico Mayor
Menéndez y Miguel Angel de Pedro)
gestionaron la posible construcción de un
nuevo edificio. Gracias a su gestión, hoy en
día tenemos un proyecto para construir una
nueva sede en el Campus de Cantoblanco,
dentro del Parque Científico de Madrid.
Tenemos cedida por la UAM una parcela, y
actualmente existe un proyecto de
construcción de este nuevo edificio que está
llevando a cabo la empresa Euroespacios.
Con este nuevo edificio se pretende
reorganizar el CBMSO. En este reorganizado
Centro se piensa aunar las diferentes líneas
de trabajo, junto con algún otro nuevo grupo
externo, en cuatro áreas de trabajo que
hagan más eficiente su funcionamiento.
C O M E N TA R I O S D E L D I R E C T O RW O R D S F R O M T H E D I R E C T O R
4
En el bienio 2001-2002 la
producción de las diferentes líneas
del Centro ha dado lugar a 338
artículos de investigación con un
índice de impacto medio de
alrededor de 6. El número de
proyectos de investigación
financiados ha sido de 316
incluyendo aquellos
subvencionados por instituciones
públicas (del Gobierno Central o
de Comunidades Autónomas,
fundamentalmente la Comunidad
de Madrid, que adicionalmente ha
indicado que hará una valiosa
inversión en el desarrollo del nuevo
edificio), privadas, y de la Unión
Europea.
El CBMSO es un centro
universitario y por lo tanto cuida
la formación científica de sus
miembros más jóvenes de
acuerdo con las normas
académicas. Desde este punto de
vista, y en colaboración con el
Dpto. de Biología Molecular, ha
colaborado en algunos aspectos
docentes y se han leído tesis
doctorales. Adicionalmente, se ha
mantenido el Master de
Biotecnología. Además, se han
llevado a cabo 81 Seminarios, de
ellos 20 dentro del Ciclo Severo
Ochoa. Se han celebrado también
las Lecciones 8ª y 9ª en honor a
Severo Ochoa, y la 2ª y 3ª en
memoria de Eladio Viñuela,
nuestro pionero de la Biología
Molecular, en las que han
participado investigadores de talla
mundial. En recuerdo a Eladio
Viñuela, el Instituto de Biología
Molecular (CSIC) ha pasado a
denominarse Instituto de Biología
Molecular “Eladio Viñuela”. Otra
novedad relacionada con el
personal científico en formación
no en plantilla, ha sido la
instauración de dos premios para
una buena Tesis leída en el Dpto.
de Biología Molecular de nuestra
Facultad, y para un buen trabajo
publicado de investigación. Cuidar
la formación de nuestros
investigadores más jóvenes y
mejorar su modo de trabajar es
de vital importancia. En este
sentido se debe de buscar para
ellos unas mejores condiciones
contractuales que faciliten su labor.
No menos importante es la
formación de personal técnico
altamente capacitado. En este
sentido, el CBMSO ha mantenido
su colaboración con el INEM, a
través de la Fundación Severo
Ochoa, para favorecer la
formación de técnicos en la
Escuela-Taller.
Otra actividad novedosa ha
sido la iniciación de una Escuela
de Periodismo Científico,
subvencionada por la Fundación
Española para la Ciencia y la
Tecnología (FECYT), y que ha
buscado mejorar la capacidad de
comunicación de nuestros
científicos más jóvenes.
Uno de los pilares
fundamentales para el buen
funcionamiento del CBMSO es su
Departamento Técnico. Muchos
de los servicios de este
Departamento se han consolidado
durante este bienio y se ha
procedido a la instauración de uno
nuevo, el Servicio de Citometría
de Flujo.
De cara al futuro, la mayor
preocupación es la de tener a las
personas adecuadas y los medios
necesarios para llevar a cabo una
excelente labor investigadora; para
ello necesitaremos más
subvenciones para plazas y
contratos de trabajo, y para
infraestructuras.
Cerca del X aniversario de la
muerte de D. Severo Ochoa,
debemos de buscar que nuestro
Centro sea un lugar de excelencia
científica como él deseaba.
Tenemos un personal creativo y
con gran capacidad de trabajo.
Por ello debemos de encontrar
más recursos para poder realizar
el trabajo que deseamos. Estoy
convencido que con unas buenas
condiciones el CBMSO podrá
realizar un trabajo excelente y
competitivo que pueda dar frutos
a nuestra sociedad.
Jesús Avila
Director
5
Close to the celebration ofthe 50th anniversary of thediscovery of the double helix,we can look back on thebreakthroughs in the field ofMolecular Biology. In the lasttwo year period, after thedetermination of the DNAsequence of numerousorganisms — including that ofthe human — functionalgenomics research has beencarried out with many of theseorganisms. New discoveriessuch as RNA molecules thatcan prevent gene expressionmay become valuableinstruments for use in this areaof research. Advances havenot been restricted to the areaof gene expression but includeother research areas, such as:Developmental Biology,Virology, Immunology,Microbiology, Cell Biology,Cellular Signalling andNeurobiology; all thesedisciplines are followed at ourCentre.
There is rapid progressand change within the field ofMolecular Biology; in order toremain competitiveinternationally we will have towork hard. Additionally, newtechniques and systems aredeveloped daily, putting new
burdens on our resources. Ifwe do not keep up we will lagbehind our competitorsabroad.
The effort of ourresearchers and supportpersonnel has been and isexemplary. They are thefundamental reason why ourCentre has achieved a stronginternational recognition. Butmore resources are needed.Fortunately, we are backed byour sponsors — the CSIC(Spanish Board of ScientificResearch) and the UAM(Autonomous University ofMadrid) — and we enjoy theconstant and essential supportfrom the Ramón ArecesFoundation. Likewise, theprecious skills of ourresearchers have allowed usto obtain competitive grantsfrom public organisations —mainly from the Departmentof Science and Technologyand the Department of Healthand Consumer Affairs — aswell as from private institutions(acknowledged in the Lines ofWork section of theMemorandum Report).However, in spite of this, westill require more resources.
A fundamental problemfaced by the CBMSO is thelack of space. Therefore, theformers Directors, FedericoMayor and Miguel Angel dePedro, have planned theconstruction of a new building.Thanks to his work, today wehave a project for theconstruction of our new centralpremises at the CantoblancoCampus, located in theScientific Park of of Madrid .We have been given a plot ofland by the UAM, and currentlythere is a project for theconstruction of this newbuilding carried out by the firmEuroespacios. The aim of thisdevelopment is to reorganisethe CBMSO and gather in thisnew Centre groups in fourareas and to join them withsome groups from outside.This will make the running ofthe Centre much moreefficient.
In the 2001-2002 period,the production of the Centre’sdifferent teams has led to 338research papers, with anaverage impact value ofaround 6. Financed researchprojects amounted to 316,including all those projectssubsidised by publicinstitutions such as Central or
C O M E N T A R I O S D E L D I R E C T O R
W O R D S F R O M T H E D I R E C T O R
6
Autonomous Governments — mainly theCommunity of Madrid, which have expressedtheir interest in investing in the new buildingdevelopment — private institutions and theEuropean Union.
The CBMSO is a university centre and,therefore takes care of the scientific trainingof its youngest members in accordance withacademic ordinances. From this point ofview, and in collaboration with the Departmentof Molecular Biology, it has trained manygraduate students to PhD level. In addition,we have supported the Masters ofBiotechnology studies. Eighty-one seminarshave been given, of which twenty were partof the Severo Ochoa Cycle. The 8th and 9thlectures celebrated Severo Ochoa’s, and the 2nd and 3rd were a tribute to Eladio Viñuela,our pioneer in the field of MolecularBiology.These lectures were given byinternationally well-known researchers. Also,as a tribute to Eladio Viñuela, the CSIC(Institute of Molecular Biology) has beenrenamed Institute of Molecular Biology “EladioViñuela”. Other news in connection withscientific trainees has been the creation oftwo awards, one for the best Thesis read atour Faculty’s Department of MolecularBiology, and another for the best peer-reviewed piece of research. It is our policyto provide training and support to ouryoungest researchers, so we must achievethe best contractual terms for them and theirwork.
The training of highly qualified technicalpersonnel is equally important. The CBMSOis continuously collaborating with the INEM (Spanish Employment Office) through theSevero Ochoa Foundation in order topromote the training of technicians at theWorkshop School.
Another new activity was theestablishment of a Scientific JournalismSchool, subsidised by the FECYT (SpanishScience and Technology Foundation) whichseeks to improve the capacity forcommunication of our youngest scientists.
One of the foundations of the smoothoperation of the CBMSO is its TechnicalDepartment. Many of the services offeredby this Department have been consolidatedduring this two-year period. Furthermore, anew service, the Flux Cytometry Service hasalso been set up.
As for the future, our main concern is togather the appropriate people and thenecessary means to carry out excellentresearch work. To achieve this, we will needmore subsidies for labour positions andcontracts, as well as for infrastructures. Closeto the X anniversary of Severo Ochoa’spassing, we must build a Centre that is theplace of scientific excellence he envisaged.We have creative and hard workingpersonnel. Therefore, we must find moreresources so we can reach the goals set inour work. I am convinced that, under goodconditions, the CBMSO will be able to carryout outstanding and competitive work for thebenefit of our society.
Jesús Avila
Director
7
Personal Científico /Scientific Staff
CONSEJO SUPERIOR DEINVESTIGACIONES CIENTÍFICAS (CSIC)PROFESORES DE INVESTIGACIÓN /RESEARCH PROFESSORS
Alarcón Sánchez, BalbinoAlonso Bedate, CarlosAvila de Grado, JesúsDomingo Soláns, EstebanGarcía Ballesta, Juan PedroGarcía-Bellido y Gª de Diego, AntonioGutiérrez Armenta, CrisantoJimenez Martínez, AntonioLópez de Castro, José AntonioModolell Mainou, JuanMorata Pérez, GinésMoscat Guillén, JorgePalacián Gil, EnriqueRamírez Ortiz, GaloRipoll Quintas, Pedro M.Salas Falgueras, MargaritaVicente-Sandoval Rodríguez, Ignacio
INVESTIGADORES CIENTÍFICOS /RESEARCH SCIENTISTS
Alonso Lebrero, Miguel AngelBlanco Dávila, LuisCampuzano Corrales, SonsolesGuerrero Vega, IsabelHaro Castella, César Jesús, deMartínez Salas, EncarnaciónNieto López, AntonioPedro Montalbán, Miguel Angel, deRamírez Ortiz, AngelRedondo Moya, Juan MiguelSalas Falgueras, JoséSalas Falgueras, María LuisaSánchez-Herrero Arbide, ErnestoSobrino Castello, FranciscoToribio García, María Luisa
CIENTÍFICOS TITULARES /TENURED SCIENTISTS
Alcamí Pertejo, Antonio JavierAntón Canto, Luis CarlosAyala Serrano, Juan AlfonsoBusturia Jimeno, Ana MaríaCastrillo Díez, José LuisCelis Ibeas, José Felix deDíaz-Meco Conde, Mª TeresaEscarmís Homs, CristinaGómez Skarmeta, José LuisJiménez Díaz-Benjumea, FernandoLópez Carrascosa, Angel L.Lucas Lozano, José JavierMenéndez Arias, LuisPulido Vega, DiegoRevilla Novella, YolandaRodríguez Marcos, Miguel A.Ruiz Gómez, MarTalavera Díaz, AntonioVázquez Cobos, JesúsVillasante Atienza, AlfredoWandosell Jurado, Francisco
CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR"SEVERO OCHOA"· Dirección /
Management Board
Director / Director
Jesús Avila de Grado
Vicedirector / Vicedirector
José Berenguer Carlos
Director del Instituto de BiologíaMolecular "Eladio Viñuela" del CSIC /Director of the Instituto de BiologíaMolecular "Eladio Viñuela" CSIC
Crisanto Gutiérrez Armenta
Director del Instituto Universitario deBiología Molecular de la UAM /Director of the Instituto Universitariode Biología Molecular UAM
José Manuel Cuezva Marcos
Gerente / Administrative Director
Salvador Fortes Alba
Oficina de Relaciones Institucionales/ External Relations andCommunication Department
Rosario Martín Rodríguez
A BPersonal Personnel
8
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEMADRID (UAM)
CATEDRÁTICOS / PROFESSORS
Amils Pibernat, RicardoAragón Rueda, CarmenCarrasco Llamas, LuisCuezva Marcos, José ManuelFresno Escudero, ManuelGiménez Martín, CecilioHermoso Nuñez, José MiguelMayor Menéndez, FedericoMayor Zaragoza, FedericoMoreno Muñoz, FranciscoSatrústegui Gil-Delgado, JorginaSierra Pérez, José ManuelUgarte Pérez, MagdalenaValdivieso Amate, Fernando
PROFESORES TITULARES /ASSOCIATE PROFESSORS
Abad Lorenzo, José PascualAlmendral del Río, José MªArmas Portela, RosarioBerenguer Carlos, JoséBogónez Pelaez, ElenaBonay Miarons, PedroCarrascosa Baeza, Jose MªCatalán Tobar, EdgardoCorreas Hornero, IsabelDíaz Nido, JavierDíez-Guerra, Fco. JavierFernández Lobato, MaríaFernández Santarén, Juan AntonioGarcía Mateu, MauricioGarcía Ruiz, PredestinaciónHernández Sánchez, FranciscoIzquierdo Rojo, MartaJiménez Martínez, Juan SalvadorLópez Corcuera, BeatrizLópez Guerrero, José AntonioManso Martinez, RafaelMarín Palma, IrmaMartínez Serrano, AlbertoMontejo de Garcini Guedas, EstebanRemacha Moreno, MiguelRequena Rolania, José MªRuiz Gómez, AnaSantamaría Pérez, FranciscoSanz Martín, José LuisZafra Gómez, Francisco
PERSONAL CIENTÍFICOCONTRATADO /
Airaksinen, AnteroAzpiazu Torres, NataliaBarrio Olano, María RosaBravo García, AliciaBullido Gómez-Heras, Mª JesúsCalleja Requena, ManuelCamacho Pedrero, AnaCampillos González, MónicaCano López, Eva MªCastellano Moreno, Mª del MarDel Pozo Benito, Juan CarlosDesvoyes, Irene BenedicteFernández Malavé, EdgarGarcía García, Miguel AngelGarcía Muñoz, Mª JoséGironés Pujol, NuriaGorfinkiel Haim, NicoleHernández López de Munain, CristinaHernández Pérez, Félix
Iñiguez Peña, Miguel AngelIzquierdo Juárez, José MaríaLafuente Monasterio, Mª JoséLalioti, VassilikiLozano Salvatella, Juan JoséMartín Belmonte, FernandoMartín Fernández, PilarMartínez Martínez, SaraMeijer, WilfriedMendieta Gómez, JesúsMerinero Cortés, BegoñaMoreno Flores, Mª TeresaMurga Montesinos, CristinaNavarrete López de Soria, Rosa MaríaNúñez garrote, José IgnacioNusspaumer da Costa, GretelPardo Merino, BeatrizPenela Márquez, PetronilaPérez González, BelénPérez Martín, José ManuelPérez Martínez, Mª. del MarPérez-Cerdá, CeliaRibas Núñez, CatalinaRichartd Rodríguez, Eva MaríaRodríguez Márquez, AntonioRodríguez Martínez, Javier MaríaRojo Gozalo, SusanaRuiz Desviat, LourdesSan José Martínez, EstherSantos Tejedor, CruzSanz Alonso LauraSchamel, WolfgangSevilla Hidalgo, NoemíSoto Alvarez, ManuelSuzanne, Magali
POSTDOCTORALES /POSTDOCTORAL FELLOWS
Agudo Barriuso, MartaAldudo Soto, JesúsAlejo Herberg, AliAlfranca González , ArantzazuAlonso Martínez, MaríaAlvarez Nieto, GemaAndrés Hernández, GermánBaranowski, EricBarrios Bardavio, BeatrizBeneyto Santonja, MónicaBonniotti, BeatriceBoskovic, YasminkaBurgos Muñoz, JavierCallejo de Prado, AinhoaCanellada, AndreaCañas Montalvo, BenitoCarrillo Rosales, GracielaCavodeassi, FlorenciaCebria Gómez, Antoniodel Arco Martínez, AraceliDíaz Gallardo, Martha YadiraDíaz Hernández, MiguelDufour, EmmanuelDurán Cascales, ConsueloEisembrand, RalfExcavour, CasandraFrünt, CorinneFrutos de Diego, SoniaGaragorri Ganchegui, NereaGarcía Escudero, RamónGarcía García, Miguel AngelGarcía Muñoz, FernandoGarcía Palomero, EstherGarcía Peydró, MarinaGarrido Jurado, Juan JoséGascón Escobar, IreneGil Pagés, Diana
Giménez Mateo, OscarGiménez Sanz, CarmenGiovinazzo, GiovannaGiovizazo, GiovannaGlavic Mure, ALvaroGómez -Casero Esteban, ElenaGómez Gómez, FelipeGonzález Barrera, SergioGonzález Huici, VictorGonzález López, ClaudiaGuerra García, SusanaGutierrez Rivas, MónicaHaro Castuera, AmparoHerranz Muñoz, HéctorLamas López, José RamónLim, FilipListe Noya, IsabelLlorca Blanco, Oscar AntonioLomas López, RodrigoLombardia Uria, ManuelLópez Bueno, AlbertoLópez de Quinto, SoniaLópez Matas , Mª. AngelesLorite Arana, Mª. JoséMadridPérez, OlgaMarco Recuenco, Mª Carmen deMaroto López, BeatrizMartín Aparicio, Mª EsterMartín Gordillo, FernandoMartín Ruíz-Jarabo, CarmenMás López, AntonioMolina Balsa, IsabelMorato López, EsperanzaParadela Elizalde, AlbertoPerales Viejo, CeliaPérez Martínez, Mª del MarQuijada Arteaga, LuisRamírez Parra, ElenaRecuero Vicente, MaríaResino de Castro, JaimeRodríguez Martínez, Javier MªRuiz León, YolandaRuiz Olivar, EmilioSabariegos Jareño, RosarioSánchez Martínez, CristinaSánchez Ramón, SilviaSaugar Gómez, IreneSayas Casanova, Carmen LauraSolorzano Blanco, KarlaSpeicher, StephanTruniger, VerónicaVázquez García, Miriam NoemíVilla Díaz, AnaYunta González, Mónica
BECARIOS PREDOCTORALES /GRADUATE STUDENTS
Acosta, FedericoAdan Padrón, AlexanderAlcaide Alonso, PilarAlcorlo Pagés, MartínAldaz Casanova, SilviaAlonso Martínez, MaríaAlonso Torres, PabloAltmutter, ChristinaAlvarez Gómez, EnriqueAranda Gómez, Juan FranciscoArgoñórez, Martín EduardoArias Esteban, ArmandoArroyo Becerra, AnaliliaAvila Flores, JuanaAvila Flores, SilviaBaena López, Luis AlbertoBarrado Guerrero, PatriciaBassy Alvarez, Olga
Batista Barcón, AliciaBejarano León, FernandoBlanco Fuentes, RaquelBlas Galindo, EmilioBourahi, RedouaneBriceño, VerónicaBueno López, CarlosCaballero Mateo, NuriaCacheiro Llaguno, CristinaCalandria Pérez, CarlosCalles Arenales, BelénCantó, CarmenCarmona, PedroCaro Azoy, EddyCarrasco Rando, MartaCarreira Moreno, AuraCarrillo Terán , WilmanCarrión Herrero, Fco. JavierCases González, Clara ElisaCastán García, PabloCastro Reguera, MargaritaCava Valenciano, Luis FelipeCavero Martínez, SantiagoClavero Villarrubia, SoniaCobas Pupo, GuillermoContreras Balsa, LauraCosta, KatyssullaCrespo Alonso, MiguelCruz Rubio, CristinaCubelos Alvarez, BeatrizChattopadhyay, SharmilaChichón García, Francisco JavierDel Alamo Camuñas, MartaDel Molnar-Darkos Muro, Cristina AnaDelgado Cañaveras, Mª del PilarDíaz Muñoz, LauraDíaz Portuondo, EmilianoDiaz Triviño, SaraDominguez Hernández, FranciscoDuque Muñoz, JavierDurán Molina, Mª.AngelesEcay Crespo, Mª. JesúsElías García, MónicaEngel, TobiasEpifano García, CarolinaEscudero Cuadrado, Luis MaríaFernández Miragal, OlgaFerrer López, IsaacFornes Chaves, AmparoForonda Alvaro, DavidGandi, GiudittaGarcía Arriaza, Juan FranciscoGarcía Briones, MercedesGarcía de Yébenes Mena, VirginiaGarcía Díaz, MiguelGarcía Escudero, VegaGarcía Lievana, JobGarcía Marcos, AlbertoGiménez Sáinz, CarmenGómez Martín, SilviaGómez Molina, Carmen PatriciaGómez Ramos, AlbertoGómez Sintes, RaquelGómez Vicente , VioletaGonzález Alonso, BeatrizGonzález García, InmaculadaGonzález Granja, AitorGonzález Ruiz, DomingoGonzález Santamaría, PatriciaGonzález Toril, ElenaGrajal Cuervo, HenarGrau Simón, RaquelGrueso Hierro, Mª. EstherGurzov Amarelo, EstebanGutiérrez Berzal, JavierHernández Tiedra, Sonia
9
Herrera Quintana, MónicaHidalgo Estévez, Alicia MaríaHurtado Marcos, CarolinaIborra Martín, SalvadorImbaud, Juan IgnacioIsidoro Pacheco, AntonioIzcue Castellvi, Ana MariaJiménez Mateos, Eva Mª.Juanas Melero, DavidJuarez Santos, RaquelKöchling, ThorstenLarreta López, RuthLatorre Muñoz, EduardoLeo Macías, AlejandraLetizia, AnnalisaLongas Torne, ElisaLopez Ferrer, DanielMadam Renes, VanesaMaganto García, ElenaManjón Castro, CristinaMarcilla Goldaracena, MiguelMarín Alberdi, DoloresMartín Aparicio, EstherMarín Palma, EnriqueMartín Castro, FranciscoMartín Cofreces, NoaMartínez Díez, MartaMartínez Fernández-Yáñez, LauraMartínez García, AnaMartínez García, AngelesMatamoros Grande, TaniaMateo Fernández, RobertoMena, MarcelaMinguet García, SusanaMolina Arranz, SusanaMolina Polo, Nicolás SegundoMonjas Serrano, AliciaMontserrat Pérez, VerónicaMorales García, Mª. DoloresMoreno Albiger, RenataMoustafa, MalkiMuñoz Espín, DanielMuñoz Risueño, RuthNavarro Galve, BeatrizNavarro Lobato, Mª. de las NievesNavas Fernández, Luis Fernando deNavascués Melero, Joaquín deOrtega López, PaulaOrtega Pérez, InmaculadaPacheco García, AlmudenaPacheco Santos, MaríaPalacios Airado, LucíaPariente Peñamaría , NoniaParody de la Fuente, NuriaPastor Pareja, José CarlosPastrana Izquierdo, ErikaPeregrín Pedrique, SandraPérez Fernández, CoraliaPérez Fernández, JorgePérez Ferreiro, Carmen MªPérez García, LauraPérez Garijo, AinhoaPérez Lorenzo, Mª JesúsPey Rodríguez, Angel LuisPicher Serantes, Angel JoaquínPomar Ballestero, NataliaPoyatos Belio, IrenePozueta Larios, JulioPrado Delgado, AmayaPulgar Montoro, ManuelQuesada Navidad, Antonio JesúsQui, DeyiRamírez Moreno, CarlosRamos Álvarez-Buylla, ManuelRamos Martín, Mª del CarmenRey Martín, Marta
Riolobos Santamaría, LauraRivera Gorrín, HenryRivero Guedez, DamarízRodenstein, Lara MaríaRodríguez Benito, María JoséRodríguez Carrasco, YolandaRodríguez García, IreneRodríguez González, IreneRodríguez González, NuriaRodríguez Torres, AngelinaRomero Prado, MarinaRubio Muñoz, DanielRuiz Pérez, JoséSalcedo de Haro, MartaSalero Coca, EnriqueSan Antonio Felipe, BelénSánchez Díaz, RaquelSánchez Martínez, BlancaSánchez Santos, Miguel AngelSánchez-Valdepeñas , Carmen MªSanta María Pérez, IsmaelSantamaría Núñez, GemaSarnago Cebada, SusanaSerna Rico, AlejandroSerrano, Miguel AngelSerrano Carballal, ElenaSerrano de las Heras, GemaSerrano Saiz, EstherSesma Aguirre, LauraSierra Aragón, SaletaSierra Istúniz, JavierSimón Sanz, DianaTenorio Vela, RaquelTerrados Aguado, Gloria MaríaValle Benitez, NoeliaVázquez Alvarez, BlancaVega Mendoza, Daniel EdgarVelasco Ortiz, LaraVergara Jaúregui, SilviaVicente Cenzano, Mª. CarmenVila del Sol, VirginiaVilla Cuesta, María EugeniaVillajos Barja, JesúsZafra Amorós, OlgaZaldivar Notario, Irene
Personal de apoyo enlíneas de Investigación/ TechnicalAssistance
Alcalde García, JoséAlonso Barba, CarmenÁlvarez Pérez, IñaquiArenas Martínez, SantiagoBarat Cascante, AnaBarrero Hervás, LorenaBlanca Benito, VanesaBustos Sánchez, Mª JoséCabornero Catalá, Ana IsabelCaminero Jiménez, Eva Mª.Campos Trujillo, RamónCano Cabezas, EmilioCantarero Mateo, AngélicaCasado García, Mª. del MarCava Valenciano, FelipeCazorla Plaza, MaríaCerrato Gómez, AntoniaChamorro Bello, MargaritaCisneros González, Nerea
Cuadros Catalán, RaquelDávila Cerrato, Mª Mercedesde Chorro y de Villa-Ceballos, Mª de losAngelesDe la Calle Mustianes, ElisaEstella Sagrado, CarlosFernández Algar, MaríaFernández Moyano, Mª CarmenFuertes Villadangos, Miguel A.Fuertes Yebra, EstherGarcía García, CarlosGarcía García, EstherGarcía Mira, José LuisGarriga Fuentes, CésarGaruti Rodríguez, Helena Mª.Gómez Buendía, TeresaGómez Mariano, GemaGómez Medina, SergioGonzález Herrera, Rosa MaríaGonzález Páramo, CristinaGranda Vega, CarmenGutierrez Aranda, JuliaGutierrez Luque, RuthHermoso Crispín, CarmenHernández Baeza, María del RosarioHernández Carrasquilla, MiguelHernando Bellido, AlmudenaIbáñez Pérez, CarmenJiménez Gallego, AnaLanga Gabriel, ElenaLázaro Bolos, José MªLazcano Duque, Juan JoséLlorens Berzosa, SergioLópez Varea, AnaMartín Bermejo, Mª. JesúsMartín Fernández, Mª PalomaMartín Redondo, Mª AsunciónMartínez Villarraso, AngelesMora-Gil Cobo, Mª VictoriaMuñoz Fernández, ConsueloMuñoz Sánchez, Angel LuisNavarrete López, Rosa MaríaNogal Paris, María LuisaNúñez Balbuena, EnriqueOrtega Pérez, InmaculadaPablos Pérez, Beatriz deParrón Muñoz, ÁngelaPeñate Santajuana, SilviaPunzón Gálvez, CarmenReguerra Vidaechea, Juan JavierReina Alba, IsabelRodríguez Enríquez, IsabelSaiz Delgado, Eva MaríaSánchez de la Chica, AscensiónSánchez Marujo, VanessaSánchez Moreno, AntonioSanz Fernández, Miguel AngelSanz Rebollo, PalomaSastre Merlín, IsabelSesé Cobos, BárbaraSobrado de Vicente Tutor, AntonioSoto-Largo Dimitrigeff, SantiagoTorre Tante, Mª. del Mar, de laTorroja Fungairiño, CarlosVillar García, LaurentinoZamarreño Fernández, Noelia
Departamento Técnico/ Technical Department
GERENTE / ADMINISTRATIVEDIRECTOR:
Fortes Alba, Salvador
ADMINISTRACIÓN /ADMINISTRATIONJefe/Head:García Martín-Delgado, Jaime
Belda San Mateo, EloyBerciano Ledesma, JuanDel Castillo Tamayo, MilagrosEscribano Sánchez, GloriaGarcía Arias, RamónGutiérrez García, NatividadPallarés Vargas, ReginaPlaza Diago, LoretoRueda Cubero, EstebanVillar Pérez, Belén
ANIMALARIO / ANIMAL FACILITYJefe/Head:Palacín Urquijo, Javier
Bordallo Martín-Fontecha, Miguel A.Cobeña Chivato, Miguel A.Díaz Riffo, Felipe AndrésGarcía Martínez, VerónicaGaruti Rodríguez, Helena MªGonzález Mella, MartaMéndez Río, IsabelMuñoz Fuentes, Jaime AlbertoPinel Ballesteros, GemaQuintana Fernández, Juan AntonioRevuelta Mayo, PatriciaRodríguez Fernández, ElenaRosco Pulido, PilarSalgado Muñoz, HugoVera Meneses, Mª. Eugenia
BIBLIOTECA / LIBRARYJefe/Head:Gutiérrez García, Rosario
Sanz Frías, Angeles
COMPRAS Y ALMACÉN / PURCHASEDEPARTMENTJefe/Head:Blanco Martín, José Luis
Celestén Martín, Jose MiguelCorral Díaz, MargaritaFernández Martín, Mª JoseHernández Sánchez, LorenzoMadrid del Alamo, RemediosPedraza Caro, TeodoroPedraza Fernández, Teodoro
CULTIVOS CELULARES / CELLCULTURE
Alonso Hernández, PilarBustos Sánchez, JuanaGutiérrez García, AlfonsoRebelles Vicente, Juan Antonio
C
D
10
DISEÑO / DESIGN
Aganzo Mateo, PedroBelio López, José IgnacioDíaz Dorado, CarmenGalán González, José Mª
FERMENTACIÓN / FERMENTATION
Ureña Rodríguez, Dionisio
FOTOGRAFÍA / PHOTOGRAPHYJefe/Head:Bautista Torres, Mariano
Pérez Gracia, José Antonio
INSTRUMENTACIÓN /INSTRUMENTS AND EQUIPMENTJefe/Head:Seguido de la Fuente, Lorenzo
Calvo Romero, ManuelGonzález Galán, JesúsGonzález García, JulioGutiérrez de la Cruz, FranciscoMejías Pozuelo, José LuisMuñoz Maqueda, FernandoPalomo Fernández, MarcosPozuelo Torrijos, JesúsZazo Chapinal, Antonio
LAVADO Y ESTERILIZACIÓN /WASHING AND STERILIZATION
Blanco Ferreras, AngelesBlanco Ferreras, ValentinaCarrascal Blanco, IsabelCobeña Chivato, ConcepciónEscribano Molina, JosefinaGil Pinto, AfricaMartín Bermejo, María NievesSánchez Ramos, Montserrat
MANTENIMIENTO / MAINTENANCEJefe/Head:Muñoz Diez, José Antonio
Cordón Polanco, Pedro PabloFernández Arias, AlfonsoGarcía Alarcón, Juan LuisGonzález Díaz, MiguelMartín Izquierdo, TomásMartos Valladares, CésarMontero Minguez, EmilioRomero Celada, Juan MiguelZúñiga Parra, Ceferino
MICROSCOPIA ELECTRÓNICA /ELECTRON MICROSCOPYJefe/Head:Rejas Marco, Mª Teresa
Guerra Rodríguez, MilagrosOcaña Romero, Francisca
MICROSCOPIA ÓPTICA YCONFOCAL / OPTICAL ANDCONFOCAL MICROSCOPYJefe/Head:Díez Guerra, Javier
Muñoz Alcalá, Mª AngelesSánchez Martín, CarlosVillalba Villacorta, Teresa
INFORMÁTICA / COMPUTINGJefe/Head:Pemau Alonso, Pedro
Bodas Gómez, OscarDíaz Rodilla, DiegoDíaz Rodríguez, FidelPérez García, María PeñaSantos Martín, Tomas
QUÍMICA DE PROTEÍNAS YPROTEOMICA / PROTEINCHEMISTRYJefe/Head:Vázquez Cobos, Jesús
Barahona Nieto, FernandoGonzález-Nicolás Garrido, JosefaJorge García, AlbertoMarina Ramírez, Ana IsabelOgueta Villarreal, SamuelRogado Manzanares, Rosana
RECEPCIÓN / RECEPTIONCabrerizo Las Heras, LuisGil Marinas, Mª JesúsRamiro Sánchez, Juan
SECRETARIAS / SECRETARIALDirección / Management BoardMorales Pájaro, AdelaidaGerencia / Administrative DirectorCondes Cano, AntoniaLlaguno Pérez, ReyesGeneral / PoolHorrillo Muñoz, LucíaNavarro Martínez, Carmen
SECUENCIACIÓN DE DNA / DNASEQUENCINGJefe/Head:Modolell Mainou, Juan / EscarmísHoms, Cristina
Ayuso Moreno, Mª. LuisaCarrasco Ramiro, FernandoMadueño Amor, Encarna
SEGURIDAD BIOLÓGICA /BIOLOGICAL SAFETYJefe/Head:Sánchez Sánchez, Angeles
Arribas Arcones, MarisolCaparrós de la Jara, GemaDel Valle Sanz, AuroraMartínez García, Victor M.Ortega Molina, Isabel
VIGILANCIA / SECURITYBarajas Marín, ManuelDelgado Rodríguez, Juan AntonioGarcía García, FranciscoHidalgo Checa, FranciscoMirasol Burgos, Francisco BorjaParra García, JoaquínTirado Morón, Antonio
Programa CSIC-INEM
2001Antón González, RocioAyuela Butragueño, BelénCillan Capilla, José LuisDávila de León , DavidHevia Hernández, ElenaLeón Fernández, GabrielaLópez de la Fuente, Clemente RamónMartos Pérez, CarmenMuñoz Villalba, PilarRuiz Bouley, Rosa Mª.Ruiz Ibáñez, Jorge AntonioSierra Filardi, ElenaUrendez Morillas, Francisco
2002Cañete Parras, Antonia MªContreras López, NievesGarrido, Gema EmiliaGuindal Calleja, SusanaHernández Sierra, RosanaMéndez Río, IsabelPérez Poza, LudivinaRodera Pérez, NellyRodríguez Navas, Mª del CarmenRuiz Orejón, Mª. BelénTuero Gil-Delgado, MyriamValeri Lozano, PaolaValladares Bartolomé, Mª.CruzVallejo Zabulegui, Jorge
Tercera Escuela Taller“Severo Ochoa” deTécnicos deLaboratorio /Third Workshop“Severo Ochoa” forLaboratoryTechnicians
Profesores/Teachers
Gutiérrez Erlandsson, SylviaRamos Ruiz, RicardoValle Sanz, Mercedes del
Secretaria/Secretary
Herrador Morales, Mercedes
Alumnos/Students
Alcaín Sánchez, JuanAlcaraz Iglesias, GemaMartínez Villacorta, Angel ManuelCastro Nieto, JorgeCuesta Mejías, José ManuelGosalbez López, AlteaGutiérrez Aldea, ModestaMartín-Francés Trigos, EnriquePalmeiro Cuesta, GemaPeralta Cañadas NuriaPérez Carrero, OscarPérez Pulido, MiguelPostigo Haro, FernandoPrieto López, RubénRamajo Alonso, JorgeRuíz García, Desiré
E F
11
Clones de células doble mutantes para patched 14 y dispatched en el
disco imaginal de ala teñidos con GFP y con anticuerpos contra lasproteinas Patched (azul) y beta-Gal (rojo). Las células mutantes parapatched se marcan por la falta de color rojo. Las células mutantes paradispatched por la falta de color verde. Las células doble mutantes tienenuna falta completa de color. Las distintas intensidades de verde y rojocorresponden a células silvestres y heterocigóticas para cada una de lasmutaciones.
12
ABiología del DesarrolloDevelopmental Biology
A.2 Mecanismos de señalización en el desarrolloA.2 Signalling mechanisms in development
Isabel Guerrero
A.1 Análisis genético de mecanismosmorfogenéticos en Drosophila
A.1 Genetic analysis of morphogeneticmechanisms in Drosophila
AntonioGarcía-Bellido
A.3 Comunicación intercelular en el desarrollodel Drosophila
A.3 Cell-cell signalling in Drosophiladevelopment
Fernando JiménezDíaz-Benjumea
A.4 Biología molecular del desarrolloA.4 Molecular biology of development
Juan Modolell
A.5. Control genético de la morfogénesisA.5 Genetic control of morphogenesis
Ginés Morata
Resumen de Investigación
Control del tamaño del ala. Alelos letales
en cinco loci producen autónomamente, en
mosaicos genéticos, células más pequeñas
y menos células por territorio (l(3)Me10),
células más grandes y menos células (gig
y cdc2) asi como células más pequeñas y
más células (EP(3)622 y ft). Otros fenotipos
asociados revelan fallos en comunicación
celular y de ahí en la generación local de
valores posicionales.
Control de la forma del ala. Un análisis
de clones gemelos permite definir donde
estaban las células madre del clon. La
proliferación de las células del ala es
intercalar y las células postmitóticas se
alocan preferentemente en el eje próximo-
distal o anterior-posterior dependiendo de
la región del disco.
Eversión del disco. Lo que va a ser el
borde de contacto entre discos
contralaterales e ipsolaterales está
predefinido por células que expresan puc
(de la ruta de la Jun K) en los discos
imaginales. Esta ruta está relacionada con
la relajación del citoesqueleto y la
separación de células. La eversión tiene
lugar por la apertura de agujeros alrededor
del tallo que luego coaslecen y desplazan
a las células epidérmicas larvarias.
El gen vestigial. Clones de sobreexpresión
de vg causan transformaciones hacia tejido
ala y expresión génica típica de ala si
ocurren en territorios que ya expresan Wg.
Los efectos morfogenéticos complejos
reflejan que vg está implicado, en
combinación con otros genes, en el
crecimiento distalizante del primordio de la
región de ala propia.
Regulación del gen spalt en el ala. Hemos
identificado la región reguladora de spalt y
caracterizado los sitios de unión de
diferentes factores de transcripción.
Mutagénesis de exceso de función.
Hemos mapeado 500 inserciones PUAS
cuya sobreexpresión afecta la diferenciación
de las venas.
Proteoma. Se están caracterizando los
péptidos de geles bidimensionales del disco
imaginal de ala como referencia para
detectar cambios mutacionales.
Jefe de Línea / Group Leader:
Antonio García-Bellido
e-mail: [email protected]
Personal Científico /
Scientific Staff:
Juan Fenández Santarén
(responsable de laboratorio)
José Félix de Celis
Enrique Martín-Blanco
Rosa Barrio Olano
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Cassandra Extavour
Alvaro Glavic
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Jaime Resino de Castro
Luis Alberto Baena López
José Carlos Pastor Pareja
Cristina Molnar-Darkos
Mª Dolores Morales García
David Juanas Melero
Cristina Cruz Rubio
Jana Alonso Lorenzo
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
Almudena Hernando Bellido
Mª Paloma Martín Fernández
Ana López Varea
Rosario Hernández Baeza
Carmen Alonso Barba
Mar Casado García
Clones gemelos (rojo y amarillo) en las regiones dorsal (A) y ventral (B)
de ala ilustrando que su forma y tamaño depende de cada territorio del
disco.
Análisis genético de mecanismosmorfogenéticos en Drosophila
A.1Biología del� DesarrolloDevelopmental Biology
14
Extavour, C., García-Bellido, A. (2001) Germ cell selectionin genetic mosaics in Drosophila melanogaster. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 98, 11341-11346
Mollerau B., Dominguez, M., Webel, R., Colley, N.J.,Keung, B., de Celis, J.F., Desplan, C. (2001) Two-stepprocess of photoreceptor formation in the Drosophilaeye. Nature 412, 911-913
Rusten, T. E., Cantera, R., Urban, J., Techanu, G.,Kafatos, F. C., Barrio, R. (2001) Spalt restricts EGFRmediated induction of chordotonal precursors in theembryonic PNS of Drosophila. Development 128, 711-722
López, P.P., Santarén, J.F., Ruiz, M.F., Esponda, P.,Sanchez, L. (2001) The Drosophila melanogaster X-linked mfs(1)6E locus is required for production of normalseminal fulid by the male accessory glands. Exp. CellRes. 267, 1-12
Rodríguez, J.M., Salas, M.L., Santarén, J.F. (2001)African swine fever virus-induced polypeptides in porcinemacrophages and in Vero cells: A high resolution twodimensional analysis. Proteomics 1, 1447-1456
Resino, J., Salama-Cohen, P., García-Bellido, A. (2002)Determining the role of patterned cell proliferation in theshape and size of the Drosophila wing. PNAS 99, 7502-7507
Rusten, T.E., Cantera, R., Kafatos, F.C., Barrio, R. (2002)The role of TGF- signaling in the formation of the dorsalnervous system is conserved between Drosophila andchordates. Development 129, 3575-3584
Cantera, R. Lüer, K., Rusten, T.E., Barrio, S., Kafatos,F.C., Technau, G.M. (2002) spalt mutations cause asevere but reversible neurodegenerative phenotype inthe embryonic central nervous system of Drosophilamelanogaster. Development 129, 5577-5586
Premios / Awards
- Doctor Honoris Causa por la Universidad MiguelHernández de Alicante, 2001.
- Miembro Electo del Neuroscience Institute. USA, 2001.
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Jaime Resino de Castro. 2002. “Tamaño y Proliferaciónen el Disco Imaginal de Drosophila melanogaster”.Universidad Autónoma de Madrid.
Genetic analysis of morphogeneticmechanisms in Drosophila
Publicaciones/Publications:
Twins clones (red-yellow pairs) in the dorsal (A) and ventral (B) wing imaginal disc. The size
and shape of the clones characteristically varies with the different regions.
Research summary
Size control. Lethal alleles in 5 loci
autonomously cause, in genetic mosaics
in the wing, smaller cells and clones
(l(3)Me10), larger cells but small clones
(gig y cdc2) and smaller cells but larger
territories (EP(3)622 y ft). Other
associated phenotypes reveal failures in
cell communication what suggests that
growth is determined by the local
generation of positional values.
Shape control. Twin-clon analysis
indicates the position of mother cells and
subsequent daughter cell allocation. Cell
proliferation in the wing is intercalary and
daughter cells allocate preferentially either
the proximo-distal or antero-posterior axis
depending on the region of the wing.
Disc eversion. The prospective border
of contact between discs is predefined
by the expression of puc (Jun K pathway)
a pathway related to the relaxation of the
cytoskeleton and loosening of cells. The
actual eversion takes place by
coalescence of holes in the stalk of the
disc and subsequent elimination of larval
epidermal cells.
The gene vestigial. Clones of cells over
expressing vg lead to ectopic
transformations to wing blade in territories
that already express wg. The
morphogenetic effects are complex,
indicating that vg acts in combination with
other genes in the distalization of the
wing.
Regulation of spalt expression in the
wing disc. We have identified the DNA-
regulatory region driving spalt expression
in the wing disc, and characterised the
binding sites of several transcription
factors.
Gain of function screening. We have
mapped 500 insertions of a PUAS
element affecting vein differentiation and
wing growth.
Proteome. We continue the catalogation
and characterization of wing proteins in
two-dimensional gels for comparisons
between wildtype and mutants.
15
Resumen de Investigación
El desarrollo de las estructuras adultas de
Drosophila melanogaster se ha utilizado
como sistema modelo para el estudio de la
inducción de patrones morfogenéticos. En
cada estructura adulta de la mosca, la
proteína Hedgehog (Hh) induce la activación
de nuevas señales morfogenéticas desde
el centro organizador anterior / posterior,
tales como los factores de secreción
Wingless (WG) y Decapentablegic (DPP),
pertenecientes a las familias proteicas Wnt
and TGF- respectivamente. Esta cascada
de inducción de señales es clave para el
desarrollo de todos los apéndices de la
mosca. Uno de los problemas mas
fascinantes actualmente en biología es
entender como este tipo de señales
morfogenéticas se secretan y difunden, y
como las células las reciben e interpretan.
En los últimos años nos hemos centrado
en el estudio de los mecanismos de
señalización de Hh debido a su importancia
en enfermedades humanas
(holoprosencefalia, polidactilia, carcinomas
de células básales, meduloblastomas, etc.).
Estudiando el receptor de Hh, Patched
(Ptc), hemos identificado dos dominios
funcionales en su proteína ya que ciertas
mutaciones afectan solo a la difusión de
Hh y otras solo a la interacción con
segundos mensajeros.
Hemos demostrado que la internalización
de Hh por Ptc no se requiere para la
señalización de Hh siendo necesaria esta
endocitosis de Hh solo para controlar su
degradación. Por otra parte, existen varias
líneas de evidencia que indican una relación
del colesterol y los lípidos con la vía de Hh.
Se ha demostrado que el colesterol se
requiere para la respuesta a la vía de Hh.
De acuerdo con este requerimiento, en Ptc
se ha identificado unas secuencias (dominio
sensible a esterol (SSD)), que presentan
homología con las proteínas que controlan
la homeostasis de colesterol. Nosotros
hemos encontrado que mutaciones en el
dominio SSD de Ptc abren constitutivamente
la vía de Hh y sin embargo, no impiden el
reconocimiento e internalización de Hh por
la proteína mutante de Ptc.
Paralelamente, estamos estudiando la
morfogénesis de la genitalia en Drosophila.
El disco genital, del cual deriva la terminalia,
es desde el punto de vista morfogenético
muy interesante ya que para su desarrollo
es necesaria la interacción entre los genes
de formación de patrón y los genes de
determinación sexual. Hasta ahora, hemos
establecido los parámetros que intervienen
en la organización del disco genital y como
las respuestas a las vías de señalización
de Hh, Wg y Dpp están controladas
diferencialmente en el macho y en la
hembra por los genes de determinación
sexual.
Clones de células doble mutantes para patched 14 y dispatched en el disco imaginal de ala teñidoscon GFP y con anticuerpos contra las proteinas Patched (azul) y beta-Gal (rojo). Las célulasmutantes para patched se marcan por la falta de color rojo. Las células mutantes para dispatchedpor la falta de color verde. Las células doble mutantes tienen una falta completa de color. Lasdistintas intensidades de verde y rojo corresponden a células silvestres y heterocigóticas paracada una de las mutaciones.
Mecanismos de señalización en el desarrolloA.2Biología del� DesarrolloDevelopmental Biology
Jefe de Línea / Group Leader:Isabel Guerreroe-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:Nicole GorfinkielIsabel Rodríguez
Postdoctorales / PostdoctoralFellows:Ainhoa CallejoGraciela CarrilloVerónica Martín
Becarios Predoctorales /Graduate Students:Carlos TorrojaJavier SierraElvira Benitez
Estudiantes /Undergraduate Students:Ruth MuñozMario TorradoUsue Martínez
Técnico de Investigación / TechnicalAssistance:Carmen Ibañez
16
Signalling mechanisms in development
Publicaciones/Publications:
Research summary
The development of the adult structures
of Drosophila melanogaster has been
used as a model system to study the
induction of the morphogenetic processes.
In each fly structure, extra-cellular
signaling molecules from specialized
groups of cells, termed organizers, supply
the information for these morphogenetic
processes. Thus, Hedgehog protein (Hh)
induces from the anterior/ posterior
organizer the activation of new
morphogenetic signals, such as Wingless
(Wg) and Decapentaplegic (Dpp) that
belong to the super-families Wnt and
TGF- respectively. This signaling
cascade is fundamental for the
development of all the fly appendages.
One of the most fascinating problems in
biology is to understand how these
morphogenetic signals are secreted and
diffuse and how the receiving cells
interpret them.
Due to the importance of Hh signaling
pathway in human diseases
(holoprosencephaly, polidactily, basal-
cell-carcinomas, medullablastomas, etc)
we are studying the mechanism of Hh
signaling. For the last few years, we have
analyzed the function of Patched (Ptc),
the Hh receptor molecular and genetically.
We have identified two Ptc functional
domains because some ptc mutations
affect only the Hh diffusion and others
only the interaction of Ptc with second
messengers. We have demonstrated that
the internalization of Hh by Ptc is not
required for Hh signaling. However, this
Hh internalization is required for Hh
degradation to control the Hh
morphogenetic gradient. Besides, there
are several evidences that indicate a
relationship of cholesterol and lipids with
the Hh pathway. It has been demonstrated
that cholesterol is required for Hh
response in the receiving cells. In this
context, a sterol sensing domain (SSD)
has been identified in Ptc. Other proteins
with this SSD domain are involved in the
control of cholesterol homeostasis. We
have found that mutations in the SSD
domain constitutively open the Hh
pathway but do not avoid the
internalization of Hh by Ptc.
Simultaneously, we are studying the
development of the genitalia in Drosophila.
The development of the genital disc, which
gives rise to the genitalia and analia of
the adult fly, requires the activity of both
patterning and sex determination genes.
We have first established the segmental
organization of the genital disc as well as
the expression and requirement of several
patterning genes for the development of
the genitalia. Next, we have found that
the sex determination genes control the
development of the genital discs
modulating the responses to Hh, Wg, and
Dpp signals. This modulation of the
signaling pathways by the sex genes is
the key mechanism in the development
of either male or female structures.
Mullor, J.L., Guerrero, I. (2000) A gain-of-function mutant
of patched dissects different responses to the Hedgehog
gradient. Dev. Biol. 228, 211-224
Sánchez, L., Gorfinkiel, N., Guerrero, I. (2001) Sex
determination genes control the development of the
Drosophila genital disc modulating the response to
Hedgehog, Wingless and Decapentaplegic signals.
Development 128, 1033-1043
Martín, V., Carrillo, G., Torroja, C., Guerrero, I. (2001)
The sterol-sensing domain of Patched protein seems to
control Smoothened activity through Patched vesicular
trafficking. Curr. Biol. 11, 1-7
Sánchez, L., Guerrero, I. (2001) The development of
the Drosophila genital disc. Bioessays 23, 698-707
Gorfinkiel, N., Sánchez, L., Guerrero, I. (2003)
Development of the Drosophila genital disc requires
interactions between its segmental primordia.
Development 130, 295-305
Patente / Patent
Application Number PCT/GB01/04891
Method for detecting inhibitors of tumor growth.
17
Resumen de Investigación
El ala de Drosophila se desarrolla por la
acción combinada de dos diferentes
organizadores: el anterior-posterior (AP) y
el dorsal-ventral (DV). Estos dos
organizadores se sitúan en el disco en los
bordes de expresión de los genes selectores
engrailed y apterous, los cuales determinan
los compartimentos posterior y dorsal del
ala respectivamente. Interacciones celulares
median la activación de los genes
decapentaplegic (dpp) y wingless (wg) en
los organizadores AP y DV respectivamente.
dpp y wg codifican moléculas difusibles que
promueven el desarrollo del ala mediante
la activación de diferentes genes diana.
El eje próximo-distal (PD) del disco no se
desarrolla por la acción de un tercer
organizador, sino que es la acción
combinada de Dpp y Wg la que activa la
expresión de una serie de genes que se
considera que definen el eje PD.
Nuestro trabajo está dirigido al análisis de
diferentes aspectos del desarrollo del ala
en el eje PD.
La especificación de la articulación
del ala
El suceso más temprano en la organización
del eje PD del disco de ala es la
determinación del destino ala por el gen
vestigial (vg) en el desarrollo larvario
temprano. Más tarde en el desarrollo,
interacciones celulares en el borde del
dominio de expresión de vg activan la
expresión de una serie de genes que
promueven el desarrollo de la articulación
del ala. Nuestro objetivo es identificar los
genes involucrados en el desarrollo de la
articulación y los componentes de esta ruta
de señalización intercelular.
La función del gen optomotor-blind
(omb) en el desarrollo del ala
El gen omb codifica una proteína nuclear
con un dominio T-box. Su expresión en el
disco de ala es activada por la acción
combinada de las rutas de Dpp y Wg. El
fenotipo mutante sugiere que omb tiene un
papel primordial en el desarrollo del ala,
aunque su función real no se conoce.
Nuestro objetivo es estudiar la función de
omb y de otros genes involucrados en el
desarrollo del eje PD del ala.
Jefe de Línea / Group Leader:
Fernando Jiménez Díaz-Benjumea
e-mail: [email protected]
Estudiantes /
Undergraduate Students:
David del Álamo Rodríguez
Javier Terriente Félix
Patrones de expresión de wingless (rojo) y engrailed (verde) en un discode ala silvestre (izquierda) y mutante para omb (derecha). En mutantesomb, wingless se expresa ectópicamente en las células anteriores del bordede compartimento AP del ala.
Comunicación intercelular en el desarrollodel Drosophila
A.3Biología del� DesarrolloDevelopmental Biology
18
del Alamo Rodríguez, D., Terriente, J., Díaz-Benjumea,
F. J. (2002) Spitz-EGFr signalling via the Ras/MAPK
pathway mediates the induction of bract cells in
Drosophila legs. Development 129, 1975-19822
del Alamo Rodríguez, D., Terriente, J., Galindo, M. I.,
Couso, J. P., Díaz-Benjumea, F. J. (2002) Different
mechanisms initiate and maintain wingless expression
in the Drosophila wing hinge. Development 129, 3995-
4004
Cell-cell signalling in Drosophila development
Publicaciones/Publications:
Research Summary
The Drosophila wing is patterned by the
combined action of two different
organizers: the anterior-posterior (AP)
and the dorsal-ventral (DV). These two
organizers are placed in the disc at the
borders of expression of the selector
genes engrailed and apterous, which
specify the P and the D compartments of
the wing respectively. Cell interactions
mediate the activation of the genes
decapentaplegic (dpp) and wingless (wg)
at the AP and DV organizers respectively.
dpp and wg encode diffusible molecules
that pattern the disc through the activation
of different target genes.
The proximal-distal (PD) axis of the disc
is not patterned by a third organizer,
otherwise the combined action of Dpp
and Wg is required to activated a set of
genes that, it is considered, defines the
PD axis. Our work is focused in different
aspects of PD wing patterning:
The specification of the wing hinge
The earliest event in PD patterning in the
wing disc is the specification of the wing
fate by the gene vestigial (vg) in early
larval development. Later in development
cell interactions at the border of the vg-
expression domain drive the expression
of a set of genes that promotes the growth
of the wing hinge. Our goal is to identify
and to characterize both the genes
involved in the development of the wing
hinge and the components of this cell-
signalling pathway.
The function of the gene optomotor-
blind (omb) in wing development
The gene omb encodes a T-box protein.
omb expression in the wing disc is
activated by the combined action of Dpp
and Wg. The omb mutant phenotype
suggests that it plays an important role
in wing development but its real function
is not known. Our goal is to study the
function of omb and of other genes
involved in the development of the PD
axis of the wing.
Wingless (red) and engrailed (green) patterns of expression in wild-type (left) and omb mutant(right) wing discs. In omb wingless is ectopically expressed in the anterior side of the AP compartmentboundary of the wing blade.
19
Resumen de investigación
Especificación territorial. Un proceso
importante durante el desarrollo es la
subdivisión de un epitelio en distintos
territorios. La subdivisión que separa el ala
(apéndice) del mesotórax (tronco) de
Drosophila depende de los genes iroquois
(Iro-C) puesto que su ausencia del
mesotórax dorsal transforma a éste en ala.
Hemos demostrado que la señalización del
morfógeno Decapentaplegic, que proviene
del territorio de ala, confina la expresión
del Iro-C al territorio del tronco, y define por
tanto la subdivisión entre estos territorios.
Se está investigando en la actualidad la
función de genes adicionales (msh y
islet=tail-up) en estas especificaciones y/o
subdivisiones.
Inhibición lateral. La señalización entre
las células de un grupo proneural mediada
por el receptor Notch limita el número de
células que pueden devenir precursores
nerviosos (inhibición lateral). En
colaboración con el grupo de Jui-Chou Hsu
en Taiwan, hemos demostrado la función
de la proteína de membrana Echinoid de
potenciar la señalización de Notch.
Función de DaPKC. Los complejos
multiproteicos Par-3/Par-6/aPKC y
Crumbs/Discs lost/Stardust se requieren
para el establecimiento de la polaridad
apicobasal de las células epiteliales en
vertebrados e invertebrados. Hemos
demostrado que, en Drosophila, ambos
complejos interaccionan físicamente, que
aPKC fosforila in vitro a Crumbs y que esta
fosforilación se require para la actvidad in
vivo de Crumbs. En colaboración con el
grupo de J. Moscat.
Control de la expresión de los genes Iro.
Hemos identificado y estamos
caracterizando varias de las secuencias
reguladoras (enhancers) responsables de
la expresión espacial y temporalmente
regulada de los genes Iro-C.
Miogénesis. Los músculos de Drosophila
son sincitios formados por fusión de
mioblastos. Previamente a la fusión, los
mioblastos se subdivid en subtipos, siendo
esta segregación fundamental para que
progrese la miogénesis. Esto se debe a la
naturaleza asimétrica de la fusión, que
implica dos poblaciones de mioblastos:
fundadores y competentes en fusión.
Estamos utilizando una combinación de
técnicas genéticas, celulares y moleculares
para estudiar el control de la miogénesis,
centrándonos en el proceso de la
diversificación de los mioblastos. Para ello,
estamos caracterizando funcionalmente
genes específicos de las distintas
subpoblaciones.
Función de los genes iro en vertebrados.
Hemos comprobado que los genes iro en
Xenopus (Xiro) participan en múltiples
procesos del desarrollo. Así, los genes Xiro
se requieren para la formación del
organizador de Spemman y el
establecimiento del neuroectodermo. Estos
procesos tienen lugar a través de la
represión de Bmp4 por las proteínas Xiro.
Por otro lado, en estadios más tardios, los
genes Xiro se requieren para el
establecimiento y mantenimiento del
organizador secundario localizado entre el
cerebro medio y el cerebro posterior, y para
coordinar la salida del ciclo celular y la
diferenciación de las neuronas primarias.
Biología molecular del desarrolloA.4Biología del� DesarrolloDevelopmental Biology
Jefe de Línea / Group Leader:
Juan Modolell
e-mail: [email protected]
Personal Científico /
Scientific Staff:
Sonsoles Campuzano
José-Luis Gómez-Skarmeta
Isabel Rodríguez
Mar Ruiz-Gómez
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Florencia Cavodeassi
Sol Sotillos
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Marta Carrasco
Joaquín de Navascués
Luis María Escudero
Annalisa Letizia
María Eugenia Villa
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
Eva Caminero
Elisa de la Calle
Paloma Martín
La expresión forzada de chn provoca la activación del gen proneural scute(rojo) y la aparición de numerosos órganos sensoriales extra (amarillo).
20
Benos, P.V., Modolell, J., et al. (2001) From first base:the sequence of the tip of the X chromosome ofDrosophila melanogaster, a comparison of twosequencing strategies. Genome Res. 11, 710-730
Campuzano S. (2001) Emc, a negative HLH regulatorwith multiple functions in Drosophila development.Oncogene 20, 8299-8307
Cavodeassi, F., Modolell, J., Gomez-Skarmeta, J.L.(2001) The Iroquois family of genes: from body buildingto neural patterning. Development 128, 2847-2855
Culi, J., Martin-Blanco, E., Modolell, J. (2001) The EGFreceptor and N signalling pathways act antagonisticallyin Drosophila mesothorax bristle patterning. Development128, 299-308
Glavic, A., Gómez-Skarmeta, J.L., Mayor, R. (2001) Xiro-1 controls mesoderm patterning by repressing bmp-4expression in the Spemann organizer. Dev. Dyn. 222,368-376
Gomez-Skarmeta, J., de La Calle-Mustienes, E., Modolell,J. (2001) The Wnt-activated Xiro1 gene encodes arepressor that is essential for neural development anddownregulates Bmp4. Development 128, 551-560
Martin, B.S., Ruiz-Gomez, M., Landgraf, M., Bate, M.(2001) A distinct set of founders and fusion-competentmyoblasts make visceral muscles in the Drosophilaembryo. Development 128, 3331-3338
Cavodeassi, F., Rodríguez, I., Modolell, J.(2002) Dppsignalling is a key effector of the wing-body wallsubdivision of the Drosophila mesothorax. Development129, 3815-3823
Claveria, C., Caminero, E., Martinez-A , C., Campuzano,S., Torres, M. (2002) GH3, a novel proapoptotic domainin Drosophila Grim, promotes a mitochondrial deathpathway. EMBO J. 21, 3327-3336
de la Calle-Mustienes, E., Glavic, A., Modolell, J. Gómez-Skarmeta, J.L. (2002) Xiro homeoproteins coordinatecell cycle exit and primary neuron formation byupregulating neuronal-fate repressors and downregulatingthe cell-cycle inhibitor XGadd45- . Mech. Dev. 119, 69-80
de la Calle-Mustienes, E., Modolell, J., Gómez-Skarmeta,J.L. (2002) The Xiro-repressed gene CoREST isexpressed in Xenopus neural territories. Mech. Dev. 110,209-211
Dutta, D., Bloor, J.W., Ruiz-Gomez, M., VijayRaghavan,K., Kiehart, D.P. (2002) Real-time imaging ofmorphogenetic movements in Drosophila using Gal4-UAS-driven expression of GFP fused to the actin-bindingdomain of moesin. Genesis 34, 146-151
Glavic, A., Gomez-Skarmeta, J.L., Mayor, R. (2002) Thehomeoprotein Xiro1 is required for midbrain-hindbrainboundary formation. Development 129, 1609-1621
Gómez-Skarmeta, J,L., Modolell, J. (2002) Iroquoisgenes: genomic organization and function in vertebrateneural development. Curr. Opin. Genet. Dev. 12, 403-408
Pena-Rangel, M.T., Rodríguez, I., Riesgo-Escovar, J.R.(2002) A misexpression study examining dorsal thoraxformation in Drosophila melanogaster. Genetics 160,1035-1050
Peter, A., Modolell, J., et al. (2002) Mapping andidentification of essential gene functions on the Xchromosome of Drosophila. EMBO Rep. 3, 34-38
Ruiz-Gómez, M., Coutts, N., Suster, M.L., Landgraf, M.,Bate, M. (2002) myoblasts incompetent encodes a zincfinger transcription factor required to specify fusion-competent myoblasts in Drosophila. Development 129,133-141
Premios / Awards / Other Activities
Juan Modolell, Premio Rey Jaime I de Investigación,2002
Workshop on Neural Prepatterning and Specification.Fundación Juan March. Junio 2001
Molecular biology of development
Publicaciones/Publications:
Research Summary
Territorial specification. The subdivision
of an epithelium in distinct territories is an
important process during development.
The subdivision that separates a
Drosophila appendage (wing) of the trunk
(mesothorax) depends on the iroquois
(iro) genes, since their removal transforms
the dorsal mesothorax into wing hinge.
We have shown that signaling by the
Decapentaplegic morphogen, which
emanates from the wing territory, confines
iro expression to the trunk territory and
thereby defines the subdivision between
these territories. The function of msh and
islet=tail-up in these specifications and
subdivisions is being examined.
Lateral inhibition. Notch signaling
between cells of a proneural cluster limits
the number of its cells that can become
neural precursors (lateral inhibition). In
collaboration with Jui-Chou Hsu (Taiwan),
we have shown that the trans-membrane
protein Echinoid potentiates Notch
signaling.
Function of DaPKC. The multiprotein
complexes Par-3/Par-6/aPKC and
Crumbs/Discs lost/Stardust are requiered
to stablish apicobasal polarity in epithelial
cells, both in vertebrates and in
invertebrates. We have shown that both
complexes physically interact, that aPKC
phosphorylates Crumbs in vitro and that
this phosphorylation is required for the in
vivo activity of Crumbs. In collaboration
with J. Moscat group.
Control of Iro genes expression. We
have identified and are in the process of
characterizing several regulatory
sequences (enhancers) that govern the
spatially and temporally restricted
expression of the Iro-C genes.
Myogenesis. Muscles in Drosophila are
syncytial fibres formed by cell fusion. In
Drosophila the subdivision of the
mesoderm into different populations is
essential for normal myogenesis and
muscle patterning. This is so because
myoblast fusion is a polar process that
involves two kinds of myoblasts: founders
and fusion-competent myoblasts. We use
a combined genetic, cellular and molecular
approach to study how myogenesis is
regulated and the role of myoblast
diversification in this control. To this
purpose, we are functionally characterizing
genes specific of the different sub-
populations of myoblasts.
Function of vertebrate iro genes. We
have found that Xenopus iro genes (Xiro)
participate in multiple processes during
development. Thus, Xiro genes are
required to form the Spemman organizer
and the prospective neuroectoderm.
These processes take place through Xiro-
mediated Bmp4 downregulation. In
addition, at later stages, Xiro genes are
required for the formation and
maintenance of the midbrain-hindbrain
secondary organizer and for coordinating
cell cycle exit and differentiation of primary
neurons.
Forced expression of chn promotes activation of the proneural gene scute(red) and the emergence of many extra sensory organs (yellow).
21
Resumen de Investigación
En nuestro laboratorio co-existen dos gruposde trabajo, dirigidos por G. Morata y por E.Sánchez-Herrero respectivamente, quedesarrollan líneas de investigaciónindependientes dentro del área del controlgenético del desarrollo de Drosophila..
Durante el periodo 2001-2002 el grupodirigido por G. Morata ha desarrollado treslíneas de trabajo principales: 1) Identificacióny estudio de las subdivisiones genéticas enlos discos imaginales, 2) Estudio de losgenes que delimitan el eje dorsoventral delembrión, y 3) Análisis de los mecanismosde control de tamaño en el ala.
Con respecto al primer apartado se estánestudiando dos genes que codifican parafactores de transcripción con homeodominioy que muestran expresión restringida en eltórax adulto. El gen muscle specifichomeobox (msh) funciona en la regióntorácica lateral, mientras que eyegone (eyg)está activo en la región mas anterior ycentral del tórax. El estudio de ambosgenes se está realizando mediante lainducción de mutaciones y experimentosde expresión dirigida por el métodoGal4/UAS. Los resultados demuestran quejuegan un papel crítico en el proceso desubdivisión genética del notum. En el casode eyg se ha demostrado que está activadopor los genes iroquois and pannier (pnr) yque media la función torácica de estos.
El análisis de la especificación dorsoventral(D/V) del embrión se ha centrado en lafunción de pnr, buttonhead (btd) y LP1 tresgenes que se expresan en regionesespecíficas a lo largo del eje D/V. Losresultados con pnr indican que este gentiene una función selectora en el embriónsimilar a la que ejerce en el adulto,especificando el desarrollo de la regiónmediodorsal y regulando la actividad de losgenes que especifican el desarrollo dezonas dorsales adyacentes. La función debtd en la región ventral está restringida ala formación del Sistema Nervioso y de losprimordios de los discos imaginalesventrales, de antena, pata y genital. Enausencia de la función de btd y su gengemelo D-Sp1 no se forman las estructurasventrales del adulto. LP1 se expresa en laamnioserosa, la región mas dorsal delembrión y su papel parece estar relacionadocon la respuesta a la señal Dpp.
El estudio de los mecanismos de controlde tamaño es un tema reciente en ellaboratorio, pero relacionado conexperimentos realizados hace mas de 25años, cuando se encontró que en los discosimaginales las células de crecimiento lentoson eliminadas si co-existen con célulasque se dividen mas rápidamente. Estefenómeno se denominó “competicióncelular” e implicaba la existencia demecanismos de comunicación entre célulasque distinguen ritmos diferentes deproliferación. Recientemente se haencontrado en el laboratorio que laeliminación por competición celular se debea apoptosis originada por niveles diferentesde función de la vía Dpp. En la actualidadse está estudiando la relación funcionalentre la actividad de la vía Dpp, elcrecimiento del ala y la aparición deapoptosis. Los resultados indican que lafunción principal de Dpp es activarcrecimiento, pero esta función estáantagonizada por dos genes que a su vezson regulados por la vía Dpp, daughtersagainst dpp (dad) y brinker (brk). El tamañodel ala de Drosophila parece ser el resultadodel compromiso de estas dos funcionesantagónicas.
El grupo dirigido por E. Sánchez-Herreroestudia los mecanismos por los que losgenes Hox confieren especificidad en el ejeantero-posterior de Drosophilamelanogaster. El gen Hox Abdominal-B esnecesario para formar la genitalia y, en suausencia ésta se transforma en una patao una antena. Estos dos apéndicescomparten con la genitalia una informaciónposicional común, que es modificada porAbdominal-B para la formación de estaestructura. Para ello, Abdominal-B reprimegenes característicos de la pata o laantenna. Si bien éstos apéndices sonsimilares en varios aspectos de sudesarrollo, hemos caracterizado dos genesadyacentes y con gran similitud desecuencia que no se expresan en la patapero sí en la antena, además de en el ojo.La expresión ectópica de cualquiera deestos dos genes, que hemos llamadoHernández y Fernández, produce antenasu ojos ectópicos. El que se desarrolle unau otra estructura depende, al menos enparte, de la vía de señalización del genNotch. Nuestros resultados desarrollanestudios previos sobre la relación de genesHox y vías de señalización, determinanalgunos de los mecanismos por los que seespecifican diferentes estructuras en lamosca e identifican dos genes que medianla función de genes Hox para la formaciónde distintos apéndices.
Jefes de Linea / Group Leaders:
Ginés Morata
Ernesto Sánchez-Herrero*
e-mail: ,
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
Natalia Azpiazu
Manuel Calleja,
Postdoctorales / Postdoctoral
Fellows:
Hector Herranz
Eduardo Moreno
Magali Suzanne
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Silvia Aldaz
Carlos Estella
Beatriz Estrada
David Foronda
Francisco Martín
Luis de Navas
Ainhoa Perez
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
Angelica Cantarero
Rosa González
* Jefe de Línea asociado / Associate
Group Leader
Control genético de la morfogénesisA.5Biología del� DesarrolloDevelopmental Biology
22
Genetic control of morphogenesis
Research Summary
In the laboratory there two researchgroups, led by G. Morata and E. Sanchez-Herrero respectively, centered on thegenetic control of Drosophiladevelopment.
During the 2001-2002 period the researchwork by the Morata group has beenfocussed in three major lines 1)Identification and study of new geneticsubdivisions in the imaginal discs, 2)Study of the genes that establish thedorsal-ventral body axis in the embryoand 3) Analysis of the mechanismscontrolling the size of the wing.Regarding the first issue, there are twogenes encoding homeodomaintranscription factors and that areexpressed in restricted domains of thethorax. The muscle specific homeobox(msh) gene functions in the lateral regionwhereas eyegone (eyg) is active in theanterior central region. The function ofthe two genes is being studied by inducingmutations and by misexpressionexperiments with the Gal4/UAS method.The results so far indicate that the twogenes play critical roles in the subdivisionof the thorax. For eyg it has been shownthat it functions downstream the thoracicgenes iroquois and pannier (pnr) andmediates their patterning function.
In the analysis of the embryonic dorsal-ventral (D/V) specification, the workfocused on three genes, pnr, buttonhead(btd) and LP1, which are expressed indistinct zones along the D/V axis. In thecase of pnr the evidence is that it has aselector-like function similar to thatreported for the adult structures; itspecifies the development of themediodorsal region and interacts withother genes like iro and spalt responsiblefor the development of other dorsalregions. In contrast, btd function isrestricted to the Nervous System and theventral discs primordia, antennal, leg andgenital. The loss of btd function and ofthe related gene Dsp-1 the ventral adultstructures do not form. The LP1 gene isexpressed in the most dorsal zone of theembryo, the amnioserosa, and its functionappears to be related with the diffusionand response to the Dpp signal, which inthe embryonic development has adorsalising function.
The analysis of the size controlmechanisms is a new research topic inthe group but related to experimentsoriginated in the laboratory about 27 yearsago (Morata and Ripoll, Dev. Biol. 1975). It was found that in the wing disc cellsthat divide slowly are eliminated if theyco-exists in the same polyclone with fasterdividing cells. This phenomenon wascalled “cell competition” and implied theexistence of a cell communication processthat discriminates cells with differentproliferation rates. Recent work in thelaboratory has shown that the eliminationof slow dividing cells is due to apoptosistriggered by low levels of activity of theDpp signalling pathway. Experimentsunder way try to establish a functionalconnection between Dpp activity, growthof the wing and apoptosis. Preliminaryresults indicate that the Dpp pathwaypromotes growth but this activity isantagonised by those of two genes,daughters against dpp (dad) and brinker(brk), which in turn are regulated by Dpp. The final size of the Drosophila wingappears to be the result of these twoantagonistic forces.
The group headed by E. Sanchez-Herrerois studying the mechanisms responsiblefor the Hox genes specificity in thedetermination of the anteroposterior axisin Drosophila. The Hox gene Abdominal-B (Abd-B) is required to determine thegenitalia and, in its absence, this istransformed into leg or antenna. Thesetwo appendages share with the genitaliaa common positional information that ismodified by Abd-B to form this structure.This is achieved by Abd-B repressinggenes characteristic of legs or antennae.These two appendages are similar inmany respects, however, we haveidentified two adjacent genes with a similarsequence that are expressed in theantenna (and the eye) but not in the leg.Ectopic expression of either of these twogenes, that we have called Hernándezand Fernández, makes ectopic eyes orantenna. Whether one or another structureis made depends in part on the activityof the Notch gene. We have extendedprevious results as to the relationship ofHox genes and signalling pathways,determined some of the mechanisms tospecify fly structures and characterisedtwo genes that mediate Hox informationto make different appendages.
Morata, G. (2001) How Drosophila appendages develop.Nature Reviews Mol. Cell Biol. 2, 89-97
Morata, G. (2001) La Historia de los genes Homeóticos.Arbor 662, 229-246
Estrada, B., Sánchez-Herrero, E. (2001) The Abdominal-B Hox gene of Drosophila antagonizes appendagedevelopment. Development 128, 331-339
Morata, G. (2001) Compartmentalization. Encyclopediaof Genetics (Ed. Sydney Brenner and Jeffrey H. Miller)Academic Press, New York pp 426-427
Estrada, B., Sánchez-Herrero, E. (2001) To see or notto see. The ELSO Gazette: http://www.the-elso-gazette/magazines/issue5/ mreviews12.asp) Issue 5.
Morata, G. (2001) La revolución biológica y el futuro delhombre. En “Las incertidumbres de un mundo enmutación”. Vol. 1. pp 109-117 Forum Deusto, Universidadde Deusto Bilbao
Herranz, H., Morata, G. (2001) Different functions ofpannier during Drosophila embryogenesis. Development128, 4837-4846
Moreno, E., Basler, K., Morata, G. (2002) Cells competefor the Decapentaplegic survival factor to preventapoptosis in Drosophila wing development. Nature 416,755-759
Calleja, M., Renaud, O., Usui, K., Pistillo, D., Morata,G., Simpson, P. (2002) How to pattern an epithelium:lessons from achaete-scute regulation on the notum ofDrosophila” Gene 292, 1-12
Azpiazu, N., Morata, G. (2002) Distinct functions ofhomothorax in leg development in Drosophila.Mechanisms of Development 119, 55-67
Morata, G. (2002) The blueprints of animals revealed.In “Knowledge from Nature: Twenty-one discoveries thatchanged the world” Seminal Nature. Garwin, L. andLincoln, T. (Eds.) pp 189-197 Japanese edition
Estrada, B., Casares, F., Busturia, A., Sánchez-Herrero,E. (2002) Genetic and molecular characterization of anovel iab-8 regulatory domain in the Abdominal-B geneof Drosophila melanogaster. Develoment 129, 5195-5204
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Beatriz Estrada. 2001. “Estudio de la regulación y funcióndel gen Hox Abdominal-B de Drosophila melanogaster”.Universidad Autónoma de Madrid.Hector Herranz. 2002. “Estudio de la función del genpannier en el desarrollo embrionario de Drosophilamelanogaster”. Universidad Autónoma de Madrid.
Premios / Awards / Other Activities
Ginés Morata. Miembro del Comité Científico del Centrode Reuniones Internacionales de Biología de laFundación Juan March, desde 2001.
Ginés Morata. Miembro del Comité Evaluador delInstituto de Investigaciones Bioquímicas de la FundaciónCampomar. Buenos Aires (Argentina) Abril, 2001.
Ginés Morata. Premio Nacional Santiago Ramón y Cajalde Investigación en Biología 2002.
Ginés Morata. Miembro del Scientific Advisory Committeeof the European Molecular Biology Laboratory (EMBO),desde 2002.
Publicaciones/Publications:
23
Proliferación (A) y muerte (B) de una célula tumoral. A, Anafase:mitocondrias, verde; cromátidas, azul; microtúbulos del husoacromático, rojo. B, Apoptosis: DNA fragmentado (azul) y mitocondriashinchadas (verde).
Proliferation (A) and death (B) of a tumour cell. A, Anaphase:mitochondria, green; chromatids, blue; microtubules of the mitoticspindle, red. B, Apoptosis: fragmented DNA (blue) and swollenmitochondria (green).
24
B
Biología CelularCell Biology
B.5 Señalización celular por PKC atípicas eninmunidad y cáncer
B.5 Cell signaling through the atypical PKCpathways in immunity and cancer
Jorge Moscat
B.1 Citoesqueleto y nucleoesqueletoB.1 Cytoskeleton and nucleoskeleton
Isabel Correas
B.2 Mecanismos de regulación de la biogénesismitocondrial y alteración mitocondrial encáncer
B.2 Mechanisms that regulate the biogenesis ofmitochondria and mitochondrial alterationsin cancer
José M. Cuezva
B.3 Terapia génica experimentalB.3 Experimental gene therapy
Marta Izquierdo
Francisco Moreno
B.4 Desarrollo neuronal y neurodegeneraciónB.4 Neuronal development and
neurodegeneration
B.6 Tráfico regulado de proteínas de membranaB.6 Regulated membrane protein trafficking
Ignacio V. Sandoval
B.7 Terapia génica experimentalB.7 Experimental gene therapy
AntonioTalavera Díaz
B.8 Química de proteínas y proteómicaB.8 Protein chemistry and proteomics
Jesús Vázquez
Resumen de Investigación
La proteína 4.1 fue originalmente
identificada en el eritrocito humano como
un componente de 80 kDa cuya función es
el anclaje del citoesqueleto de actina a la
membrana plasmática. En células
nucleadas de mamífero la situación es más
compleja puesto que hay una gran
diversidad de isoformas, originadas
mediante splicing alternativo del RNA
precursor, distribuidas en múltiples
compartimentos subcelulares y cuya función
comienza a caracterizarse. En este sentido,
nuestro grupo ha demostrado que 4.1 es
un componente nuclear y que juega un
papel estructural formando parte del
nucleoesqueleto celular al que se anclan
componentes de la maquinaria de ‘splicing’.
Actualmente a la proteína 4.1 eritroide se
la designa 4.1R (red blood cells) para
diferenciarla de otras proteínas 4.1
recientemente descritas y codificadas por
tres genes diferentes: 4.1N (neuronal), 4.1B
(brain) y 4.1G (general). Hay que señalar
que la 4.1B es una proteína supresora de
tumores específicos.
Los objetivos principales que nuestro grupo
viene abordando en los últimos años son
la caracterización de las señales
responsables de la distribución subcelular
diferencial de las isoformas de 4.1R y el
estudio de las funciones que 4.1R
desempeña en las células de mamífero no
eritroides.
Los resultados más destacables del bienio
2001-2002 han sido, por un lado, la
identificación de nuevos dominios
involucrados en la localización núcleo-
citoplasmática de 4.1R y el establecimiento
del orden jerárquico en que éstos actúan.
Los datos obtenidos sugieren que las
isoformas de 4.1R se distribuyen entre el
núcleo y el citoplasma siguiendo, al menos,
cuatro mecanismos de transporte diferentes.
Además, hemos demostrado que 4.1R
participa en el mantenimiento de la
arquitectura de los microtúbulos interfásicos
mediante su asociación con la tubulina a
través de un dominio común a todas las
isoformas. Estos resultados están
contribuyendo a esclarecer las múltiples
funciones que la diversidad de isoformas
de 4.1R desempeña en la célula no eritroide
así como los mecanismos que regulan su
transporte y distribución intracelular.
Jefe de Línea / Group Leader:
Isabel Correas
e-mail: [email protected]
Postdoctoral / Postdoctoral Fellow:
Carmen María Pérez-Ferreiro
Estudiantes / Undergraduate
Students:
Altea Gosálbez, Desiderio Ordoño,
Elimelec Sendino
Citoesqueleto y nucleoesqueletoB.1Biología Celular
Cell Biology
La proteína 4.1R posee una secuencia rica en leucinas capaz de regular su localización núcleo-
citoplasmática. A. La secuencia rica en leucinas presente en 4.1R se parece a las señales de
exportación nuclear ya caracterizadas en otras proteínas. B. Estructura tridimensional de la
NES de 4.1R. C. Estructura tridimensional del dominio FERM de 4.1R donde se muestra la
señal de exportación nuclear presente en una -hélice expuesta. Los dos residuos más
conservados, Leu34 y Leu36 están indicados en la figura.
26
Perez-Ferreiro, C.M., Luque, C.M., Correas, I. (2001)
4.1R proteins associate with interphase microtubules in
human T cells: a 4.1R constitutive region is involved in
tubulin binding. J. Biol. Chem. 276, 44785-44791
Perez-Ferreiro, C.M., Luque, C.M., Pérez-González, A.,
Sendino, E., Correas, I. (2001) Nuclear and cytoplasmic
localization signals in protein 4.1R. Cell Mol. Biol. Lett.
6,195
de Marco, M.C., Martin-Belmonte, F., Kremer, L., Albar,
J.P., Correas, I., Vaerman, J.P., Marazuela, M., Byrne,
J.A., Alonso, M.A. (2002) MAL2, a novel raft protein of
the MAL family, is an essential component of the
machinery for transcytosis in hepatoma HepG2 cells. J.
Cell Biol. 159, 37-44
Tesis doctorales/Doctoral Theses
Carmen María Pérez-Ferreiro. 2001. "Secuencias que
modulan la distribución subcelular y las interacciones
de la proteína 4.1R en células no eritroides”. Universidad
Autónoma de Madrid.
Cytoskeleton and nucleoskeleton
Publicaciones/Publications:
Research summary
Protein 4.1 was originally identified as an
80 kDa component of the membrane
skeleton of human red blood cells. In
these cells, 4.1 acts as an stabilizing
protein of the spectrin-actin network, linked
to the plasma membrane via interactions
with transmembrane proteins. The picture
is more complex in nucleated cells, in
which many 4.1R isoforms varying in size
and intracellular location, have been
identified. Little is known about the
functional roles that proteins 4.1 are
playing in nonerythroid cells. Studies
carried out by our group have shown that
a specific 4.1 isoform is a component of
the nucleoskeleton to which proteins of
the splicing machinery attach. Red blood
cell protein 4.1 has recently been referred
to as 4.1R to distinguish it from three
newly described 4.1 proteins which are
encoded by three other genes. These
proteins are named 4.1B (abundant in
brain), 4. 1N (abundant in neurons), and
4.1G (generally distributed). Protein 4.1B
functions as a tumor suppressor and its
loss is observed in a variety of tumors,
including breast and lung cancers as well
as meningiomas.
The main current goals of our group
comprise the characterization of the
sequence motifs involved in differential
targeting of proteins 4.1R and the
elucidation of the roles that 4.1 plays in
nucleated cells.
During the 2001-2002 period, our main
findings on signals involved in nucleo-
cytoplasmic distribution of 4.1R isoforms
suggest that 4.1 is differentially distributed
between these two compartments at least
by four different mechanisms. Our results
also indicate that all 4.1R isoforms bind
to interphase microtubules in human T
cells through a conserved region. All these
data will contribute to the understanding
of the multiple 4.1R functions played in
non-erythroid cells as well as to elucidate
the mechanisms involved in 4.1R
intracellular distribution.
A leucine-rich sequence regulates nuclear cytoplasmic
localization of protein 4.1R. A. The leucine-rich sequence
of 4.1R resembles nuclear export signals (NESs)
characterized in a variety of proteins. B. Three-
dimensional structure of the NES present in protein
4.1R. C. Three-dimensional structure of the FERM
domain of 4.1R showing the position of the NES in an
exposed -helix. Two essential residues, Leu34 and
Leu36, are shown.
27
Resumen de Investigación
El objetivo fundamental que persigue esta
línea de investigación es la caracterización
de los mecanismos celulares y moleculares
que regulan la biogénesis de las
mitocondrias en células de mamífero, esto
es, el conjunto de procesos que tienen
como finalidad el aumento de la dotación
y/o de la actividad mitocondrial en la célula.
Por la implicación evidente que la
mitocondria tiene en múltiples
manifestaciones de la patología humana
(cáncer, enfermedades neurodegenerativas,
envejecimiento, diabetes,…) hacemos
especial hincapié en el estudio de aquellos
mecanismos que conducen a la expresión
de un fenotipo mitocondrial aberrante. La
finalidad de estos estudios es la
caracterización de las moléculas que
participan en la manifestación de la
patología y, eventualmente, el desarrollo
de estrategias encaminadas a prevenir la
progresión de la enfermedad. En este
contexto, nuestros estudios se centran en
el complejo de la H+-ATP sintasa, sistema
enzimático cuello de botella de la generación
de energía biológica, de la generación y
organización de la membrana interna
mitocondrial que, además, está implicada
en la ejecución del programa de apoptosis.
Trabajos anteriores de nuestro laboratorio
han demostrado que la expresión del gen
que codifica la subunidad catalítica del
complejo H+-ATP sintasa está regulada en
desarrollo y en células tumorales por control
de la traducción del mRNA correspondiente.
En este periodo hemos caracterizado los
dos elementos de la secuencia del mRNA
que participan en el control de su traducción,
así como las proteínas del hígado que
interaccionan con dichos elementos. Por
otro lado, hemos demostrado que en
pacientes con cáncer de hígado, riñón y
colon se produce una alteración de la
biogénesis mitocondrial que hemos definido
como “la huella bioenergética del cáncer”.
Esta alteración está íntimamente ligada a
la progresión tumoral, de tal forma que la
subunidad catalítica de la H+-ATP sintasa
constituye un excelente marcador de la
supervivencia de pacientes con cáncer de
colon.
En la actualidad nuestros objetivos se
centran a cuatro niveles: (i) el desarrollo de
un kit para el análisis de la huella
bioenergética del cáncer, (ii) el estudio de
la huella bioenergética en otros tumores y
líneas tumorales humanas, (iii) el estudio
del mecanismo por el que la H+-ATP sintasa
está implicada en muerte celular y (iv) el
análisis del control de la traducción del
mRNA de la subunidad catalítica de la H+-
ATP sintasa en desarrollo y en cáncer.
Jefe de Línea / Group Leader:
José M. Cuezva
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
José M. Izquierdo
Postdoctoral / Postdoctoral Fellow:
Fernando Martín
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Gema Santamaría
Marta Martínez
Antonio Isidoro
Alvaro Ortega
Técnico de Investigación /
Technical Assistance:
Margarita Chamorro
Grupo / Group members:
(de izquierda a derecha/from left to right)
Gema, Álvaro, Pepe, Marta, Fernando,
Margarita, Antonio.
Mecanismos de regulación de la biogénesismitocondrial y alteración mitocondrial en cáncer
B.2Biología Celular
Cell Biology
Estudiando la dinámica mitocondrial (“gusanitos” verdes en la pantalla del ordenador)
en células vivas.
Studying mitochondrial (green worm-like structures in the PC screen) dynamics in living
cells.
28
Mechanisms that regulate the biogenesis of mitochondriaand mitochondrial alterations in cancer
Publicaciones/Publications:
Research summary
Our group is interested in the
characterisation of the cellular and
molecular mechanisms that regulate the
biogenesis of mitochondria in cells of
mammals, that is, the set of processes
that result in an increase of the number
and/or activity of mitochondria within the
cell. Because mitochondria is implicated
in many manifestations of human
pathology (cancer, neurodegenerative
diseases, ageing, diabetes,…..) we pay
special emphasis to the study of those
mechanisms that promote the expression
of an aberrant mitochondrial phenotype
in the cell. The aim of these studies is
the characterisation of the molecules that
participate in the development of
pathology and, eventually, the
development of new strategies aimed at
the prevention of disease progression.
Within this context, our studies are centred
on the H+-ATP synthase complex, the
enzyme system that is bottle-neck for the
generation of biological energy, for the
generation and organisation of the inner
mitochondrial membrane and that is also
implicated in the execution of apoptosis.
Previous works from our laboratory have
demonstrated that during development
and in tumour cells the expression of the
gene encoding the catalytic subunit of
the H+-ATP synthase is regulated at the
level of mRNA translation. We have
recently characterised the two elements
of the mRNA sequence that participate
in the control of its translation, as well as
the liver proteins that interact with the two
RNA elements. On the other hand, we
have demonstrated that the alteration of
the biogenesis of mitochondria is a cellular
hallmark of liver, kidney and colon cancer
patients. We have defined this feature as
“the bioenergetic signature of cancer”.
The bioenergetic signature of cancer is
intimately related with cancer progression,
providing the catalytic subunit of the H+-
ATP synthase an excellent marker of the
survival of the patients with early-stage
colorectal carcinomas.
At present time our objectives are focused
at four main levels: (i) the development
of a kit assay for the analysis of the
bioenergetic signature of cancer, (ii) the
study of the bioenergetic signature in
other tumours and tumoral human cells,
(iii) the study of the mechanism that
implicate the H+-ATP synthase in cell
death and (iv) the analysis of the control
of the translation of the mRNA encoding
the catalytic subunit of the H+-ATP
synthase in development and in cancer.
Fresnedo, O., López de Heredia, M., Martínez, M.J.,
Cristobal, S., Rejas, M., Cuezva, J.M., Ochoa, B. (2001)
Immunolocalization of erCEH: a novel cholesteryl ester
hydrolase localized in the endoplasmic reticulum of murine
and human hepatocytes. Hepatology 33, 662-667
Ricart, J., Izquierdo, J.M., Di Liegro, C.M., Cuezva, J.M.
(2002) The assembly of the ribonucleoprotein complex
containing -F1-ATPase mRNA requires the participation of
two distal cis-acting elements and a complex set of cellular
trans-acting proteins. Biochem. J. 365, 417-418
Cuezva, J.M., Krajewska, M., López de Heredia, M.,
Krajewski, S., Santamaría, G., Kim, H., Zapata, J.M.,
Marusawa, H., Chamorro, M., Reed, J.C. (2002) The
bioenergetic signature of cancer: a marker of tumor
progresión. Cancer Res. 62, 6674-6681
Patentes / Patents
Cuezva, J.M. (2002) “Procedimiento para el diagnóstico,
análisis de la progresión y prognosis de tumores malignos
basado en el estudio de marcadores metabólicos de la
célula” Universidad Autónoma de Madrid, OEPM
200201190. PCT (Europe, Canada, USA, Japan)
ESO3/00228
Proliferación (A) y muerte (B) de una célula tumoral. A,
Anafase: mitocondrias, verde; cromátidas, azul; microtúbulos
del huso acromático, rojo. B, Apoptosis: DNA fragmentado
(azul) y mitocondrias hinchadas (verde).
Proliferation (A) and death (B) of a tumour cell. A, Anaphase:
mitochondria, green; chromatids, blue; microtubules of the
mitotic spindle, red. B, Apoptosis: fragmented DNA (blue)
and swollen mitochondria (green).
29
Resumen de Investigación
Terapia génica de tumores cerebrales
malignos. Los glioblastomas son tumores
primarios cerebrales, poseen una
mortandad superior al 90 % considerándose
prácticamente incurables. Los avances y
descubrimientos recientes en biología
molecular permiten la utilización de nuevas
estrategias contra este mal. Una de ellas
está basada en un gen vegetal (linamarasa)
que transforma el sustrato inocuo linamarina
(2-HO isobutyronitrile--D-glucopyranoside)
en glucosa y cianuro. Con este sistema
hemos logrado erradicar tumores de hasta
1000 mm3 de volumen en la rata Wistar.
El efecto colateral debido al cianuro puede
compensar los bajos porcentajes de
infección viral que se estiman en tumores
sólidos. Estamos asimismo utilizando el
perro, (Beagle) cuyo tamaño de cerebro es
intermedio entre la rata y el hombre, como
modelo experimental. Se pretende
caracterizar en profundidad este sistema
para su eventual utilización en humanos.
Si bien tradicionalmente nuestro grupo ha
utilizado la rata Wistar y la línea celular C6
de glioblastoma de rata, en los últimos años
hemos constatado repetidamente que un
10% de los animales son capaces de
sobrevivir al tumor sin medicación o terapia
alguna. Estas curaciones, que enmascaran
el éxito de la terapia génica que pudo
aplicarse, podrían explicarse como un
rechazo no inmediato a un transplante
alogénico.
Otra nueva estrategia se basa en la
utilización de ARN de interferencia (ARNi)
basado en un ARN de doble hebra y dirigido
contra algunas proteínas imprescindibles
para la progresión del ciclo celular. Se han
construido vectores retrovirales portadores
de un ADN que se transcribirá en ARNis
pequeños de interferencia y que actuarán
contra los ARNs correspondientes al genes
potencialmente letales del ciclo celular.
Personal Científico / Scientific Staff:
Marta Izquierdo
e-mails:
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Vega García-Escudero
Daniel Muñoz
Esteban Gurzov
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
Nuria Peralta
Terapia génica experimentalB.3Biología Celular
Cell Biology
30
de Felipe, P., Izquierdo, M., Wandosell, F., Lim, F. (2001)
Integrating retroviral cassette extends gene delivery of
HSV-1 expression vectors to dividing cells BioTechniques
31, 394-405
Izquierdo, M (2001) Ingeniería Genética y Transferencia
Génica. Ediciones Pirámide. Madrid 2001
Ciafré, S.A., Barillari, G., Bongiorno Borbone, L.,
Wannenes, F., Izquierdo M., Farace, M.A. (2002) A
tricistronic retroviral vector expressing natural
antiangiogenic factors inhibits angiogenesis in vitro but
is not able to block tumor progression in vivo Gene
Therapy 9 297-302
Cortés, M.L., García-Escudero, V., Hughes, M., Izquierdo,
M. (2002) The cyanide bystander effect of the
linamarase/linamarin killer-suicide gene therapy system
The Journal of Gene Medicine 4 1-8
Experimental gene therapy
Publicaciones/Publications:
Research Summary
Gene therapy in malignant brain
tumors. Glioblatomas are primary brain
tumors, having over 90% mortality and
being considered virtually incurable. The
current new advances in molecular
biology, allow the use of new strategies.
One of those is based on the plant gene
(linamarase) that will hydrolyze the
innocuous substrate linamarin (2-HO
isobutyronitrile--D-glucopyranoside) into
cyanide and glucose. We have
successfully used this approach to
eradicate tumors up to a volume of 1000
mm3 in the Wistar rat. The bystander
effect due to cyanide can compensate
the low viral percentages of infection
estimated in solid tumors. We are also
using the dog (Beagle) as a model system
because its brain size is intermediate
between that of the rat and humans.
We are characterizing several aspects of
the system in order to be able to apply it
in the future to humans.
Although we have used traditionally the
Wistar rat and the C6 rat glioblastoma
cell line as model systems, in the last few
years we found that about 10% of the
animals were consistently able to eliminate
the tumor spontaneously with no help
from gene therapy. The spontaneous
tumor remision, that would mask the gene
therapy treatment applied, might be the
result of a graft-host allogenic rejection.
A second strategy is base in RNA
interference (RNAi) by double-stranded
RNA against targeted cell cycle genes.
We have constructed constructed vectors
based on retroviruses bearing transgenes
whose transcription gives rise to small
interfering RNAs (siRNAs) specific for the
mRNAs corresponding to the cell cycle-
controller genes.
31
Resumen de investigación
La morfogénesis neuronal depende de la
organización de los diferentes componentes
del citoesqueleto, en donde los microtúbulos
desempeñan un papel central. Se ha podido
demostrar que el grado de fosforilación de
ciertas proteínas, por ejemplo, tau puede
controlar una serie de procesos tales como
el desarrollo neuronal, algunos procesos
neurodegenerativos e incluso procesos
oncogénicos.
Se han descrito diferentes modificaciones
químicas anormales en la proteína tau en
enfermos de Alzheimer. Parece ser que
fosforilaciones aberrantes son los
principales cambios que afectan a su
capacidad de unión a microtúbulos,
disminuyéndola aunque no afecta a su
ensamblaje. Se han implicado varias
quinasas en la hiperfosforilación anómala
de tau entre las que cabe destacar a la
GSK3 y CK2, desempeñando importantes
funciones. La actividad de la GSK3 puede
ser regulada a través de interacción con
otras proteínas, tales como las proteínas
que se unen a la GSK3 (GBPs).
Recientemente hemos descrito una nueva
GBP que además puede actuar como
competidor de tau.
La Proteína quinasa CK2 es una quinasa
ubiqua, capaz de actuar en mecanismos
de señalización, proliferación celular, y
expresión génica. Cataliza la fosforilación
de restos de serina y treonina en un gran
número de proteínas relacionadas con la
síntesis de ácidos nucleicos, productos de
oncogenes, y las proteínas del citosqueleto.
El hecho de que la enzima sea más
abundante en cerebro que en otros tejidos,
y el gran número de substratos implicados
en desarrollo, neuritogénesis, transmisión
sináptica, y supervivencia indican que la
enzima tiene un papel importante en
funciones neuronales. Muchos datos
sugieren también su implicación en
desórdenes debidos a la enfermedad de
Alzheimer. La Protein Kinasa CK2 se
compone de dos tipos de subunidades
catalíticas y de dos subunidades
reguladoras. Ambas subunidades
interaccionan entre si para formar un
complejo muy estable. Con el objetivo de
contribuir a la elucidación de la forma de
interacción de ambos tipos de subunidades,
hemos usado un equipo de Resonancia
de Plasmón Superficial, desarrollado en
nuestro laboratorio, para estudiar la
interacción entre las subunidades para
formar la holoenzima, así como la forma
de interaccionar de cada subunidad con
proteínas substrato.
Se tiene un gran interés en conocer como
afectan los cambios en la actividad de la
GSK 3 sobre distintos aspectos del
metabolismo en el sistema nervioso. Por
esta razón se han usado células de
neuroblastoma y cultivos primarios de
neuronas de regiones específicas del
cerebro, como modelos experimentales,
para examinar la expresión de ésta enzima
durante la diferenciación neuronal y las
posibles implicaciones en la patología
neuronal que se ha descrito en la
enfermedad de Alzheimer. Nuestros
resultados indican que la GSK 3 desempeña
una función destacada en la regulación de
la dinámica de los microtúbulos y que la
existencia de una mayor expresión del
enzima puede ser decisiva en la patología
observada en neuronas con esta
enfermedad.
Estamos interesados también en analizar
la respuesta neuronal ante situaciones de
estress y/o lesiones del sistema nervioso
central. En este sentido , hemos podido
comprobar que la proteína de matriz
extracelular fibronectina a es parte de la
respuesta de estres inducida por el péptido
amiloide.
Hemos podido comprobar que la proteína
quinasa GSK3/Shaggy se activa tras la
inducción de la retracción de axones.
Además la inhibición farmacológica de PI3K
produce activación de GSK3 y retracción
neurítica. Esta activación aumenta la
expresión de fosfo-epítopos de tau que son
característicos de AD, como PHF-1. Además
hemos localizado los elementos de la ruta
de LPA-Rho responsables del sistema de
activación de GSK3/Shaggy.
Desarrollo neuronal y neurodegeneraciónB.4Biología Celular
Cell Biology
Jefe de Línea / Group Leader:
Francisco Moreno
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
Francisco Wandosell
Juan S. Jiménez
María José Benitez
Concepción Pérez Martín
María Teresa Moreno
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Silvia Sánchez
Marta Agudo
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Marta Salcedo
Diana Simon
Olga Varea
Personal Técnico /
Technical Assistance:
Beatriz García
Mª Jesús Martín-Bermejo
32
Agudo, M.Trejo, JL., Lim F., Avila, J., Torres-Aleman, I.,.Diaz-Nido, J., Wandosell, F. (2002) Highly efficient andSpecific gene transfer to Purkinje cells in vivo using aHerpes Simplex virus I amplicon. Human Gene Theraphy13, 665-674
Ávila. J., Lim, Moreno, FJ., Belmonte,. Claudio Cuello,A. (2002) Tau function and dysfunction in neurons. Itsrole in neurodegenerative disorders. Mol. Neurobiol. 25,213-231
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Benítez, M.J., Jiménez, J.S.(2002) A method of reversiblebiomolecular immobilization for the surface-plasmon-resonance quantitative analysis of interacting biologicalmacromolecules. Anal. Biochem. 302, 161-168
Diaz-Nido, J., Wandosell, F., Avila, J. (2002)Glycosaminoglycans and beta-Amyloid, Prion and TauPeptides in Neurodegenerative Diseases. Peptides 23,1321-1330
de Felipe, P., Izquierdo, M., Wandosell, F. Lim, F. (2001)Integration of a retroviral cassette extends gene deliveryof HSV-1amplicon vectors to diving cells. Biotechniques31, 394-405
González-Billault, C., Engelke, M., Jiménez-Mateos,EM.,
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Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Silvia Sánchez. 2001. “Análisis de los mecanismosmoleculares que controlan la elongación y retracciónaxonal: Papel de la PI3-Quinasa”. Univ. Autónoma deMadrid.
Neuronal development and neurodegeneration
Publicaciones/Publications:
Research Summary
Research Summary
Neuronal morphogenesis depends on the
organization of cytoskeletal elements
among which microtubules play a very
important role. Regulation of tau
phosphorylation might be one of the key
mechanism modulating neuronal
development, neurodegenerative process
and oncogenic processes.
Several abnormal modifications have
been described for tau proteins present
in the brain of AD patients. Aberrant tau
phosphorylation appears to be mainly
involved in the regulation of its binding to
microtubules, decreasing it but not in
facilitating tau assembly. Several kinases
have been involved in the anomalous
hyperphosphorylation of tau protein and
GSK3 and CK2 appear to play important
roles. The activity of GSK 3 can be
regulated through its interaction with
proteins such as GSK 3 binding protein
(GBPs). We have described a novel GBP
that can act as a competitor with tau.
Protein Kinase CK2 is a ubiquitous kinase,
acting on signaling, cell proliferation, and
gene expression mechanisms. It catalyses
the phosphorylation of serine and
threonine residues of a large number of
proteins related to nucleic acid synthesis,
oncogenes products, and cytoskeleton
proteins. The enzyme has an important
role in neural functions as indicated by
the facts that it is more abundant in brain
than in other tissues; and the large amount
of enzyme substrates involved in
development, neuritogenesis, synaptic
transmission, and survival. Many data
suggests also its implication in disorders
due to Alzheimer’s disease. Protein
Kinase CK2 is composed of two types of
catalytic subunits and two regulatory
subunits. It is well known that both catalytic
and regulatory subunits bind each other
to form a very stable complex. In order
to contribute to the elucidation of the
mode of interaction of both type of
subunits we have used a Surface
Plasmon Resonance equipment
developed in our laboratory to study the
intersubunit interactions to form the whole
holoenzyme, as well as the mode of
interaction of each subunit with protein
substrates.
There is a great interest in elucidating
how different aspect of neuronal
metabolism is altered upon changes in
GSK 3 activity. Thus we have used the
human neuroblastoma cell and primary
cultures of rat cerebellar granule neurons
as model systems to study the expression
of GSK 3 during neuronal differentiation
and the possible implications for neurite
pathology in Alzheimer’s disease.
Our results are consistent with an
important role for GSK 3 in the regulation
of cytoskeletal dynamics during neurite
growth and that upregulation of GSK 3
may contribute to cytoskeletal pathology
within neurites in AD. We are interested
too, in the analysis of brain response after
some stress situations of after some
insults. We reported that fibronectin is
part of an astroglilal response to beta-
Amiloide peptide.
We have further studied the role of
GSK3/Shaggy, after the induction of
growth cone collapse and neurite
retraction. The pharmacological inhibition
of PI3K produces a growth cone collapse
and GSK3 activation. This activation
enhanced the phosphorylation of Tau
epitope characteristics of AD brains, such
as PHF-1. And more significant, we
described the elements from LPA-Rho
pathway that responsible of GSK3/Shaggy
activation.
We initiated a new study of molecular
mechanism of regeneration based on the
capacity of ensheathing glia to promote
or redirect neuronal regeneration
33
Resumen de Investigación
Las quinasas son elementos esenciales en
los mecanismos de comunicación celular.
En particular, numerosos estudios han
implicado a las PKC atípicas (aPKC), PKC
y / PKC, en la activación de NF- B, que
es un factor de transcripción crítico en el
crecimiento celular y la respuesta inmune.
La alteración de los mecanismos normales
que regulan la señalización celular da lugar
a la aparición de enfermedades humanas
tales como el cáncer, la inflamación o
desordenes autoinmunes como el lupus o
la artritis reumatoide. En nuestro laboratorio
hemos caracterizado recientemente el ratón
“knock out” (KO) de PKC, lo que nos ha
permitido concluir que esta quinasa
efectivamente juega un importante papel
en el sistema inmune y especialmente en
la función de células B.
Así, la falta de PKC en este tipo celular
inhibe la proliferación y la supervivencia
celulares en respuesta a estímulos del
receptor antigénico, lo que correlaciona con
un defecto en la inducción de varios genes
dependientes de NF- B, como Bcl-xL. Como
consecuencia de estos defectos
moleculares, los ratones KO para PKC
son incapaces de montar una respuesta
inmune óptima y manifiestan un retraso en
el desarrollo de órganos linfoides
secundarios, especialmente de las placas
de Peyer. Mecanísticamente, las células
de ratones PKC KO muestran una fuerte
inhibición en la activación transcripcional
de NF- B, debido al hecho de que PKC
fosforila directamente su subunidad
transactivadora, RelA. Por lo tanto, durante
estos dos años hemos generado resultados
que prueban genéticamente que PKC es
esencial en la activación de NF- B y en el
control de la respuesta inmune.
Esto hace de esta quinasa una diana muy
atractiva para el descubrimiento de nuevas
medicinas anti-inflamatorias y anti-
cancerosas. Las aPKC interaccionan con
dos proteínas reguladoras: Par-4 y p62. La
primera es pro-apoptótica e inhibidora de
las aPKC, y sus niveles se reprimen en
células tumorales.
Hemos empezado a caracterizar los ratones
KO de Par-4 cuyo fenotipo está revelando
información de gran interés sobre el papel
que esta proteína juega in vivo. Por otra
parte, p62 es una proteína de andamiaje
que organiza el complejo de señalización
de aPKC en la ruta de NF- B. La reciente
generación, en nuestro laboratorio, de
ratones KO para p62 ayudará a la
comprensión de los mecanismos por los
que el complejo aPKC/p62 participa en la
transducción específica de señales en
modelos in vivo.
Jefe de Línea / Group Leader:
Jorge Moscat
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
María Teresa Díaz-Meco
María José Lafuente
Pilar Martín
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Antonia Avila
Carlos Guillén
María José Lorite
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Angeles Durán
Raquel Sánchez
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
Esther Garcia
Esther Fuertes
Juan José Lazcano
Desireé Ruiz
Científicos Visitantes /
Visiting Scientists:
Marie W. Wooten
(Auburn University, Alabama)
Nancy Laurin
(L’Université Laval, Quebec)
Señalización celular por PKC atípicas eninmunidad y cáncer
B.5Biología Celular
Cell Biology
Microfotografías de marcajes representativos de hematoxilina-eosina de placas de
Peyer (arriba) y bazo (abajo) de ratones wild type y KO para PKC de 2 semanas de
edad. Las características estructurales de las Placas de Peyer están alteradas en los
ratones KO, mostrando reducción en el número y tamaño de los folículos. La estructura
global del bazo de los ratones KO está preservada pero son aparentes los defectos en
la zona marginal así como la existencia de folículos B menores en pulpa blanca.
PKZ +/+ PKZ -/-
Pey
er’s
Pat
ches
Sp
leen
34
Cell signaling through the atypical PKCpathways in immunity and cancer
Research Summary
Kinases are essential players in the
mechanisms of cell communication. In
particular, numerous studies have
implicated the atypical PKC isoforms
(aPKC), PKC and / PKC, in the
activation of NF- B which is critical in the
control of cell proliferation and the immune
response. The subversion of the normal
mechanisms that regulate cell signaling
leads to various forms of human diseases
such as cancer, inflammation or
autoimmune disorders like lupus or
rheumatoid arthritis. We have recently
characterized the PKC knock out (KO)
mice which reveals that this kinase plays
an essential role within the immune
system and specifically in B-cell function.
Thus, the loss of PKC in B-cells impairs
survival and proliferation in response to
antigen receptor stimulation which
correlates with a defective induction of
several NF- B-dependent genes,
including Bcl-xL. Consistent with these
molecular defects, the PKC KO mice
are unable to mount an optimal immune
response and display a delay in the
development of secondary lymphoid
organs, specially the Peyer’s patches.
Of great interest, PKC-deficient cells
have a severe defect in NF- B
transcriptional activity which is due to the
fact that PKC phosphorylates the NF-
B transactivating subunit, RelA.
Therefore, our results during these two
years have genetically established the
role of PKC in NF- B signaling and in
the immune response which makes this
kinase an attractive therapeutic target for
drug discovery in the areas of
inflammation and cancer.
The atypical PKCs interact with two
regulatory proteins: Par-4 and p62. The
former is a pro-apoptotic inhibitor of the
aPKCs that is down-regulated in tumor-
transformed cells. We have now started
to characterize the Par-4 KO mice whose
phenotype is revealing extremely
interesting information on the role of this
protein in vivo.
On the other hand, p62 is a scaffold
protein that serves to organize the aPKCs
signaling complex in the NF- B pathway.
The recent generation, in our laboratory,
of the p62 KO will help to understand how
the aPKC/p62 complexes participate in
the control of specific signaling events in
in vivo models of human diseases.
Publicaciones/Publications:
Diaz-Meco, M.T., Moscat, J. (2001) MEK5, a New Target
of the Atypical PKCs in Mitogenic Signalling. Mol. Cell.
Biol. 21, 1218-1227
Moscat, J., Sanz, L., Sanchez, P., Diaz-Meco, M.T., (2001)
Regulation and role of the atypical PKC isoforms in cell
survival during tumor transformation. Adv. Enzyme Regul.
41, 99-120
Wooten, M., Seibenhener, M.L., Mamidapudi, V., Diaz-
Meco, M.T., Moscat, J. (2001) The Atypical PKC-
Interacting Protein p62 is a Scaffold for NF-B Activation
by Nerve Growth Factor. J. Biol. Chem. 276, 7709-7712
Wooten, M.W., Vandenplas, M.L., Seibenhener, M.L.,
Geetha, T., Díaz-Meco, M.T. (2001) Nerve Growth factor
Stimulates multisite tgrosine phosphorglation and
activation of the atgpical Protein kinase C’s via a SRC
kinase pahtwag. Mol. Cell. Biol. 21, 8414-8427
Leitges, M., Sanz, L., Martin, P., Duran, A., Braum, U.,
Garcia, J.F., Camacho, F., Diaz-Meco, M.T., Rennert,
P.D., Moscat, J. (2001) Targeted disruption of the PKC
gene results in the impairment of the NF-B pathway.
Mol.Cell. 8, 771-780
Ponting, C.P., Ito, T., Moscat, J., Diaz-Meco, M.T., Inagaki,
F., Suminoto, H. (2002) OPR, PC and AID: all in the PB1
family. TIBS 27, 10
Moscat, J., Diaz-Meco, M.T. (2002) Specificity in atypical
Protein kinase C signaling: the NF-B paradigm. In Protein
Kinase C, 2nd
Edition. Lodewijk Dekker ed. (eirekah.com)
Martin, P., Duran, A., Minguet, S., Gaspar, M.L., Diaz-
Meco, M.T., Rennert, P., Leitges, M., Moscat, J. (2002)
Role of PKC in B-cell signaling and function. EMBO J.
21, 4049-4057
Avila, A., Silverman, N., Diaz-Meco, M.T., Moscat, J.
(2002) The Drosophila atypical PKC-Ref(2)P complex
constitutes a conserved module for signalling in the Toll
Pathway. Mol. Cell. Biol. 22, 8787-8795
Premios / Awards / Other Activities
J. Moscat. Premio de la Fundación Carmen y Severo
Ochoa
J. Moscat. II Ayuda de la Fundación Juan March a la
Investigación Básica
J. Moscat. Co-organizador Workshop de la Fundación
Juan March “Control of NF- B Signal Transduction in
Inflammation and Innate Immunity” (7-9 Octubre, 2002)
Photomicrographs of representative hematoxilin-eosin stainings of Peyer’s patches (upper panels)
and spleen (lower panels) of 2-weeks old PKC KO and wild type mice. The structural features of
individual Peyer’s patches were altered in the KO mice, showing a reduction in the number and size
of follicles. The overall structure of the spleens from the PKC-deficient mice was preserved but a
defect in the marginal zone was detected together with smaller B cell follicles in the white pulp.
35
Resumen de Investigación
El principal interés de nuestro grupo consiste
en entender los mecanismos moleculares
que regulan el secuestro intracelular de
proteínas de membrana en las proximidades
del aparato de Golgi y su translocación a
la membrana plasmática en respuesta a
estímulos que demandan su funcionamiento
en ésta.
Trabajamos con el transportador de glucosa
sensible a insulina, GLUT4, y los
transportadores de cobre, ATP7A y ATP7B,
centrándose nuestros estudios en la
caracterización morfológica y molecular de
los compartimentos de la red trans del Golgi
en donde son almacenados y desde donde
son transportados a la membrana
plasmática.
Doscientos millones de personas padecen
diabetes de tipo II, enfermedad en la que
la función transportadora de GLUT4 está
impedida, y doscientas cincuenta mil sufren
las graves toxicosis provocadas por la
disfunción de ATP7A y ATP7B.
Perseguimos identificar los sensores que
responden a insulina y cobre activando la
translocación de GLUT4 y de ATP7A y
ATP7B, respectivamente, así como
caracterizar las correspondientes
maquinarias de retención y transporte que
operan sobre ellos.
Jefe de Línea / Group Leader:
Ignacio V. Sandoval
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
Diego Pulido, Vassiliki Lalioti
Postdoctoral / Postdoctoral Fellow:
Beatriz Barrios
Becarios Predoctorales / Graduate
Students:
Silvia Vergarajauregui
Sonia Hernández
Sharmila Chatopadhyay
Eduardo Silles
Tráfico regulado de proteínas de membranaB.6Biología Celular
Cell Biology
36
Regulated membrane protein trafficking
Research Summary
The aim of our research is to advance
the knowledge of the Golgi-based
mechanisms that operate in the
intracellular sequestering and
translocation to the plama membrane of
proteins that modify its functioning in a
regulated fashion.
Subjects of our studies are: the insulin
regulated glucose transporter, GLUT4,
and the copper transporters, ATP7A and
ATP7B.
We seek to identify the sensors that
respond to increases in the levels of insulin
and copper by promoting their
translocation to the cell surface, as well
as to characterize the machineries of
retention and transport that act upon them.
Two hundred million people suffer type II
diabetes, a disease produced by the
peripheral resistance to insulin and the
ill-functioning GLUT4. The often lethal
toxicosis produced by the dysfunction of
ATP7A and ATP7B are suffered by two
hundred and fifty thousand people.
Significant contributions of our studies to
the understanding of the cellular trafficking
of GLUT4 were the characterization of
four distinct signals of transport: one,
RXXXLL490 implicated in its transport from
the Golgi cisternae to its storage
compartment (GSC); two, Y502 y
PDEND509, involved in its retention and
release from the GSC; and, a forth one,
FQQI8 , which operates in its recycling
from endosomes to the GSC, upon the
fall in the insulin levels. More recently we
have characterized the physical
interaction between Daxx and JNK1 with
the N and C-cytoplasmic domains of
GLUT4, and cloned using the yeast two
hybrid system and the thirty terminal
amino acids of GLUT4 as bait, KIS, a
new membrane protein lodged in the Golgi
that appears to have the capacity to signal
both intra and extracellularly.
Publicaciones/Publications:
Palacios, S. Lalioti, V., Martínez-Arca, S., Chattopadhyay,
S., Sandoval, I.V. (2001) Recycling of the insulin-sensitive
glucose transporter GLUT4. Access of surface internalised
GLUT4 molecules to the perinuclear storage compartment
is mediated by the Phe5-Gln7-Ile8 motif. J. Biol. Chem.
276, 3371-3383
Leber, R., Silles, E., Sandoval, I.V., Mazon, M.J. (2001)
Yol082p, a novel CVT protein involved in the selective
targeting of aminopeptidase I to the yeast vacuole. J.
Biol. Chem. 276, 29210-29217
Holman, G.H., Sandoval, I.V. (2001) Moving the insulin-
regulated glucose transporter GLUT4 into and out of
storage. Trends in Cell Biology 11, 173-179
Lalioti, V., Vergarajauregui, S., Sandoval, I.V. (2001)
Targeting motifs in GLUT4. Mol. Membrane Biol. 18, 257-
264
Lalioti, V., Vergarajauregui, S., Sandoval, I.V. (2002) The
insulin-sensitive glucose transporter GLUT4, interacts
physically with Daxx: two proteins with capacity to bind
Ubc9 and conjugated to SUMO1. J. Biol. Chem. 18, 257-
264
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Eduardo Martínez Díaz. 2002. “Transport of pAPI from
the cytoplasm to the vacuole of yeast”. Universidad de
la Habana, Cuba.
37
Resumen de Investigación
La utilidad de los vectores retrovirales en
la terapia génica radica en la estabilidad
del gen terapéutico transducido, inserto en
el genoma celular mediante el proceso de
integración proviral. No obstante, y como
ha quedado en evidencia recientemente,
los éxitos de esta técnica pueden quedar
ensombrecidos por la aparición de efectos
secundarios debidos a integraciones
inadecuadas de los vectores.
En el caso de la terapia génica sustitutiva
la integración no es, sin embargo, necesaria,
ya que el efecto perseguido no es la
expresión del gen transducido, sino la
reparación de un gen endógeno mediante
su recombinación homóloga con una
secuencia del DNA transducido. Con el fin
de adaptar los vectores retrovirales a la
terapia génica sustitutiva, hemos introducido
dos modificaciones en el sistema.
La primera consistió en abolir su capacidad
integrativa, bien delecionando secuencias
del provirus necesarias para su
reconocimiento y procesamiento por la
integrasa, o bien utilizando un sistema
empaquetador desprovisto de integrasa
funcional.
Con los vectores así obtenidos hemos
logrado corregir, en un modelo celular, un
gen testigo a niveles compatibles con su
uso clínico. La segunda modificación
consistió en la adición, en el esqueleto del
vector retroviral, de dos elementos que
permitiesen su establecimiento como
episoma replicativo extracromosómico: el
origen de replicación del virus SV40 y la
región de unión a la matriz nuclear (región
MAR) del gen del interferón humano.
Hemos confirmado que estos elementos
contribuyen al mantenimiento
extracromosómico del DNA proviral en las
células transducidas, ya que el gen selector
transducido no aparecía en el DNA de alto
peso molecular, pudiendo, en cambio, ser
rescatado de la fracción extracromosómica.
Hemos observado, sin embargo,
reorganizaciones inesperadas en los DNAs
transducidos que, aunque en principio no
deberían interferir con el proceso de
reparación génica, consideramos
conveniente minimizar o abolir, para lo cual
hemos abordado su caracterización.
Personal Científico / Scientific Staff:
Antonio Talavera Díaz
e-mail: [email protected]
Becarios Predoctorales / Graduate
Students:
Humberto Sánchez González
Laura Fuentes Sánchez
Leticia Alda Herrán Villalaín
Terapia génica experimentalB.7Biología Celular
Cell Biology
Modelo celular de reparación génica. El gen tk contiene una mutación de
cambio de fase, y está unido en fase con el gen egfp. El conjunto es
seleccionable con higromicina, ya que el gen de resistencia a dicho antibiótico
esta separado del gen de fusión por una secuencia de entrada ribosomica
interna (IRES). La reparación del gen de fusión recupera tanto la actividad
timidina kinasa como la sintesis de proteina verde fluorescente. Las celulas
curadas pueden ser seleccionadas tanto por fluorometria como por su
resistencia en medio HAT.
38
Experimental gene therapy
Research Summary
The usefulness of retroviral vectors in
gene therapy is related to the stability of
the transduced therapeutic gene, that
remains linked to the cell genome by
virtue of the process of proviral
integration.
However, as evidenced by recent reports,
the success of gene therapy may be
obscured by unwanted results caused by
inadequate integration of the vectors used.
Nevertheless, substitutive gene therapy
does not require integration as, in this
instance, the action sought for is the rapair
of a defective endogenous gene by
homologous recombination between this
and a sequence in the transduced DNA,
rather than the expression of the incoming
gene. In order to adapt retroviral vectors
to substitutive gene therapy, we have
introduced two modifications in the vector
system.
First, we abolished integration by deleting
proviral sequences recognised, bound,
and processed by the integrase or,
alternatively, by using a packaging system
devoid of the enzyme.
The modified vectors have allowed us to
repair, in a model system, a reporter gene
at levels compatible with their clinical use.
The second modification was the addition,
in the retroviral backbone, of two elements
that lead to its establishment as a
replicative episome: the SV40 replication
origin and a matrix attachment region
(MAR) of the human interferon gene.
We have proved that these elements
contribute to the extrachromosomal
permanence of the proviral DNA in the
transduced cell, as in most instances the
transduced reporter gene was absent
from the high molecular weight DNA
fraction, being readily rescued from the
extrachromosomal fraction.
We have observed, however, unexpected
rearrangements in the transduced DNAs
which, although should not, in principle,
interfere with the process of gene repair,
their origin and mechanism of formation
should be characterised, in order to
minimise or altogether prevent their
occurrence.
Publicaciones/Publications:
Fuentes, L., Sánchez, H (2001) Comentario "La
importación al núcleo del genoma del VIH-1 está mediada
por una solapa central del DNA" al artículo homónimo
de V. Zennou y col. [Cell 101, 173-185].
Virología 8, 37-38
Fuentes, L. (2001) Comentario "La transducción estable
de células proliferativas puede ser mediada por un nuevo
vector adenoepisomal" al artículo homónimo de H. Lebois
y col. [Mol. Ther. 1, 314-321] Virología 8, 73-74
Talavera, A., Sánchez, H. (2001) El virus del SIDA:
un retrovirus patógeno como agente terapéutico.
Biopress, nº 1.
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Laura Fuentes Sánchez. 2001. "Nuevas adaptaciones
de vectores retrovirales para terapia génica". Universidad
Autónoma de Madrid.
Humberto Sánchez González. 2001. “Modelos celulares
para el estudio de la sustitución génica mediada por
vectores retrovirales defectivos en integración".
Universidad Autónoma de Madrid.
Esquema de las
interacciones de las
secuencias MAR con la
matriz nuclear. Los lazos de
DNA constituyen dominios
del genoma
transcripcionalmente
independientes.
39
Resumen de Investigación
Nuestro grupo está actualmente estudiando
la regulación del promotor del gen APOE
en el contexto de la patogénesis de la
Enfermedad de Alzheimer (EA). Hemos
buscado nuevos factores que regulen la
actividad del promotor mediante técnicas
de espectrometría de masas y Proteómica.
Estos factores podrían generar nuevas
pistas para entender los mecanismos de la
EA y para identificar nuevas dianas
terapéuticas. Hemos demostrado que el
oncogen DEK modula el efecto de AP-2,
un activador del promotor específico de
cerebro. También hemos encontrado que
la proteína hnRNPA1 modula
específicamente la actividad de la forma
–219T del promotor de APOE. Nuestros
resultados demuestran que hnRNPA1 juega
un papel fisiológico en la actividad diferencial
de las dos isoformas –219 del promotor, y
permiten proponer un mecanismo molecular
para explicar la asociación existente entre
la isoforma –219T y el aumento en el riesgo
de desarrollar la enfermedad.
Nuestro laboratorio también está trabajando
en el emergente campo de la Proteómica.
Esta tecnología se basa principalmente en
técnicas de espectrometría de masas y de
bioinformática, que todavía no se han
desarrollado plenamente. Estamos por ello
concentrando nuestros esfuerzos en la
implementación y desarrollo de estas
nuevas técnicas. Estamos trabajando en
métodos para la caracterización de
modificaciones posttraduccionales y la
identificación de factores de relevancia
fisiológica mediante purificación por afinidad
en tándem (“TAP”). La mayoría de estos
desarrollos han sido aplicados con éxito en
varios trabajos biomédicos y
biotecnológicos.
Una de las técnicas emergentes más
prometedoras (“shotgun Proteomics”) se
basa en el análisis a gran escala de las
complejas mezclas de péptidos generadas
a partir de proteomas no sometidos a
separación previa. Las herramientas
bioinformáticas actuales sólo permiten
descifrar de forma parcial la enorme
cantidad de información sobre
fragmentación de péptidos que se genera
mediante estas técnicas. Estamos
trabajando en un nuevo algoritmo
desarrollado en nuestro laboratorio
(comercializado por Thermo Finnigan bajo
el nombre de “DeNovoX”), para la
secuenciación automática de péptidos.
Estamos probando y tratando de mejorar
las prestaciones de este algoritmo para
mejorar la fiabilidad de la identificación de
péptidos a gran escala, y para el análisis
automático de mutaciones, modificaciones
posttraduccionales, y proteomas de
especies poco representadas en las bases
de datos.
Jefe de Línea / Group Leader:
Jesús Vázquez
e-mail: [email protected]
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
José Ramón Lamas
Miguel Angel García
Mónica Campillos
Benito Cañas
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Daniel López
Técnico de Investigación /
Technical Assistance:
Alberto Monteagudo
Científicos Visitantes /
Visiting Scientists:
Fernando Martín
(ThermoFinnigan, CA, USA)
Carmen Piñeiro
(Instituto Investigaciones Marinas Vigo)
Silvia Lorenzo
(Universidad de Santiago Compostela)
Química de proteínas y proteómicaB.8Biología Celular
Cell Biology
Caracterización de sitios de fosforilación mediante espectrometría de
masas en tándem de trampa iónica.
Characterization of phosphorylation sites by ion trap tandem mass
spectrometry.
40
Protein chemistry and proteomics
Research Summary
Our group is currently studying the
regulation of APOE gene promoter in the
context of the pathogenesis of Alzheimer’s
Disease (AD). Using mass spectrometry
and Proteomics, we have searched for
novel factors which regulate promoter
activity. These factors may provide new
clues to understand the mechanisms
underlying AD, as well as for the
identification of novel therapeutic targets.
We have demonstrated that the oncogene
DEK modulates the effect of AP-2, a brain-
specific activator of the promoter. We have
also found that the protein hnRNPA1
specifically modulates the activity of –219T
isoform of APOE promoter. Our results
demonstrate that hnRNPA1 plays a
physiological role in the differential activity
of the two –219 APOE promoter isoforms,
and provide a molecular mechanism to
explain the association of the –219T form
with an increased risk for AD.
Our laboratory is also working in the
emerging field of Proteomics. This
technology relies mainly in mass
spectrometry and bioinformatic
approaches, which are not fully developed
yet. We are therefore concentrating our
efforts in the implementation and
development of novel techniques. We are
working in methods for characterization
of postranslational modifications and
identification of interacting factors of
physiological relevance by tandem affinity
purification (TAP). Most of these
approaches have been successfully
applied in several works in the fields of
biomedicine and biotechnology.
One of the most promising techniques is
the so-called “shotgun Proteomics”, which
is based in the large-scale analysis of the
peptide pools generated from unseparated
proteomes. The vast amounts of peptide-
fragmentation information generated by
these approaches are only partially
deciphered by current bioinformatic tools.
We are working with a novel algorithm
developed in our laboratory (marketed by
Thermo Finnigan under the name of
“DeNovoX”) for automated “de novo”
sequencing of peptides. We are testing
and improving the performance of this
algorithm for increasing the confidence
of large-scale peptide identification, and
for the automated analysis of mutations,
postranslational modifications and
proteomes from species poorly
represented in databases.
Publicaciones/Publications:
Piñeiro, C., Vázquez, J., Marina, A., Barros-Velázquez, J.,Gallardo, J.M. (2001) Characterization and partial sequencingof species-specific sarcoplasmic polypeptides fromcommercial hake species by mass spectrometry followingtwo dimensional electrophoresis. Electrophoresis 22, 1545-1552
López, J.L., Mosquera, E., Fuentes, J., Marina, A., Vázquez,J., Alvarez, G. (2001) Two-dimensional gel electrophoresisof Mytilus galloprovincialis. Differences in protein expressionbetween intertidal and cultured mussels. Marine EcologyProgress Series 224, 149-156
Yagüe, J., Marina, A., Vázquez, J., López de Castro, J.A.(2001) Major histocompability complex class I moleculesbind natural peptide ligands lacking the amino-terminalbinding residue in vivo. J.Biol.Chem. 276, 43699-43707
Alvarez, I., Martí, M., Vázquez, J., Camafeita, E., Ogueta,S., López de Castro, J.A. (2001) The Cys67 residue of HLA-B27 influences cell surface stability, peptide specificity andT-cell antigen presentation. J. Biol. Chem. 276, 48740-48747
Pérez Martín, C., Vázquez, J. Avila, J., Moreno, F.J. (2002)P24, a glycogen synthase kinase 3 (GSK 3) inhibitor. Biochim.Biophys. Acta 1586, 113-122
Pineda-Molina, E., Klatt, P., Vázquez, J., Marina, A., Garcíade Lacoba, M., Pérez-Sala, D., Lamas, S. (2002)Glutathionylation of the p50 subunit of NF-B: a mechanismfor redox-induced inhibition of DNA-binding. Biochemistry40, 14134-14142
Sesma, L., Montserrat, V., Lamas, J.R., Marina, A., Vázquez,J., López de Castro, J.A. (2002) The peptide repertoires ofHLA-B27 subtypes differentially associated tospondyloarthropathy (B*2704 and B*2706) differ by specificchanges at three anchor positions. J. Biol. Chem. 277,16744-16749
López, J.L., Marina, A., Vázquez, J. and Alvarez, J. (2002)A proteomic approach to the study of the marine mussels,Mytilus edulis and Mytilus galloprovincialis Marine Biology141, 217-223
García, M.A., Koonrugsa, N., Toda, T. (2002) Spindle-kinetochore attachment requires the combined action of KinI-like Klp5/6 and Alp14/Dis1-MAPs in fission yeast. EMBOJ. 21, 6015-6024
Montes, C., Zuñiga, E.I., Vázquez, J., Arce, C., Gruppi, A.(2002) Trypanosoma cruzi mitochondrial malatedehydrogenase triggers polyclonal B-cell activation. Clin.Exp. Immunol. 127, 27-36
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Urzainqui, A., Serrador, J.M., Viedma, F., Yáñez-Mó, M.,Corbí, A.L., Alonso-Lebrero, J.L., Luque, A., Vázquez, J.,Sánchez-Madrid, F. (2002) ITAM-based interaction of ERMproteins with Syk mediates signaling by the leukocyteadhesion receptor PSGL-1. Immunity 17, 401-412
Rey, M., Vicente-Manzanares, M., Viedma, F., Yáñez-Mó,M., Urzainqui, A., Barreiro, O., Vázquez, J., Sánchez-Madrid,F. (2002) Association of the Motor Protein Nonmuscle MyosinHeavy Chain-IIA with the C-terminus of the chemokine receptorCXCR4 in T Lymphocytes. J. Immunol. 169, 5410-5414
Esquema de la identificación de péptidos a gran escala mediante los motores actuales de búsqueda
en las bases de datos (Sequest), o mediante interpretación automática de secuencia utilizando el
programa DeNovoX. Este último permite la identificación de mutaciones y de modificaciones
posttraduccionales.
Scheme of large-scale peptide identification using current database searching engines (Sequest), or
by automated sequence intepretation using DeNovoX software. The latter allows the identification of
mutations and posttranslational modifications.
41
Microscopía electrónica del VPPA. (A) Viriones maduros intracelulares. (B) Cápsidas vacías
generadas en células infectadas con el virus recombinante v220i inducible en la poliproteína
pp220, en condiciones restrictivas. c, cápsida; ie, envuelta interna; cs, dominio intermedio; n,
nucleoide.
Electron microscopy of ASFV. (A) Intracellular mature virions. (B) Empty capsids generated in cells
infected with the recombinant virus v220i inducible in polyprotein pp220, under restrictive conditions.
c, capsid; ie, inner envelope; cs, core shell; n, nucleoid.
42
CInmunologíay Virología
Immunologyand Virology
C.3 Bases moleculares de la citopatologia viralC.3 Molecular bases of viral cytopathology
Luis Carrasco
C.2 Bases moleculares de la patogenia y delpotencial anti-tumoral de los parvovirus
C.2 Molecular bases of parvovirus pathogenesisand anti-tumour potential
José M.Almendral
C.4 Variabilidad genética de virus RNAC.4 Genetic variability of RNA viruses
Esteban Domingo
C.5 Activación del sistema inmuneC.5 Activation of the immune system
Manuel Fresno
C.6 Estabilidad e ingeniería de proteínas víricasC.6 Stability and engineering of viral proteins
MauricioGarcía Mateu
C.7 Replicación del DNA y ciclo celularC.7 Dna replication and cell cycle
CrisantoGutierrez
C.1 Transmisión de señales a través delreceptor para el antígeno de células T
C.1 Signal transduction through the T cellantigen receptor
Balbino Alarcón
José A.López de Castro
C.8 Inmunología de los antígenos dehistocompatibilidad
C.8 Immunology of histocompatibility antigens
C.10 Regulación de la expresión génica enendotelio vascular
C.10 Regulation of gene expression in vascularendothelium
Juan MiguelRedondo
C.11 Desarrollo del sistemalinfohematopoiético embrionario
C.11 Embryonic development of thelymphohematopoietic system
Miguel AngelRodríguez Marcos
C.15 Replicación y transcripción del dna delbacteriófago ø29
C.15 Replication and transcription ofbacteriophage ø29
Margarita Salas
C.12 Virus de la peste porcina africanaC.12 African swine fever virus
María Luisa Salas
C.9 Enzimas retrovirales: análisis estructural yfuncional de la retrotranscriptasa del virusde la inmunodeficiencia humana
C.9 Retroviral enzymes: structural and functionalanalysis of human immunodeficiency virusreverse transcriptase
Luis MenéndezArias
C.13 Desarrollo de nuevas estrategias para elcontrol y prevención de enfermedadesvirales: el virus de la fiebre aftosa comomodeloFrancisco Sobrino
C.13 Development of new strategies to controland prevent viral diseases: the foot-and-mouth virus as a model
C.14 Desarrollo del sistemalinfohematopoyético humano
C.14 Development of the humanlymphohematopoietic system
María LuisaToribio
Resumen de Investigación
El receptor para el antígeno de los linfocitos
T (TCR) está compuesto de 6 subunidades:
TCR , TCR , CD3 , CD3 , CD3 y CD3 .
Mientras que las dos primeras son
responsables del reconocimiento del
antígeno, las demás están encargadas de
la transmisión de señales al interior celular.
El TCR no actúa como un simple interruptor
sino que es capaz de dar distintas
respuestas dependiendo de ligeras
modificaciones en el antígeno. En nuestro
laboratorio, estamos dedicados al estudio
de los mecanismos que regulan la formación
de este complejo multiproteíco y de cómo
se transmiten las señales de activación al
interior de la célula. En líneas generales,
los objetivos de nuestra línea de
investigación son los siguientes:
- Dilucidar la estequiometría del TCR.
- Estudiar los mecanismos de ensamblaje
y retención intracelular.
- Discernir entre los papeles específicos y
redundantes de cada una de las
subunidades del TCR.
Es en este último objetivo dónde hemos
realizado una contribución más significativa
en el pasado bienio. Hicimos una búsqueda
de ligandos intracelulares de CD3 por un
método de dos híbridos con el fin de
encontrar efectores distintos a los reclutados
por tirosinas fosforiladas, ya conocidos. Uno
de los ligandos encontrados fue Nck, un
adaptador implicado en la reorganización
del citoesqueleto de actina. Descubrimos
que la interacción Nck-CD3 es importante
para la polimerización de actina inducida
por el TCR y así, un mutante dominante-
negativo de Nck la bloquea (figura 1). Pero
lo que es más importante, Nck es reclutado
al TCR de forma inducible en lo que
constituye una prueba de que en este
receptor se produce un cambio
conformacional como mecanismo de
señalización. En el momento presente segui-
mos investigando sobre el mecanismo de
regulación de la interacción TCR-Nck y en
la caracterización de nuevos ligandos de
CD3 y de las demás subunidades.
Jefe de Línea / Group Leader:
Balbino Alarcón
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
Edgar Fernández
Ester San José
Postdoctoral / Postdoctoral Fellow:
Wolfgang Schamel
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Diana Gil
Pilar Delgado
Alicia Monjas
Irene Zaldívar
Manuel Pulgar
Ruth M Risueño
Personal Técnico /
Technical Assistance:
Maite Gómez
Toñi Cerrato
Transmisión de señales a través del receptor para elantígeno de células T
C.1Inmunología y Virología
Immunology and Virology
Inducción de "spreading" en linfocitos T transfectados con una
construcción dominante negativa para Nck (DN-Nck) o con el vector
vacío (control) y estimulados sobre cubreobjetos recubiertos de
anti-CD3. Las células están teñidas con Texas Red-faloidina que
permite la visualización de F-actina.
44
Gil, D, Gutiérrez, D., Alarcón, B. (2001) Intracellular
redistribution of nucleolin upon interaction with the CD3
chain of the T cell receptor complex. J. Biol. Chem. 276,
11174-11179
Borroto, A., San José, E., Monjas, A., Roumier, A.,
Gutiérrez, D., Martí, M., Terhorst, C., Alcover, A., Alarcón,
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Teixeiro, E., Fuentes, P., Galocha, B., Alarcón, B.,
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transduction controlled by the beta chain transmembrane
domain: apoptosis-deficient cells display unbalanced
mitogen-activated protein kinases activities upon T cell
receptor engagement. J. Biol. Chem. 277, 3993-4002
Sancho D., Montoya M.C., Monjas A., Gordon-Alonso
M., Katagiri T., Gil D., Tejedor R., Alarcon B. Sanchez-
Madrid F.(2002) TCR Engagement Induces Proline-Rich
Tyrosine Kinase-2 (Pyk2) Translocation to the T Cell-
APC Interface Independently of Pyk2 Activity and in an
Immunoreceptor Tyrosine-Based Activation Motif-
Mediated Fashion. J. Immunol. 169, 292-300
Gil, D., Schamel, W., Montoya, M., Sánchez-Madrid, F.,
Alarcón, B. (2002) Recruitment of Nck by CD3 reveals
a ligand-induced conformational change essential for T
cell receptor signaling and synapse formation. Cell 109,
901-912
Premios / Awards
Balbino Alarcón fue galardonado con el IX Premio
Carmen y Severo Ochoa en 2002. Balbino Alarcón was
awarded with the IX Carmen and Severo Ochoa Prize
in 2002.
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Diana Gil Pagés. 2002. "Caracterización de ligandos
citoplásmicos para la cadena CD3 del TCR implicados
en la activación de linfocitos T". Universidad Autónoma
de Madrid.
Signal transduction through the T cellantigen receptor
Publicaciones/Publications:
Research summary
The T cell antigen receptor (TCR) is
composed of 6 subunits: TCR , TCR ,
CD3 , CD3 , CD3 and CD3 . While the
first two subunits are responsible for
antigen recognition, the others are
responsible for signal transduction. The
TCR does not act as a simple switch but
is able to produce different responses
depending on slight modifications of the
antigen. In our laboratory we are dedicated
to the study of the mechanisms that
regulate the formation of this multiproteic
complex as well as the signal transduction
mechanisms. Our general research
objectives are the following:
- To elucidate the stoichiometry of the
TCR.
- To study the mechanisms of assembly
and intracellular retention.
- To investigate the existence of redundant
and specialized roles in signal
transduction for each TCR subunit.
It is in this last objective where we have
made the most significant progress in the
last two-year period. We made a two-
hybrid-based screening for intracellular
ligands of CD3 , aiming to find cytoplasmic
effectors different to the well-characterized
tyrosine phosphorylation-dependent
ligands. One of the new ligands was Nck,
an adapter protein involved in
reorganization of the actin cytoskeleton.
We found that the Nck-CD3 interaction
is important for the TCR-induced actin
polymerization and, thus, a dominant-
negative Nck mutant blocked it (figure 1).
But, more important, Nck is recluted to
the TCR in an inducible manner in what
constitutes a hallmark of an undergoing
conformational change in the TCR as a
signaling mechanism. We are at present
studying the mechanisms that regulate
the TCR-Nck interaction as well as trying
to characterize further ligands of CD3
and other CD3 subunitis.
Induction of cell spreading in T cells transfected with a dominant negative Nck construct (DN-Nck) or with
empty vector (control) and stimulated on anti-CD3-coated coverslips. Cells were stained with Texas Red-
phalloidin to visualize F-actin.
45
Resumen de Investigación
La dependencia de la replicación de los
parvovirus por funciones moduladas por la
proliferación, diferenciación y transformación
celular, confiere a estos virus icosaédricos
de ADN de banda sencilla unas propiedades
biológicas de especial interés. Aspectos
recientes de nuestra investigación con la
especie prototipo del género, el virus
diminuto del ratón (MVM), son los siguientes.
Patogenia y evolución. La cepa MVMi
induce en ratones inmunodeficientes una
leucopenia severa consecuencia de su
capacidad de infectar precursores
hematopoyéticos comprometidos y
primitivos, incluyendo células madre con
potencial de reconstitución hematopoyética
de larga duración. El MVM muestra en su
hospedador natural una alta frecuencia de
mutación sorprendente para un virus ADN,
que permite la selección en un sólo individuo
de variantes virulentos con alteración en la
unión al receptor primario, y la emergencia
de mutantes patogénicos resistentes a
anticuerpos monoclonales en respuesta a
una inmunoterapia pasiva. Los virus
resistentes a la neutralización poseen
cambios puntuales de amino ácidos situados
en la espícula de la cápsida (Figura 1).
Transporte nuclear y morfogénesis. Las
subunidades de proteínas de la cápsida del
MVM forman complejos citoplasmáticos
que se traslocan al núcleo mediante señales
de localización nuclear, localizadas en la
secuencia N-terminal de VP1 y en una
lámina beta de la región común de VP1/VP2.
Mutaciones sencillas en VP1 que alteran el
transporte determinan que estos complejos
formen estructuras anulares subvirales
asociadas a ubiquitina (Figura 2), un
fenómeno que puede participar en la
regulación de la permisividad celular a los
parvovirus. La cápsida de las partículas
virales que maduran en el núcleo está
fosforilada fundamentalmente en tres
serinas del extremo N-terminal de VP2, que
conforman una señal de transporte a través
de la membrana nuclear en células
transformadas.
Oncotropismo. El tropismo del MVM hacia
células de glioblastomas humano lo
encontramos regulado a nivel de la
replicación del genoma, y en funciones
desconocidas requeridas para la transmisión
entre células que mapean en la región de
las proteínas no-estructurales. Estamos
construyendo virus oncotrópicos por
manipulación de estas funciones y de ciertos
dominios expuestos en la superficie de la
cápsida, para conferir a estos virus una
mayor especificidad por receptores de
células transformadas que pudiera permitir
su uso como vectores selectivos en terapias
anti-cáncer.
Jefe de Línea/ Group Leader:
José M. Almendral
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
Juan Carlos Ramírez
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Cristina Sánchez
Alberto López-Bueno
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Noelia Valle
Laura Riolobos
Esther Grueso
Macarena Sierra
Estudiantes /
Undergraduate Students:
Elena Merino
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
Vanesa Sánchez
Silvia Peñate
José M. Cuesta
Bases moleculares de la patogenia y delpotencial anti-tumoral de los parvovirus
C.2Inmunología y Virología
Immunology and Virology
Localización de los cambios de amino ácido en la superficie de la cápsida de MVM (en rojo),
que permiten al virus evadir una terapia con anticuerpos neutralizantes en ratones
inmunodeficientes.
Localization of the amino acid changes on MVM capsid surface in red allowing viral evasion
of a neutralizing antibody therapy in immunodeficient mice.
46
Rubio, M.P., Guerra, S., Almendral, J.M. (2001) Genome
replication and post-encapsidation functions mapping to
the non-structural gene restrict the host range of a murine
parvovirus in human cells. J. Virol. 75, 11573-11582
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The Springer Index of Viruses. A. Tidona, G. Darai (ed.)
Lombardo, E., Ramírez, J.C., García, J., Almendral, J.M.
(2002) Complementary roles of multiple nuclear targeting
signals in the capsid proteins of the parvovirus minute
virus of mice during assembly and onset of infection. J.
Virol. 76, 7049-7059
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Alberto López-Bueno. 2002. “Cambios de aminoácidos
en la superficie de la cápsida del parvovirus MVM
determinan la adaptación, el tropismo y el escape a
anticuerpos neutralizantes, en un hospedador
inmunodeficiente”. Universidad Autónoma de Madrid.
Noelia Valle Benítez. 2002. “Mecanismos de salida
nuclear del parvovirus MVM: fosforilación de la cápsida
por la kinasa Raf-1 en células transformadas humanas”.
Universidad Autónoma de Madrid.
Molecular bases of parvovirus pathogenesisand anti-tumour potential
Publicaciones/Publications:
Research summary
The dependence of parvovirus replication
on functions modulated by proliferation,
differentiation and cellular transformation
confers to these icosahedral single-
stranded DNA viruses some biological
properties of special interest. Recent
issues of our research on the type species
of the genus, the minute virus of mice
(MVM), are the followings.
Pathogenesis and evolution. The MVMi
strain induces in immunodeficient mice a
severe leukopenia as a consequence of
its capacity to infect committed and
primitive hemopoietic precursors, including
stem cells with long-term hemopoietic
reconstitution potential. The MVMi shows
in the natural host a striking high mutant
frequency for a DNA virus, that allows the
selection in a single individual of virulent
variants with alteration in the binding to
the primary receptor, and the emergence
of pathogenic mutants resistant to
monoclonal antibodies in response to a
passive immunotherapy. The neutralization
resistant viruses harbor punctual changes
in amino acids placed at the spike of the
capsid (figure 1).
Nuclear transport and morphogenesis.
The MVM capsid protein subunits form
cytoplasmic complexes that are
translocated to the nucleus by nuclear
localization signals placed at the VP1 N-
terminal sequence and in a beta strand
of the VP1/VP2 common region. Single
mutations disrupting VP1 transport
determine that these complexes form ring-
shaped subviral structures associated to
ubiquitine (Figure 2), a phenomenon that
may participate in the regulation of cell
permissiveness to parvoviruses. The
capsid of the viral particles maturing within
the nucleus is phosphorylated mainly in
three serine residues of VP2 N-terminus,
that conform a signal for the transport of
the virions across the nuclear membrane
of transformed cells.
Oncotropism. The MVM tropism toward
human glioblastoma cells was found to
be regulated at the level of genome
replication, and by unknown functions
required for intercellular spreading
mapping to the non-structural proteins
region. We are constructing oncotropic
viruses by the manipulation of these
functions as well as certain domains
exposed at the capsid surface, to endow
these viruses with a higher specificity for
transformed cells receptors that could
allow their use as selective vectors for
anti-cancer therapies.
Conjugación de ubiquitina con proteínas de la cápsida de MVM. El genoma de MVM mutado en la
región N-terminal de VP1 fue transfectado en células permisivas y analizado por microscopía confocal
con (A) un suero anti-cápsida de MVM, y (B) un anticuerpo monoclonal que reconoce ubiquitina
conjugada.
Ubiquitine conjugation to MVM capsid proteins. MVM genome mutated in the VP1 N-terminal region
was transfected in permissive cells and analyzed by confocal microscopy with a (A) MVM capsid
antiserum and (B) a monoclonal antibody recognizing conjugated ubiquitine.
47
Resumen de Investigación
La infección de células animales por virus
produce toda una serie de alteraciones en
numerosas funciones celulares. A lo largo
de los años se han descrito numerosas
modificaciones tanto morfológicas como
funcionales en las células infectadas por
virus. Nuestra investigación en estos últimos
años se ha enfocado hacia el análisis de
los cambios inducidos por la infección viral
de la maquinaria de traducción de los
mRNAs, poniendo especial atención en el
factor de iniciación eIF4G. Por otro lado,
hemos continuado con el estudio de las
proteínas virales conocidas como
viroporinas, que están implicadas en el
aumento de la permeabilidad de la
membrana plasmática que tiene lugar
después de la replicación del genoma viral.
Modificación del factor de iniciación de
la traducción eIF4G. Existen algunas
especies de virus dentro del grupo de los
picornavirus que contienen una proteasa
capaz de hidrolizar el eIF4G en dos mitades,
inactivando a este factor para la traducción
de mRNAs celulares sintetizados de novo.
Se ha pensado que esta hidrólisis era
específica de estas especies de
picornavirus. Notablemente hemos
encontrado que el virus VIH, responsable
de causar el SIDA en humanos, utiliza un
mecanismo análogo. La proteasa del VIH
es capaz de hidrolizar el eIF4G en dos
posiciones, dividiéndolo en los tres dominios
funcionales descritos para este factor. Esta
hidrólisis inactiva el eIF4G para traducir los
mRNAs celulares, mientras que el RNA
genómico retroviral es capaz de traducirse
en estas condiciones, debido a la presencia
de una estructura tipo IRES. Se está
analizando si esta capacidad para reconocer
e hidrolizar el eIF4G ocurre también con
las proteasas de otras especies de
retrovirus. Estos estudios abren nuevas
perspectivas en el campo de la regulación
de la traducción en células humanas
infectadas por miembros de la familia
retroviridae. La estrategia descrita basada
en la modificación del complejo de iniciación
eIF4F conduce a una expresión genética
del virus más eficaz.
Las viroporinas. Nuestro grupo propuso
hace años la existencia de esta nueva familia
de proteínas virales, capaces de formar
poros en las membranas de las células
infectadas. Estas proteínas son de pequeño
tamaño, muy hidrofóbicas, que oligomerizan
e interaccionan con membranas. La función
principal de las viroporinas, aunque no
única, es la de facilitar la salida de las
partículas virales de las células infectadas,
aumentando la gemación de los virus que
poseen cubiertas lipídicas. En estos dos
últimos años hemos asistido a un
incremento notable en el conocimiento de
este grupo de proteínas por parte de varios
grupos de investigación. Un descubrimiento
de interés ha sido la constatación de la
formación de poros en membranas modelo
por las viroporinas de picornavirus y de
togavirus. Futuros estudios sobre las
viroporinas darán lugar a un mayor
conocimiento de la estructura y función de
esta familia de proteínas virales.
Jefe de Línea / Group Leader:
Luis Carrasco
e-mail: [email protected]
Postdoctoral / Postdoctoral Fellow:
Ivan Ventoso
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Celia Perales
Carlos Calandria
Raquel Blanco
Enrique Alvarez
Susana Molina
Maria Vanesa Madam
Vanesa Rojas
Alfredo Castelló
Marta Ramos
Patricia García.
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
Miguel Angel Sanz
Rebeca Galisteo
Carmen Hermoso
Bases moleculares de la citopatología viralC.3Inmunología y Virología
Immunology and Virology
Dominios y sitios de corte de diversas proteasas sobre el factor de iniciación
de la traducción eIF4G.
Domains and cleavage sites of several virus proteases on the initiation factor
of translation eIF4G.
48
González, M.E., Carrasco, L. (2001) Human
immunodeficiency virus type 1 Vpu protein affects Sindbis
virus glycoprotein processing and enhances membrane
permeabilization. Virology 279, 201-209
Irurzun, A., Carrasco, L (2001) Entry of poliovirus into
cells is blocked by valinomycin and concanamycin A.
Biochemistry 40, 3589-3600
Sanz, M.A., Carrasco, L. (2001) A Sindibis virus variant
with a deletion in the 6K gene shows defects in
glycoprotein processing and trafficking. Lack of
complementation by a wild-type 6K gene in trans. J.Virol.
75, 7778-7784
Ventoso, I., Blanco, R., Perales, C., Carrasco, L. (2001)
HIV-protease cleaves eukaryotic factor 4G and inhibits
cap-dependent translation. Proc. Nat. Acad. Sci. USA
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Robin, V., Irurzun, A., Amoros, M., Boustie, J., Carrasco,
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Antiviral Chemistry and Chemotherapy 12, 283-291
Agirre, A., Barco, A., Carrasco, L., Nieva, J.L. (2002)
Viroporin-mediated membrana permeabilization: pore
formation by non-structural poliovirus 2B protein. J. Biol.
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Carrasco, L., Guinea, R., Irurzun, A., Barco, A. (2002)
Effects of viral replication on cellular membrane
metabolism and function. In: Molecular Biology of
Picornaviruses. B.L. Semler y E. Wimmer (eds.) ASM
Press, Washington pp. 337 354
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Celia Perales Viejo. 2002. "Regulación de la traducción
de los ARNm de gag y env del virus de la
inmunodeficiencia humana”. Universidad Autónoma de
Madrid. Calificación: Apto cum laude.
Carlos Calandria Pérez. “Citotoxicidad de las proteasas
2A y 3C del virus de la polio”. Universidad Autónoma de
Madrid.
Molecular bases of viral cytopathology
Publicaciones/Publications:
Research summary
Viral infection of animal cells provokes a
variety of alterations in several cell
functions. Throughout the years a number
of morphological and biochemical
modifications have been described in
virus infected cells. Our research in the
last few years has focused in the analysis
of the changes of the translational
machinery that takes place after viral
infection, with particular interest in the
initiation factor of translation eIF4G. On
the other hand, we have continued the
study of viral proteins known as viroporins,
that are involved in the enhancement of
plasma membrane permeability that
occurs after virus genome replication.
Modification of the initiation factor of
translation eIF4G. Some species of
picornaviruses encode a protease able
to bisect eIF4G, inactivating this factor to
translate de novo synthesized cellular
mRNAs. It has been thought that this
mechanism only occurred with some
picornavirus species. Notably, we have
found that the HIV, that causes AIDS in
humans, uses an analogous strategy. The
HIV PR has the ability to hydrolyze eIF4G
at two positions, rendering the three
domains described for this factor.
This hydrolysis inactivates eIF4G to
translate cellular mRNAs, while the
genomic retroviral RNA is translated due
to the presence of an IRES structure. The
capability of other retroviral PRs to cleave
eIF4G is being tested. These studies open
new perspectives in the field of the
regulation of translation in human cells
infected by members of the retroviridae
family. The strategy based in the
modification of the eIF4F complex leads
to a more efficient viral gene expression.
The viroporins. Several years ago we
advanced the idea of the existence of this
group of viral proteins, which are able to
form pores at membranes of the infected
cells. These virus- encoded proteins are
of small size, very hydrophobic, that
oligomerize and interact with membranes.
The main function of viroporins, amongst
others, is to facilitate viral exit, increasing
budding in enveloped viruses. In the last
two years we have witnessed a
significative increase in our knowledge
of this group of proteins carried out by
several groups. A notable finding has
been to analyze pore formation by
picornavirus and togavirus viroporins in
model membranes. Future work about
viroporins will add further insights in our
understanding of this protein family.
Representación esquemática
de las estructuras formadas
por las viroporinas en
membranas biológicas.
Schematic representation of
the structures formed by
viroporins in biological
membranes.
49
Resumen de Investigación
El objetivo del grupo es entender la dinámica
de cuasiespecies virales para definir
mecanismos de adaptación de los virus y
diseñar nuevas estrategias para controlar
enfermedades víricas. Empleamos como
modelo el virus de la fiebre aftosa (VFA),
el virus de la coriomeningitis linfocítica del
ratón (VCML), el prototipo de los arenavirus,
y el virus de la inmunodeficiencia humana
tipo-1 (VIH-1).
Los principales resultados han sido: (i)
Caracterización de la memoria molecular
en cuasiespecies víricas. (ii) Medidas de la
frecuencia de extinción de variantes del
VFA al someter el virus bien a acumulación
de mutaciones asociadas a cuellos de
botella poblacionales o a mutagenesis
incrementada mediante análogos de base
mutagénicos, empleados aisladamente o
en combinación con inhibidores antivíricos.
Al someter virus a cuellos de botella
sucesivos se ha documentado un descenso
bifásico de valores de eficacia biológica y
una considerable resistencia del VFA a la
extinción a pesar de una acumulación lineal
de mutaciones. Se ha desarrollado un
modelo teórico que es coherente con los
resultados experimentales obtenidos. En
cambio, mediante mutagenesis
incrementada se obtiene una extinción
eficiente del virus que va acompañada de
aumentos de complejidad de los espectros
de mutantes. La extinción es tanto más
efectiva cuanto menores son la carga viral
y la eficacia biológica del virus. Resultados
sobre extinción de VCML en cultivos
celulares fueron coherentes con los
obtenidos con VFA. (iii) Hemos participado
en un proyecto de colaboración para
seguimiento de cuasiespecies de VIH-1 en
pacientes sometidos a tratamiento
antiretroviral altamente agresivo (HAART).
Estos trabajos se han realizado con el apoyo
del Ministerio de Ciencia y Tecnología, la
Comunidad Autónoma de Madrid, la Unión
Europea y la Fundación FIPSE. El grupo
ha colaborado con varios grupos de
investigación tanto españoles como
extranjeros, cuyas contribuciones se
recogen en la lista de publicaciones.
Jefe de Línea / Group Leader:
Esteban Domingo
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
Cristina Escarmís
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Antero Airaksinen
Eric Baranowski
Claudia González
Antonio Mas
Noemí Sevilla
Eloisa Yuste
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Armando Arias
Juan Francisco García Arriaza
Mónica Herrera
Nicolás Molina
Nonia Pariente
Carmen Martín Ruíz-Jarabo
Saleta Sierra
Estudiantes /
Undergraduate Students:
Yvonne Avalos
Eric Louis Miller
Allyson Norman
Samuel Ojosnegros
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
Jorge Castro
Mercedes Dávila
Gema Gómez-Mariano
Científicos Visitantes / Visiting
Scientists:
Ana Grande
Variabilidad genética de virus RNAC.4Inmunología y Virología
Immunology and Virology
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Saleta Sierra Aragón. 2001. "Caracterización de la respuesta del virus de lafiebre aftosa a mutagénesis química". Universidad Autónoma de Madrid.
Carmen Martín Ruíz-Jarabo. 2002. "Coevolución de antigenicidad y tropismocelular del virus de la fiebre aftosa y descripción de memoria genética en
cuasiespecies víricas". Universidad Autónoma de Madrid.
Otras Actividades / Other Activities
Esteban Domingo, Director del CISA-INIA.Miembro del Consejo Editorial de Virology.
Vocal del Consejo Rector del Instituto Nacional de Investigación y TecnologíaAgraria y Alimentaria (INIA).
Colaborador Honorífico del Departamento de Patología Animal I (Sanidad Animal)de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid.
50
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Genetic variability of RNA viruses
Publicaciones/Publications:
Research summary
The objective of the group is to understand
quasispecies dynamics to define
mechanisms of virus adaptation and to
design new strategies to control viral
disease. As model systems we use foot-
and-mouth disease virus (FMDV),
lymphocytic choriomeningitis virus
(LCMV) and human immunodeficiency
virus type 1 (HIV-1).
The main results have been: (i)
Characterization of quasispecies memory.
(ii) Measurements of frequency of FMDV
extinction associated either with
accumulation of mutations upon serial
bottleneck transfers or to enhanced
mutagenesis by base analogues, used
alone or in combination with antiviral
inhibitors. A bifasic fitness decrease and
a remarkable resistance to extinction have
been observed upon subjecting FMDV to
repeated bottlenecks, despite a linear
accumulation of mutations. A theoretical
model coherent with experimental results
has been developed. In contrast,
enhanced mutagenesis led to efficient
viral extinction, associated with increases
in mutant spectrum complexity. Low viral
load and low fitness favour virus extinction.
Results of extinction of LCMV in cell
culture were in agreement with the results
using FMDV. (iii) We have been involved
in a collaborative project on quasispecies
analyses of HIV-1 samples of patients
undergoing highly active antiretroviral
therapy (HAART).
These studies have been supported by
grants from Ministerio de Ciencia y
Tecnología, Comunidad Autónoma de
Madrid, Unión Europea and Fundación
FIPSE. The group has collaborated with
several Spanish and foreign groups, as
reflected in several joint publications.
51
Resumen de Investigación
La activación del linfocito T induce la
expresión de ciclooxigenasa-2 (COX-2),
implicada en la síntesis de prostaglandinas,
cuya expresión y función en linfocitos T no
habían sido descritas. La inducción de COX-
2 tiene lugar mediante la activación del
factor de transcripción NFAT. Además, COX-
2 juega un papel importante en la activación
del linfocito T, y está inducida por Cot kinasa
y PCK que regula la activación
transcripcional de NF-B via PI3K y de NFAT
(Fig1). COX-2 via NFAT juega también un
papel fundamental en angiogénesis y en
metástasis tumoral.
La infección de linfocitos T por HIV-1 induce
la expresión de iNOS, que sintetiza NO cual
activa NF-B y la replicación viral. Además,
la proteína tat de HIV afecta la activación
del linfocito T, uniéndose a los factores de
transcripción, c-rel y AP-1 impidiendo su
asociación, conduciendo a una inhibición
de la transcripción de IL-2.
El protozoo Trypanosoma cruzi causa de
la enfermedad de Chagas que cursa con
una inmunosupresión en la fase aguda y
autoinmunidad en la fase crónica. Hemos
caracterizado una mucina, AgC10 de T.
cruzi, responsable de la inhibición de la
transcripción de IL-2 en la fase aguda.
Además, hemos descrito la existencia de
2 mecanismos de inmunosupresión en la
fase aguda, uno mediado por AgC10, y otro
por inducción de células inmunosupresoras
mieloides inmaduras Gr1+Mac1+ que
secretan NO que inhibe la activación T.
Estas se inducen también en infeciones por
Candida. Además, hemos demostrado
claramente que la autoinmunidad juega un
papel importante en la patología de la fase
crónica. Hemos identificado un nuevo
autoantígeno, Cha, que presenta reacción
cruzada con 2 proteínas de T. cruzi. Un
epítopo es reconocido por linfocitos T y otro
por linfocitos B. Además, la transferencia
de células T autoreactivas es capaz de
inducir patología similar a la causada por
la infección (Fig2).
Jefe de Línea / Group Leader:
Manuel Fresno
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
Pedro Bonay Miarons
Miguel Angel Iñiguez Peña
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Iñigo Angulo Barturen
Núria Gironès Pujol
Belén San Antonio de Felipe
Elena Gómez Casero
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Pilar Alcaide Alonso
Javier Duque Muñoz
Raquel Grau Simón
Carmen Punzón Galvez
Carmen Mª Sánchez Valdepeñas
Virginia Vila del Sol
Elena Maganto García
Camino Menéndez García de la Infanta
Alicia Hidalgo Estévez
Cristina Cacheiro Llaguno
Henar Cuervo Grajal
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
María Cazorla Plaza
Mª de los Angeles de Chorro y de Villa-
Ceballos
Gema Alcaraz Iglesias
Activación del sistema inmuneC.5Inmunología y Virología
Immunology and Virology
Regulation of NF-kB and NFAT transactivation. Several signals: T cell receptor (TCR)
activation, tumor promoters (TPA), TNF. VEGF, etc, stimulate NF-kB or NFAT nuclear
translocation viaI KK or calcineurin activation respectively. We have found that full
activation of these factors requires the induction of a path way that involves the
Cot/PKCç axis leading to the phosphorylation of the transactivation domains.
Antinflammatory compounds as glucocorticoids and PGJ2 inhibit this path way.
52
González, E., Punzón, C., González, M., Fresno, M.(2001) HIV-1 tat inhibits IL-2 gene transcription throughqualitative and quantitative alterations of the cooperativeRel/AP1 complex bound to the CD28RE/AP1 compositeelement of the IL-2 promoter. J. Immunol. 166, 4560-4569
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Activation of the immune system
Publicaciones/Publications:
Research summary
T cell activation induces cyclooxygenase-
2 (COX-2) expression, involved in
protaglandin synthesis. COX-2 expression
and function had not been previously
described in T cells. Besides, COX-2 plays
a very important role in T cell activation.
COX-2 induction takes place through
activation of NFAT transcription factor
which in turn is activated by Cot kinase
and PCK which also regulates
transcriptional activation of NF-B and TNF
via PI3K (Fig1). COX-2 induction via NFAT
also plays an essential role in
angiogenesis and tumor metastasis.
HIV-1 infection of T lymphocytes induce
iNOS expression which synthesize NO
that activates NF-B and viral replication.
Besides, HIV-1 tat protein alters T cell
activation, being able to bind to c-rel and
AP-1 transcription factors, preventing their
association, leading to IL-2 transcription
inhibition.
The protozoan parasite, Trypanosoma
cruzi, causes Chagas’ disease
characterized by immunosupression in
the acute phase and autoimmunity in the
chronic phase. We have characterized
AgC10, a mucin, responsible for the
inhibition of IL-2 transcription in the acute
phase. Besides, we have identified 2
mechanism of immunosuppression: one
mediated by AgC10 and another that
involves the induction of Gr1+Mac1+
immature myeloid cells that secrete NO
that in turns inhibits T cell activation. Those
cells are also induced in other infections,
as Candida. Besides, we have clearly
demostrated the role of autoimmunity in
the pathology of the chronic phase. Thus,
we have identified a new autoantigen,
named Cha, that has crossreactivity with
2 T. cruzi proteins. One crossreactive
epitope is recognized by T cells and the
other by B cells. Adoptive transfer of T
cells to naive recipients causes a disease
similar to infected mice (Fig2).
Adoptive transfer of purified T cells from chronically
infected mice triggers myocarditis in syngeneic recipient
naive mice. Key: black arrow, subendocardial
lymphocytic cumulus; black star, limited myocarditis
zone; white star, general edema. Scale bar 1/4 25 mm.
Romaris, F., Escalante, M., Lorenzo, S., Bonay, P., Garate,T., Leiro, J., Ubeira, F.M. (2002). Monoclonal antibodiesraised in Btk(xid) mice reveal new antigenic relationshipsand molecular interactions among gp53 and otherTrichinella glycoproteins. Mol. Biochem. Parasitol. 125,173-183.
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Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Belén San Antonio Felipe. 2001. "Papel de la isoformaz de la proteína quinasa C en procesos desupervivencia y activación del linfocito T". UniversidadAutónoma de Madrid.
José Luis Jiménez Fuentes. 2002. "Efecto de lafosfodiesterasa tipo 4 en la activación del sistemainmune y en la replicación del virus de lainmunodeficiencia humana tipo 1": Universidad
Complutense de Madrid.
53
Resumen de Investigación
Nuestra investigación se centra en el estudio
de los determinantes moleculares del
ensamblaje y estabilidad de cápsidas
víricas, utilizando técnicas de ingeniería de
proteínas, y de sus aplicaciones para el
diseño de vacunas y antivirales. Actualmente
llevamos a cabo tres proyectos relacionados,
utilizando como modelos el virus de la fiebre
aftosa (VFA), el virus diminuto del ratón
(MVM) y el virus de la inmunodeficiencia
humana (HIV), en colaboración con diversos
grupos, incluyendo los de J.M. Almendral
(CBMSO), J.L. Neira (CBMC) y M.
Menéndez (IQFR).
1) Disección del papel estructural y
funcional de residuos e interacciones
en las interfases entre subunidades de
una cápsida. Hemos truncado las cadenas
laterales implicadas en todas o la mayoría
de interacciones entre subunidades de las
cápsidas de VFA o MVM, y analizado los
efectos sobre infectividad y/o ensamblaje
y estabilidad. Los resultados (Mateo y col.,
para ser enviado; Reguera y col., en
preparación) han facilitado una estrategia
para intentar la construcción de una cápsida
termoestable de VFA con potencial como
vacuna mejorada.
2) Efecto de inserciones de epítopos
sobre la estabilidad de una cápsida.
Hemos construido cápsidas de MVM que
contienen inserciones peptídicas en los
bucles presumiblemente más tolerantes.
Los resultados (Carreira y col., para ser
enviado) sugieren un papel crítico de incluso
los bucles más expuestos en el ensamblaje
y estabilidad, que deberá tenerse en cuenta
en el diseño de vacunas quiméricas.
3) Disección termodinámica de una
interfase entre subunidades de la
cápsida. Hemos realizado la primera
disección termodinámica de una interfase
proteína-proteína en una cápsida vírica, la
implicada en dimerización de la proteína
de la cápsida (CA) de HIV. Los resultados
(Del Álamo y col., en preparación) han
revelado la contribución energética de cada
residuo y nos ayudan en la construcción
de un inhibidor del ensamblaje de HIV.
Jefe de Línea / Group Leader:
Mauricio García Mateu
e-mail: [email protected]
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Roberto Mateo Fernández
Marta del Álamo Camuñas
Aura Carreira Moreno
Técnico de Investigación /
Technical Assistance:
Juan Reguera Vidaechea
Científicos Visitantes /
Visiting Scientists:
José Luis Neira
(Centro de Biología Molecular y Celular,
Universidad Miguel Hernández)
Estabilidad e ingeniería de proteínas víricasC.6Inmunología y Virología
Immunology and Virology
Estructura de uno de 12 pentámeros en la cápsida de VFA. Se indican los
residuos interfásicos más críticos para la infectividad (violeta) o tolerantes
a mutación a alanina (verde).
Structure of one of 12 pentamers in the FMDV capsid. Interfacial residues
most critical for infectivity (violet) or tolerant to ala mutation (green) are
indicated.
54
Neira, J.L., Mateu, M.G. (2001) Hydrogen exchange of
the tetramerization domain of the human tumour
suppressor p53 probed by denaturants and temperature.
Eur. J. Biochem. 268, 4868-4877
Mateu, M.G. (2002) Equilibrium unfolding of dimeric and
monomeric forms of the C-terminal domain of the HIV-
1 capsid protein. J.Mol. Biol. 318, 519-531
Stability and engineering of viral proteins
Publicaciones/Publications:
Research summary
Research in our group is focused on the
molecular determinants of assembly and
stability of viral capsids using protein
engineering, and on possible applications
for the design of vaccines and antiviral
agents. We are currently undertaking three
related projects using foot-and-mouth
disease virus (FMDV), minute virus of
mice (MVM) and human
immunodeficiency virus (HIV) as models,
in collaboration with several groups
including those of J.M.Almendral
(CBMSO), J.L.Neira (CBMC) and
M.Menéndez (IQFR).
1) Dissection of the structural and
functional role of residues and
interactions at the interfaces between
capsid subunits. We have truncated the
side chains involved in all or most
interactions between subunits in the FMDV
or MVM capsids and assessed their
individual relevance for viral infectivity
and/or capsid assembly and stability. The
results (Mateo et al., to be submitted;
Reguera et al., in preparation) has led us
to a strategy to attempt the engineering
of a thermostable FMDV capsid,
potentially useful in the development of
an improved vaccine.
2) Effect on capsid stability of epitope
insertions. We have engineered MVM
capsids with peptide insertions at the
presumably most tolerant surface loops.
The results (Carreira et al., to be
submitted) suggest a critical role of even
the most exposed loops on assembly and
stability, and the need to compensate for
such effects in the design of chimeric
vaccines.
3) Thermodynamic dissection of an
interface between capsid subunits.
We have carried out the first
thermodynamic dissection of a protein-
protein interface involved in assembly of
a viral capsid. Analyses of the dimerization
interface of the capsid protein (CA) of HIV
(Del Álamo et al., in preparation) revealed
the energetic contribution of each residue
to CA stability and dimerization and are
of help in the engineering of a modified
CA domain with strong inhibitory activity
on HIV assembly.
Estructura del dominio C-terminal de la proteína CA de HIV. Los residuos en la interfase de dimerización
se indican en colores de acuerdo a su contribución energética a la asociación, de mayor a menor: rojo,
naranja, amarillo, verde. Los residuos en violeta dificultan la dimerización.
Structure of the C-terminal domain of protein CA from HIV. Residues at the dimerization interface are
indicated in colours according to their energetic contribution to association, from highest to lowest.
Residues in violet actuallly impair dimerization.
55
Resumen de Investigación
La salida y entrada del ciclo celular junto
con la duplicación del material genético y
su coordinación con el ciclo celular son
procesos cruciales para la proliferación
celular y con implicaciones en diferenciación
celular y desarrollo. La estrategia general
de control de las transiciones del ciclo celular
parece estar mecanísticamente conservada
en eucariontes. Sin embargo, existen
diferencias fundamentales en los elementos
reguladores, en especial en organismos
multicelulares. En plantas, que poseen
características únicas de crecimiento y
desarrollo, un balance correcto entre división
celular, diferenciación y desarrollo es
fundamental, ya que la organogénesis es
un proceso post-embrionario.
La reactivación de la división celular
(transición G0/G1) y la iniciación del período
S (transición G1/S) son puntos de control
críticos que integran señales intra- y
extracelulares. Nuestro grupo está
estudiando dos de las principales rutas de
control a este nivel: la de retinoblastoma
(RBR)/E2F/DP y las fases iniciales de la
replicación del DNA (Fig. 1), que transducen
señales hormonales y ambientales a través
del ciclo celular para producir una variedad
de patrones de crecimiento y desarrollo
(Fig. 2). Trabajamos con la planta modelo
Arabidopsis thaliana que nos permite
realizar abordajes de tipo bioquímico,
molecular, celular, genético y de genómica
funcional, y con los geminivirus.
Recientemente hemos identificado los
complejos CDK/ciclina responsables de la
fosforilación de RBR en G1/S, estudiado la
regulación de los factores E2F a nivel
transcripcional y post-traduccional por el
proteasoma, identificado una serie de genes
regulados por E2F, dilucidado el mecanismo
de reclutamiento del complejo RFC al origen
de replicación de geminivirus por la proteína
de iniciación Rep, y analizado el papel de
proteínas de los complejos pre-replicativos
(CDC6 y ORC) en endoreplicación y durante
el desarrollo.
Uno de nuestros mayores retos futuros es
entender cómo la regulación de la
proliferación celular se integra con los
procesos de diferenciación celular,
crecimiento y desarrollo así como cuál es
el papel de la ruta de retinoblastoma/E2F/DP
en diferenciación y en la biología de las
células progenitoras (stem cells).
Jefe de Línea / Group Leader:
Crisanto Gutierrez
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
Juan Carlos del Pozo Benito
Postdoctoral / Postdoctoral Fellow:
M. Beatrice Boniotti
María del Mar Castellano Moreno
Bénédicte Desvoyes
Corinne Fründt
María de los Angeles López-Matas
Elena Ramírez-Parra
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
María del Mar Castellano Moreno
Sara Díaz Triviño
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
Sergio Llorens Berzosa
Nerea Cisneros González
Científicos Visitantes /
Visiting Scientists:
Manuela Nájera
(UNAM, Mexico)
Analilia Arroyo
(IB, Cuernavaca, México)
Leyre Agreda
(Universidad de Navarra)
Replicación del DNA y ciclo celularC.7Inmunología y Virología
Immunology and Virology
Expresión del gen CDC6 en células proliferantes del meristemo radicular (A; flecha) y endoreplicantes (B; tricomas,
flechas) de Arabidopsis. La división celular y el desarrollo de las hojas de plantas de tipo salvaje (C; flecha) se inhibe
por la expresión ectópica de E2Fc (D; flecha).
Expression of CDC6 gene in proliferating root meristem (A; arrow) and endoreplicating (B; trichomes, arrows)
Arabidopsis cells. Cell division and leaf development in wild type plants (C; arrow) is inhibited by ectopic expression
of E2Fc (D; arrow).
56
Castellano, M. M., del Pozo, J. C., Ramirez-Parra, E.,
Brown, S., Gutierrez, C. (2001) Expression and stability
of Arabidopsis CDC6 is associated with endoreplication.
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Boniotti, M. B., Gutierrez, C. (2001) A cell cycle-regulated
kinase activity phosphorylates plant retinoblastoma
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Blanchard, F., Rusiniak, M. E., Sharma, K., Sun, X.-L.,
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Sánchez, M. P., Torres, A., Boniotti, M. B., Gutierrez, C.,
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by the ubiquitin-SCFAtSKP2 – pathway in response to
light. Plant Cell 14, 3057-3071
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
María del Mar Castellano Moreno: 2002. “Iniciación de
la replicación del DNA en Arabidopsis: regulación de los
componen tes CDC6, CDT1 y ORC1 del complejo pre-
replicativo". Universidad Autónoma de Madrid.
Otras Actividades / Other Activities
- Miembro del EMBO Fellowship Committee
- Miembro del Advisory Board de Plant Journal
Simposios organizados /Symposia organized
- C. Gutierrez, Co-organizer "Cross talk between cell
division and development in plants". Fundación Juan
March, 2001.
DNA replication and cell cycle
Publicaciones/Publications:
Research summary
Cell cycle entry and exit together with
duplication of the genetic material and its
coordination with cell cycle progression
are crucial processes for cell proliferation
with enormous implications in cell
differentiation and development. The
general strategy for controlling cell cycle
transitions seems to be mechanistically
well conserved among eukaryotes.
However, fundamental differences exist
in the regulatory networks, in particular
in multicellular organisms. In plants, with
unique growth and developmental
properties, a correct balance between
cell division, differentiation and
development is crucial since
organogenesis is a continuous post-
embryonic process.
Reactivation of cell division (G0/G1
transition) and initiation of S-phase (G1/S)
are checkpoints that integrate intra-and
extracellular signals. Our laboratory is
studying two of the main control pathways
at this level: the retinoblastoma
(RBR)/E2F/DP pathway and the initial
stages of DNA replication (Fig. 1), both
of which transduce hormonal and
environmental signals, through the cell
cycle machinery, to produce a variety of
growth and developmental patterns (Fig.
2). We use the model plant Arabidopsis
thaliana that allows us to combine
biochemical, molecular, cellular, genetic
and functional genomic approaches.
Recently, we have identified the
CDK/cyclin complexes that phosphorylate
RBR at G1/S, studied the regulation of
E2F transcription factors at the
transcriptional and post-translational level
through the proteasome, identified a
collection of E2F-regulated genes,
dilucidated the mechanism to recruit the
RFC complex to the origin of geminivirus
DNA replication by the initiator protein
Rep, and analyzed the role of components
of pre-replication complexes (pre-RC),
such as CDC6 and ORC, in
endoreplication and during plant growth
and development.
One of our major challenges ahead is to
understand how cell proliferation is
integrated with cell differentiation, cell
growth and development, as well as what
is the relevance of the RBR/E2F/DP
pathway for stem cell biology.
Rutas implicadas en la transición
G1/S en Arabidopsis y su
integración con la salida del ciclo
celular.
Pathways involved in the G1/S
transition and their integration with
cell cycle exit.
57
Resumen de Investigación
Base molecular de la asociación de HLA-
B27 con espondiloartritis. Los antígenos
HLA de clase I presentan péptidos derivados
del procesamiento proteasómico del
proteoma celular a los linfocitos T citotóxicos.
La supresión de la tolerancia inmunológica
hacia péptidos propios, por ejemplo como
consecuencia de una estimulación
antigénica externa, puede desembocar en
autoinmunidad. En nuestro laboratorio se
estudia el posible papel de la presentación
peptídica por HLA-B27 en la patogenia de
la espondilitis anquilosante (EA) y otras
espondiloartropatías. Se han desarrollado
métodos, basados en el análisis estructural
por espectrometría de masas, para el
análisis comparativo de los repertorios
peptídicos presentados constitutivamente
por subtipos de HLA-B27 asociados
diferencialmente a enfermedad. Estos
estudios permiten correlacionar la
asociación a EA con subconjuntos de
péptidos y definir algunas características
comunes a estos subconjuntos, entre ellas
la presencia de tyrosina C-terminal.
Complementariamente a esta aproximación,
que persigue la identificación de péptidos
con potencial artritogénico, hemos utilizado
la digestión in vitro de substratos sintéticos
con el proteasoma 20S para la predicción
e identificación de ligandos naturales de
HLA-B27. En el curso de estos estudios se
ha identificado un ligando natural endógeno
de HLA-B27 que es presentado
selectivamente por los subtipos de este
antígeno asociados a enfermedad. Dicho
ligando presenta alta homología con una
secuencia de Chlamydia trachomatis, una
bacteria artritogénica. El correspondiente
péptido bacteriano se une in vitro a HLA-
B27 con la misma eficiencia que el ligando
endógeno homólogo y es generado por el
proteasoma 20S a partir de un precursor
sintético con la secuencia de la proteína
bacteriana parental. Estos resultados
demuestran que es posible, a través del
análisis de repertorios peptídicos
endógenos, identificar ligandos naturales
de HLA-B27 que posean las características
esperables de posibles péptidos
artritogénicos.
Mecanismos de procesamiento
antigénico. La degradación proteolítica en
núcleo y citosol marca el punto en el que
se inicia la vía de procesamiento de
antígeno. Es entonces cuando tiene lugar
la selección de substratos de esta vía,
siendo el proteasoma la principal proteasa
implicada en este proceso. Nuestro trabajo
se centra en los mecanismos de esta
selección, planteándonos el estudio del
papel potencial de estructuras celulares
relacionadas con degradación proteolítica,
así como la identificación de diferentes
proteínas, ya sean chaperonas,
cochaperonas u otras proteasas, que
regulen este proceso.
Jefe de Línea / Group Leader:
José A. López de Castro
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
Luis Antón
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Mercè Martí
Alberto Paradela
Miriam Vázquez
Jesús Yagüe
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Iñaki Alvarez
Patricia Gómez
Violeta Gómez
Miguel Marcilla
Verónica Montserrat
Manuel Ramos
Laura Sesma
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
María del Mar de la Torre
Inmunología de los antígenos de histocompatibilidadC.8Inmunología y Virología
Immunology and Virology
Vista lateral, desde la hélice 2 hacia la hélice 1, del modelo molecular de B*2705
(superficie blanca) en complejo con los péptidos B27 (309-320), en color azul, y
DNA primasa (211-222) de Chlamydia trachomatis, en color amarillo. Se muestran
los residuos de los péptidos que sobresalen de la superficie de B*2705 (Ramos
et al. 2002. J. Biol. Chem. 277: 37573-37581).
Side view, from the 2- towards the 1-helix, of a molecular model of B*2705 (white
in complex with peptides B27 (309-320), blue, and DNA primase (211-222) from
Chlamydia trachomatis, yellow. Protruding peptide residues are indicated (Ramos
et al. 2002. J. Biol. Chem. 277: 37573-37581).
58
Tesis Doctorales / Doctoral ThesesIñaki Alvarez Pérez. 2001. "Generación proteasómica
de ligandos naturales de HLA-B27 y modulación del
repertorio peptídico por posibles factores patogenéticos".
Universidad Autónoma de Madrid.
Purcell, A.W., Gorman, J. J., García-Peydró, M., Paradela,
A., Burrows, S. R., Talbo, G. H., Laham, N., Peh, C.A.,
Reynolds, E.C., López de Castro, J.A., McCluskey, J.
(2001) Quantitative and qualitative influence of tapasin
on the class I peptide repertoire. J. Immunol. 166, 1016-
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Ramos, M., Alvarez, I., García-del-Portillo, F., López de
Castro, J.A. (2001) Minimal alterations in the HLA-B27-
bound peptide repertoire induced upon infection of
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Reinelt, S., Martí, M., Dédier, S., Reitinger, T., Folkers,
G., López de Castro, J.A., Rognan D. (2001) -amino acid
scan of a class I MHC-restricted alloreactive T-cell epitope.
J. Biol. Chem. 276, 24525-24530
Alvarez, I., Sesma, L., Marcilla, M., Ramos, M., Martí,
M., Camafeita, E., López de Castro, J.A. (2001)
Identification of novel HLA-B27 ligands derived from
polymorphic regions of its own or other class I molecules
based on direct generation by 20S proteasome. J. Biol.
Chem. 276, 32729-32737
Yagüe, J., Marina, A., Vázquez, J., López de Castro, J.A.
(2001) Major Histocompatibility Complex class I molecules
bind natural peptide ligands lacking the amino-terminal
binding residue in vivo. J. Biol. Chem. 276, 43699-43707
Alvarez, I., Martí, M., Vázquez, J., Camafeita, E., Ogueta,
S., López de Castro, J.A. (2001) The Cys-67 residue of
HLA-B27 influences cell surface stability, peptide
specificity, and T-cell antigen presentation. J. Biol. Chem.
276, 48740-48747
Martí, M., Alvarez, I., Montserrat, V., and López de Castro,
J.A. (2001). Large sharing of T-cell epitopes and natural
ligands between HLA-B27 subtypes (B*2702 and B*2705)
associated with spondyloarthitis. Tissue Antigens 58,
351-362
Antón L. C., Bennink J. R., Yewdell J. W. (2001) Use of
proteasome inhibitors to examine processing of antigen
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Presentation Protocols, (Methods in Molecular Biology,
v. 156). Ed. J.C.Solheim. Humana Press, Totowa, NJ,
USA. pp. 17-31
Sesma, L, Montserrat, V., Lamas, J. R., Marina, A.,
Vázquez, J., López de Castro, J.A. (2002) The peptide
repertoires of HLA-B27 subtypes differentially associated
to spondyloarthropathy (B*2704 and B*2706) differ by
specific changes at three anchor positions. J. Biol. Chem.
277, 16744-16749
Ramos, M., Paradela, A., Vázquez, M., Marina, A.,
Vázquez, J., López de Castro, J.A. (2002) Differential
association of HLA-B*2705 and B*2709 to ankylosing
spondylitis correlates with limited peptide subsets but
not with altered cell surface stability. J. Biol. Chem. 277,
28749-28756
Ramos, M., López de Castro, J.A. (2002) HLA-B27 and
the pathogenesis of spondyloarthritis. Tissue Antigens
60, 191-205
May, E., Dulphy, N., Frauendorf, E., Duchmann, R.,
Bowness, P., López de Castro, J. A., Toubert, A., Märker-
Hermann, E. (2002) Conserved TCR chain usage in
reactive arthritis. Evidence for selection by a putative
HLA-B27-associated autoantigen. Tissue Antigens 60,
299-308
Ramos, M., Alvarez, I., Sesma, L., Logean, A., Rognan,
D., López de Castro, J.A. (2002) Molecular mimicry of
an HLA-B27-derived ligand of arthritis-linked subtypes
with chlamydial proteins. J. Biol. Chem. 277, 37573-
37581
Immunology of histocompatibility antigens
Publicaciones/Publications:
Research summary
Molecular basis of the association of
HLA-B27 with spondyloarthritis. HLA
class I molecules present peptides derived
from the proteasomal processing of the
cell proteome to cytolytic T lymphocytes.
Abrogation of immune tolerance towards
self-peptides, for instance as a
consequence of external antigenic
challenge, may lead to autoimmunity. In
our laboratory we are addressing the
possible role of HLA-B27-mediated
peptide presentation in the pathogenesis
of ankylosing spondylitis (AS) and other
spondyloarthropathies. We have
developed mass spectrometry-based
methods for the comparative analysis of
peptide repertoires constitutively
presented for HLA-B27 subtypes
differentially associated to disease. These
studies allowed us to correlate association
to AS with limited peptide subsets, and
with structural features of these peptides,
such as the presence of C-terminal Tyr.
Besides this approach, which aims at
identifying putative arthritogenic peptides,
in vitro digestion of synthetic substrates
with 20S proteasome was used to predict
and identify novel natural ligands of HLA-
B27. Within these studies, we identified
an endogenous HLA-B27 ligand that was
selectively presented by disease-
associated subtypes. This peptide had
high homology with a protein sequence
from Chlamydia trachomatis, an
arthritogenic bacteria. The chlamydial
peptide bound HLA-B27 in vitro with the
same efficiency as its homologous natural
ligand, and was generated by the 20S
proteasome from a synthetic precursor
with the sequence of the parental bacterial
protein. These results show that it is
possible, through the analysis of
endogenous peptide repertoires, to
identify natural HLA-B27 ligands with
features expected from putative
arthritogenic peptides.
Mechanisms of antigen processing.
Proteolytic degradation in both cytosol
and nucleus lies at the core of substrate
selection in the MHC class I antigen
processing pathway. The proteasome
constitutes the main source of peptide
substrates supplied to the pathway. Our
research is focused on the mechanisms
behind this selection, aiming at both the
cellular structures involved and the
identification of proteins, such as
molecular chaperones and cochaperones
or additional proteases, which may
regulate this process.
Microscopía electrónica de transmisión (x15000) de
células linfoides C1R-B*2705 infectadas con
Salmonella typhimurium. Las bacterias se observan
como cuerpos oscuros, rodeados de membranas
vacuolares (Ramos et al. 2001. Arthritis Rheum. 44:
1677-1688).
Transmission electron microscopy (x 15000) of the
lymphoid C1R-B*2705 cells infected with Salmonella
typhimurium. The bacteria are observed as dark
bodies surrounded by vacuolar membranes (Ramos
et al. 2001. Arthritis Rheum. 44: 1677-1688).
59
Resumen de Investigación
El virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH) es un retrovirus que infecta
preferentemente a células del sistema
inmune, y provoca el síndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA).
Actualmente, el tratamiento de la infección
por el VIH en países desarrollados implica
la utilización de inhibidores de enzimas
virales como la retrotranscriptasa (RT) y la
proteasa. Estos fármacos han mostrado
una gran eficacia clínica pero la aparición
de virus resistentes, la existencia de
reacciones cruzadas entre ellos y los efectos
secundarios que producen son factores que
hipotecan su utilidad a largo plazo.
La retrotranscriptasa del VIH es una enzima
clave en la replicación del RNA que
constituye el material genético del virus.
Se trata de una enzima heterodimérica, que
posee actividad DNA polimerasa
dependiente de RNA y de DNA, además
de actividad endonucleasa (ribonucleasa
H). Nuestro trabajo se ha centrado en el
análisis del papel que juegan distintos
aminoácidos del sitio de unión de
desoxirribonucleótido (dNTP) en la reacción
de síntesis de DNA, con particular énfasis
en el estudio de los determinantes
moleculares de la especificidad de
nucleótido. Fruto de estos estudios hemos
podido demostrar el papel que juega la Tyr-
115 en la discriminación entre
ribonucleótidos (rNTPs) y dNTPs, y también
su influencia sobre la fidelidad de copia de
la enzima. Nuestros trabajos han puesto
de manifiesto el papel de otros residuos,
como la Met-230, situados fuera del sitio
de unión del dNTP y que también
contribuyen de forma importante a la
fidelidad de la enzima. Estos estudios son
potencialmente útiles para el diseño de
nuevas estrategias y fármacos
antirretrovirales.
Otros proyectos en curso tienen como
objetivo la caracterización bioquímica de
variantes de la RT de relevancia clínica.
Por ejemplo, RTs portadoras de inserciones
que exhiben resistencia a múltiples
fármacos antirretrovirales, y cuyo
mecanismo de resistencia demostramos
en estudios previos; o RTs resistentes a
nevirapina y otros inhibidores no
nucleosídicos, que aparecen en aislados
del VIH-1 de grupo O y que se encuentran
alejadas filogéneticamente de las variantes
predominantes en Europa y Norteamérica.
Junto a estos estudios, nuestro grupo está
implicado en la puesta a punto de una Base
de Datos de secuencias de virus de
pacientes infectados por el VIH y tratados
en hospitales españoles.
Jefe de Línea / Group Leader:
Luis Menéndez Arias
e-mail: [email protected]
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Clara E. Cases González
Tania Matamoros Grande
Blanca Mª Vázquez Álvarez
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
César Garriga Fuentes
Enzimas retrovirales: análisis estructural yfuncional de la retrotranscriptasa del virus dela inmunodeficiencia humana
C.9Inmunología y Virología
Immunology and Virology
Estructura cristalográfica de la retrotranscriptasa del VIH-1.
Crystal structure of HIV-1 reverse transcriptase.
60
Menéndez-Arias, L., Abraha, A., Quiñones-Mateu, M.E.,
Mas, A., Camarasa, M.-J., Arts, E.J. (2001) Functional
characterization of chimeric reverse transcriptases with
polypeptide subunits of highly divergent HIV-1 group M
and O strains. J. Biol. Chem. 276, 27470-27479
Zakharenko, A.L., Kolpashchikov, D.M., Khodyreva, S.N.,
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the dNTP-binding site of HIV-1 reverse transcriptase
using photoreactive analogs of dNTP. Biochemistry
(Moscow) 66, 999-1007
Gutiérrez-Rivas, M., Menéndez-Arias, L. (2001) A
mutation in the primer grip region of HIV-1 reverse
transcriptase that confers reduced fidelity of DNA
synthesis. Nucleic Acids Res. 29, 4963-4972
Quiñones-Mateu, M.E., Tadele, M., Parera, M., Mas, A.,
Weber, J., Rangel, H.R., Chakraborty, B., Clotet, B.,
Domingo, E., Menéndez-Arias, L., Martínez, M.A. (2002)
Insertions in the reverse transcriptase increase both
drug resistance and viral fitness in a human
immunodeficiency virus type 1 isolate harboring the
multi-nucleoside reverse transcriptase inhibitor resistance
69 insertion complex mutation. J.Virol. 76, 10546-10552
Mas, A., Vázquez-Álvarez, B. M., Domingo, E., Menéndez-
Arias, L. (2002) Multidrug-resistant HIV-1 reverse
transcriptase: Involvement of ribonucleotide-dependent
phosphorolysis in cross-resistance to nucleoside analogue
inhibitors. J. Mol. Biol. 323, 181-197
Domingo, E., Mas, A., Yuste, E., Pariente, N., Sierra, S.,
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population dynamics, fitness variations and the control
of viral disease: an update. En: Jucker, E. (ed.) Progress
in Drug Research., vol. 57. Birkhäuser-Verlag, Basilea
(Suiza), págs. 77-115
Menéndez-Arias, L., Domingo, E. (2002) Amino acid
substitutions associated with resistance to HIV-1 reverse
transcriptase, protease inhibitors, and other antiretroviral
drugs. En: Clotet, B., Menéndez-Arias, L., Ruiz, L., Tural,
C., Brun-Vezinet, F., Loveday, C., Burger, D., Schapiro,
J., Boucher, C., D’Aquila, R., Richman, D.D. (eds.) Guide
to management of HIV drug resistance and
pharmacokinetics of antiretroviral therapy, 2ª Edición.
Editorial Taisa, S.L., Barcelona, España, págs. 37-112
Menéndez-Arias, L. (2002) Sensitivity to reverse
transcriptase and protease inhibitors of recombinant HIV
clones harboring resistance mutations: In vitro studies.
En: Clotet, B., Menéndez-Arias, L., Ruiz, L., Tural, C.,
Brun-Vezinet, F., Loveday, C., Burger, D., Schapiro, J.,
Boucher, C., D’Aquila, R., Richman, D.D. (eds.) Guide
to management of HIV drug resistance and
pharmacokinetics of antiretroviral therapy, 2ª Edición.
Editorial Taisa, S.L., Barcelona, España, págs. 113-202
Menéndez-Arias, L., Martínez-Picado, J., Domingo, E.
(2002) Drug resistance-associated mutations and their
effects in viral fitness. En: Clotet, B., Menéndez-Arias,
L., Ruiz, L., Tural, C., Brun-Vezinet, F., Loveday, C.,
Burger, D., Schapiro, J., Boucher, C., D’Aquila, R.,
Richman, D.D. (eds.) Guide to management of HIV drug
resistance and pharmacokinetics of antiretroviral therapy,
2ª Edición. Editorial Taisa, S.L., Barcelona, España,
págs. 203-222.
Menéndez-Arias, L. (2002) Molecular basis of fidelity of
DNA synthesis and nucleotide specificity of retroviral
reverse transcriptases. Prog. Nucleic Acids Res. Mol.
Biol. 71, 91-147
Menéndez-Arias, L. (2002) Targeting HIV: Antiretroviral
therapy and development of drug resistance. Trends
Pharmacol. Sci. 23, 381-388
Retroviral enzymes: structural and functionalanalysis of human immunodeficiency virusreverse transcriptase
Publicaciones/Publications:
Research summary
The human immunodeficiency virus (HIV)
is a retrovirus that infects cells of the
immune system, and causes the acquired
immunodeficiency syndrome (AIDS).
Nowadays, treatment of HIV-infection in
developed countries involves the use of
inhibitors of retroviral enzymes such as
the reverse transcriptase (RT) and the
protease. These drugs have been rather
successful in the clinic, but the emergence
of resistant viruses, the observed cross-
reactivity between the inhibitors, and
unwanted secondary effects are major
hurdles towards their long-term efficacy.
The HIV reverse transcriptase plays a
pivotal role in the replication of the viral
genomic RNA. It is a heterodimeric
enzyme that possesses RNA- and DNA-
dependent DNA polymerase activity as
well as endonuclease (ribonuclease H)
activity. Our recent work has been
devoted to the analysis of the role of
different residues that form the
deoxynucleotide (dNTP)-binding site in
the DNA synthesis reaction, with particular
emphasis on their role in determining the
nucleotide specificity of the enzyme. We
have shown that Tyr-115 plays a critical
role in discrimination between
ribonucleotides (rNTPs) and dNTPs, and
also influences the copying fidelity of the
RT. In addition, the role of residues
outside of the dNTP-binding pocket (e.g.
Met-230) in fidelity of DNA synthesis has
also been demonstrated. These studies
are potentially useful for the design of
novel therapeutic strategies and
antiretroviral drugs.
Other current projects include the
biochemical characterization of clinically-
relevant variant RTs. For example,
multidrug-resistant RTs carrying a two-
amino acid insertion in their “fingers”
subdomain, whose resistance mechanism
was elucidated in our laboratory; or
nevirapine-resistant RTs found in group
O HIV-1 variants, which are viruses
phylogenetically distant from those
predominant in Europe and North
America.
Together with those studies, our group is
also involved in the establishment of a
Database collecting nucleotide sequences
of HIV clinical isolates from patients
treated in Spanish hospitals.
Localización estructural de la Tyr-115 y la Met-230 en relación al sitio de unión del dNTP, en el complejo
ternario formado por la retrotranscriptasa, el dNTP entrante y un molde-iniciador DNA/DNA.
Structural location of Tyr-115 and Met-230 within the dNTP-binding pocket of HIV-1 reverse transcriptase
in the ternary complex containing a DNA/DNA template-primer.
61
Resumen de Investigación
Nuestro interés científico se centra en el
estudio de la regulación de la expresión
génica en la activación de células
endoteliales.
En estos modelos celulares estamos
analizando los mecanismos que integran
la transducción de señales extracelulares
con la activación de factores de
transcripción, a su vez encargados de
regular programas específicos de inducción
génica. Parte de nuestros objetivos están
dirigidos al estudio de la regulación de la
familia de factores de transcripción NFAT.
Esta familia está implicada en procesos de
importancia biológica tales como activación
linfocitaria, morfogénesis de válvulas
cardiacas y en el desarrollo de sinapsis. Al
menos 4 miembros de la familia residen en
el citoplasma en células en reposo y se
translocan al núcleo en respuesta a
aumentos intracelulares de calcio, en un
proceso que conlleva la desfosforilación de
NFAT mediada por calcineurina. Al cesar
las señales de calcio, quinasas nucleares
poco caracterizadas median su re-
exportación al citoplasma. La efectividad
de algunas drogas inmunosupresoras que
inhiben la actividad de calcineurina proviene
de su acción inhibitoria de NFAT. La
disección de los mecanismos de regulación
de NFAT permitirían desarrollar estrategias
para reemplazar estos inmunosupresores
por drogas con menores efectos
secundarios.
En células endoteliales estamos analizando
las rutas de señalización y el papel de
distintos factores de transcripción en la
respuesta a VEGF (factor de crecimiento
del endotelio vascular), un potente factor
mitogénico y angiogénico. Recientemente
hemos determinado que la respuesta
endotelial a VEGF conduce a la activación
de NFAT, lo que se requiere para la
expresión de Ciclooxigenasa-2 y que la
inhibición de NFAT por Ciclosporina A
produce inhibición selectiva de angiogénesis
por VEGF. Estos resultados nos han
conducido a investigar el efecto de
eicosanoides y NFAT en modelos in vitro e
in vivo de patologías que cursan con
neovascularización mediada por VEGF,
actualmente en estudio en nuestro
laboratorio.
Jefe de Línea / Group Leader:
Juan Miguel Redondo
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
Eva Cano
Antonio Rodríguez
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Arantzazu Alfranca
Sara Martínez
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Inmaculada Ortega
Antonio J Quesada.
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
Dolores López
Felipe Were
Regulación de la expresión génica enendotelio vascular
C.10Inmunología y Virología
Immunology and Virology
62
Hernández, G. L., Volpert, O. V., Iñiguez, M. A., Lorenzo,
E., Martínez-Martínez, S., Grau, R., Fresno, M., Redondo,
J. M. (2001) Selective inhibition of vascular endothelial
growth factor-mediated angiogenesis by cyclosporin A:
roles of the nuclear factor of activated T cells and
cyclooxygenase 2. J. Exp. Med. 193, 607-620
Lorenzo, E., Ruiz-Ruiz, C., Quesada, A.J., Hernández,
G., Rodríguez, A., López-Rivas, A., Redondo, J.M. (2002)
Doxorubicin induces apoptosis and CD95 gene
expression in human primary endothelial cells through
a p53-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 17,10883-
10892
Ruiz de Almodóvar, C., López-Rivas, A., Redondo, J.M.,
Rodríguez, A. (2002) Transcription initiation sites and
promoter structure of the human TRAIL-R3 gene. FEBS
Lett. 531, 304-308
Carretero, M., Gómez-Gonzalo, M., Lara-Pezzi, E.,
Benedicto, I., Aramburu, J., Martínez-Martínez, S.,
Redondo, J.M., and López-Cabrera, M. (2002) The
Hepatits B virus X protein binds to and activates the
NH2-termial transactivation domain of nuclear factor of
activated T-cells-1. Virology 299, 288-300
Urzainqui, A., Serrador, J.M., Viedma, F., Yáñez-Mó, M.,
Rodríguez, A., Corbí, A.L., Alonso-Lebrero, J.L., Luque,
A., Deckert, M., Vázquez, J., Sánchez-Madrid, F. (2002)
ITAM-based interaction of ERM proteins with Syk
mediates signaling by the leucocyte adhesion receptor
PSGL-1. Immunity 17, 1-20
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Elisa Lorenzo Álvarez. 2002. “Estudio de la regulación
transcripcional de genes en respuesta a VEGF y
Doxorrubicina en células endoteliales. Efecto apoptótico
de Doxorrubicina”. Universidad Autónoma de Madrid.
Premios / Awards
Juan Miguel Redondo: Premio Iñigo Alvarez de Toledo
2002 a la Investigación Básica.
Regulation of gene expression in vascularendothelium
Publicaciones/Publications:
Research summary
We are investigating the mechanisms that
couple extra-cellular signals to the
activation of the transcription factors that
regulate specific programmes of gene
induction during endothelial cell activation.
Our efforts are directed towards the study
of NFAT (nuclear factor of activated T-
cells). NFAT is implicated in such important
biological processes as lymphocyte
activation, heart valve morphogenesis,
and the development of synaptic
connections. Members of this large family
of transcription factors are activated by
the calcium-sensitive phosphatase
calcineurin, Deactivation is effected by
poorly-defined nuclear kinases that
rephosphorylate NFAT and initiate its
return to the cytosol. There is strong
evidence to support a role for MAP
kinases in these processes, including our
previous work that demonstrated a
physical association of p38 MAPK with
NFAT. We are using mass spectrometry
and phospho-peptide mapping to identify
NFAT residues phosphorylated by kinases
such as p38 and JNK. We have generated
mutants in which these residues are
substituted. These mutants are now being
used in transient transfection experiments
to define the influence of individual
phosphorylated residues on the
transactivating activity and subcellular
localization of NFAT family members. The
effectiveness of immunosuppressive
drugs that inhibit calcineurin arises from
their blockade of NFAT. This research
programme is allowing us to dissect the
mechanisms of NFAT regulation, and
carries with it the potential for developing
strategies to replace drugs in current use
that have unwanted side effects.
We are also investigating signalling
pathways and transcription factors
activated by VEGF (vascular endothelial
growth factor), potent mitogenic and
angiogenic agent. We recently
demonstrated that activation of NFAT is
required for VEGF–induced expression
of Cyclooxygenase-2. As COX-2 activity
plays an important role in angiogenesis,
we are studying the actions of eicosanoids
and NFAT in in vitro and in vivo models
of angiogenesis and pathologies
characterised by neovascularisation
mediated by VEGF.
63
Resumen de Investigación
El sistema hematopoiético adulto se
mantiene en un equilibrio dinámico entre
la diferenciación de células tronco
multipotenciales y el recambio celular de
los estadios maduros. En el embrión
postgastrulación, los progenitores
hematopoiéticos emergen de novo de
hemangioblastos y/o endotelios
hemogénicos, y experimentan altas tasas
de proliferación/expansión en nichos
primarios (saco vitelino –SV- y
esplanchnopleura paraaórtica –P/Sp-) y
secundarios (hígado, bazo, sangre).
Investigaciones recientes, incluidas de
nuestro grupo, han establecido un escenario
con dos compartimientos autónomos (SV,
P/Sp) que dan lugar a una onda transitoria
de mieloeritropoiesis embrionaria y a la
linfohematopoiesis definitiva,
respectivamente. En condiciones
experimentales, sin embargo, ambos tipos
de progenitores pueden expresar un amplio
espectro de potenciales de diferenciación,
en respuesta a señales del microambiente.
Estamos interesados en los mecanismos
genéticos y celulares que condicionan los
destinos celulares de progenitores
embrionarios, así como en evaluar sus
potenciales de regeneración in vivo.
(A) Los primeros tres días del desarrollo
linfoide B. Un día después de su
especificación, las células tronco de la P/Sp
inician la diferenciación linfoide B, y una
población de precursores B-específicos es
detectable. Dichos precursores son
fácilmente establecidos in vitro en cultivos
estromales + IL7 a largo plazo, donde
maduran a linfocitos B maduros y secretores
de Igs y, lo que es más interesante, pueden
reconstituir el sistema adulto B funcional.
(B) En el SV inicial, además de los eritrocitos
nucleados y células mieloides, existen
pequeñas poblaciones de eritrocitos adultos,
megacariocitos, mastocitos y progenitores
de microglia. Estamos caracterizando una
nueva población de precursores T/NK que
emerge in situ a día 9 de la gestación del
ratón,, y que podría ser relevante en el
establecimiento de la tolerancia madre-feto.
(C) El hígado es la estación central de la
hematopoiesis fetal, donde conviven
precursores hepatoepiteliales que generarán
hepatocitos y células biliares, con
progenitores linfohematopoiéticos de origen
extrínseco. Hemos caracterizado una nueva
población de progenitores hepatoepiteliales
bipotenciales (c-KitdullCD45-TER119-),
capaces de diferenciarse in vitro en sistemas
específicos. Co-cultivos de progenitores de
ambos sistemas revelan la existencia de
influencias mutuas, a través de interacciones
celulares directas y factores solubles
específicos (SCL, OSM, HGF, etc.). Estamos
explorando el posible papel de estos
progenitores embrionarios en modelos de
regeneración hepática in vivo.
Jefe de Línea / Group Leader:
Miguel Angel Rodríguez Marcos
e-mail: [email protected]
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Gracia Morales Kucharski
Ana Izcue Castellví
Becario Predoctoral /
Graduate Student:
Susana Minguet García
Desarrollo del sistemalinfohematopoiético embrionario
C.11Inmunología y Virología
Immunology and Virology
Organización celular del desarrollo de novo, recambio celular
y regeneración tras daño tisular.
64
Izcue, A., Morales, G., Minguet, S., Sánchez-Movilla, A.,
Martínez, J.A., Gaspar, M.L., Marcos, M.A.R. (2001)
Both B and TCR + lymphocytes regulate superantigen-
dependent selection of TCR + lymphocytes in an
opposite and complementary manner. Eur. J. Immunol.
31, 2811- 2817
Martínez, J.A., Minguet, S., Gonzalo, P., Soro, P.G., De
Andrés, B., Ízcue, A., Marcos, M.A.R., Gaspar, M.L.
(2001) Long-lived polyclonal B-cell lines derived from
midgestation mouse embryo lymphohematopoietic
progenitors reconstitute adult immunodeficient mice.
Blood 98, 1862-1871
De Andrés, B., Gonzalo, P., Minguet, S., Gómez Soro,
P., Martínez, J.A, Marcos, M.A.R., Gaspar, M.L. (2002)
The first three days of B cell development in the mouse
embryo. Blood 100, 4073- 4081
Tesis Doctoral / Doctoral Theses
Susana Minguet García. 2002. “Una población de células
tronco-hepáticas en los estadios iniciales de la
morfogénesis del hígado embrionario de ratón”.
Universidad Autónoma de Madrid, Fac. de Ciencias.
Embryonic development of thelymphohematopoietic system
Publicaciones/Publications:
Research summary
In the adult steady state, the
hematopoietic complex is balanced
between the differentiation of
hematopoietic stem cells and the mature
cell turnover. In the postgastrulation
embryo, hematopoietic progenitors
emerge de novo from hemangioblasts
and/or hemogenic endothelia, and show
high rates of proliferation/expansion in
primary (yolk sac –YS- and paraaortic
splanchnopleura –P/Sp-) and secondary
niches (liver, spleen, blood). Recent
findings from our and other groups have
defined a scenario with two autonomous
compartments (YS, P/Sp) giving rise to
both the transient wave of embryonic
myeloerythropoiesis and definitive
lymphohematopoiesis, respectively. In
experimental conditions, however, both
types of progenitors can express a wider
spectrum of differentiation potentials in
response to microenvironment-derived
signalings. We are interested in the
dissection of the genetic and cellular
mechanisms constraining the cell fates
of embryonic progenitors, as well as in
elucidating their in vivo regeneration
potentials.
1) The first three days of B cell
development. One day after the
specification of P/Sp hematopoietic
progenitors, their differentiation to B-cell
lineages begins, and a small population
of B-restricted precursors is detected.
These cells are easily established in vitro
on long-term stromal cell cultures + IL7,
where they mature to functional, Ig-
secreting B lymphocytes and, more
interestingly, they are able to reconstitute
an efficient B-cell compartment in the
adult.
2) Besides the nucleated erythroid and
myeloid cells, other subsets of adult
erthrocytes, megakaryocytes, mast cells
and microglial precursors are present in
the starting YS. We are characterizing a
novel population of T/NK precursors
emerging in situ at day 9 of gestation that
could be relevant for the establishment
of the mother/fetus tolerance.
3) The liver becomes the central organ
of fetal hematopoiesis. There,
hepatoepithelial precursors for both
hepatocytes and biliary cells are intimately
linked to extrinsic hematopoietic
progenitors. We have characterized a
novel population of hepatoepithelial
bipotential progenitors (c-KitdullCD45-
TER119-) that differentiate in vitro. Co-
cultures of both types of liver progenitors
have revealed processes of
hematopoietic/hepatoepithelial cross-talk
through direct cell interactions and soluble
factors (SCL, OSM, HGF, etc.). We are
exploring the putative role of these
embryonic hepatoepithelial progenitors
in in vivo hepatic regeneration.
Hepatocitos y células biliares en la
diferenciación in vitro de progenitores
embrionarios. (A) Hepatocitos secretores de
glucógeno (tinciones de PAS); (B) Expresión
de citoqueratinas (8, 18, 19) y albúmina en
precursores comunes (CK19+ALB*,
amarillos), hepatocitos (CK19-ALB+, verdes)
y colangiocitos (CK19+ALB-, rojos).
65
Resumen de Investigación
Uno de los objetivos de nuestra línea es el
estudio del sistema de reparación del DNA
del virus de la peste porcina africana
(VPPA), que puede ser esencial para el
mantenimiento de la integridad del genoma
viral en el ambiente oxidativo y
potencialmente genotóxico del macrófago.
El sistema de reparación por excisión de
bases (BER) del VPPA está constituido por
una AP endonucleasa, una DNA polimerasa
reparativa, designada pol X, y una DNA
ligasa. La fidelidad de inserción de la pol X
es comparable a la de la DNA polimerasa
beta reparativa humana, lo que apoya su
participación en la reparación de un daño
en el DNA viral debido a alteraciones en
las bases. Por otra parte, la actividad liasa
que posee la pol X sobre intermedios
reparativos que contienen un sitio abásico
sugiere la existencia de una ruta alternativa
para el BER viral.
Nuestros estudios tienen también como
finalidad comprender los procesos de
ensamblaje de la partícula viral y los
mecanismos implicados en la diseminación
del virus. Utilizando un recombinante del
VPPA que expresa induciblemente la
proteína de la cápsida p14.5, hemos
demostrado que esta proteína es necesaria
para la diseminación del virus, estando
implicada en el transporte mediado por
microtúbulos del VPPA desde las factorías
virales hasta la membrana plasmática. La
formación del dominio central del virus
(“core”), constituido por el nucleoide que
contiene el DNA y el dominio intermedio
que rodea a éste, se investigó
caracterizando un recombinante inducible
en la poliproteína pp220, uno de los
componentes mayoritarios del dominio
intermedio. La represión de la síntesis de
la pp220 en este sistema tiene un efecto
dramático sobre la morfogénesis del virus,
generándose cápsidas vacías, que carecen
del “core” central. Estas estructuras, que
no son infectivas y que contienen los
determinantes antigénicos presentes en la
capa externa de la partícula viral, podrían
constituir una herramienta útil para el
desarrollo de una vacuna eficaz contra la
peste porcina africana, así como para el
diagnóstico de la enfermedad.
Otro objetivo de nuestro trabajo es investigar
los mecanismos que utiliza el virus para
controlar la apoptosis y la respuesta inmune
del huésped. Nuestros estudios indican que
la apoptosis se induce durante la
desencapsidación del virus y que no se
requiere la replicación de éste para activar
el proceso apoptótico. Hemos demostrado,
por otra parte, que el gen viral homólogo
al IAP celular, además de bloquear la
activación de la caspasa-3, activa al NFkB
mediante la inducción de actividad IkB
kinasa (IKK). Esto representa una nueva
estrategia para evadir la respuesta del
huésped, no descrita previamente para
otros virus animales.
Jefe de Línea / Group Leader:
María Luisa Salas
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
José Salas
Ángel L. Carrascosa
Yolanda Revilla
Javier M. Rodríguez
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Alí Alejo
Germán Andrés
Ramón García
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Carolina Epifano
Aitor González
Javier Gutiérrez
Carolina Hurtado
Irene Rodríguez
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance
María José Bustos
María Luisa Nogal
Virus de la peste porcina africanaC.12Inmunología y Virología
Immunology and Virology
Microscopía electrónica del VPPA. (A) Viriones maduros intracelulares. (B) Cápsidas vacías generadas en
células infectadas con el virus recombinante v220i inducible en la poliproteína pp220, en condiciones restrictivas.
c, cápsida; ie, envuelta interna; cs, dominio intermedio; n, nucleoide.
Electron microscopy of ASFV. (A) Intracellular mature virions. (B) Empty capsids generated in cells infected with
the recombinant virus v220i inducible in polyprotein pp220, under restrictive conditions. c, capsid; ie, inner
envelope; cs, core shell; n, nucleoid.
66
Andrés, G., Alejo, A., Simón-Mateo, C., Salas, M. L.
(2001) African swine fever virus protease: A new viral
member of SUMO-1-specific protease family. J. Biol.
Chem. 276, 780-787
Nogal, M. L., González de Buitrago, G., Rodríguez, C.,
Cubelos, B., Carrascosa, A. L., Salas, M. L., Revilla, Y.
(2001) African swine fever virus IAP homologue inhibits
caspase activation and promotes cell survival in
mammalian cells. J. Virol. 75, 2535-2543
Andrés, G., García-Escudero, R., Viñuela, E., Salas, M.
L., Rodríguez, J. M. (2001) African swine fever virus
structural protein pE120R is essential for virus transport
from the assembly sites to the plasma membrane but
not for infectivity. J. Virol. 75, 6758-6768
Rodríguez, J. M., Salas, M. L., Santarén, J. F. (2001)
African swine fever virus-induced polypeptides in porcine
alveolar macrophages and in Vero cells: Two-dimensional
gel analysis. Proteomics 1, 1447-1456
Andrés, G., García-Escudero, R., Salas, M. L., Rodríguez,
J. M. (2002) Repression of African swine fever virus
polyprotein pp220-encoding gene leads to the assembly
of icosahedral core-less particles. J.Virol. 76, 2654-2666
Rodríguez, C. I., Nogal, M. L., Carrascosa, A. L., Salas,
M. L., Fresno, M., Revilla, Y. (2002) African swine fever
virus IAP-like protein induces the activation of nuclear
factor kappa B. J. Virol., 76, 3936-3942
Carrascosa, A. L., Bustos, M. J., Nogal, M. L., González
de Buitrago, G., Revilla, Y. (2002) Apoptosis induced by
an early step of African swine fever virus (ASFV) entry
into Vero cells does not require virus replication. Virology,
294, 372-382
Bustos, M. J., Nogal, M. L., Revilla, Y., Carrascosa, A. L.
(2002) Plaque assay of African swine fever virus on
swine macrophages. Arch. Virol., 147, 1453-1459
Andrés, G., Alejo, A., Salas, J., Salas, M. L. (2002) African
swine fever virus polyproteins pp220 and pp62 assemble
into the core shell. J. Virol. 76, 12473-12482
African swine fever virus
Publicaciones/Publications:
Research summary
One objective of our research line is the
study of the African swine fever virus
(ASFV) DNA repair system, which may
be essential to maintain the integrity of
the viral genome in the oxidative and
potentially genotoxic environment of the
macrophage. The ASFV base excision
repair (BER) system is constituted by an
AP endonuclease, a reparative DNA
polymerase, designated pol X, and a DNA
ligase. The insertion fidelity of pol X is
comparable to that of the human
reparative DNA polymerase beta,
supporting its participation in the repair
of a viral DNA damage due to alterations
in the bases. On the other hand, pol X
possesses a lyase activity on reparative
intermediates containing an abasic site,
suggesting the existence of an alternative
viral BER pathway.
Our studies are also directed to
understand the assembly processes of
the viral particle and the mechanisms
involved in virus dissemination. Using an
ASFV recombinant inducibly expressing
the capsid protein p14.5, we have
demonstrated that this protein is
necessary for virus dissemination, being
involved in the microtubule-mediated
transport of ASFV from the viral factories
to the plasma membrane. The formation
of the virus central “core” domain,
constituted by the DNA-containing
nucleoid and the core shell that surrounds
it, was investigated by characterizing a
recombinant inducible in polyprotein
pp220, one of the main components of
the core shell. Repression of pp220
synthesis using this system causes a
dramatic effect on virus morphogenesis,
with the generation of “empty capsids”
lacking the virus core. These structures,
which are non-infectious and contain the
antigenic determinants of the particle
external layer, may provide a useful tool
for the investigation of effective vaccines
against ASFV infection and for the
development of ASF diagnostic tests.
Another objective of our work is to
investigate the mechanisms used by the
virus to control the apoptosis and the
immune response. Our studies indicate
that apoptosis is induced during virus
uncoating and that virus replication is not
required to activate the apoptotic process.
On the other hand, we have demonstrated
that the viral gene homologous to cellular
IAP, in addition to its effect in preventing
caspase-3 activation, is able to activate
NFkB through a mechanism that involves
the induction of IkB kinase (IKK) activity.
This represents a new strategy to evade
the host’s immune response, not
described previously for mammalian
viruses.
Modulación de NFkB por genes del VPPA homólogos
a IkB (gen A238L) e IAP (gen A224L). El IkB viral es
un inhibidor del NFkB, mientras que el homólogo del
IAP activa a este factor de transcripción por un
mecanismo que implica la activación de las IKKs.
Modulation of NFkB by ASFV genes homologous to
IkB (gene A238L) and IAP (gene A224L). The viral
IkB is an inhibitor of NFkB, while the IAP homologue
activates this transcription factor by a mechanism
involving IKKs activation.
67
Resumen de Investigación
El virus de la fiebre aftosa (VFA) constituye
un interesante modelo, de gran importancia
económica, para entender como las
interacciones entre un virus con gran
capacidad de variación y sus diferentes
hospedadores naturales, condicionan el
control de la enfermedad que produce.
Se está caracterizando la respuesta inmune
celular que induce el VFA y sus vacunas
convencionales en un importante
hospedador natural, el cerdo. Se participa,
también, en el diseño de nuevas vacunas
y en el análisis de su inmogenicidad en
modelos animales. Se han identificado
epítopos T cooperadores en proteínas no
estructurales (NSP) del VFA que son
eficientemente reconocidos por linfocitos
de cerdos domésticos. Estos epítopos están
siendo empleados en la formulación de
vacunas peptídicas, cuya inmunogenicidad
está siendo estudiada.
Se trabaja, también, en el análisis funcional
de elementos reguladores del RNA y en el
papel de NSP en la patogenia producida
por el VFA. La 3’NCR del RNA viral es
esencial para la replicación del virus en
cultivos celulares y en modelos animales.
Así mismo, se ha demostrado la implicación
de la NSP 3A en el rango de hospedador
del virus, habiéndose identificado que una
única sustitución de aminoácido en esta
proteína confiere al VFA la capacidad de
producir lesiones vesiculares en cobaya.
Finalmente, se ha trabajado en el desarrollo
de nuevas estrategias de diagnóstico
serológico y en la optimización de la
secuenciación y análisis filogenético del
VFA y otros virus RNA.
Parte de este trabajo ha sido desarrollado
en el laboratorio BSL3 del que se dispone
en el CISA-INIA. Se ha colaborado
activamente con: D. Andreu (U. Pompeu
Fabra), E. Domingo (CBMSO), E. Giralt (U.
Barcelona), V. Ley (INIA), E. Martínez-Salas
(CBMSO), E.L Palma (INTA, Argentina), M.
Sáiz (CISA-INIA), A. Villaverde (U.A.
Barcelona), y dentro de los proyectos de la
UE: FAIR CT97-3665 y CT96 1317.
Investigador responsable /
Scientist in charge:
Francisco Sobrino
Becarios Postdoctorales /
Postdoctoral fellows:
José Ignacio Núñez
Becarios Predoctorales
Nicolás Molina
Diana Belén de la Morena
Científicos Visitantes
Visiting Scientists:
Lliliane Ganges (CENSA, Cuba)
Judith Villén (U. Pompeu Fabra,
Barcelona)
Desarrollo de nuevas estrategias para el control yprevención de enfermedades virales: el virus de lafiebre aftosa como modelo
C.13Inmunología y Virología
Immunology and Virology
Representación esquemática de la respuesta inmune específica inducida por el VFA.
Reconocimiento de epítopos virales por linfocitos B y T CD4 (cooperadores) y CD8
(citotóxicos, CTL). La inducción de anticuerpos neutralizantes frente al VFA se asocia
con protección frente a la infección viral. El papel de la respuesta CTL en la protección
frente al VFA es poco conocido, lo que se indica con un interrogante.
Schematic representation of the specific immune response induced by FMDV. Recognition
of viral epitopes by B and T CD4 (helper) and T CD8 (CTL) lymphocytes. Induction of
viral neutralizing antibodies correlates with protection to viral infection. The role of the
CTL response in FMD protection is not well established and this is indicated by a question
mark.
68
Sáiz, M., Gómez, S., Martínez-Salas, E., Sobrino, F.
(2001) Deletion or substitution of the aphthovirus 3'NCR
abrogates infectivity and viral replication. J. Gen. Virol.
82, 93-101
Sobrino, F., Sáiz, M., Jiménez-Clavero, M.A., Núñez, J.I.,
Rosas, M.F., Baranowski, E., Ley, V. (2001) Foot-and-
mouth disease virus: a long known virus, but a current
threat. Vet. Res. 32, 1-30
Núñez, J.I., Martín, M.J., Piccone. M.E., Carrillo, E.,
Palma, E.L., Dopazo, J., Sobrino, F. (2001) Identification
of optimal regions for phylogenetic studies on VP1 gene
of foot-and-mouth disease virus: analysis of types A and
O Argentinean viruses. Vet. Res. 32, 31-45
Blanco, E., García-Briones, M., Sanz-Parra, A., Chiva,
C., Andreu, D., Ley, V., Sobrino, F. (2001) Identification
of T cell epitopes in non-structural proteins of foot-and-
mouth disease virus. J. Virol. 75, 3164-3174
Núñez, J.I., Baranowski, E., Molina, N., Ruiz-Jarabo, C.,
Domingo, E., Sobrino, F. (2001) A single amino acid
substitution in non-structural polypeptide 3A can mediate
adaptation of foot-and-mouth disease virus to guinea-
pig. J. Virol. 75, 3977-3983 Seleccionado por la Journal
Highlights Section of ASM News, como uno de los seis
mejores artículos del mes.
Sobrino, F., Domingo, E. (2001) Foot-and-mouth disease
in Europe. EMBO reports 2, 459-461
Sobrino, F. (2001) La fiebre aftosa y su control. Pequeños
Rumiantes. Publicación de la Sociedad Española de
Ovinotecnia y Caprinotecnia. 2, 8-15
Feliu, J.X, Ferrer-Miralles, N., Blanco, E., Sobrino, F.,
Villaverde, A. (2002) Enhanced response to antibody
binding in engineered -galactosidase enzymatic sensors.
Biochem. Biophys. Acta. 36605, 1-13
Sobrino, F., Blanco, E., Núñez, J.I., Jiménez-Clavero,
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and-mouth disease virus. Mod. Asp. Immunobiol. 2, 166-
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Sáiz, M., Jiménez-Clavero, M.A., Núñez, J.I., Baranowski,
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prospective for disease control. Microb. Infect. 4, 183-
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Domingo, E., Baranowski, E., Escarmís, C., Sobrino, F.
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López de Quinto, S., Sáiz, M., de la Morena, D., Sobrino,
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translation is stimulated separately by the viral 3’NCR
and poly (A) sequences. Nucleic Acids Res. 30, 4398-
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Domingo, E., Baranowski, E., Escarmís, C., Sobrino, F.,
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RNA polymerases-evolutionary implications for virus
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pp. 285-298
New strategies for prevention and control of viraldiseases: foot-and-mouth disease virus as amodel.
Publicaciones/Publications:
Research summary
Foot-and-mouth disease virus (FMDV) is
one of the major concerns for animal
health. It is also an interesting model
system for understanding the interactions
of a highly variable virus and its natural
hosts and the implications of these
interactions on disease control.
We are involved in the characterization
of the cellular immune response to FMDV
and its conventional vaccines in pigs. We
are also participating in the design of new
vaccines and the analysis of their
immunogenicity in animal models. T cell
epitopes that are efficiently recognized
by porcine lymphocytes have been
identified on FMDV non-structural proteins
(NSP). These epitopes are being included
in the formulation of peptide vaccines
whose immunogenicity is under study.
We are also analyzing the functional role
of RNA regulatory elements and FMDV
NSP. The 3’NCR of FMDV RNA is
essential for virus replication in cell culture
and in animal models. We have also
demonstrated the implication of NSP 3A
in viral host range. A single amino acid
substitution in this protein can mediate
adaptation of foot-and-mouth disease
virus to guinea-pig.
Finally, we have worked on the
development of methods for serological
diagnosis and for optimization of
nucelotide sequencing and phylogenetic
analyses of FMDV and other RNA viruses.
Part of these activities has been carried
out in the BSL3 laboratory that F. Sobrino
utilizes at CISA-INIA. An important part
of the results have been obtained in
collaboration with D. Andreu (U. Pompeu
Fabra), E. Domingo (CBMSO), E. Giralt
(U. Barcelona), V. Ley (INIA), E. Martínez-
Salas (CBMSO), E.L Palma (INTA,
Argentina), M. Sáiz (CISA-INIA) y A.
Villaverde (U.A. Barcelona), and as a
result of the participation in the EU
projects: FAIR CT97-3665 y CT96 1317.
F. Sobrino:
Miembro del Comité de Redacción y del Consejo
Editorial de la Revista Oficial de la Sociedad
Española de Virología. (1999- ).
Miembro del Editorial Board de Veterinary
Reserach (Elsevier). (1998- ).
Miembro del Scientific Panel of the Action Access
to Research Infrastructures, HPRI-CT2001-00131,
of the EU Improving Human Potential Programme.
CISA-INIA. (2002 - ).
Miembro del Comité Científico Técnico del Centro
de Investigación en Sanidad Animal (CISA) del
INIA, MCYT. ( Feb 2002 - Mayo 2002).
Miembro de Comité Asesor a la Dirección del
Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA)
del INIA, MCYT.(Junio 2002 - ).
Director del XI Curso Internacional sobre
enfermedades Exóticas Animales (AECI-INIA).
CISA-INIA, Valdeolmos, Madrid. Noviembre 2002.
J.I. Núñez:
Seleccionado como Experto internacional en
Diagnóstico y Epidemiología Molecular cuantitativa
por la FAO en el proyecto TCP/CUB/8926(A)
“Epidemiología molecular del virus de la peste
porcina clásica”. 2000-2001.
Seleccionado como Experto por la Oficina de
Alimentación y Veterinaria de la Comunidad
Europea (UE) en la Comisión de seguimiento y
evaluación de la fiebre aftosa en Brasil y Uruguay
. Enero-febrero 2001.
Distinción a la labor científica durante los años
académicos 98-99 y 99-00 por el Instituto de
Investigaciones Agrarias y Alimentarias INIA, 23
de marzo de 2001.
Coordinador del Curso Internacional de
Epidemiología molecular y enfermedades
transfronterizas de los animales domésticos,
organizado por la FAO. CENSA- San José de las
Lajas, Cuba, mayo de 2001
Colaboración con la empresa Tecnología para el
Diagnóstico e Investigación (TDI, SA), para el
desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico y
caracterización de virus.
Otras actividades y reconocimientos científicos /Other scientific activities and awards
Colaboraciones con la industria /Collaborations with Industry
69
Resumen de Investigación
Nuestro trabajo se centra en el estudio de
los programas madurativos que determinan
la especificación de diferentes linajes
celulares a partir de un precursor
hematopoyético multipotencial. En concreto,
hemos identificado las rutas madurativas
que determinan la generación in vivo de
linajes hematolinfoides alternativos (linfocitos
T, células dendríticas -DC-, o células NK),
a partir de los progenitores que colonizan
el timo humano. Nuestro objetivo final es
definir la contribución de genes concretos
en la especificación celular para identificar
los mecanismos implicados en la generación
de patologías asociadas al desarrollo
linfohematopoyético.
Durante el bienio 2001-2002, nuestros
estudios han incidido en tres aspectos:
1) Ontogenia de las DCs intratímicas.
La identificación en el timo humano de una
nueva población de DCs, generadas in vivo
a través de un progenitor intermediario
mieloide, cuestiona la idea aceptada de
que las DCs intratímicas tienen origen
linfoide y demuestra que el timo se coloniza
por progenitores inmaduros que retienen
ambas potencialidades, linfoide y mieloide.
2) Regulación de la expresión del pre-
TCR durante el desarrollo linfoide T.
La expresión estadio-específica del pre-
TCR se regula a nivel transcripcional,
existiendo una expresión diferencial de las
formas pT a y pT b de procesamiento
alternativo del mRNA de pT durante el
desarrollo intratímico. Además, sólo pT a
es capaz de expresarse en la membrana
formando parte del complejo CD3-pre-TCR,
mientras que pT b se asocia con la cadena
TCR y la retiene intracelularmente, lo que
sugiere que pT b también participa en la
regulación de la expresión en superficie del
pre-TCR.
3) Mecanismos moleculares de control
de los niveles de expresión del pre-TCR.
Hemos demostrado que la limitada
expresión del pre-TCR en la superficie
celular está regulada por la cadena pT y
es independiente de la composición
bioquímica del módulo CD3/ . La cadena
pT induce la internalización y degradación
constitutiva del pre-TCR y su región
citoplásmica posee una función de retención
en el retículo endoplásmico. Ambos
mecanismos contribuyen a la regulación de
los niveles de expresión en superficie del
pre-TCR.
Jefe de Línea / Group Leader:
María Luisa Toribio
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
Gretel Nusspaumer
Susana Rojo
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Marina García Peydró
Almudena Rodríguez Ramiro
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Virginia García de Yébenes
María de las Nieves Navarro
Yolanda Rodríguez Carrasco
Técnico de Investigación /
Technical Assistance:
Angel Manuel Martínez
Desarrollo del sistemalinfohematopoyético humano
C.14Inmunología y Virología
Immunology and Virology
Acumulación intracelular y colocalización de las subunidades pT y TCR del pre-TCR
humano con la proteína PDI residente en el retículo endoplásmico (ER).
Intracellular accumulation and colocalization of pT and TCR subunits of the human
pre-TCR with the ER-resident PDI protein.
70
Carrasco, Y.R., Ramiro, A.R., Trigueros, C., de Yébenes,
V.G., García-Peydró, M., Toribio, M.L. (2001) Identification
of an endoplasmic reticulum retention function for the
cytoplasmic tail of the human pre-T cell receptor (TCR)
chain: A possible role in the regulation of cell-surface
pre-TCR expression levels. J. Exp. Med. 193, 1045-1057
Ramiro, A.R., Navarro, M.N., Carreira, A., Carrasco, Y.R.,
de Yébenes, V.G., Carrillo, G., San Millán, J.L., Rubin,
B., Toribio, M.L. (2001) Differential developmental
regulation and functional effects on pre-TCR surface
expression of human pT a and pT b spliced isoforms.
J. Immunol. 167, 5106-5114
Rubin B., Alibaud L., Huchenq-Champagne, A., Arnaud,
J., Toribio, M.L., Constans, J. (2002) Some hints
concerning the shape of T-cell receptor structures. Scand
J Immunol. 55, 111-118
Ichimiya S., Kojima, T., Momota, H., Kondo, N., Ozaki,
T., Nakagawara, A., Toribio, M.L., Imamura, M., Sato, N.
(2002) p73 is expressed in human thymic epithelial cells.
J. Histochem. Cytochem. 50, 455-462
de Yébenes, V.G., Carrasco, Y.R., Ramiro, A.R., Toribio,
M.L. (2002) Identification of a myeloid intrathymic pathway
of dendritic cell development marked by expression of
the GM-CSF receptor. Blood 99, 2948-2956
Carrasco, Y.R., Navarro, M.N., Ramiro, A.R., Toribio, M.L.
(2002) Regulation of surface expression of the human
pre-TCR. Semin. Immunol. 14, 325-334
de Yébenes, V.G., García-Peydró, M., Toribio, M.L. (2002)
Lymphoid developmental potential of human
hematopoietic progenitors transduced with retroviral
vectors. Inmunología 21, 121-128
Patentes / Patents
Toribio, M.L., Carrillo, G., Ramiro, A.R., de Yébenes,
V.G., Carrasco, Y.R.(2001). “Pre-receptor de las células
T (pre-TCR): Caracterización y regulación de su expresión
durante el desarrollo de las células T en humanos”.
CSIC. PCT/ ES02/ 00387 (España, Europa, USA,
Canadá, Japón).
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Yolanda Rodríguez Carrasco. 2001. “Mecanismos
moleculares que regulan la expresión del complejo pre-
TCR en la membrana: implicación del dominio
intracitoplásmico de la proteína pT . Universidad
Autónoma de Madrid.
Virginia García de Yébenes Mena. 2002. “Plasticidad de
los progenitores hematopoyéticos del timo humano:
desarrollo de sistemas de modificación genética para el
estudio de la diversificación de linajes celulares”.
Universidad Autónoma de Madrid.
Development of the humanlymphohematopoietic system
Publicaciones/Publications:
Research summary
Our work aims at understanding the
maturation programs that lead to lineage
specification from hematopoietic stem
cells. Particularly, we have contributed to
the identification of the developmental
pathways that specify the generation of
alternative hematolymphoid lineages (T,
dendritic –DCs-, and NK cell lineages)
from the earliest thymic precursors. Our
final aim is to determine the contribution
of particular genes to critical cell-fate
choices, in order to identify pathogenetic
events linked to lymphohematopoietic
development.
During the years 2001-2002 , our work
has focused on three main topics:
1) Developmental origin of intrathymic
DCs.
The identification in our lab of a novel
population of intrathymic DCs that develop
in vivo through an intermediate myeloid-
restricted progenitor challenges the
current view that all intrathymic DCs are
lymphoid-derived, and provide evidence
that precursors seeding the human
thymus are actually uncommitted
progenitors that retain the potential to
develop into both lymphoid- and
myelomonocytic-lineage cells.
2) Regulation of pre-TCR gene
expression and function during T cell
development.
Expression of pT a and pT b mRNA
spliced products is differentially regulated
along intrathymic development,
suggesting that stage-specific expression
of the pre-TCR is regulated at the
transcriptional level. In addition, we found
that only pT a is capable of inducing
surface expression of a CD3-associated
pre-TCR, while pT b pairs with and
retains TCR intracellularly. Thus, pT b
may also contribute to the regulation of
surface pre-TCR
3) Molecular mechanisms that control
surface pre-TCR expression levels.
Our studies showed that low surface
expression of the human pre-TCR is
independent of the biochemical
composition of the CD3/ modules, but
depends on the pT chain itself. We found
that the pT cytoplasmic tail serves an
endoplasmic reticulum retention function,
and propose that pT plays a direct role
in promoting constitutive internalization
and degradation of the pre-TCR. Both
mechanisms may thus contribute to the
regulation of surface pre-TCR expression
levels.
Localización subcelular de las isoformas pT a y pT b. Patrón de expresión intracelular (A) y de
superficie (B) de proteínas quiméricas pT a-GFP y pT b-GFP en transfectantes estables de células
pre-T.
Subcellular localization of pT a and pT b isoforms. Intracellular (A) and surface (B) expression patterns
of chimeric pT a-GFP and pT b-GFP proteins in pre-T cell stable transfectants.
71
Resumen de Investigación
Replicación del DNA de ø29
Hemos continuado el estudio del
mecanismo de iniciación de la replicación
del DNA de ø29 mediante proteína terminal
(TP), así como el de otras proteínas
implicadas en replicación.
Los residuos Tyr59, His61 y Phe69 de la
DNA polimerasa de ø29, localizados en el
dominio N-terminal, son esenciales para la
interacción con la TP. En el dominio C-
terminal, la Lys392, conservada en DNA
polimerasas que inician con TP, localizada
a continuación del motivo Kx3NSxYG, es
importante para la unión correcta del
nucleótido en la iniciación de la replicación.
Por otra parte, la Lys371, que precede al
motivo Kx3NSxYG, conservada en las DNA
polimerasas de tipo eucariótico, está
implicada en la unión del nucleótido entrante
en las reacciones de iniciación y
polimerización.
La función de la proteína p6 de ø29 in vivo
requiere la formación de dímeros. Por otra
parte, la p6 se une in vivo preferentemente
a los extremos del DNA de ø29, lo que
confirma resultados obtenidos in vitro.
Además, la unión de la p6 al DNA in vivo
aumenta ~30 veces en presencia de
novobiocina, que disminuye el
superenrollamiento negativo del DNA. Estos
resultados sugieren que el DNA de ø29,
aunque no está cerrado covalentemente,
tiene restricción topológica in vivo.
La proteína p17, en forma dimérica,
interacciona con la p6 in vitro y favorece la
unión de ésta a los extremos del DNA de
ø29.
Mediante mutagénesis de deleción hemos
demostrado que la región N-terminal de la
proteína SSB del fago GA-1, relacionado
con ø29, en concreto los aminoácidos 19
a 26, son esenciales para la oligomerización
de la proteína y para su funcionalidad.
Por mutagénesis dirigida hemos
determinado que el motivo “coiled-coil” de
la proteína p1 de ø29 está implicado en la
formación de láminas bidimensionales in
vitro. La proteína p1 también forma
estructuras multiméricas in vivo asociadas
a la membrana bacteriana, lo que sugiere
que la p1 suministra un sitio de anclaje para
la replicación del DNA de ø29.
La p16.7 de ø29 es una proteína dimérica
integral de membrana que se une al DNA
de cadena simple, forma multímeros e
interacciona con la TP. Hemos propuesto
que la función de p16.7 es la unión de los
intermedios replicativos a la membrana
bacteriana mediante la interacción con la
TP y con el DNA de cadena simple.
Transcripción del DNA de ø29
Hemos completado la secuencia del DNA
del fago GA-1, y se ha realizado un análisis
de los promotores tempranos del mismo.
Se ha demostrado que la represión del
promotor C2 temprano de ø29 por la
proteína p6 se debe a un defecto en la
formación del complejo cerrado.
La proteína p6 coopera con la proteína
reguladora p4 de ø29 en el control del
cambio de la transcripción temprana a
tardía. La formación de un complejo
nucleoprotéico de ambas proteínas con el
DNA de ø29 da lugar a represión de los
promotores tempranos A2b y A2c y
activación del promotor tardío A3. La
represión del promotor A2c se debe a la
inhibición de la formación del complejo de
transcripción abierto. La formación estable
del complejo nucleoprotéico requiere la
interacción entre la p6 y la región C-terminal
de la p4.
Jefe de Línea / Group Leader:
Margarita Salas
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
Alicia Bravo
Ana Camacho
José Miguel Hermoso
Wilfried J.J. Meijer
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Ana Abril
Belén Calles
Emmanuelle Dufour
Ralf Eisenbrandt
Irene Gascón
Víctor González-Huici
José A. Horcajadas
Alejandro Serna-Rico
Verónica Truniger
Becarios Predoctorales /
Predoctoral Students:
Martín Alcorlo
Elisa Longás
Daniel Muñoz
Laura Pérez
Irene Rodríguez
Gemma Serrano
Estudiantes / Undergraduate
Students:
Blanca Manzano
Patricia Pérez
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
José Mª. Lázaro
Ángeles Martínez
Laurentino Villar
Replicación y transcripción del DNAdel bacteriófago ø29
C.15Inmunología y Virología
Immunology and Virology
Análisis mutacional en la proteína p1 del fago ø29
Mutational analysis in the phage ø29 protein p1
72
Replication and transcription ofbacteriophage ø29 DNA
Publicaciones/Publications:
Research summary
Replication of ø29 DNA
We have continued with the studies of
the mechanism of ø29 DNA initiation of
replication primed by the TP, as well as
of others proteins involved in replication.
Residues Ty59, His61 and Phe69 of ø29
DNA polymerase located at the N-terminal
domain are essential for the interaction
with the TP. At the C-terminal domain,
Lys392, conserved in DNA polymerases
that use TP as primer, located adjacent
to motif Kx3NSxYG, is important for
correct binding of the templating
nucleotide during initiation of ø29 DNA
replication. On the other hand, Lys371,
that precedes motif Kx3NSxYG,
conserved in eukaryotic-type DNA
polymerases, is involved in the binding of
the incoming nucleotide in initiation and
polymerisation reactions.
In vivo studies have shown that formation
of p6 dimers are required for its function.
On the other hand, p6 interacts in vivo
preferentially with the ø29 DNA ends,
confirming in vitro results. In addition, p6
binding to DNA in vivo increases ~30 fold
in the presence of novobiocin, that
decreases the negative supercoiling of
DNA. These results suggest that ø29
DNA, although it is not covalently closed,
is topologically constrained in vivo.
Protein p17 dimers interact with p6 in vitro
and favor p6 binding to the ø29 DNA
ends.
By deletion mutagenesis we have shown
that the N-terminal region of the SSB
protein of the ø29-related phage GA-1,
specifically amino acids 19 to 26, are
essential for the oligomerization and
functionality of the protein.
By site-directed mutagenesis we have
shown that the coiled-coil motif of ø29
protein p1, is involved in the in vitro
formation of bidimensional sheets. Protein
p1 also forms multimeric structures in
vivo associated to the bacterial
membrane, suggesting that p1 provides
an anchoring site for ø29 DNA replication.
The ø29 dimeric protein p16.7 is an
integral membrane protein that binds to
single-stranded DNA (ssDNA), forms
multimers and interacts with the TP. We
have proposed that p16.7 function is the
attachment of the replicative intermediates
to the bacterial membrane through the
interaction with the TP and with ssDNA.
Transcription of ø29 DNA
We have completed the sequence of GA-
1 DNA and analysed its early promoters.
We have shown that the repression of the
ø29 early promoter C2 by protein p6 is
due to impairment of closed complex
formation.
Ø29 protein p6 cooperates with the
regulatory protein p4 in the switch from
early to late transcription. The formation
of a multiprotein complex of both proteins
with ø29 DNA leads to repression of the
early promoters A2b and A2c and
activation of the late promoter A3.
Repression of promoter A2c results from
inhibition of open complex formation. The
stable formation of the nucleoprotein
complex requires interaction between p6
and the C-terminal region of p4.
Meijer, W.J.J. Serna-Rico, A., Salas, M. (2001)
Characterization of the bacteriophage ø29-encoded
protein p16.7: a membrane protein involved in phage
DNA replication. Mol. Microbiol. 39, 731-746
Calles, B., Monsalve, M., Rojo, F. , Salas, M. (2001) The
C-terminal domain of the RNA polymerase alpha subunit
plays a role in the stability of open complexes formed at
the phage ø29 late A3 promoter. J.Mol.Biol. 307, 487-
497
Meijer, W.J.J., Horcajadas, J.A., Salas, M. (2001) The
ø29-family of phages. Microb.Mol.Biol.Rev. 65, 261-287
Bravo, A., Serrano-Heras, G., Salas, M. (2001) A single
amino acid substitution within a coiled-coil motif changes
the assembly of a 53-amino-acid protein from two-
dimensional sheets to filamentous structures.
J.Biol.Chem. 276, 21250-21256
Brenkman, A.B. Heideman, M.R., Truniger, V., Salas, M.,
van der Vliet, P.C. (2001) The "YXGG/A" motif of
adenovirus DNA polymerase affects template DNA
binding and the transition from initiation to elongation.
J.Biol.Chem. 276, 29846-29853
Camacho, A., Salas, M. (2001) Repression of
bacteriophage ø29 early promoter C2 by the viral protein
p6 is due to the impairment of the closed complex.
J.Biol.Chem. 276, 28927-28932
Camacho, A., Salas, M. (2001) Mechanism for the switch
of ø29 DNA early to late transcription by regulatory
protein p4 and histone-like portein p6. EMBO J. 20,
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Horcajadas, J.A., Meijer, W.J.J., Rojo, F., Salas, M.
(2001) Analysis of early promoters of the Bacillus
bacteriophage GA-1 J.Bacteriol. 183, 6965-6970
Salas, M. (2002) Genus ø29-like viruses (Podoviridae).
The Springer Index of Viruses. Springer-Verlag. pp. 798-
803
Serna-Rico, A., Salas, M., Meijer, W.J.J. (2002) The
Bacillus subtilis phage ø29 protein p16.7, involved in
ø29 DNA replication, is a membrane-localizaed single-
stranded DNA-binding protein. J.Biol.Chem. 277, 6733-
6742
Truniger, V., Lázaro, J.M., Blanco, L., Salas, M. (2002)
A highly conserved lysine residue in ø29 DNA polymerase
is important for correct binding of the template strand
during initiation of ø29 DNA replication. J.Mol.Biol. 318,
83-96
73
Replicación y transcripción del DNA del bacteriófago ø29
Publicaciones cont./Publications cont.:
Truniger, V., Lázaro, J.M., Esteban, F.J., Blanco, L.,
Salas, M. (2002) A positively charged residue in DNA
polymerases from families A and B, is involved in binding
the incoming nucleotide. Nucl.Acids.Res. 30, 1483-
1492
Eisenbrandt, R., Salas, M., de Vega, M. (2002) ø29
DNA polymerase residues Tyr59, His61 and Phe69 of
the highly conserved ExoII motif, are essential for
interaction with the terminal protein. Nucl.Acids.Res.
30,1379-1386
Gascón, I., Carrascosa, J.L., Villar, L., Lázaro, J.M.,
Salas, M. (2002) Importance of the N-terminal region
of the phage GA-1 SSB for its self-interaction ability
and functionality. J.Biol.Chem. 277, 22534-22540
Abril, A.M., Salas, M., Hermoso, J.M. (2002) The in vivo
function of phage ø29 nucleoid-associated protein p6
requires formation of dimers. Gene 296, 187-194
Calles, B., Salas, M., Rojo, F. (2002) The ø29
transcriptional regulator contacts the nucleoid protein
p6 to organize a repression complex. EMBO J. 21,
6185-6194
Irene Gascón Escobar. 2001. “Caracterización
estructural y funcional de las SSBs de los fagos Nf y
GA-1. Estudio comparativo con la SSB de ø29”.
Universidad Autónoma de Madrid.
Víctor González-Huíci. 2001. “Reconocimiento del origen
de replicación del DNA del bacteriófago ø29”.
Universidad Autónoma de Madrid.
Belén Calles Arenales. 2002. “Regulación de la
transcripción de los promotores A3 y A2c del
bacteriófago ø29 de Bacillus subtilis. Función de las
proteínas p4 y p6”. Universidad Autónoma de Madrid.
Margarita Salas
Nombrada Asturiana del Siglo XX por El Comercio.
Diario de Información (2001).
Elegida entre las 100 Mujeres del Siglo XX que abrieron
el camino a la igualdad en el Siglo XXI por el Consejo
de la Mujer de la Comunidad de Madrid (2001).
Nombrada Patrona de la Fundación Foro Jovellanos
del Principado de Asturias (2001- ).
Miembro del Colegio Libre de Eméritos (2001– ).
Miembro Electo de la Real Academia de la Lengua
(2001- ).
Miembro del Patronato de la Fundación ICO (2001- ).
Co-dirigió el curso: "Procesos moleculares básicos de
los organismos y su patología" de la Escuela de Biología
Molecular "Eladio Viñuela". Universidad Internacional
Menéndez Pelayo (2001).
Member of The Novartis Foundation Scientific Advisory
Panel (2002– ).
Premio Isabel Ferrer de la Generalitat Valenciana (2002).
Medalla de Oro de la Comunidad de Madrid (2002).
Doctora Honoris Causa por la Universidad de
Extremadura (2002).
Co-dirigió el curso “Nuevas perspectivas en Biomedicina
y Biotecnología“ de la Escuela de Biología Molecular
“Eladio Viñuela”. Universidad Internacional Menéndez
Pelayo (2002).
Tesis Doctorales / Doctoral Theses Premios / Awards / Other Activities
74
Distribución regional de los transportadores GLYT1 (verde)y v-GLUT (rojo) en el área CA3 en hipocampo de cerebrode rata.
76
DNeurobiologíaNeurobiology
D.1 Bases moleculares de la neurotransmisiónglicinérgica
D.1 Molecular basis of glycinergicneurotransmission
Carmen Aragón
D.2 Función de las proteínas microtubulares enneuronas
D.2 Function of microtubular proteins in neurons
Jesús Avilade Grado
D.3 Transducción de señales. Mecanismos deacción de neuromoduladores e implicacionesfarmacológicas
D.3 Signal transduction. Mechanisms of actionof neuromodulators and pharmacologicalimplications
Edgardo Catalán
D.11 Neuropatología molecular de la enfermedadde alzheimer
D.11 Molecular neuropathology of alzheimer'sdisease
FernandoValdivieso
D.10 Neurodegeneración y envejecimiento:señalización mitocondrial del calcio yseñalización de insulina/leptina enenvejecimiento
JorginaSatrústegui
D.10 Neurodegeneration and ageing: calciumsignalling in mitochondria and insulin/leptinsignalling during ageing
D.9 Neurotransmisión y desarrolloD.9 Neurotransmission and development
Galo Ramírez
D.8 Mecanismos de señalización y regulación dereceptores acoplados a proteínas G
D.8 G protein-coupled receptors signaling andregulatory mechanisms
Federico Mayor, jr.
D.7 Biología de células troncales neuraleshumanas. Potencial para reposición celulary terapia génica en neurodegeneración
D.7 Biology of human neural stem cells. Potentialfor gene therapy in neurodegeneration
AlbertoMartínez Serrano
D.6 Bases moleculares de la adaptación alejercicio y de la plasticidad muscular
D.6 Molecular bases of the adaptation to exerciseand of skeletal muscle plasticity
Rafael Manso
D.5 Regulación de la expresión génica enenfermedades neurogegenerativas
D.5 Regulation of the gene expression inneurodegenerative diseases
Cecilio Giménez
D.4 Bases moleculares de la plasticidad neuronalD.4 Molecular basis of neuronal plasticity
F. JavierDíez Guerra
Resumen de Investigación
La glicina es un neurotransmisor inhibidor
en la médula espinal y en el tallo cerebral
de vertebrados que interviene en el
procesamiento de la información sensorial
y motora de actividades como el
movimiento, visión y audición. Así mismo,
la glicina tiene un papel excitador como co-
agonista del glutamato sobre receptores
NMDA en corteza e hipocampo. Los
transportadores específicos de glicina de
la membrana plasmática de las terminales
presinápticas y de los procesos gliales,
denominados GLYT1 y GLYT2,
desempeñan un papel importante en la
finalización de la transmisión glicinérgica,
manteniendo concentraciones
extracelulares de glicina bajas y elevados
niveles en el interior celular. Las alteraciones
en la actividad de GLYT1 y GLYT2 podrían
estar implicadas en patologías relacionadas
con la actividad muscular esquelética y con
un tipo de esquizofrenia asociada a una
hipofunción de los receptores NMDA. Los
transportadores de glicina son, por tanto,
considerados actualmente como dianas
de futuros compuestos con acción
terapéutica.
El objetivo de nuestro grupo es el estudio
a nivel molecular de la estructura,
mecanismo funcional y regulación de GLYT1
y GLYT2, con el objeto de profundizar en
la fisiología y patología de la
neurotransmisión glicinérgica.
Hemos eliminado los cuatro sitios de
glicosilación del segundo bucle extracelular
de GLYT2 mediante mutagénesis dirigida,
lo que nos ha permitido demostrar que las
cadenas de oligosacáridos constituyen
señales de inserción y distribución
asimétrica del transportador en la
membrana apical de células polarizadas.
Las propiedades dinámicas del bucle
extracelular 1(EL1) de GLYT1 y GLYT2 han
sido estudiadas mediante técnicas
bioquímicas y electrofisiológicas utilizando
mutaciones puntuales y transportadores
quiméricos. Nuestros resultados sugieren
que EL1 es una fuente de heterogeneidad
estructural entre la familia de
transportadores de neurotransmisores y
que funciona a modo de una visagra que
fluctúa entre diferentes conformaciones
secuenciales durante el ciclo de transporte.
En cuanto a la regulación de estas
proteínas, hemos demostrado la existencia
de un mecanismo regulador mediado por
proteínas del complejo SNARE que
aumenta la expresión en membrana de
GLYT2 durante la neurosecreción de glicina.
Mediante la aplicación de técnicas de
microscopía electrónica y detección
inmunológica con oro coloidal a una
preparación de vesículas sinápticas
purificadas hemos localizado GLYT2 en
estos orgánulos, lo que sugiere que a través
del tráfico intracelular del transportador
existe una estrecha coordinación entre la
liberación de neurotransmisor y su recaptura
por los transportadores en la sinapsis.
Jefe de Línea / Group Leader:
Carmen Aragón*
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
Beatriz López-Corcuera
Postdoctoral / Postdoctoral Fellow:
Arjan Geerlings
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Amparo Fornés
Lara Rodenstein
Pablo Alonso
Técnico de Investigación /
Technical Assistance:
Enrique Núñez
*Jefe de línea asociado
Bases moleculares de la neurotransmisiónglicinérgica
D.1NeurobiologíaNeurobiology
78
López-Corcuera, B., Geerlings, A., Aragón, C. (2001)
Glycine neurotransmitter transporters: an update. Mol.
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Molecular basis of glycinergic neurotransmission
Publicaciones/Publications:
Research summary
Glycine is an inhibitory neurotransmitter
in the spinal cord and the brain stem of
vertebrates that participates in the
processing of motor and sensory
information and is involved in several
functions like movement, vision, and
audition. In addition, glycine acts as an
necessary coagonist of glutamate, the
main excitatory neurotransmitter in the
brain, on NMDA receptors. Two specific
glycine transporters, GLYT1 and GLYT2,
located at the plasma membrane of pre-
synaptic nerve terminals or surrounding
glial processes, play a major role in the
final step of synaptic transmission
maintaining a low extracellular and high
intracellular concentration of glycine.
Dysfunctions of GLYT1 or GLYT2 could
be involved in pathologies dealing with
disturbed musculoskeletic activity, and a
kind of schizophrenia related to NMDA
hypofunction. Therefore, glycine
transporters are now considered as
targets of future therapeutic drugs.
Our group is studying the molecular
properties of GLYT1 and GLYT2, mainly
structure-function relationship and
regulation characteristics, with the aim to
understand the physiology and pathology
of glycine-mediated neurotransmission.
By site-directed mutagenesis of the four
N-glycosylation sites located in the second
extracellular loop of GLYT2, we have
identified the carbohydrate moiety as
signals for targeting and sorting to apical
membrane when this neuronal transporter
is expressed in polarized cells.
The dynamic properties of the extracellular
loop1 (EL1) domain of glycine transporters
have been studied by biochemical and
electrophysiological methods with
chimeric and point mutant transporters.
Our results suggest that EL1 is a source
of structural heterogeneity among the
family of neurotransmitter transporters
and acts as a fluctuating hinge undergoing
sequential conformational changes during
the transport cycle.
We have reported the existence of a
SNARE-mediated regulatory mechanism
that controls the surface expression of
GLYT2 in a brain-derived preparation.
Under conditions that stimulate vesicular
glycine release, GLYT2 is rapidly traffics
first toward the plasma membrane and
then internalized. This coordinated
regulation of glycine neurosecretion and
glycine reuptake has been also supported
by GLYT2 localization on synaptic vesicles
by immunogold electron microscopy.
79
Resumen de Investigación
Nuestro trabajo ha continuado en el estudio
de la función de las proteínas
microtubulares, fundamentalmente la
proteína asociada a los microtúbulos
MAP1B, en el desarrollo de la forma
neuronal; la implicación de la proteína
asociada a los microtúbulos, tau, en
procesos de degeneración neuronal que
cursan con la aparición de agregados
aberrantes de dicha proteína, y el análisis
de la regeneración neuronal.
Sobre la implicación de la proteína MAP1B
en el desarrollo de la forma neuronal hemos
encontrado que MAP1B juega un importante
papel en el proceso de elongación axonal
y que puede complementar a otras proteínas
como MAP2 y tau para la determinación
de la forma neuronal. Para estos análisis
se ha utilizado un ratón deficiente en
MAP1B, y en estudios de cultivos de
neuronas se han utilizado oligonucleótidos
antisentido para inhibir la expresión de
MAP2 y tau.
La agregación aberrante de tau ha sido
estudiada a tres niveles; in vitro, en cultivos
celulares, y en ratones transgénicos.
Experimentos in vitro han determinado la
región de la molécula de tau,
fundamentalmente implicada en el proceso
de autoasociación. También, mediante
experimentos in vitro, se ha observado que
la proteína tau cambia su conformación
durante el proceso de su polimerización.
En experimentos en cultivos celulares se
ha logrado observar la formación de
agregados de tau hiperfosforilado,
habiéndose encontrado que la fosforilación
de tau por la proteína GSK3 puede facilitar
dicho ensamblaje.
En base a los resultados anteriores se aisló
un ratón transgénico condicional que
sobreexpresa GSK3. En este ratón, tau está
hiperfosforilado, su asociación a los
microtúbulos está disminuida, pero no forma
agregados aberrantes. Sin embargo, el
estudio de su comportamiento sugiere
defectos en su memoria. También, el ratón
presentaba unas características patológicas
similares a las encontradas en enfermos
de Alzheimer. Adicionalmente, se aisló un
ratón transgénico que sobreexpresa tau
humano conteniendo alguna de las
mutaciones que se encuentran en la
demencia frontotemporal asociada al
cromosoma 17 (FTDP-17). La
caracterización de este ratón indicó la
presencia en su cerebro de agregados
aberrantes de tau. Tanto en este ratón como
en el que sobreexpresa GSK3 podrían ser
utilizados como modelos para estudiar
alguna de las características patológicas
que tienen lugar en la enfermedad de
Alzheimer.
Sobre la regeneración axonal hemos
continuado estudiando las células de glía
envolvente y hemos observado que en
procesos de regeneración axonal hay un
aumento en la expresión de la proteína
MAP1B fosforilada.
Jefe de línea / Group Leader:
Jesús Avila de Grado
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
José Javier Lucas
Javier Díaz-Nido
María Teresa Moreno-Flores
Félix Hernández
Filip Lim
Mar Pérez
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Christian González-Billault
Ester Martín
Miguel Díaz
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Alberto Gómez
Eva-María Jiménez
Erika Pastrana
Tobías Engel
Raquel Gómez
Alfredo Giménez
Olga Abbad
Técnicos de Investigación /
Technical Assitance:
Raquel Cuadros
Elena Langa
Chus Martín
Santiago Soto-Largo
Función de las proteínas microtubularesen neuronas
D.2NeurobiologíaNeurobiology
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Ester Martín Aparicio. 2002. “Caracterización del modelo
transgénico condicional de la enfermedad de Huntington:
estudios in vivo y en cultivos primarios”.
Premios / Awards
Premio de la Comunidad de Madrid, 2001. / Prize from
the Comunidad de Madrid, 2001.
Premio de la Fundación Pfizer, Envejecimiento y Calidad
de Vida, 2001. / Prize of Fundación Pfizer, 2001.
Premio de la Fundación Pfizer, Envejecimiento y Calidad
de Vida, 2002. / Prize of Fundación Pfizer, 2002.
Premio de la Fundación Lilly en Investigación Biomédica,
2002. / Prize of Fundación Lilly on Biomedical Research,
2002.
80
Function of microtubular proteins in neurons
Publicaciones/Publications:
Research summary
We have continued in our analysis of the
function of a microtubule associated
protein, MAP1B, in the development of
neuron morphology; in the study of the
role of other microtubule associated
protein, tau, in neurological disorders
(tauopathies) characterized by the
appearance of aberrant aggregates of
that protein; and in the analysis of axonal
regeneration in damaged neurons.
About the function of MAP1B in neuron
morphogenesis we have found that this
protein plays an important role on the
process of axonal elongation. Together
with other microtubule associated proteins
like MAP2 and tau, MAP1B could
determine the neuron shape. For these
analyses we have used a mouse lacking
MAP1B and neuron cultures where the
expression of MAP2 and tau has been
prevented by addition of antisense
oligonucleotides.
We have studied the aberrant tau
aggregation at three different levels; in
vitro, in cell culture and by using transgenic
mice. In vitro analysis has indicated the
region, in tau molecule, involved in self-
association. Additional in vitro experiments
indicated that tau protein modifies its
conformation when it polymerizes into
filaments.
By using cellular cultures, some conditions
were developed to allow the formation of
hyperphosphorylated tau aggregates.
Moreover, it was shown that the
modifications of tau protein by GSK3
could facilitate its aggregation.
Based in the previous results, a transgenic
mouse overexpressing GSK3, in a
conditional way, was isolated. In this
mouse, tau is in hyperphosphorylated
form, this modified tau shows a lower
microtubule binding capacity, but it does
not form aberrant aggregates. However,
some memory deficits were observed by
doing behavioural tests, and it presents
some pathological features similar to those
found in Alzheimer´s disease patients.
Additionally, we isolated another
transgenic mouse overexpressing human
tau containing those mutations that are
found in some patients with frontotemporal
dementia linked to chromosome 17
(FTDP-17).
The characterization of this mouse
showed the presence, in its brain, of
aberrant aggregates of tau. Thus, this
mouse and that one overexpressing GSK3
may be used as models for some
pathological features that take place in
Alzheimer´s disease.
About axonal regeneration we have
continued the characterization of
ensheating glia cells and we found that
during nerve regeneration is an increase
of MAP1B in phosphorylated form.
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81
NeurobiologíaNeurobiology
Publicaciones/Publications:
Función de las proteínas microtubulares en neuronas
Function of microtubular proteins in neurons
Jefe de línea / Group Leader:
Jesús Avila de Grado
e-mail: [email protected]
D.2
Sustituye las publicaciones
del grupo del Dr. Jesús Ávila de Grado (pag.81)
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Wataya, T., Nunomura, A., Smith, M. A., Siedlak, S. L.,Harris, P. L., Shimohama, S., Szweda, L. I., Kaminski, M.A., Avila, J., Price, D. L., Cleveland, D. W., Sayre, L. M.,Perry, G. (2002) High molecular weight neurofilamentproteins are physiological substrates of adduction by thelipid peroxidation product hydroxynonenal. J. Biol. Chem.277, 4644-4648
Resumen de Investigación
El objetivo principal del proyecto de
investigación lo constituye el estudio de los
mecanismos de transducción implicados
en la acción de neuromoduladores, en
particular endotelina (ET) y factor activante
de plaquetas (PAF), así como la implicación
de agentes farmacológicos específicos. Los
objetivos particulares de este proyecto han
sido:
a) Estudio del mecanismo de acción de la
ET. Los estudios llevados a cabo han
confirmado que el mecanismo de acción
de la ET implica la fosforilación de proteínas
y la participación de mediadores lipídicos;
en este sentido, se ha establecido la relación
entre el neuropéptido y el sistema de
esfingolípidos como otro posible mecanismo
de transducción. Por otra parte, el análisis
del papel de la ET en estados fisiológicos
relacionados con alteraciones patológicas
ha sido analizado, demostrándose cambios
en los perfiles lipídicos en vasos y cerebelo,
así como un descenso en la sensibilidad a
la acción de ET.
b) Estudio del mecanismo de acción del
PAF. Nuestros estudios han demostrado
que el PAF, a través de sitios de unión
específicos, produce un incremento de
diacilglicerol en el núcleo, lo que
probablemente tiene lugar por mediación
de la activación de fosfolipasa C. Estos
resultados confirman la modulación por
PAF de sistemas de transducción
intranuclear y la existencia de receptores
nucleares específicos. Por otra parte, se ha
demostrado que el PAF aumenta la
fosforilación en tirosina de las proteínas
p125FAK y p130Cas mediante la producción
de NO en hipocampo, hecho que valida del
todo su papel en la funcionalidad del sistema
nervioso.
c) Estudio de la participación de mediadores
lipídicos. El estudio en particular del sistema
de esfingolípidos como vía de transducción
implicada en la acción de
neuromoduladores, ha señalado el papel
de la PI3-quinasa en la translocación nuclear
de la PKC por acción de la ceramida, así
como el papel de derivados como
esfingosina-1-P en el metabolismo nuclear.
d) Estudio de la barrera hematoencefálica
a nivel de sistemas de transducción. Se
han obtenido nuevos datos acerca de la
acción de la ET modulando el sistema de
esfingolípidos, en particular de
esfingosina-1-P.
e) Estudio de sistemas de transducción
mediante agentes farmacológicos.
Jefe de Línea / Group Leader:
Edgardo Catalán
e-mail: [email protected]
Becario Predoctoral /
Graduate Student:
Eduardo Latorre
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
María Victoria Mora-Gil
Transducción de señales. Mecanismos de acción deneuromoduladores e implicaciones farmacológicas
D.3NeurobiologíaNeurobiology
82
Miguel, B.G., Calcerrada, M.C., Martín, L., Catalán, R.E.,
Martínez , A.M. (2001) Increase of phosphoinositide
hydrolysis and diacylglycerol production by PAF in isolated
rat liver nuclei. Prostag. Other Lipid Mediat. 65, 159-166
Miguel, B.G., Calcerrada, M.C., Catalán, R.E., Martínez,
A.M. (2001) Sphingolipid derivatives modulate intracellular
Ca2+ in rat synaptosomes. Acta Neurobiol. Exp. 61, 113-
117
Calcerrada, M.C., Catalán, R.E., Martínez, A.M. (2002)
PAF-stimulated protein tyrosine phosphorylation in
hippocampus: involvement of NO synthase. Neurochem.
Res. 27, 313-318
Latorre, E., Morán, M., Aragonés, M.D., Saborido, A.,
Fernández, I., Delgado, J., Catalán, R.E., Megías, A.
(2002) Exercise training-induced changes in sensitivity
to endothelin-1 and aortic and cerebellum lipid profile in
rats. Lipids 37, 43-52
Calcerrada, M.C., Miguel, B.G., Martín, L., Catalán, R.E.,
Martínez, A.M. (2002) Involvement of phosphatidylinositol-
3-kinase in nuclear translocation of protein kinase C _
induced by C2-ceramide in rat hetapocytes. FEBS Letters
514, 361-365
Signal transduction. Mechanisms of action of neuromodulatorsand pharmacological implications
Publicaciones/Publications:
Research summary
The main goal of this project is to study
the biochemical mechanisms at the
transduction level involved in the action
of neuromodulators, in particular
endothelin (ET) and platelet activating
factor (PAF) and the involvement of new
pharmacological agents. In this regard,
the particular objectives are:
a) Study of the mechanism of action of
ET. Our studies have confirmed that the
mechanism of action of ET involves the
protein phosphorylation and some lipid
mediators; in this regard, the relationship
between the neuropeptide and the
sphingolipid system has been established.
On the other hand, the role of ET in some
physiological conditions related to
physiopathological states has been
analyzed and changes in both vascular
and cerebellar lipid profiles and a
decrease sensitivity to ET action have
been observed.
b) Study of the mechanism of action of
PAF. We have demonstrated that PAF
increases diacylglycerol in the nuclei
through specific nuclear PAF-binding sites.
The changes are due to the activation of
the phospholipase C. These data confirm
a modulation by PAF of intranuclear signal
transduction and the existence of specific
nuclear PAF receptors. On the other hand,
PAF causes an increase on the tyrosine
phosphorylation of two phosphoproteins
which were identified as the focal adhesion
kinase p125FAK and p130Cas. PAF
increased the tyrosine phosphorylation
by the production of NO in hippocampus,
suggesting that PAF may play role in the
functioning of the nervous system.
c) Study of the involvement of lipid
mediators. The study of the sphingolipid
transduction system has indicated the
involvement of PI3-kinase in the nuclear
PKC translocation after ceramide
treatment as well as a role of sphingosine-
1-P on the nuclear metabolism.
d) Functioning of the blood-brain barrier
mainly at the transduction level. New data
about the modulation of sphingolipids, in
particular sphingosine-1-P, by ET have
been observed.
e) Modulation of the transduction systems
by pharmacological agents
83
Resumen de Investigación
Las proteínas de la familia GMC (GAP-43,
Neurogranina, MARCKS, MacMARCKS y
CAP-23) comparten, entre otras
características, una estructura filamentosa,
su interacción con calmodulina y fosfolípidos
y una expresión elevada en tejido nervioso
de mamíferos, especialmente en las
primeras etapas del desarrollo.
Su funcionalidad se relaciona con el
dinamismo morfológico y la motilidad
neuronal, ambos procesos fundamentales
en el marco de la plasticidad neuronal y
reorganización sináptica típicas del
desarrollo. El trabajo de nuestro grupo de
investigación se orienta hacia el
esclarecimiento de los mecanismos de
acción de estas proteínas en el ámbito
molecular y celular, y su estudio como
“dianas moleculares” en el desarrollo de
agentes activos para la regeneración
neuronal y la prevención de
neurodegeneración.
Para ello, estudiamos la expresión,
localización subcelular y modificaciones
post-traduccionales de las proteínas GMC,
así como sus interacciones con otras
proteínas y/o lípidos. Este estudio se realiza
en el contexto de la señalización intracelular
relacionada con el dinamismo del
citoesqueleto de actina, la aparición de
lamelipodios y filopodios, la polarización,
la adhesión y la motilidad celular.
Utilizamos técnicas convencionales de
mutagénesis dirigida y fusión con proteínas
fluorescentes que nos permiten analizar la
relevancia funcional de dominios
estructurales y sitios de fosforilación o
acilación en proteínas GMC, realizar
seguimientos “in vivo” de su traslocación
entre compartimentos subcelulares y
analizar “in situ” su interacción con otras
proteínas mediante técnicas de microscopía
de transferencia resonante de fluorescencia
(FRET). Nuestro interés en conocer el modo
de acción de las proteínas GMC se
fundamenta en su potencial como “dianas
moleculares” para modular localmente la
plasticidad neuronal.
Este conocimiento contribuirá al diseño de
nuevos agentes farmacológicos con acción
sobre la regeneración neuronal post-lesión
acoplada a recuperación funcional y la
prevención de neurodegeneración masiva
asociada con episodios epilépticos.
Jefe de Línea / Group Leader:
F. Javier Díez Guerra
e-mail: [email protected]
Postdoctoral / Postdoctoral Fellow:
Noa Martín Cófreces
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Patricia Molina Ortiz
Irene Domínguez González
Técnico de Investigación /
Technical Assistance:
Carmen Granda Vega
Bases moleculares de la plasticidad neuronalD.4NeurobiologíaNeurobiology
Célula Swiss-3T3 tratada (90 min) con el péptido Ant-IQ(Nrg) biotinilado y visualizado con
estreptavidina-TxRed. Observar la afinidad del péptido por vesículas endocíticas.
84
Sánchez, C., Arellano, J.I., Rodríguez-Sánchez, P., Avila,
J., DeFelipe, J., Díez-Guerra, F:J. (2001) Microtubule-
associated protein 2 phosphorylation is decreased in
the human epileptic temporal lobe cortex. Neuroscience
107, 25-33
Paglini, G., Peris, L., Díez-Guerra, F.J., Quiroga, S.
Cáceres, A. (2001) The cdk5-p35 kinase associates with
the Golgi apparatus and regulates membrane traffic.
EMBO Rep. 2, 1139-1144
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Noa Beatriz Martín Cófreces. 2002. “Fisiología Molecular
de GAP-43: una proteína implicada en guía y extensión
axonal”. Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de
Ciencias.
Molecular basis of neuronal plasticity
Publicaciones/Publications:
Research summary
GMC proteins (GAP-43, Neurogranin,
MARCKS, MacMARCKS and CAP-23)
share, among other features, an elongated
structure, their ability to interact with
calmodulin and phospholipids and their
high expression in mammalian nervous
tissue, particularly during the earlier
stages of development.
Their functionality is associated with
cellular morphology dynamics and also
cellular motility, both of them fundamental
processes central to neuronal plasticity
and synaptic reorganization during
development. Our research group focuses
its work on the understanding of the GMC
proteins mode of action at the molecular
and cellular level, and their potential use
as “molecular targets” of new agents and
treatments designed to enhance neuronal
regeneration and prevent
neurodegeneration.
Thus, we currently study GMC proteins
expression, subcellular localization, post-
translational modifications and interactions
with other proteins or lipids. This study is
carried out in the context of intracellular
signal transduction and actin cytoskeleton
dynamics, lamelipodia and filopodia
formation, and cellular polarity, adhesion
and motility.
We use conventional site-directed
mutagenesis and generation of fusion
quimeras with fluorescent proteins to
study the functional relevance of structural
domains of GMC proteins and their
potential sites for phosphorylation or
acylation, carry out time-lapsed “in vivo”
imaging demonstrating their translocation
among subcellular compartments and “in
situ” analyze their interaction with other
proteins using fluorescence resonance
energy transfer (FRET) microscopy.
Our interest in disclosing the molecular
mode of action of GMC proteins is backed
by their potential as appropriate “molecular
targets” to modulate neuronal plasticity
locally. This would help to design new
pharmacological agents with specific
action on post-lesion neuronal
regeneration and functional recovery and
the prevention of massive
neurodegeneration associated to epileptic
episodes.
Experimento de seguimiento “in vivo” de
la adhesión y extensión sobre sustrato
de células Swiss-3T3 transfectadas con
GAP-43-GFP. Se observan dos células
una transfectada y otra no. La primera
ralentiza su extensión sobre el sustrato
al tiempo que extiende gran cantidad de
filopodios.
85
Resumen de Investigación
El interés del grupo se centra, en primer
lugar, en el estudio de los mecanismos que
regulan la expresión de la apolipoproteína
E en células nerviosas.
ApoE, además de jugar un papel importante
en el metabolismo de las lipoproteínas
plasmáticas, está involucrada en procesos
de mantenimiento y reparación de células
nerviosas. ApoE4, una de las isoformas de
la proteína, es un factor de riesgo importante
para la enfermedad de Alzheimer tardía.
Aunque es conocido el hecho de que se
producen cambios en la producción de
ApoE en respuesta a lesiones degenerativas
en zonas como el hipocampo, o en
respuesta a mediadores inflamatorios, los
mecanismos de regulación del gen que
codifica esta proteína son bastante
desconocidos.
Nuestro grupo ha demostrado que los
factores de transcripción AP-2, Zic1 y Zic2
se unen y transactivan al promotor del gen
de ApoE en células de glia. Más
recientemente hemos demostrado que el
factor de transcripción USF 1, perteneciente
a la familia de proteínas bHLH con
cremallera de leucina, activa al promotor
de ApoE uniéndose a la región URE3 del
promotor, la cual contiene una secuencia
no-canónica del tipo E-box.
El segundo objetivo del grupo sigue siendo
el estudio de la sinápsis glicinérgica,
centrado en la relación estructura función
y regulación de los transportadores de
glicina GLYT1 y GLYT2 de células nerviosas.
Estas proteínas son las responsables de
mantener bajos niveles de glicina en el
espacio sináptico regulando así la actividad
de la neurotransmisión glicinérgica.
Alteraciones en la actividad de GLYT1 y de
GLYT2 pueden estar involucradas en
desórdenes neuromusculares y en algún
tipo de esquizofrenia.
En este periodo hemos estudiado la
distribución subcelular de las isoformas de
GLYT1 y de GLYT2 en células polarizadas
MDCK y en neuronas de hipocampo.
Mediante mutagénesis dirigida hemos
identificado señales de localización
basolateral y/o apical en los extremos amino
y carboxilo de GLYT1.
Por otro lado, hemos demostrado que los
sitios de glicosilación de GLYT2 son
responsables de su localización apical en
células polarizadas.
Jefe de Línea / Group Leader:
Cecilio Giménez
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
Francisco Zafra
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Irene Poyatos
Enrique Salero
Beatríz Cubelos
Inma González
Estudiantes /
Undergraduate Students:
Vanesa de Mingo
Técnico de Investigación /
Technical Assistance:
Enrique Núñez
Regulación de la expresión génica enenfermedades neurogegenerativas
D.5NeurobiologíaNeurobiology
Distribución regional de los transportadores GLYT1 (verde) y v-GLUT (rojo) en el área
CA3 en hipocampo de cerebro de rata.
Regional distribution of GLYT1 (green) and v-GLUT (red) transporters in the CA3
of rat brain hippocampus.
86
Salero, E., Pérez-Sen, R., Aruga, J., Giménez, C., Zafra,
F. (2001) Transcription factors Zic1 and Zic2 bind and
transactivate the apolipoprotein E gene promoter. J. Biol.
Chem. 276, 1881-1888
Martínez-Maza, R., Poyatos, I., López-Corcuera, B.,
Núñez, E., Giménez, C., Zafra, F., Aragón, C. (2001) The
role of N-glycosylation in transport to the plasma
membrane and sorting of the neuronal glycine transporter
GLYT2. J. Biol. Chem. 276, 2168-2173
Zafra, F., Giménez, C. (2001) Molecular determinants
involved in the asymmetrical distribution of glycine
transporters in polarised cells. Biochem. Soc. Trans. 29,
746-750
Salero, E., Giménez, C., Zafra, F. (2002) Identification
of a non-canonical E-box motif as a regulatory element
in the proximal promoter region of the apolipoprotein E
gene. Biochem. J. 20021142
Tesis Doctorales / Doctoral Thesis
Enrique Salero. 2001. “Identificación de los factores Zic1,
Zic2 y USF como reguladores transcripcionales del gen
de la apolipoproteína E”. Universidad Autónoma de
Madrid.
Regulation of the gene expression inneurodegenerative diseases
Publicaciones/Publications:
Research summary
The main interest of the group is, firstly,
focussed in the study of the regulatory
mechanisms involved in the expression
of the apolipoprotein E by nerve cells.
ApoE, apart of playing a key role in the
metabolism of plasma lipoproteins, has
been demonstrated to be involved in
neuronal maintenance and repair.
ApoE4, one of the four existing isoforms
of the protein, is an important risk factor
for late-onset Alzheimer´s disease.
Although has been demonstrated changes
in ApoE production in response to
neurodegenerative insults in the
hippocampus, or in responds to
inflammatory mediators, the regulation of
the gene encoding for this protein remains
largely unknown.
Previous studies of our group
demonstrated that transcription factors
AP-2, Zic1 and Zic2 bind and transactivate
the apolipoprotein E gene promoter in
glioblastoma cells. More recently, we have
identified transcription factor USF 1, a
protein that belongs to the bHLH family
which also contains a leucine zipper,
activates the apoE promoter by binding
into the regulatory element URE3 to a
region which contains a functional non-
canonical E-box motif.
The second objective of the group is the
study of the glycinergic synapse, focused
on the structure-function and the
regulation of the glycine transporters
GLYT1 and GLYT2 from nerve cells. These
proteins are responsible to maintain low
levels of glycine in the synaptic cleft during
glycine-mediated neurotransmission.
Dysfunctions of the activity of GLYT1 or
GLYT2 could underlay to some
musculoskeletical disorders or to some
types or schizophrenia.
During this period we have studied the
asymmetrical subcellular distribution of
the GLYT1 isoforms, and of GLYT2 in
polarised MDCK cells and in neurons
from the hippocampus.
By using site directed mutagenesis we
have been able to identify signals for
basolateral/somatodendritic localisation
in the amino and carboxyl tail of GLYT1.
Moreover, we have shown the N-
glycosylation sites of GLYT2 are involved
in the apical localisation of this protein in
polarised cells.
87
Jefe de Línea / Group Leader:
Rafael Manso
e-mail: [email protected]
Postdoctorales / Postdoctoral
Fellows:
Beatriz González Alonso
Pilar Negredo Madrigal
María Jesús Pérez Lorenzo
Bases moleculares de la adaptación al ejercicioy de la plasticidad muscular
D.6NeurobiologíaNeurobiology
Diversidad molecular de las cadenas ligeras reguladoras de miosina en músculo esquelético
de rata y cambios en su expresión durante el remodelado del músculo rápido EDL inducido
por estimulación eléctrica crónica de baja frecuencia (s, f, isoformas lenta y rápida; E1, 7,
21, 30, días de estimulación eléctrica del EDL)
Resumen de Investigación
El interés científico general del laboratorio
se ha dirigido a la caracterización de señales
y rutas de transducción que median cambios
adaptativos inducidos por el ejercicio. Se
ha estudiado la implicación de las HSPs en
la respuesta hepática al ejercicio ya que su
expresión incrementada permite entender
como se puede conseguir tolerancia a
ejercicio más intenso y a otras situaciones
de estrés celular, al mismo tiempo. Utilizando
como modelo la rata ejercitada en tapiz
rodante se puso de manifiesto una
respuesta compleja tras un golpe agudo de
ejercicio que se inició con la inducción
temprana, bajo control transcripcional, de
diversas HSPs. A ésta siguió una
acumulación transitoria de HSP72, que es
el antecedente de al menos otras dos ondas
de acumulación en el post-ejercicio tardío
que tuvieron lugar en ausencia de niveles
detectables del mensajero. Se ha estudiado
el papel del estrés oxidativo como señal
inductora de la respuesta hepática de las
HSPs tras el ejercicio. La correlación directa
entre los niveles de HSP72 acumulada
durante el post-ejercicio temprano y los de
TBARS conjugadas, puso de manifiesto la
existencia de un mecanismo muy sensible
para ajustar la amplitud de esta respuesta
en función del estrés oxidativo.
Se han identificado variantes de carga de
las HSP70 citosólicas en el hígado. Para
entender su relevancia para la actividad
biológica o estabilización de niveles
incrementados, se ha estudiado su
presencia y abundancia relativa durante el
periodo temprano y en los picos de las
ondas de acumulación de HSP72 en el
post-ejercicio tardío. Se ha realizado también
un estudio paralelo para caracterizar la
implicación de la proteína de estrés de bajo
peso molecular HSP25 en la respuesta
hepática al ejercicio. Se han cubierto
aspectos relativos a las cinéticas de
inducción de la proteína y del mRNA, así
como a la modificación post-traduccional
asociada a la respuesta en diversas etapas
del post-ejercicio
Un segundo aspecto de interés investigador
se refirió a la caracterización de la diversidad
molecular de las cadenas ligeras
reguladoras de la miosina (rMLCs) en el
músculo estriado de mamífero. Se han
analizando los patrones de variantes en
músculo esquelético rápido y lento y en
aurícula y ventrículo de diversas especies,
para entender el papel que las diferentes
isoformas de las rMLCs y sus estados
fosforilados pueden tener en el ciclo de
contracción-relajación muscular
estableciendo una posible correlación entre
ellas y las isoformas conocidas de las
cadenas pesadas de miosina. Se han
utilizado aproximaciones de proteómica
para caracterizar los mecanismos
moleculares responsables de la generación
de variantes y se han analizado las
transiciones que tienen lugar durante la
remodelación de fibras rápidas a lentas que
se induce por estimulación eléctrica de baja
frecuencia.
Un tercer aspecto de interés investigador
se refiere a la influencia de factores neurales
y hormonales en la expresión de proteínas
contráctiles y de estrés en músculo
esquelético. Para ello se han utilizado
modelos animales de ratas ejercitadas,
cordotomizadas y estimuladas
eléctricamente a través del nervio y, en
colaboración con el Departamento de
Cirugía Ortopédica, modelos de lesión del
ligamento cruzado anterior en gato.
88
González, B., Negredo, P., Hernando, R., Manso, R.
(2002) Protein variants of skeletal muscle regulatory
myosin light chains: prevalence in mammals, generation
and transitions during muscle remodelling. Pflügers Arch-
Eur. J. Physiol. 443, 377-386
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Beatriz González Alonso. 2002. “Inducción y estabilización
de los niveles de expresión de proteínas de estrés en
el hígado en respuesta al ejercicio agudo y crónico”.
Universidad Autónoma de Madrid.
Molecular bases of the adaptation to exercise andof skeletal muscle plasticity
Publicaciones/Publications:
Research summary
The overall research interest of the
laboratory concerned the characterization
of signals and transduction pathways
involved in adaptive changes in response
to exercise. The increased expression of
heat-shock proteins (HSPs) provides a
conceptual framework to understand how
exercise could increase tolerance to
physical activity of growing intensity and
to a variety of other stressors at the same
time. To get a better understanding of
whole organism adaptation to chronic
exercise one of the research aims was to
characterize the involvement of HSPs in
the hepatic exercise response. Using
treadmill-exercised rats as a model a
complex hepatic response of HSPs to a
single exercise bout was observed. It was
initiated by an early, transcriptionally-
controlled induction of the synthesis and
accumulation of HSP70s and other HSPs,
followed by at least two further waves of
HSP72 accumulation that took place over
the next 48 h in the absence of detectable
levels of mRNA. The role of oxidative
stress as the initiating signal of this
response was also investigated. The
positive correlation between levels or
protein-bound TBARS and accumulated
HSP72 during the early post-exercise
period (in the absence of statistically
significant increases in either free or
protein-bound TBARS), indicated the
existence a sensitive mechanism capable
of adjusting the amplitude of the stress-
response to exercise according to
perceived oxidative stress.
Cytosolic HSP70s displayed isoelectric
point variants in the liver. The relevance
of these variants for biological activity or
stabilization of increased HSP70-levels
was studied by analysing their presence
and relative abundance in the liver in the
peaks of the HSP72 accumulation waves
during early and late post-exercise. A
parallel study was performed to
understand the role of the small heat-
shock protein HSP25 in the hepatic
exercise response. This study covered
induction kinetics of synthesis and
accumulation of protein and mRNA during
early and late post-exercise, as well as
post-translational modifications associated
with the exercise response.
A second area of interest was the
characterization of the molecular diversity
of the regulatory myosin light chains
(rMLCs) in mammalian striated muscle.
A comparative study of two-dimensional
patterns of rMLCs in fast and slow skeletal
muscle types an in atrium and ventricle
of different mammals was performed to
understand the role of the different rMLCs
and of their phosphorylated products in
the contraction-relaxation cycle of skeletal
muscle and to establish a possible
correlation between them and the known
isoforms of the myosin heavy chains. The
molecular mechanism involved in
generating the diversity of variants of
rMLCs, considering the possibility of
multiple phosphorylation, was investigated
using a proteomic approach. The
relevance of rMLC variants in defining
muscle contractile properties was
investigated following their transitions
during fast-twitch muscle remodelling
induced by low-frequency electrical
stimulation.
A third research interest was aimed at
understanding the implication of neural
and hormonal activity in defining the
expression of contractile and stress
proteins in skeletal muscle. Models of
exercise, spinal cord transection and
electrical stimulation in rats and a model
of lesions of the anterior cruciate ligament
(in collaboration with the Department of
Orthopaedic Surgery) have been used.
Molecular diversity of myosin regulatory light chains in
rat skeletal muscle and changes in their expression
levels during remodelling of the fast-twitch EDL muscle
induced by low-frequency electrical stimulation (s, f,
slow and fast isoforms; E1, 7, 21, 30, days of electrical
stimulation of EDL muscle)
89
Resumen de Investigación
La actividad de nuestro grupo se centra en:
i) el estudio de la biología básica de células
neurales troncales (preferentemente de
origen humano), y ii) el estudio de su
potencial para el desarrollo de estrategias
de reposición celular (neuronal y glial) y de
transferencia génica en situaciones de
neurodegeneración.
1. Biología básica de células troncales
neurales de origen humano.
Nuestro trabajo se centra en parte en el
desarrollo de métodos de expansión y
perpetuación de estas células, cuyo
crecimiento en cultivo es muy lento y está
limitado, de forma similar a lo que ocurre
con otras células humanas mortales. En
años anteriores hemos desarrollado
herramientas genéticas para la perpetuación
de estas células. En previsión de la
necesidad de retirar los genes
inmortalizadores de las células, para su
potencial uso en el ser humano, estamos
ya utilizando construcciones donde éstos
están flanqueados por sitios loxP.
Además, tenemos interés en determinar el
potencial de diferenciación a linajes neurales
de estas líneas celulares, in vitro e in vivo,
y los factores epigenéticos y genéticos que
controlan estas decisiones.
2. Potencial para reposición celular en
el cerebro dañado.
En esta línea de trabajo estamos
caracterizando cuál es el potencial de
supervivencia, integración, migración y
diferenciación de lineas de células neurales
troncales humanas, una vez transplantadas
al cerebro adulto, principalmente en estriado
y sustancia negra.
3. Desarrollo de nuevas estrategias de
transferencia génica.
Utilizando células neurales troncales
humanas, estamos desarrollando los
procedimientos necesarios para llevar a
cabo knock-in, y así, mediante
recombinación homóloga, modificar
genéticamente estas células de la mejor
manera hoy en día posible. En teoría, esta
estrategia nos permitirá llevar a cabo
transferencia génica al cerebro adulto de
forma controlada, eficiente y completamente
segura, por un tiempo ilimitado, y también
ofrece la posibilidad de regulación fisiológica
de los transgenes.
Jefe de Línea / Group Leader:
Alberto Martínez Serrano
e-mail: [email protected]
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Ana Villa
Isabel Liste
Milagros Ramos
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Francisco Javier Rubio
Carlos Bueno
Beatriz Navarro
Matthew Sledenbroek
Florian Mayrhofer
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
Inmaculada Ocaña
Biología de células troncales neurales humanas.Potencial para reposición celular y terapia génicaen neurodegeneración
D.7NeurobiologíaNeurobiology
Neuronas dopaminérgicas humanas (aquéllas que degeneran en la
enfermedad de Parkinson), generadas a partir de una línea establecida
de progenitores humanos de mesencéfalo ventral.
Human dopaminergic neurons (those that degenerate in Parkinson’s
disease), generated from a established cell line of neuronal progenitors
of ventral mesencephalic origin.
90
Villa, A., Rubio, J.F., Navarrro B, Bueno, C., Martínez-
Serrano, A. (2001) Human neural stem cells in vitro. A
focus on their isolation and perpetuation. Biomed.
Pharmacother. 55, 1-5
Martínez-Serrano, A., Rubio, F.J., Navarro, B., Bueno,
C., Villa, A. (2001) Human Neural Stem and Progenitor
Cells: In vitro and in vivo properties, and potential for
gene therapy and cell replacement in the CNS. Curr.
Gene Ther. 1, 279-299
Philips, M.F., Mattiasson, G., Wieloch, T., Bjorklund, A.,
Johansson, B.B., Tomasevic, G., Martinez-Serrano, A.,
Lenzlinger, P.M., Sinson, G., Grady, M.S., McIntosh, T.K.
(2001) Neuroprotective and behavioral efficacy of nerve
growth factor-transfected hippocampal progenitor cell
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attenuation of the Erk pathway. J. Biol. Chem. 277, 46645-
46650
Biology of human neural stem cells. Potential forgene therapy in neurodegeneration
Publicaciones/Publications:
Research summary
Our research is focused in the study of:
i) the basic biology of neural stem cells
(preferably of human origin), and ii) their
potential for therapeutic intervention in
human neurodegenerative conditions, in
cell replacement or gene therapy
modalities.
1. Basic biology of human neural stem
cells.
Our work is focused on the development
of expansion and perpetuation procedures
for these cells, which normally grow very
slowly and for a limited time, since we
are dealing with cells with mortal
properties. As a result of previous work,
we have developed genetic tools for the
perpetuation of these cells. Since the
presence of an oncogene or proto-
oncogene in the cells might hamper or
limit their use in the clinical setting (even
when the cells are not transformed, just
established), we have already developed
lines in which the perpetuating gene is
floxed (flanked by loxP sites for site
specific recombination), to allow for its
removal before transplantation of the cells.
In addition, we have the interest to
determine the differentiation potential of
these immortal neural stem cells towards
different neural lineages, both in vitro and
in vivo, as well as to explore the role of
epigenetic and genetic factors influencing
cell fate decisions.
2. Cell replacement potential in the
damaged brain.
In this line of work we are characterizing
the survival, integration, migration and
differentiation properties of human neural
stem cell lines, once grafted to the adult
mammalian brain, mainly in the striatum
and substantia nigra.
3. Development of new gene therapy
strategies.
Using human neural stem cell lines, we
are developing knock-in procedures
(based on homologous recombination),
on the assumption that this is the best
available way of genetically modifying
cells nowadays. In principle, this strategy
will allow for ex vivo gene transfer to the
adult mammalian brain in a controlled,
efficient and safe manner, and for
unlimited time. It will also provide means
for the physiological control of transgene
expression.
Astroglia (GFAP, verde) y neuronas (-III-tubulina,
rojo) humanas diferenciadas a partir de una línea
de células troncales neurales humanas.
Human astroglia (GFAP stain, green) and neurons
(-III-tubulin stain, red) differentiated from a cell line
of human neural stem cells.
91
Resumen de Investigación
Los receptores acoplados a proteínas G
(GPCR) median las acciones de diversos
mensajeros que desempeñan un papel
esencial en la función del sistema
cardiovascular o del sistema inmune.
Además de con proteínas G
heterotriméricas, los GPCR activados
interaccionan con quinasas de receptores
acoplados a proteínas G (GRKs) y con las
proteínas moduladoras denominadas
arrestinas. Estas dos familias de proteínas
desempeñan un papel clave en la rápida
modulación de la funcionalidad y la dinámica
intracelular de receptores tras la activación
por ligandos, así como permiten el
reclutamiento y regulación de otras
proteínas celulares, iniciando nuevas vías
de señalización, por lo que son tanto
moduladores como componentes
esenciales de la transducción de señales
mediada por GPCR. Los niveles y
funcionalidad de algunas GRKs están
alteradas en situaciones patológicas como
el fallo cardiaco congestivo, la hipertrofia
cardiaca, la hipertensión o procesos
inflamatorios como la artritis reumatoide.
Sin embargo, no se conoce en detalle cómo
esos cambios alteran la señalización por
GPCRs y contribuyen al
desencadenamiento y/o progresión de estas
patologías, lo que podría ser de gran interés
para identificar nuevas estrategias
diagnósticas y terapéuticas. En este
contexto, nuestro grupo se plantea los
siguientes objetivos generales: a)
profundizar en los mecanismos de control
de la función, expresión y estabilidad de
GRKs y su relación con los cambios
descritos en situaciones patológicas; b)
contribuir a definir el conjunto de
interacciones e interconexiones funcionales
(“interactoma”) de las GRKs y c) estudiar
el efecto de cambios en la
expresión/funcionalidad de GRKs y
arrestinas sobre vías de señalización y
procesos celulares modulados por GPCR
del sistema cardiovascular o por receptores
de quimioquinas. Finalmente, nuestro grupo
colabora con otros laboratorios del Centro
en el estudio de la relación entre sistemas
de señalización y la enfermedad de
Alzheimer.
Jefe de Línea / Group Leader:
Federico Mayor, jr.
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
Ana Ruiz-Gómez
Cristina Murga
Catalina Ribas
Petronila Penela
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Esperanza Morato
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Susana Sarnago
Ana Elorza
M. Carmen Jiménez
Sandra Peregrín
Antonio Sobrado
Alicia Salcedo
Carlota García-Hoz
Estudiantes /
Undergraduate Students
Helena Holguín
Técnico de Investigación /
Technical Assistance:
Ana Molina
Mecanismos de señalización y regulación dereceptores acoplados a proteínas G
D.8NeurobiologíaNeurobiology
Consecuencias funcionales de la fosforilación de GRK2 por
la tirosina quinasa c-Src
Functional consequences of GRK2 phosphorylation by c-Src
92
Penela, P., Elorza, A., Sarnago, S., Mayor, jr., F. (2001)
ß-arrestin and c-Src-dependent degradation of G-protein-
coupled receptor kinase 2. EMBO J. 20, 5129-5138
Penela, P., Barradas, M., Alvarez-Dolado, M., Muñoz,
A., Mayor, jr., F. (2001) Effect of hypothyroidism on G
protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) expression
levels in rat liver, lung and heart. Endocrinology 142,
987-991
Mayor, F., (2001) La Biología Molecular y los retos de la
investigación biomédica. En: Investigación y Siglo XXI.
Fundación José Casares Gil. Real Academia de
Farmacia, pp. 95-118
Mayor, F., (2001) Genética molecular de la enfermedad
de Alzheimer. En: Alzheimer XXI: Ciencia y Sociedad
(J.M. Martínez-Lage, Z.S. Khachaturian, J.J. Artells, F.
Guillén, J.J. López-Ibor, F. Mayor, jr y J.M. Segovia,
editores). Masson, Barcelona, pp. 105-110
Ribas, C., Takesono, A., Sato, M., Hildebrandt, J.D,
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of the heterotrimeric G-proteins Gi/Go by the NG108-15
G-protein activator. J Biol Chem. 277, 50223-50225
Murga, C., Zohar, M., Teramoto, H., Gutkind, J.S.. (2002)
Rac1 and RhoG promote cell survival by the activation
of PI3K and Akt, independently of their ability to stimulate
JNK and NF-kappaB" Oncogene. 21, 207-216
Ribas, C., Sato, M., Hildebrandt, J.D., Lanier, S.M. (2002)
Analysis of signal transfer from receptor to Go/Gi in
different membrane environments and receptor-
independent activators of brain G protein. Methods
Enzymol. 344, 140-152
Murga, C., Barber, D.F. (2002) Molecular mechanisms
of pre-T cell receptor-induced survival J Biol Chem 277,
39156-39162
Mayor, F., Rodes, J., (2002) La investigación biomedica
básica y clínica en España. En: Reflexiones sobre la
Ciencia en España. El caso particular de la Biomedicina
(J.A. Gutiérrez-Fuentes y J.L. Puerta López-Cózar, eds)
Medicina Stm. Editores, Barcelona, pp. 225-244
Lombardi, M.S., Kavelaars, A., Penela, P., Scholtens,
EJ., Roccio, M., Schmidt, R.E., Schedlowski, M., Mayor,
Jr., F. & Heijnen, C.J. (2002) Oxidative stress decreases
G protein-coupled receptor kinase 2 in lymphocytes via
a calpain-dependent mechanism” Mol. Pharmacol. 62,
379-388
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Susana Sarnago Cebada. 2001. “Mecanismos de
regulación de la quinasa de receptores acoplados a
proteínas G GRK2”.
Ana Elorza Moreno. 2001. “Degradación de la quinasa
de receptores acoplados a proteínas G, GRK2: un nuevo
mecanismo de la regulación de su función”.
Maria del Carmen Jiménez Sainz. 2001. “Mecanismos
de señalización y regulación de receptores de
quimioquinas”.
Otras Actividades / Other Activities
Federico Mayor:
Miembro del Consejo Asesor de Sanidad / Member of
the Advisory Board of the Minister of Health (2001- ).
Miembro del Consejo de Dirección de la Fundación
Española para la Ciencia y la Tecnología (FECYT) /
Member of the Executive Board of the Spanish Foundation
for Science and Technology (2001- ).
G protein-coupled receptors signaling andregulatory mechanisms
Publicaciones/Publications:
Research summary
G protein-coupled receptors (GPCR)
mediate the actions of a variety of
messengers that are key regulators of
cardiovascular or immune system
functions. Activation of GPCR leads to its
interaction with at least two kinds of
proteins: heterotrimeric G proteins and
GRKs (G protein-coupled receptor
kinases), which in turn promote the
binding of arrestins. GRKs and arrestins
play different important roles: they
uncouple GPCR from G proteins, promote
GPCR internalization and recycling; and
allow the recruitment of other cellular
proteins, thus triggering new signaling
pathways. Therefore, GRKs and arrestins
can be considered as both regulators and
key components of GPCR signal
transduction pathways. Alterations in the
levels and functionality of GRKs have
been related to congestive heart failure,
cardiac hypertrophy or hypertension, and
to inflammatory processes such as
rheumatoid arthritis. However, it is not
known in detail how these changes alter
GPCR signal transduction and contribute
to the ethiology and/or progression of
these diseases. This would be relevant
for the identification of new diagnostic
and therapeutic strategies. In this context,
the main objectives of our group are: a)
to better understand the mechanisms
governing function, expression and
degradation of GRKs and their relevance
in promoting changes in their levels in
different pathological conditions; b) to
contribute to identify the network of
functional conexions and interactions of
GRKs with other cellular proteins (the
GRKs “interactome”); and c) to investigate
the effect of changes in the
expression/functionality of GRKs and
arrestins on key signal transduction
pathways and cellular functions mediated
by cardiac GPCR or chemokine receptors.
Finally, our group collaborates with other
laboratories of this Center in the study of
relationships between signalling cascades
and Alzheimer’s disease.
Modelo para la activación y translocación a la membrana de GRK2
Proposed model for GRK2 activation and membrane translocation. In the absence of modulators, an
equilibrium would exist between the active “open” (B) and inactive “closed” (A) conformation. It would be
displaced towards the inactive conformation through stabilization by intramolecular interactions involving
N- and C-terminal domains of GRK2. C.- In vitro, the substitution of such interactions by the addition of
kinase fragments would allow the disruption of the constrained conformation and favor a more active state
of GRK2. A similar mechanism would explain the in vitro effects on GRK2 activity of modulators (G
subunits, phospholipids, receptor domains) able to bind to N- and C-terminal domains of GRK2. D.- In
vivo the concerted interaction of such intracellular ligands with different GRK2 domains would simultaneously
lead to the disruption of the inhibitory intramolecular associations and to the targeting of GRK2 to the
plasma membrane, where the RGS domain would also be free to interact with G q subunits. PIP2,
Phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate; ß , G protein ß subunits; circled P, putative GRK2 phosphorylation
sites in the receptor.
93
Resumen de Investigación
Interacción de los nucleótidos de
guanina con los receptores ionotrópicos
de glutamato
Los objetivos de esta nueva etapa del
proyecto se centran en el diseño, mediante
modelización molecular, la síntesis y el
ensayo biológico de una nueva línea de
antagonistas de glutamato que
interaccionarían con los iGluRs de la misma
forma que lo hace el GMP.
La primera etapa, el diseño, necesitaba
previamente de la validación de un modelo
estructural de receptor ionotrópico de
glutamato basado en datos cristalográficos,
en lugar de los modelos derivados de las
conocidas analogías entre estos receptores
y las proteínas periplásmicas bacterianas
(implicadas en el transporte de
aminoácidos) y de los datos de mutagénesis
dirigida. Partiendo del modelo reducido de
Gouaux y colaboradores, hemos estudiado,
mediante técnicas de dinámica molecular
en ordenador, la interacción del glutamato
y del kainato con el sitio activo del receptor
GluR2 de AMPA/kainato y hemos propuesto
una hipótesis sobre los cambios
conformacionales que acompañan a la
interacción agonista/receptor y la
consiguiente generación de un poro/canal
iónico asociada a una perturbación
específica del residuo Glu209 (1). A
continuación, hemos analizado, con la
misma metodología, la interacción con el
receptor de antagonistas competitivos
convencionales, como el DNQX, y el propio
GMP. A diferencia del primero, que impide
el cambio conformacional que tiende a
cerrar los segmentos S1 y S2 del receptor
sobre los agonistas, el GMP permite ese
cierre pero no activa el receptor (no se
genera el canal iónico) al no interaccionar
el GMP con el residuo Glu209, actuando
pues como un falso agonista, lo que explica
su antagonismo funcional y su carácter
neuroprotector/antiexcitotóxico (enviado
para publicación).
Finalmente hemos continuado nuestra
exploración de los efectos moduladores de
otros derivados purínicos de la guanina
sobre la captación neuronal y glial del
glutamato (2), y los estudios sobre la
presencia de elementos purinérgicos y sus
metabolitos en el LCR (3).
Jefe de Línea / Group Leader:
Galo Ramírez
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
Ana Barat
Jesús Mendieta
Científicos Visitantes/
Visiting Scientists:
Marcos Frizzo
Cintia Roehrig
Universidad Federal de Río Grande del
Sur, Brasil.
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
José Luis García-Mira
Neurotransmisión y desarrolloD.9NeurobiologíaNeurobiology
94
Mendieta, J., Ramírez, G., Gago, F. (2001) Molecular
dynamics simulations of the conformational changes of
the glutamate receptor ligand-binding core in the presence
of glutamate and kainate. Proteins (Structure, Function
and Genetics) 44, 460-469
Lara, D.R., Schmidt, A.P., Frizzo, M.E.S., Burgos, J.S.,
Ramírez, G., Souza, D.O. (2001) Effect of orally
administered guanosine on seizures and death induced
by glutamatergic agents. Brain Res. 912, 176-180
Portela, L.V.C., Oses, J.P., Silveira, A.L., Schmidt, A.P.,
Lara, D.R., Battastini, A.M.O., Ramírez, G., Vinadé, L.,
Sarkis, J.J.F., Souza, D.O. (2002) Guanine and adenine
nucleotidase activities in rat cerebrospinal fluid. Brain
Res. 950, 74-78
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Javier S. Burgos. 2000. “Interacción de los nucleótidos
de guanina con los receptores ionotrópicos de glutamato”.
Universidad Autónoma de Madrid.
Neurotransmission and development
Publicaciones/Publications:
Research summary
Interaction of guanine nucleotides with
ionotropic glutamate receptors
The molecular design, organic synthesis
and biological assay of a new line of
compounds, interacting with the iGluRs
in the same way as GMP, were among
the tasks defined for future work at the
beginning of this last two-year period.
Concerning design, we first needed to
establish a structural/functional model of
the iGluRs on the basis of crystallographic
data, rather than early models based on
analogies among the receptors and
bacterial periplasmic proteins (amino acid
transporters), and on the results of
directed mutagenesis of selected
residues.
Starting with the compact receptor model
of Gouaux and coworkers we have used
molecular dynamics simulations to
analyze the interaction of glutamate and
kainate with the GluR2 AMPA/kainate
receptor, and we have furthermore
proposed a new hypothesis to explain the
conformational changes associated to
the agonist-receptor interaction, including
the opening of a ionic channel specifically
triggered by contact with Glu209 (1). Next,
we have analyzed, with the same
methods, the interaction of the receptor
model with conventional competitive
antagonists (e.g., DNQX) and GMP.
Whereas DNQX sterically blocks the
closing movement of the S1 and S2
segments, GMP allows such closure
without interacting with Glu209 so that
pore opening does not take place: GMP
then behaves as a false agonist, a
functional competitive antagonist and an
efficient neuroprotector/antiexcitotoxic
agent (submitted).
Finally, we have continued our studies on
the modulatory effects of other purine
derivatives of guanine on neuronal and
glial glutamate uptake (2), and on the
presence of purinergic compounds and
their metabolites in the CSF (3).
95
Resumen de Investigación
Nuestro laboratorio está interesado en el
estudio de los mecanismos moleculares de
señalización por calcio en mitocondrias y
su implicación en envejecimiento y
neurogengeneración, y en el estudio de la
señalización por insulina y leptina en la
vejez.
La mitocondria se encarga de la
transducción de energía en la célula y
también controla la fase de ejecución de
la muerte apoptótica. En células neurales,
la entrada de Ca2+ en mitocondrias es
importante para la señalización por Ca2+,
ya que activa a deshidrogenasas de la
matriz mitocondrial; sin embargo, la
persistencia de Ca2+ en la mitocondria se
asocia con disfunción mitocondrial y muerte
celular. Por ello, estamos interesados en el
estudio de sistemas de señalización
mitocondrial de Ca2+ que no requieran la
entrada de Ca2+ en la mitocondria. Hemos
identificado a aralar1 y citrina, los primeros
transportadores mitocondriales regulados
por Ca2+ conocidos, como isoformas del
transportador de aspartato-glutamato
mitocondrial (AGC), un transportador
importante en la lanzadera de NADH
malato-aspartato. Los AGCs se activan por
Ca2+ en la cara externa de la membrana
mitocondrial interna, lo que permite su
estimulación por Ca2+ sin necesidad de la
entrada de calcio en la mitocondria.
Estamos estudiando la función de los
dominios de unión de Ca2+ de aralar1, la
isoforma de AGC de células neurales, en
la activación del AGC. También, el papel
de aralar1 en la maduración neuronal y en
la supervivencia a situaciones como la
toxicidad del glutamato o de la proteína
beta-amiloide, el péptido de las placas
seniles características de la enfermedad
de Alzheimer.
El envejecimiento en roedores y humanos
está asociado a la presencia de resistencia
a la insulina. El interés de nuestro grupo se
centra en desentrañar los mecanismos
responsables de dicha resistencia, habiendo
identificado algunas alteraciones en la
cascada de señalización de la hormona en
adipocitos. Recientemente describimos la
presencia de hiperleptinemia en ratas viejas
y estamos investigando actualmente la
posible relación entre hiperleptinemia y
desarrollo de la resistencia a la insulina.
Dado que las ratas viejas presentan
resistencia central a la leptina, postulamos
que una interacción directa de la leptina
con sus receptores en tejidos periféricos
podría jugar un papel en la aparición de la
resistencia global a la insulina en animales
viejos. Estamos interesados también en
explorar la reversibilidad de la resistencia
a leptina y a insulina por medio de la
restricción calórica.
Jefe de Línea / Group Leader:
Jorgina Satrústegui
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
Elena Bogónez
Jose M. Carrascosa
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Milagros Ramos
Beatriz Pardo
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Yasmin Fermín
Santiago Cavero
Coralia Perez
Laura Contreras
Patricia Mármol
Estudiantes / Students:
Carmen Galián
Javier Traba
Arancha Delgado
Técnico de Investigación /
Technical Assistance:
Bárbara Sesé
Científicos Visitantes /
Visiting Scientists:
Araceli del Arco
(Universidad de Castilla-la-Mancha)
Neurodegeneración y envejecimiento: señalizaciónmitocondrial del calcio y señalización deinsulina/leptina en envejecimiento
D.10NeurobiologíaNeurobiology
96
Carrascosa, J.M., Molero, J.C. Fermín, Y. Martínez, C.
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Tesis Doctorales / Doctoral Theses
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insulina durante el envejecimiento de la rata Wistar.
Alteraciones de las vías lipogénicas y lipolíticas en el tejido
adiposo perirrenal” Universidad Autónoma de Madrid.
Neurodegeneration and ageing: calcium signallingin mitochondria and insulin/leptin signallingduring ageing
Publicaciones/Publications:
Research summary
Our laboratory is interested in the study
of the molecular mechanisms of calcium
signal transduction in mitochondra in
ageing and neurodegeneration, and in
the study of insulin and leptin signaling
in ageing.
Mitochondria are the main sites for energy
transduction and the controllers of the
execution phase of apoptotic cell death.
In neural cells, Ca2+ entry in mitochondria
is important in cell Ca2+ signaling, as it
activates dehydrogenases in the
mitochondrial matrix; however, its
persistence in mitochondria is also
associated with mitochondrial dysfunction
and neuronal death. Thus, we are
interested in the study of systems for Ca2+
signaling in mitochondria that don't require
Ca2+ entry in the organelle. We have
identified aralar1 and citrin, the first known
calcium regulated mitochondrial carriers,
as two isoforms of the aspartate-
glutamate transporter (AGC) in
mitochondria, a carrier important within
the malate-aspartate NADH shuttle. The
AGCs are activated by Ca2+ at the outer
face of the inner mitochondrial membrane,
allowing for Ca2+-stimulation without
calcium entry in mitochondria. We are
currently studying the function of the Ca2+-
binding motifs of aralar1, the main AGC
isoform in neural cells, in AGC activation.
We are also studying the role of aralar1
in neuronal maturation and survival to
insults such as glutamate excitotoxicity
and exposure to beta-amyloid, the peptide
from senile plaques characteristic of
Alzheimer's disease.
Insulin resistance is associated with aging
in rodents and humans. We are interested
in elucidating the mechanisms responsible
for this resistance after having identified
a number of alterations in the insulin signal
cascade of adipose cells. Recently we
reported the presence of hyperleptinemia
in aged rats and we are currently
investigating the possible association
between elevated levels of leptin and the
development of insulin resistance. As
aged rats manifest central leptin resistance
we postulate that direct interaction of
leptin with its receptors in peripheral
tissues could play a role in the overall
insulin resistance of aged animals. We
are also interested in exploring the
possible reversion of leptin and insulin
resistance by means of caloric restriction.
97
Resumen de Investigación
La enfermedad de Alzheimer (EA) es un
proceso neurodegenerativo resultado de la
interacción entre genes y factores
ambientales. Mutaciones en los genes de
la proteína precursora del péptido amiloide
(APP) y las presenilinas causan la EA
monogénica. El alelo 4 de la apolipoproteína
E (APOE4) es el factor de susceptibilidad
genética más relevante para la EA
esporádica. Además, el riesgo de
neurodegeneración asociado a factores
ambientales como el traumatismo craneal
o ciertos procesos infecciosos aumenta en
presencia de factores genéticos como
APOE4.
Para estudiar los mecanismos patogénicos
de la EA, hemos desarrollado una estrategia
basada en la identificación y análisis
funcional de genes utilizando modelos
celulares y animales. Los genes candidatos
se detectan en "microarrays" de expresión
de modelos neuronales sometidos a
estímulos inductores de estrés; sobre estos
candidatos: a) realizamos estudios de
asociación genética como indicador de su
implicación real en la patogénesis, y b)
generamos modelos neuronales con dichos
genes silenciados o sobreexpresados, para
analizar los mecanismos responsables de
su participación en la muerte celular.
Mediante esta estrategia hemos identificado
polimorfismos en dos genes implicados en
señalización adrenérgica, que modifican la
susceptibilidad para la EA y los niveles de
cAMP en neuronas, sugiriendo que el estrés
adrenérgico participa en el desarrollo de la
EA.
Por otra parte, estamos estudiando la
implicación del virus herpes simplex tipo 1
(HSV-1) en procesos neurodegenerativos
utilizando modelos celulares y animales de
infección. Estudios en células sugieren que
HSV-1 puede modificar la fosforilación de
tau e iniciar un proceso de apoptosis
neuronal. En un modelo murino de infección
hematógena, hemos encontrado que la
dosis alélica de APOE modula la
neuroinvasividad del HSV-1, estableciendo
un posible vínculo funcional entre estos dos
factores, uno genético y otro ambiental, de
riesgo para EA.
Nuestros resultados inciden en la idea del
carácter multifactorial de la EA, a la que
contribuyen genes de susceptibilidad y
agresiones de índole no genética.
Jefe de Línea / Group Leader:
Fernando Valdivieso
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
Maria Jesús Bullido
José A. López Guerrero
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Jesús Aldudo Soto
Gema Alvarez Nieto
María Recuero Vicente
Javier Burgos Muñoz
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
María Alonso Martínez
Ana Martínez García
Julio Pozueta Larios
Carlos Ramírez Moreno
María del Carmen Ramos Martín
Marta Rey Martín
Elena Serrano Carballal
Esther Serrano Saiz
Raquel Tenorio Vela
María del Carmen Vicente Cenzano
Técnico de Investigación /
Technical Assistance:
Isabel Sastre Merlín
Neuropatología molecular de la enfermedadde alzheimer
D.11NeurobiologíaNeurobiology
98
Martín, D., Salinas, M., López-Valparaiso, R., Serrano,
E., Recuero, M., Cuadrado, A.
(2001) Effect of the Alzheimer amyloid fragment
Abeta(25-35) on Akt/PKB kinase and survival of PC12
cells. J. Neurochem. 78,1000-1008
Alonso, M., Dimitrijevic, A., Recuero, M., Serrano, E.
Valdivieso, F., López-Guerrero, J.A. (2001) Interaction
of alpha-2-macroglobulin and HSV-1 during infection of
neuronal cells. J. Neurovirol. 7, 556-563
Lambert, J-C., Goumidi, L., Myllykangas, L., Ellis, C.,
Wang, J.C., Bullido, M.J., Harris, J.M., Artiga, M.J.,
Hernandez, D., Kwon, J.M., Frigard, B., Petersen, R.C.,
Cumming, A.M., Pasquier, F., Sastre, I., Tienari, P.J.,
Frank, A., Sulkava, R., Morris, J. C., Clair, D. St, Mann,
D.M., Wavrant DeVrieze, F., Ezquerra-Trabalon, M.,
Amouyel, P., Hardy, J., Haltia, M., Valdivieso, F., Goate,
A.M., Pérez-Tur, J., Lendon, C.L., Chartier-Harlin, M-C.
(2002) Contribution of APOE promoter polymorphisms
to Alzheimer’s disease risk. Neurology 59, 59-66
Burgos, J.S., Ramírez, C., Tenorio, R., Sastre, I., Bullido,
M.J. (2002) Influence of reagents formulation on real-
time PCR parameters. Mol. Cel. Probes
16, 257-260
Frank García, A., Ramos, M.C., Bullido, M.J. Genética
y deterioro cognitivo severo.
(2002) Neurología 17 (supl.7) 56-62
Bullido, M.J., Fariñas, F., Sastre, I., Gil, P. (2002) Deterioro
cognitivo y funcional asociado a polimorfismos de ApoE
y A2M. Revista Española de Geriatría y Gerontología
37, 111-119
Martínez García, A., Bullido, M.J. (2002) Enfermedad
de Alzheimer. Genes y mecanismos moleculares.
BioPress.net 5
Burgos, J.S., Ramírez, C., Sastre, I., Bullido, M.J.,
Valdivieso, F. (2002) Involvement of Apoliprotein E in the
Hematogenous Route of Herpes Simplex Virus Type 1
to the Central Nervious Systems. J. Virol. 76, No.23,
12394-12398
Frank, A., Díez-Tejedor, E., Bullido, M.J., Valdivieso, F.,
Barreiro, P. (2002) APOE genotype in cerebrovascular
disease and vascular dementia. J. Neurol. Sci. 203-204,
173-176
Molecular neuropathology of alzheimer's disease
Publicaciones/Publications:
Research summary
Alzheimer's disease (AD) is a
neurodegenerative disorder produced by
the interactions among genes and
enviromental factors. Mutations in the
gene coding for the amyloid precursor
protein (APP) and in the presenilins cause
monogenic AD. The allele 4 of
apolipoprotein E (APOE4) is the main
genetic susceptibility factor for sporadic
AD. Moreover, the risk for
neurodegeneration associated to
enviromental factors such as major trauma
or certain infectious processes increase
in the presence of genetic factors as
APOE4.
To study the pathogenic mechanisms of
the AD, we have developed a strategy
based on the identification and functional
analysis of candidate genes using cell
and animal models. The candidate genes
are detected by expression microarray
analysis of cultured neuronal cells
subjected to different treatments inducing
stress; with each candidate: a) we perform
genetic association case-control studies,
as indicators of its actual implication in
pathogenesis, and b) we generate cell
models by silencing or overexpressing
the candidate, to analyze the mechanisms
mediating its participation in the proccess
of cell degeneration. Using this strategy
we have identified polymorphisms in two
genes involved in adrenergic signaling;
these polymorphisms change the
susceptibility for AD and the cAMP levels
in cultured neurons, suggesting that
adrenergic stress participates in AD
pathogenesis.
On the other hand, we are studying the
involvement of herpes simplex virus type
1 (HSV-1) in neurodegenerative
processes. Our studies in cell models
suggest that HSV-1 modifies tau
phosphorylation and initiates a neuronal
apoptosis process. In a murine model of
hematogenous infection we have found
that the allelic dose of APOE modulates
the neuroinvasivity of HSV-1, pointing to
the existence of a functional link between
these two factors, one genetic and the
other enviromental, of risk for AD. Thus,
all our results are in agreement with the
idea that AD is a multifactorial process,
with contribution of genes and non-genetic
injuries.
99
Representación del sitio activo de polimerización de la Pol ß humana, en la que se indican una seriede residuos implicados en la catálisis y fidelidad de inserción del nucleótido entrante (en amarillo),en base a la complementariedad con un nucleótido molde (en verde). Los residuos coloreados enmarrón son invariantes entre Pol ß y Pol l. La falta de conservación de Lys280, Asp276 y Ala185sugiere importantes diferencias entre la Pol ß y la Pol l. La figura ha sido realizada con los programasGRASP, MOLSCRIPT y RASTER3D, utilizando el fichero 1BPY del banco de datos PDB.
The active polymerization site of human Pol ß, indicating the sites involved in catalysis and incomingnucleotide insertion fidelity (yellow), based on the complementarity with a template nucleotide (green).Brown-colored residues are invariant in Pol ß and Pol l. The lack of conservation in Lys280, Asp276and Ala185 suggests important differences between Pol ß and Pol l. The figure has been preparedusing GRASP, MOLSCRIPT and RASTER3D software, using the 1BPY file and the PDB database.
100
101
E
Regulación dela expresióngénica
Regulationof geneexpresion
E.3 Biología molecular de extremófilos(microbiología aplicada)
E.3 Molecular biology of extremophylicmicroorganisms
Ricardo Amils
E.4 División celular bacteriana y resistencia aantibióticos
E.4 Bacterial cell division and antibioticsresistance
Juan AlfonsoAyala Serrano
E.5 Biotecnología y genética de bacteriastermófilas extremas
E.5 Biotechnology and genetics of extremethermophilic bacteria
José Berenguer
E.6 Mantenimiento y variabilidad del genoma:enzimología de la reparacion del DNA
E.6 Genome maintenance and variability:enzymology of DNA repair
Luis Blanco
E.7 Regulación de la expresión génicaespecífica de tejido
E.7 Regulation of the tissue-specific geneexpression
José LuisCastrillo Díez
E.9 Síntesis de proteínas y su regulación eneucariontes
E.9 Protein synthesis and its regulation ineukaryotes
César de Haro,José M. Sierra
E.10 Expresión génica en levaduras ystreptomyces
E.10 Gene expression in yeast andstreptomyces
Antonio Jiménez
E.11 Iniciación interna de la traducción enmRNAs eucarióticos
E.11 Internal initiation of translation ineukaryotic mRNAs
EncarnaciónMartínez-Salas
E.14 Bases Moleculares de lasEnfermedades Metabólicas
E.14 Molecular basis of metabolic diseas
MagdalenaUgarte
E.1 Parasitología molecularE.1 Molecular parasitology
Carlos Alonso
E.2 Expresión génica en linfocitos TE.2 Gene expression in T lymphocytes
Miguel A. Alonso
E.8 Estructura y función del ribosomaE.8 �Ribosome structure and function
Juan PedroGarcía Ballesta
E.12 Estructura cromatínica y transcripciónE.12 Chromatin structure and transcription
Enrique Palacián
E.13 Envolturas celularesE.13 Cell envelopes
Miguel Angel dePedro Montalban
Resumen de Investigación
Las especies de Leishmania son protozoos
parásitos, agentes etiológicos de las
Leishmaniosis, un grupo de enfermedades
que afectan a la población de 88 países.
Se estima que se producen 2 millones de
casos nuevos cada año, existiendo unos
400 millones de personas en riesgo de
contraer la enfermedad. La leishmaniosis
visceral causada por Leishmania infantum
es una enfermedad severa, fatal si no es
tratada, que es común en la región
Mediterránea y en Latinoamérica. Los perros
son el principal reservorio y la
seroprevalencia entre la población canina
oscila entre el 10 y el 30%.
La principal actividad investigadora de
nuestro grupo se dirige hacia la
caracterización de las propiedades
inmunoprofilácticas de una serie de
antígenos de L. infantum. Hemos identificado
a proteínas evolutivamente conservadas
como antígenos prominentes de Leishmania
que son específicamente reconocidos por
los sueros de humanos y perros con
leishmaniasis visceral (LV). Algunas de
estas proteínas (p. ej., las proteínas de
choque térmico HSP70 y HSP83) tienen
características inmunoestimuladoras. En
particular, hemos demostrado que estas
proteínas son mitógenos de linfocitos B de
ratón. Los estudios de inmunoprotección
se están realizando en tres sistemas
animales: el ratón, el hámster dorado y el
perro (este último en colaboración con el
Dr. Luis Carlos Gómez-Nieto (Facultad de
Veterinaria, Universidad de Extremadura,
Cáceres).
Otra parte de nuestra actividad investigadora
se desarrolla en el campo de la biología
molecular de L. infantum. Este parásito
presenta características muy peculiares de
regulación de la expresión génica, forzado
por la carencia de secuencias promotoras
en sus genes. En particular, estamos
estudiando los mecanismos de regulación
post-transcripcional, utilizando como modelo
los genes de histonas y de las proteínas
de choque térmico. Información adicional
sobre la actividad investigadora de nuestro
grupo se puede obtener en la dirección:
http://www2.cbm.uam.es/cx-
203/PAGINA1.htm
Nuestro grupo está colaborando con los
Drs. Carmen Navarro-Ranninger y Jose
Manuel Pérez (Departamento de Química
Orgánica, UAM) en la identificación de las
vías bioquímicas por las que algunos
compuestos metálicos ejercen su actividad
antitumoral.
Jefe de Línea / Group Leader:
Carlos Alonso
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
Jose Mª Requena, Manuel Soto
Postdoctoral / Postdoctoral Fellow:
Luis Quijada
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Ana Isabel Rico
Ruth Larreta
Nuria Parody
Salvador Iborra
Javier Carrión
Cristina Folgueira
Técnico de Investigación /
Technical Assistance:
Miguel A. Fuertes
Parasitología molecularE.1
Leishmania tiene dos formas morfológicas, el promastigote móvil
(izquierda) y el amastigote no móvil (derecha).
Regulación de laexpresión génica
Regulation of geneexpression
102
Fuertes, M.A., Perez, J.M., Soto, M., Lopez, M.C., Alonso,
C. (2001) Calcium-induced conformational changes in
Leishmania infantum kinetoplastid membrane protein-11.
J. Biol. Inorg. Chem. 6, 107-117
Requena, J.M., Alonso, C., Soto, M. (2001) More
panantigens in Leishmania. Trends Parasitol. 17, 64
Gonzalez, V.M., Fuertes, M.A., Alonso, C., Perez, J.M.
(2001) Is cisplatin-induced cell death always produced
by apoptosis? Mol. Pharmacol. 59, 657-663
Echeverria, P., Dran, G., Pereda, G., Rico, A.I., Requena,
J.M., Alonso, C., Guarnera, E., Angel, S.O. (2001)
Analysis of the adjuvant effect of recombinant Leishmania
infantum Hsp83 protein as a tool for vaccination. Immunol.
Lett. 76, 107-110
Thomas, M.C., Longobardo, M.V., Carmelo, E., Marañon,
C., Planelles, L., Patarroyo, M.E., Alonso, C., Lopez,
M.C. (2001) Mapping of the antigenic determinants of
the T. cruzi kinetoplastid membrane protein-11.
Identification of a linear epitope specifically recognized
by human Chagasic sera. Clin. Exp. Immunol. 123, 465-471
Jansen, B.A., Perez, J.M., Pizarro, A., Alonso, C., Reedijk,
J., Navarro-Ranninger C. (2001) Sterically hindered
cisplatin derivatives with multiple carboxylate auxiliary
arms: synthesis and reactions with guanosine-5'-
monophosphate and plasmid DNA. J. Inorg. Biochem.
85, 229-235
Planelles, L., Thomas, M.C., Alonso, C., Lopez, M.C.
(2001) DNA immunization with Trypanosoma cruzi HSP70
fused to the KMP11 protein elicits a cytotoxic and humoral
immune response against the antigen and leads to
protection. Infect. Immun. 69, 6558-6563
Viñuelas, J., Garcia-Alonso, M., Ferrando, L., Navarrete,
I., Molano. I., Miron, C., Carcelen, J., Alonso, C., Nieto,
C.G. (2001) Meningeal leishmaniosis induced by
Leishmania infantum in naturally infected dogs. Vet.
Parasitol. 31, 23-27
Fuertes, M.A., Perez, J.M., Gonzalez, V.M., Alonso, C.
(2001) A kinetic model for the B-Z transition of poly[d(G-
C)].poly[d(G-C)] and poly[d(G-m5C)].poly[d(G-m5C)]. J.
Biol. Inorg. Chem. 6, 675-682
Perez-Alvarez, M.J., Larreta, R., Alonso, C., Requena,
J.M. (2001) Characterisation of a monoclonal antibody
recognising specifically the HSP70 from Leishmania.
Parasitol. Res. 87, 907-910
Larreta, R., Guzman, F., Patarroyo, M.E., Alonso, C.,
Requena, J.M. (2002) Antigenic properties of the
Leishmania infantum GRP94 and mapping of linear B-
cell epitopes. Immunol. Lett. 80, 199-205
Perez, J.M., Cerrillo, V., Matesanz, A.I., Millan, J.M.,
Navarro, P., Alonso, C., Souza, P. (2001) DNA interstrand
cross-linking efficiency and cytotoxic activity of novel
cadmium(II)-thiocarbodiazone complexes. Chembiochem.
2, 119-123
Iniesta, V., Gomez-Nieto, L.C., Molano, I., Mohedano,
A., Carcelen, J., Miron, C., Alonso, C., Corraliza, I. (2002)
Arginase I induction in macrophages, triggered by Th2-
type cytokines, supports the growth of intracellular
Leishmania parasites. Parasite Immunol. 24, 113-118
Rico, A.I., Girones, N., Fresno, M., Alonso, C., Requena,
J.M. (2002) The heat shock proteins, Hsp70 and Hsp83,
of Leishmania infantum are mitogens for mouse B cells.
Cell Stress & Chaperones 7, 339-346
Molecular parasitology
Publicaciones/Publications:
Research summary
Leishmaniae are protozoan parasites that
are the etiological agents of
Leishmaniosis. Leishmaniosis is formed
by a group of diseases that affects the
population in 88 countries. It has been
estimated that there are about 2 million
new cases every year and that there are
about 400 million people at risk of getting
the disease which is very severe and fatal
when not treated. This form of the disease
is common in the Mediterranean area and
in Latinoamérica. Dogs are the main
reservoir of the parasite. The prevalence
is the canine population varies form 10
to 30%.
The research activity of our group is aimed
to the characterisation of a series of L.
infantum antigens and to the
determination of the immune-prophylactic
properties of these antigens. We have
identified several L. infantum proteins that
behave as prominent antigens when
confronted with human and dog sera
affected by visceral leishmaniosis (LV)
that are evolutionary conserved. Some of
these proteins belong to the group of heat
shock proteins (as an example we can
mention the HSP70 and HSP83). These
proteins have also immuno-stimulatory
properties. In particular, we have
demonstrated that these proteins are
mitogens for mouse B lymphocytes. The
experiments directed to analyse the
potential protection provided by these
antigens is carried out in three model
systems: mouse, hamster and dog. The
protection experiments with dogs are
done in collaboration with Dr. Luis Carlos
Gómez-Nieto (Facultad de Veterinaria,
Universidad de Extremadura, Cáceres).
Our research efforts are also directed to
analyse the regulation of the expression
of several genes of L. infantum since it
presents several characteristics due to
the absence of promoter sequences. In
particular we are studying mechanisms
of post-tanscriptional regulation using as
models the histone and heat shock genes.
Further information on the activity of the
group may be found in:
http://www2.cbm.uam.es/cx-
203/PAGINA1.htm.
Our group is also collaborating with Drs.
Carmen Navarro-Ranninger and José
Manuel Pérez (Departamento de Química
Orgánica, UAM) on the identification of
metabolic pathways which can be
manipulated to enhance the anti tumour
activity of certain metallic compounds.
There are two developmental forms of Leishmania, the motile promastigote (left) and the
amotile amastigote (right).
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Ana Isabel Rico Errazquin. 2002. “Propiedades
inmunoestimuladoras de las proteínas de choque
térmico HSP70 y HSP83 de Leishmania infantum”.
Universidad Autónoma de Madrid.
103
Resumen de Investigación
Las membranas celulares parecen estar
compartimentalizadas en microdominios o
balsas lipídicas implicados en procesos de
transporte intracelular y señalización. Para
que las balsas sean operativas necesitan
una maquinaria proteica especializada que
las organice y las dote de las funciones
requeridas. El principal objetivo de nuestro
laboratorio ha sido la identificación la
maquinaria de transporte que interviene en
las balsas lipídicas, investigar las rutas en
las que esta maquinaria está implicada, y
caracterizar su mecanismo de actuación.
La proteína MAL ha sido caracterizada
como el primer componente integral de
membrana de la maquinaria necesaria para
el transporte directo de proteínas mediado
por balsas lipídicas a la superficie apical
en células epiteliales MDCK. El hecho de
que MAL se exprese también en linfocitos
T nos ha llevado a demostrar la existencia
de una ruta semejante que transportaría
proteínas al urópodo, un subdominio de
membrana presente en los linfocitos T
polarizados.
Con la hipótesis de que la familia MAL de
proteínas podría desempeñar funciones
importantes en procesos de transporte,
nuestro grupo ha caracterizado BENE y
MAL2, dos miembros inéditos de la familia
MAL presentes también en las balsas
lipídicas. Nuestros resultados recientes
indican que BENE participa en el transporte
de colesterol en células endoteliales,
mientras que MAL2 es un componente
esencial de la maquinaria para la ruta
indirecta o transcitótica que transporta
proteínas desde la membrana basolateral
a la membrana apical en hepatocitos y en
células epiteliales. Nuestros resultados
sitúan a la familia MAL de proteínas en un
lugar central en la regulación del tráfico
intracelular de proteínas.
Una línea de trabajo adicional en el
laboratorio consiste en el estudio de las
bases moleculares para la regulación de la
expresión de los genes de los receptores
para antígeno en linfocitos T por enhancers
mediante el estudio de la localización
nuclear de estos genes y la caracterización
de los complejos multiprotéicos
ensamblados en los enhancers durante el
desarrollo.
Jefe de Línea / Group Leader:
Miguel A. Alonso
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
Cristina Hernández-Munain
Alicia Llorente
Fernando Martín-Belmonte
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Jaime Millán
Mª del Carmen de Marco
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
Sergio Gómez
Noelia Zamarreño
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Alicia Batista
Juan Francisco Aranda
Expresión génica en linfocitos TE.2
La ruta directa de transporte de proteínas a la superficie apical
está controlada por la proteína MAL en células epiteliales
polarizadas, mientras la proteína MAL2 dirige la ruta indirecta
o transcitótica tanto en células epiteliales como en hepatocitos.
Regulación de laexpresión génica
Regulation of geneexpression
104
de Marco, M. C., Kremer, L., Albar, J. P., Martínez-
Menárguez, J. A., Ballesta, J., García-López, M.A.,
Marazuela, M., Puertollano, R., Alonso, M. A. (2001)
BENE, a novel raft-associated protein of the MAL
proteolipid family, interacts with caveolin-1 in human
endothelial-like ECV304 cells. J. Biol. Chem. 276, 23009-
23017
Martín-Belmonte, F., Arvan, P., Alonso M. A. (2001) MAL
mediates apical transport of secretory proteins in polarized
epithelial Madin-Darby canine kidney cells. J. Biol. Chem.
276, 49337-49342
Puertollano, R., Martínez-Menárguez, J. A., Batista, A.
Ballesta, J., Alonso, M. A. (2001) An intact dilysine-like
motif in the carboxyl terminus of MAL is required for
normal apical transport of the influenza virus
hemagglutinin cargo protein in epithelial Madin-Darby
canine kidney cells. Mol. Biol. Cell 12, 1869-1883
Alonso, M. A., Millán, J. (2001) The role of lipid rafts in
signalling and membrane trafficking in T lymphocytes.
J. Cell Sci. 114, 3957-3965
Bouchon, A., Hernandez-Munain, C., Cella, M., Colonna,
M. (2001) A DAP12-mediated pathway regulates
expression of CC chemokine receptor 7 and maturation
of human dendritic cells. J. Exp. Med. 194, 1111-1122
Millán, J., Qaidi, M., Alonso, M.A. (2001) Segregation of
costimulatory components into specific T-cell surface
lipid rafts. Eur. J. Immunol. 31, 467-473
Martín-Belmonte, F., Millán, J. (2001) Estructura y función
de las balsas lipídicas (“rafts”), dominios de membrana
ricos en esfingolípidos y colesterol. Inmunología 20, 216-
224
Copie-Bergman, C., Plonquet, A., Alonso, M. A., Boulland,
M.-L., Marquet, J., Divine, M., Möller, P., Leroy, K.,
Gaulard, P. (2002) MAL expression in lymphoid cells:
further evidence for MAL as a distinct molecular marker
of primary mediastinal large B-cell lymphomas. Mod.
Pathol. 15, 1172-1180
Tracey, L., Villuendas, R., Ortiz, P., Dopazo, A., Spiteri,
I., Rodríguez-Peralto, J.L., Fernández-Herrera, J.,
Hernández, A., Fraga, J., Lombardia, L., Dominguez,
O., Herrero, J., Alonso, M.A., Dopazo, J., Piris, M. A.
(2002) Identification of genes involved in resistance to
-interferon in cutaneous T-cell lymphoma. Am. J. Pathol.
161, 1825-1837
Hernández-Munain C., Krangel, M. S. (2002) Distinct
roles for c-Myb and core binding factor/polyoma enhancer-
binding protein 2 in the assembly and function of a
multiprotein complex on the TCR enhancer in vivo. J.
Immunol. 169, 4362-4369
Sánchez-Pulido, L., Martín-Belmonte, F., Valencia, A.,
Alonso, M. A. (2002) MARVEL: a conserved domain
involved in membrana apposition events. Trends Biochem.
Sci. 27, 599-601
Millán, J., Montoya, M. C., Sancho, D., Sánchez-Madrid,
F., Alonso, M. A. (2002) Lipid rafts mediate biosynthetic
transport to the T cell uropod subdomain and are
necessary for uropod integrity and function. Blood 99,
978-984
de Marco, M. C., Martín-Belmonte, F., Kremer, L., Albar,
P. J., Correas, I., Vaerman, J. P., Marazuela, M., Byrne,
J. A., Alonso, M. A. (2002) MAL2, a novel raft protein of
the MAL family, is an essential component of the
machinery for transcytosis in hepatoma HepG2 cells. J.
Cell Biol. 159, 37-44
Gene expression in T lymphocytes
Publicaciones/Publications:
Research summary
Cellular membranes appear to be
comparmentalized in glycolipid and
cholesterol-enriched microdomains,
referred as to lipid rafts, involved in
membrane trafficking and signaling. Rafts
require specialized protein machinery to
be functional. The main goal of our lab is
the identification of protein elements of
the machinery involved in raft-mediated
membrane trafficking processes.
The MAL protein was characterized has
the first integral membrane component
of the machinery for the raft-mediated
route of direct transport to the apical
surface in epithelial MDCK cells. The fact
that MAL is also expressed in T
lymphocytes prompt us to demonstrate
the existence of a similar route involved
in the trafficking of proteins to the uropod
protrusion, a membrane subdomain found
at the rear of migrating T lymphocytes.
With the hypothesis that the MAL family
of proteins might play a general role in
membrane trafficking we have
characterized BENE and MAL2, two
unedited members of the MAL family also
present in rafts. Our studies indicate that
BENE is involved in cholesterol transport
in endothelial cells, whereas MAL2 plays
an essential role as a component of the
machinery for the indirect of transcytotic
route that transport proteins from the
basolateral to the apical surface in
hepatocytes and polarized epithelial cells.
The MAL family plays, therefore, a central
place in the regulation of the intracellular
traffic.
In addition, we are also interested in the
molecular basis for regulation of gene
expression at the T-cell receptor genes
by enhancers through the study of nuclear
localization of these genes and
characterization of the multiprotein
complexes assembled on their enhancers
during cell development.
MAL mediates the direct pathway to the apical surface in polarized epithelial cells,
whereas MAL2 directs the indirect transcytotic route both in epithelial cells and
hepatocytes.
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Fernando Martín-Belmonte. 2001. “Función del
proteolípido MAL en el transporte polarizado de
proteínas en células epiteliales”. Universidad Autónoma
de Madrid.
María del Carmen de Marco. 2002. “Caracterización
de BENE y MAL2, dos nuevos miembros de la familia
MAL de proteínas, como elementos de la maquinaria
de tráfico de membranas”. Universidad Autónoma de
Madrid.
105
Resumen de Investigación
El grupo de Biología Molecular de
Microorganismos Extremófilos posee
distintas líneas de investigación cuyos
objetivos principales se resumen a
continuación:
Biohidrometalurgia, ecología, biología
molecular y biotecnología de
microorganismos que se desarrollan en
ambientes ácidos, con especial énfasis
en los aspectos aplicados de los
mismos: biominería, biodesulfuración de
carbones, secuestro específico de metales
pesados, fitorremediación.
Ecología microbiana de ambientes
extremos terrestres como modelos de
vida de interés astrobiológico:
geomicrobiología del Río Tinto y de las
lagunas hipersalinas de la Mancha (Tirez).
Este trabajo se hace en colaboración con
el laboratorio de Extremofilia del Centro de
Astrobiología (INTA-CSIC).
Caracterización estructural y funcional
de chaperonas de haloarqueas:
purificación, identificación de los genes
codificantes y clonación, estudios
estructurales al microscopio electrónico, su
papel en la reconstitución de ribosomas,
sus aplicaciones en nanotecnología.
Metanogénesis: i) caracterización
microbiana de las formas de desarrollo
de la biomasa anaerobia (lodo granular
y biopelículas): identificación,
cuantificación, formación y estudio de la
estructura del gránulo y distribución espacial
de las diferentes poblaciones; ii) toxicidad
y biodegradación de alquilbenceno
sulfonatos (LAS) en sistemas anaerobios:
caracterización microbiológica de
sedimentos marinos, rutas degradativas,
etc.; iii) biorremediación de compuestos
azufrados en efluentes industriales; iv)
ecología molecular microbiana de
ambientes extremos anaerobios (ácidos e
hipersalinos). En todos los casos se aplican
técnicas moleculares: hibridación in situ
con sondas fluorescentes (FISH),
electroforesis en gel con gradiente
desnaturalizante (DGGE) y clonación.
Dinoflagelados marinos: i) desarrollo de
métodos inmunológicos y moleculares para
la detección de toxinas DSP y los
organismos productores y ii) identificación
y clonación de proteínas relacionadas con
la producción de toxinas PSP por diferentes
especies del género Alexandrium
comparando: a) cepas tóxicas y no tóxicas,
b) a lo largo del ciclo celular, c) sus bacterias
simbiontes. Actualmente se está iniciando
un proyecto relacionado con la
secuenciación del genoma de Dinophysis
acuminata.
Jefe de Línea / Group Leader:
Ricardo Amils
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
Irma Marín
Francisco Santamaría
José Luis Sanz
Francisco Hernández
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Elena González Toril
Angeles Aguilera
Felipe Gómez
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Enrique Marín
Javier Chichón
Eva Lospitao
Emiliano Díaz
Moustafa Malki
Eva Mejía
Antonio García
Lucía Palacios
Nuria Fernández
Thorsten Köchling
Alberto Fernández Fairen
Erik Zettler
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
Nuria Rodríguez
Juan Francisco Morales
Modesta Gutierrez
Científicos Visitantes /
Visiting Scientists:
Antonio Lazcano (U. Nacional de
México)
Ana Mª Amaro (U. de Chile)
Linda Amaral (MBL Woods Hole)
Erik Zettler (MBL Woods Hole)
Biología molecular de extremófilos (microbiologíaaplicada)
E.3
Modelo de la geomicrobiología del río Tinto.
Regulación de laexpresión génica
Regulation of geneexpression
106
López-Archilla, A.I., Marín, I., Amils, R. (2001) Microbial
Community Composition and Ecology of an Acidic Aquatic
Environment: The Tinto River, Spain. Microb. Ecol. 41,
20-35
González-Toril, E., Gómez, F., Rodríguez, N., Fernández-
Remolar, D., Zuluaga, J., Marín, I., Amils, R. (2001)
Geomicrobiology of the Tinto River, a model of interest
for biohydrometallurgy. En “Biohydrometallurgy:
fundamentals, technology and sustainable development”,
Vol. B, Ciminelli, V.S.T. y García, O. (eds.), Elsevier,
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Durán, C., Sargeant, C., Rodríguez, N., Amils, R. (2001)
Specific Cr(III) sequestering using an acidophilic fungal
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and sustainable development”, Vol. B, Ciminelli, V.S.T. y
García, O. (eds.), Elsevier, Amsterdam, pp. 237-246
Culubret, E. N,, Luz, M., Rojas, P., Amils, R., Sanz, J.L.
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Marín, I., Aguilera, A., Reguera, B., Abad, J.P. (2001)
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Gómez, F., González-Toril, E., Rodríguez, N., Fernández-
Remolar, D., Aguilera, A., Malki, M., Amils, R. (2002)
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(ed.), UNAM, México, pp. 1-20
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Modificados Genéticamente. Vida Rural 19, 14-16
Marín, E. (2002) Nueva normativa para los Organismos
Modificados Genéticamente. Cultura Biotec. 2, 5.
Molecular biology of extremophylic microorganisms
Publicaciones/Publications:
Research summary
The objectives of the Extremophiles group
are the following:
Biohydrometallurgy: ecology,
molecular biology, and biotechnology
of acidophilic microorganisms, with
special emphasis in their potential
application: biomining, bioremediation,
specific metal sequestering,
fitoremediation.
Microbial ecology of terrestrial extreme
environments as models of
astrobiological interest:
geomicrobiology of the Tinto River and
hypersaline ponds from la Mancha (Tirez).
In colaboration with the Centro de
Astrobiología (INTA-CSIC)
Structural and functional
characterization of haloarchaeal
chaperons: purification, gen identification,
cloning, structural studies at the electron
microscope, role in the reconstitution of
ribosomes, application in nanotechnology
Metanogenesis: I) microbial
characterization of the biomass present
in an anaerobic reactor (granular sludge,
biofilms): identification, quantification,
formation, structural studies of the
granules and space distribution of the
microbial populations; ii) toxicity and
biodegradation of alkylbencen sulfonates
(LAS) in anaerobic systems: microbial
characterization of marine sediments,
degradative pathways, etc.; iii)
bioremediation of sulfur compounds from
industrial effluents, iv) molecular ecology
of anaerobic extreme environments (acidic
and hypersaline). Molecular ecology
techniques are used in all the projects:
fluorescence in situ hybridization (FISH),
denaturating gradient gel electrophoresis
(DGGE) and cloning.
Marine dinoflagellates: i) development
of inmunological and molecular
methodologies for the detection of DSP
toxins and producing microorganisms and
ii) identification and cloning of proteins
related with the production of PSP toxins
by different species of the genus
Alexandrium comparing: a) toxic and non
toxic strains, b) cellular cycle, c) symbiotic
bactetia. A project related with the genome
sequencing of Dinophysis acuminata is
starting.
El rio Tinto en la zona anóxica de Berrocal.
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Elena González Toril. 2002. “Ecología molecular de la
comunidad microbiana de un ambiente extremo: el
Río Tinto”. Universidad Autónoma de Madrid.
107
Jefe de Línea / Group Leader:
Juan Alfonso Ayala Serrano
e-mail: [email protected]
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Guillermo Cobas Pupo
Daniel Edgar Vega Mendoza
Estudiantes /
Undergraduate Students:
Ana Rosa Villaroya Moreno
Rachel Ruíz
Fernando López Gallego
Amelie Borges
Ingrid Dunn-Stanley
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
Susana Dominguez Santos
Carmen Panadero Alvarez
Nuria Salas
Científicos Visitantes /
Visiting Scientist:
Vanina Romanello, Universidad de
Rosario, Argentina
Juan Francisco Almenares, Universidad
de Oriente, CEBI, Cuba
Prof. Jean van Heijenoort, Universite
de Paris-Sud, Francia
Dr. Gabriel Guntkind, Universidad
Buenos Aires, Argentina
Dr. Kuvat T. Momynaliev, Institute of
Physico-Chemical Medicine, Moscow,
Russia
División celular bacteriana y resistencia aantibióticos
E.4
Topología de FtsW en la membrana interna de Escherichia coli, derivada de la actividad AP y la resistencia a -lactámicos de fusiones génicas. La secuencia aminoacídica se
muestra con el código de una letra y rodeadas por círculos, cuadrados o rombos. Se muestran las posiciones conservadas en al menos 60% (cuadrados) o en mas de 90%
(rombos) de los homólogos a FtsW. Las posiciones de las fusiones PhoA y Bla están colocadas en el modelo (caracteres blancos) de acuerdo con la actividad AP o resistencia
a Bla, con fondo oscuro (activas o resistentes) o fondo gris (inactivas o sensibles). Los residuos conservados entre las secuencias de FtsW de E. coli y S. pneumonia están
resaltados por una línea gruesa y fondo blanco. PER, periplasma. CM, membrana citoplásmica, CYT, citoplasma.
Membrane topology model of FtsW from Escherichia coli derived from AP activity and -lactam resistance of fusion proteins. The primary amino acid sequence is given in the
single-letter code and in black characters surrounded by a circle, a square or a diamond. Conserved position in at least 60% (squares) or in more than 90% (diamonds) of the
FtsW homologues are indicated. The positions of the PhoA and BlaM fusions are superimposed to the model (in white characters) according to the AP activity or Bla resistance
as black (active or resistant) or grey (inactive or sensitive) background. Conserved residues among the sequence of FtsW from E. coli and S. pneumonia are highlighted by a
bold line and white background. PER, periplasm. CM, cytoplasmic membrane, CYT, cytoplasm.
Regulación de laexpresión génica
Regulation of geneexpression
Resumen de Investigación
Los objetivos de nuestro grupo son elestudio desde un punto de vista moleculardel proceso de crecimiento y divisiónbacteriana y de los diversos mecanismosde resistencia a los antibióticos -lactámicos,que se han desarrollado por losmicroorganismos patógenos de origenclínico.
La mayor parte de los enzimas implicadosen el proceso de división bacteria seencuentran agrupados en el cluster dcw(division and cell wall), muy conservado enla evolución y donde se incluyen, entreotros, los genes pbpB, ftsW y ftsZ. El estudiode la funcionalidad de FtsW en Escherichiacoli ha sido uno de los aspectos que hemosdesarrollado en este periodo.
Los mecanismos de resistencia a losantibióticos desarrollados por las bacteriaspatógenas son muy complejos y incluyenentre otros, transmisión horizontal dedeterminantes de resistencia, modificaciónde la permeabilidad de la membrana yexpresión de bombas de eflujo. En esteperiodo hemos caracterizado una nueva-lactamasa (CTX-M-2) transmisible en un
nuevo integrón, así como la influencia dela longitud de cadena del antígeno-O en lainvasividad de Shigella flexneri. Además,estamos caracterizando las proteínas demembrana externa de Pseudomonasaeruginosa de origen clínico.
Tras la publicación de la secuencia completadel genoma de Salmonella Typhi se hahecho patente la presencia de genesparálogos para las PBPs no previamenteidentificados por estudios bioquímicos. Dosde estos genes codifican para parálogoscromosomales de pbpA y pbpB, que noestán presente en Escherichia coli. Estamosanalizando estas proteínas desde el puntode vista genético, enzimático y fisiológico,y encontrando evidencias de su implicaciónen los procesos de invasión y proliferaciónintracelular.
El peptidoglicano lateral durante laelongación bacteriana se sintetizaesencialmente por la proteína PBP1b. Estaproteína presenta una actividadtranspeptidasa (crosslinking) asociada aldominio C-terminal, y una actividadtransglicosilasa (elongación de cadena) enel dominio N-terminal. A pesar de losesfuerzos de varios grupos para lacristalización y determinación de laestructura de esta proteína, aun no se hanconseguido resultados positivos. Noobstante hemos avanzado en elconocimiento de la interacción con elantibiótico inhibidor de la transglicosilación,moenomicina A, y en la funcionalidad decada dominio de la proteína.
La proteína FtsZ es un componente esencialdel anillo septal para la división bacteriana.Este anillo, con estructura que presentaanalogías al citoesqueleto eucariota, pareceser un componente universal para elmecanismo de división. Dado queMycoplasma hominis tiene todas lascaracterísticas de la célula procariotamínima y algunos de los procesos de lasbacterias con envoltura, es un modeloprometedor para el estudio de los principiosbásicos del proceso de división. En esteperiodo hemos iniciado el estudio de estaproteína en este microorganismo y enmutantes de origen clínico.
Los logros esenciales en los dos últimosaños han sido: 1.-Estudio de la distribuciónde cadenas de antígeno O durante elcrecimiento exponencial e intracelular deShigella flexneri, 2.- La caraterizacióntopológica en la membrana para la proteínaesencial FtsW implicada en división celularen Escherichia coli, 3.- Descripción de unnuevo integrón de Clase 1 (InS21) portadordel gen de resistencia blaCTX-M-2 enSalmonella enterica Serovar Infantis. 4.-Análisis por Resonancia de PlasmaSuperficial (SPR) de la interacción entre elantibiótico Moenomicina A con la Penicillin-Binding Protein 1b de Escherichia coli, 5.-Caracterización del gen ftsZ de Mycoplasmahominis y la variabilidad de secuencia enmutantes clínicos de Mycoplasma.
108
Varela, G., Schelotto, F., diConza, J., Ayala, J. A. (2001)
Analysis of the O-antigen chain length distribution during
exponential and intracellular growth of Shigella flexneri.
Microbial Pathogenesis 31, 21-27
Lara, B., Ayala, J.A. (2002) Topological characterization
of the essential Escherichia coli cell division protein
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Di Conza, J., Ayala, J.A., Power, P., Mollerach, M.,
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Stembera, K., Vogel, S., Buchynskyy, A., Ayala, J.A.,
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559-565
Momynaliev, K. T., Smirnova, O. V., Lazyrev, V. N., Akopian,
T. A., Chelysheva, V. V., Ayala, J.A., Simankova, A. N.,
Borchsenius, S. N., Govorun, V. M. (2002) Characterization
of the Mycoplasma hominis ftsZ Gene and Its Sequence
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Biophys. Research Comm. 293, 155-162
Di Conza, J., Mollerach, M., Ayala, J.A., Gutkind, G.
(2002) Estudio de integrones clase 1 en Salmonella
aisladas en Santa Fe, Argentina. Revista FABICIB 6,
163-169
Bacterial cell division and antibiotics resistance
Publicaciones/Publications:
Research summary
The objectives of our group is the analysis
under diverse molecular approaches of
the bacterial growth and cell division, and
to study the mechanisms of resistance to
the -lactam antibiotics, that have been
developed by pathogens of clinical origin.
Most of the gene coding for the enzymes
involved on cell division processes are
grouped in the dcw cluster (division and
cell wall), highly conserved during
evolution and including, among others,
the genes pbpB, ftsW and ftsZ. The study
of functional characterization of the FtsW
protein has been developed during this
period.
The molecular mechanisms that have
been developed by pathogens are very
complex, including, horizontal
transmission of resistance determinants,
change of membrane permeability and
expression of efflux pumps. In this period
we have characterize a new -lactamase
(CTX-M-2) transmissible by a new
integron InS21, and also the influence of
O-antigen length on virulence of Shigella
flexneri. We are also characterizing the
outer membrane proteins in clinical isolate
of Pseudomonas aeruginosa.
After the complexion of the Salmonella
Typhi genome sequence, it has become
apparent that some paralogous PBP
genes have not been identified previously
by the biochemical methods. Two of these
genes code for chromosomal pbpA and
pbpB paralogues, which are not present
in Escherichia coli. We are analyzing these
proteins from the genetic, enzymatic and
physiological point of view, and we have
found evidence for involvement on the
cellular invasion and proliferation
processes.
Lateral peptidoglycan during cell
elongation is synthesized mainly by the
penicillin-binding protein PBP1b. This
protein holds the transpeptidase activity
(crosslinking) in the C-terminal domain,
and the transglycosylase activity (chain
elongation) in the N-terminal domain. In
spite of the big effort of several groups to
crystallize and to determine the 3D
structure of this protein, there are no
positive results. However, we have
advanced on the knowledge of the
interaction with the transglycosylase-
inhibitor antibiotic moenomycin and the
functionality of each domain of the protein.
The FtsZ protein is an essential
component of the bacterial cell division
ring. This cytoskeleton-like ring is believed
to be the universal way of bacterial
division. Mycoplasma hominis possesses
all features of the minimal cell and some
traits of cell-wall bacteria and seems to
be a promising object for study of basic
principles of the bacterial division process.
In this period we have started the analysis
of this protein in this model microorganism,
and variant forms of clinical origin.
Our main achievements in the last two
years were: 1.- O-antigen chain length
distribution during exponential and
intracellular growth of Shigella flexneri,
2.- Topological characterization of the
essential Escherichia coli cell division
protein FtsW, 3.- Description of a novel
Class 1 integron (InS21) carrying the
blaCTX-M-2 in Salmonella enterica
Serovar Infantis, 4.- Surface Plasmon
Resonance analysis of the interaction
between the antibiotic moenomycin A with
Penicillin-Binding Protein 1b of
Escherichia coli, and 5.- Characterization
of the Mycoplasma hominis ftsZ gene and
its sequence variability in the Mycoplasma
clinical isolates.
109
Resumen de Investigación
Nuestro grupo utiliza aislados del género
Thermus como organismo termófilo modelo,
tanto para estudios de carácter básico
acerca de su biología, como en su vertiente
más aplicada para su utilización como
"factoría celular" para la producción de
enzimas termoestables. A nivel básico, los
objetivos fundamentales en los dos últimos
años han sido el análisis de la regulación
transcripcional y traduccional del
componente mayoritario de la capa proteica
cristalina (capaS) que envuelve a esta
bacteria, y la caracterización de las enzimas
implicadas en la respiración anaeróbica de
nitrato. En el primer aspecto, hemos
demostrado la existencia de un espacio
periplásmico en Thermus a través del
aislamiento de mutantes de deleción de la
región 5'UTR (transcrita pero no traducida)
del gen de la capa S(slpA), y hemos
analizado in vivo la función de SlrA, una
proteína que ejerce una fuerte actividad
represora sobre la transcripción de slpA, a
pesar de ser exportada al periplasma (C.
Vallés, Tesis Doctoral). En el segundo
aspecto, hemos demostrado que la
maduración y unión a la membrana de las
subunidades mayores de la nitrato reductasa
respiratoria requiere la presencia de un
citocromo C periplásmico en T. thermophilus.
A nivel aplicado, hemos descrito y
empleado por primera vez en termófilos
extremos dos genes trazadores, codificantes
de una -galactosidasa y una fosfatasa
alcalina (AP), ambas con óptimos de
actividad en torno a los 80 ºC. La AP es
una enzima periplásmica que utiliza el
recientemente descrito sistema de
transporte Tat (Twin Arginine Transporter)
para su secreción en E. coli.
Adicionalmente, hemos empleado el
promotor de la nitrato reductasa respiratoria
para la construcción de los primeros
vectores de expresión controlada en
Thermus, utilizándolos para demostrar in
vivo la termoestabilidad de una ribozima
del parásito Schistosoma mansoni.
Jefe de Línea / Group Leader:
José Berenguer
e-mail: [email protected]
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Jasminka Boskovic
Celia Perales
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Cristina Vallés
Pablo Castán
Renata Moreno
Felipe Cava
Olga Zafra
Eddy Caro
Emilio Blas
Técnico de Investigación /
Technical Assistance:
Margarita Sánchez
Biotecnología y genética de bacteriastermófilas extremas
E.5
Termoestabilidad in vivo de la ribozima SM 1 de Schistosoma mansoni. En regiones repetitivas del genoma de S. mansoni (A) se encuentra codificada una ribozima
(SM 1) capaz de producir la ruptura (en trans) de un RNA blanco (Syn) y la suya propia (en cis) (B). Ambos genes fueron clonados en T. thermophilus en direcciones
opuestas, bajo el control de un promotor inducible (Pnar) y otro constitutivo (Ps), respectivamente (C). Tras la inducción de Pnar se analizó la actividad en cis y
en trans de la ribozima a distintas temperaturas (50-80 ºC) mediante Northern blot (D) con sondas contra el RNA blanco (Osyn) y la ribozima (Orib1 y Orib2).
Nótese como ambas actividades máximas tienen lugar a 70 ºC.
In vivo thermostability of the ribozyme SM 1 from Schistosoma mansoni. Within the repetitive DNA sequences of Schistosoma mansoni (A) a ribozyme (SM 1) is
encoded, which is able to catalyze its self-cleavage (in cis) and the cleavage (in trans) of a target RNA (Syn) (B). Both genes were cloned divergently in T. thermophilus
HB8 under the control of inducible (Pnar) and constitutive (Ps) promoters, respectively (C). After induction of Pnar, cis and trans activities were analyzed by Northern
blot at different temperatures (50-80 ºC), with specific probes against the target RNA (Osyn) and the ribozyme (Orib1 y Orib2). Note how both activities reached
their maximum at 70 ºC.
Regulación de laexpresión génica
Regulation of geneexpression
110
Sanchez, M., Vicente, M. F., Cercenado, E., de Pedro,
M. A., Gomez, P,, Moreno, R., Morón, R., Berenguer, J.
(2001) Diversity among clinical isolates of penicillin-
resistant Streptococcus mitis: indication for a PBP1-
dependent way to reach high levels of penicillin resistance.
Int. Microbiol. 4, 217-222
Castán, P., de Pedro, M. A., Risco, C., Vallés, C.,
Fernández-Herrero, L. A., Schwarz, H., Berenguer, J.
(2001) Multiple Regulatory Mechanisms Act on the 5’
Untranslated Region of the S-layer Gene from Thermus
thermophilus HB8. J. Bacteriol. 183, 1491-1494
Angelini, S., Moreno, R., Gouffi, K., Santini, C-L.,
Yamagishi, A., Berenguer, J., Wu, L-F. (2001) Export of
Thermus thermophilus alkaline phosphatase via the twin-
arginine translocation pathway in Escherichia coli. FEBS
Letters 506, 103-107
Vázquez-Tello A., Castán, P., Moreno, R., Smith, J. M.,
Berenguer, J., Cedergren, R. (2002) Efficient trans-
cleavage by the Schistosoma mansoni SM 1 hammerhed
ribozyme in the extreme thermophile Thermus
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Castán, P., Zafra, O., Moreno, R., de Pedro, M. A., Vallés,
C., Cava, F., Caro, E. A., Schwarz, H., Berenguer, J.
(2002) The periplasmic space in Thermus thermophilus:
evidences from a regulation-defective S-layer mutant
overexpressing an alkaline phosphatase. Extremophiles
6, 225-232
Zafra, O., Ramírez, S., Castán, P., Moreno, R., Cava, F.,
Vallés, C., Caro, E., Berenguer, J. (2002) A cytochrome
c encoded by the nar operon is required for the synthesis
of active respiratory nitrate reductase in Thermus
thermophilus FEBS Letters 523 ,99-102
Vallés, C., Castán, P., Berenguer, J. (2002)
Microorganismos termófilos y sus aplicaciones. Colección
"Becas de Investigación" . Ed: Obra Social y Cultural
de Caja Segovia. I.S.B.N.: 84-89711-91-7
Patentes / Patents
Zafra, O., Moreno, R., Berenguer, J. (2001) Proceso de
obtención y purificación de una fosfatasa alcalina
recombinante altamente termoestable. OEPM:
200100725
Moreno, R., Zafra, O., Berenguer, J. (2001) Vector
plasmídico para la expresión controlada de proteínas
en bacterias termófilas extremas genéticamente
modificadas. OEPM: 200101224.
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Cristina Vallés. 2002. “Caracterización funcional de la
proteína SlrA de Thermus thermophilus HB8”. Universidad
Autónoma de Madrid.
Biotechnology and genetics of extremethermophilic bacteria
Publicaciones/Publications:
Research summary
Our research group uses isolates
belonging to the genus Thermus as
models of thermophilic microorganisms,
both for basic research on their biology
, and, from an applied point of view, for
their use as "cell factories" to produce
thermostable enzymes.
At the basic research level, the main
objectives during the last two years have
been the analysis of the transcriptional
and traductional regulation of the main
component of the crystalline protein layer
(S-layer) that surrounds this bacteria, and
the characterization of the enzymes
implicated on the anaerobic respiration
of nitrate. On the first topic, we have
demonstrated the existence of a
periplasmic space in Thermus through
the isolation of mutants in which the 5'UTR
(untranslated region) region of the S-layer
gene (slpA) was deleted. We also have
analyzed in vivo the function of SlrA, a
protein which strongly repress the
transcription of slpA, despite being
secreted to the periplasm (C. Vallés, PhD.
Thesis). On the nitrate respiration topic,
we have demonstrated that the maturation
and membrane binding of the major
subunit of the respiratory nitrate reductase
requires the presence of a periplasmic
cytochrome C in T. thermophilus.
At the applied level, we have described
and used for the first time in extreme
thermophiles two gene reporters, coding
for a -galactosidase and a alkaline
phosphatase (AP), both with optimum
activities around 80 ºC. Interestingly, the
periplasmic AP uses the recently
described Tat (twin arginine transporter)
system for its secretion in E. coli. In
addition, we have used the promoter of
the respiratory nitrate reductase to
construct the firsts vectors for the
controlled expression in Thermus, using
them to demonstrate in vivo the
thermostability of a ribozyme from the
parasite Schistosoma mansoni.
Corte fino de células del mutante UTRslpA
de Thermus thermophilus HB8. Obsérvese la
existencia de una envoltura externa común a
un grupo de 14 células. La barra corresponde
a 0,5 µm.
Thin section of cells from the UTRslpA mutant
of Thermus thermophilus HB8. Note the
presence of a common external envelope
surrounding a group of 14 cells. Bar
corresponds to 0,5 µm.
111
Resumen de Investigación
Hemos identificado dos nuevas DNA
polimerasas eucarióticas, denominadas
Pol (32% de identidad de aminoácidos
con la Pol ß) y Pol µ (42% de identidad de
aminoácidos con TdT). En una primera fase
hemos determinado sus principales
actividades enzimáticas: polimerización de
DNA y actividad dRP liasa (Pol );
polimerización de DNA y actividad
transferasa terminal (Pol µ). Nuestros datos
muestran el potencial enzimático de Pol
para participar en la reparación de daño
oxidativo en el DNA por un mecanismo de
excisión de base (“base excision repair”, ó
BER), uno de los procesos más frecuentes
de reparación, que elimina bases
modificadas y sitios abásicos. Por otro lado,
las propiedades de la Pol µ son idóneas
para ser el enzima implicado en la
reparación de dobles roturas de cadena de
DNA que son procesadas por un
mecanismo de reunión de extremos no
homólogos (NHEJ).
Estamos llevando a cabo un análisis
estructura-función de la fidelidad de síntesis
y de la capacidad de dislocación de ambos
enzimas. En el caso de la Pol humana,
se intentará correlacionar diferencias de
fidelidad con la expresión preferencial de
una variante alélica en muestras de tumores.
Varias isoformas de Pol , expresadas
específicamente o más abundantemente
en muestras de tumores podrían
representan variantes “mutadoras” del
enzima que pudieran contribuir al proceso
de tumorogénesis. Se intentará demostrar
la participación de Pol y Pol µ en
reparación de DNA, estudiando la respuesta
a diversos tipos de daño en el DNA de
líneas celulares sobreproductoras de Pol
(ambos alelos) o de Pol µ. Se buscarán
interacciones específicas a través del
dominio BRCT presente en ambos enzimas
mediante análisis de dos híbridos de
levadura. Finalmente, se analizarán los
modelos murinos (knock-out) deficientes
en Pol y Pol µ que hemos generado en
colaboración con otros grupos de
investigación nacionales e internacionales.
Jefe de Línea / Group Leader:
Luis Blanco
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
Antonio Rodríguez Fernández de
Henestrosa
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Tomas Kirchhoff
Rosario Sabariegos Jareño
Esther García Palomero
Sergio González Barrera
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
José Ruiz Pérez
Miguel García Díaz
Raquel Juárez Santos
Estudiantes /
Undergraduate Students:
Angel Picher Serantes
Gloria Terrados Aguado
Mantenimiento y variabilidad del genoma:enzimología de la reparacion del DNA
E.6
Funciones propuestas para la Pol µ, en base a los datos de expresión (hipermutación
somática y recombinación VDJ) y en la capacidad del enzima para alinear cadenas
de DNA parcialmente complementarias (reparación de dobles roturas de cadena de
DNA vía NHEJ).
Functions proposed for Pol µ, based on data derived from expression (somatic
hypermutation and VDJ recombination) and the ability of the enzyme to align partially
complementary DNA strands (double-stranded DNA repair through NHEJ).
Regulación de laexpresión génica
Regulation of geneexpression
112
Ruiz, J.F., Dominguez, O., Lain de Lera, T., García-Diaz,
M., Bernad, A., Blanco, L.(2001) DNA polymerase mu,
a candidate hypermutase? Philos. Trans. R. Soc. Lond.
B. Biol. Sci. 356, 99-109
García, M., Bebenek, K., Kunkel, T., Blanco, L. (2001)
Identification of an intrinsic dRP lyase activity in human
DNA polymerase lambda: a possible role in base excision
repair. J. Biol. Chem. 276, 34659-34663
Burgers, P.M.J., Koonin, E. V., Blanco, L. et al. (2001)
Eukaryotic DNA polymerases: proposal for a revised
nomenclature. J. Biol. Chem. 276, 43487-43490
Taladriz, S., Hanke, T., Ramiro, M.J., García-Diaz, M.,
García De Lacoba, M., Blanco, L., Larraga, V.. (2001)
Nuclear DNA polymerase beta from Leishmania infantum.
Cloning, molecular analysis and developmental regulation.
Nucleic Acids Res. 29, 3822-34
García-Díaz, M., Bebenek, K., Sabariegos, R.,
Domínguez, O., Rodríguez, J., Kirchhoff, T., García-
Palomero, E., Picher, A.J., Juárez, R., Ruiz, J.F., Kunkel,
T.A., Blanco, L. (2002) DNA Polymerase Lambda, a
Novel DNA Repair Enzyme in Human Cells. J. Biol.
Chem. 277, 13184-13191
Truniger, V., Lázaro, J.M., Blanco, L., Salas, M. (2002)
A highly conserved lysine residue in phi29 DNA
polymerase is important for correct binding of the
templating nucleotide during initiation of phi29 DNA
replication. J. Mol. Biol. 318, 83-96
Duvauchelle, J.-B., Blanco, L., Fuchs, R. P. P., Cordonnier,
A. M. (2002) Human DNA polymerase mu (Pol µ) exhibits
an unusual replication slippage ability at AAF lesion.
Nucleic Acids Res. 30, 2061-2067
Truniger, V., Lázaro, J.M., Esteban, F.J., Blanco, L., Salas,
M. (2002) A positively charged residue of phi29 DNA
polymerase, highly conserved in DNA polymerases from
families A and B, is involved in binding the incoming
nucleotide. Nucleic Acids Res. 30, 1483-1492
Maga, G., Villani, G., Ramadan, K., Shevelev, I., Tanguy
Le Gac, N., Blanco, L., Blanca, G., Spadari, S., Hübscher,
U. (2002) Human DNA polymerase lambda functionally
and physically interacts with proliferating cell nuclear
antigen in normal and translesion DNA synthesis. J. Biol.
Chem. 277, 48434-48440
Genome maintenance and variability:enzymology of DNA repair
Publicaciones/Publications:
Research summary
We have identified two novel eukaryotic
DNA polymerases, named Pol , (32%
amino acid identity with Pol ß) and Pol µ
(42% amino acid identity with TdT). In a
preliminar characterization, we described
their main enzymatic activities: DNA
polymerization and dRP lyase (Pol );
DNA polymerization and terminal
transferase (Pol µ). Our data demonstrate
the enzimatic potential of Pol to
participate in the repair of oxidative
damage by a mechanism named base
excision repair (BER), a very active
pathway that deals with modified bases
and abasic sites. On the other hand, the
peculiar properties of Pol µ make this
enzyme the most suitable candidate to
repair double strand breaks (DSBs) by a
mechanism referred to as non-
homologous end-joining (NHEJ).
We are carrying out a structure-function
analysis of the intrinsic fidelity and
dislocation capacity of both enzymes. For
human Pol , fidelity differences that could
imply a mutator phenotype will be
correlated with allelic variants preferentially
expressed in tumoral samples. Various
Pol isoforms, specifically and/or
abundantly expressed in tumoral samples
could be “mutator variants” with an
implication in tumorogenesis. The
involvement of Pol in a base excission
repair (BER) mechanism to relieve
oxidative damage in DNA, and the
involvement of Pol µ in double-strand
break repair via NHEJ will be studied by
testing damage responsiveness of cell
lines overproducing Pol (each of both
allelic variants) or Pol µ. Specific
interactions, proposed to occur through
the BRCT domain present in both
enzymes, will be studied by yeast two-
hybrid analysis. Finally, murine KO models
of Pol and Pol µ deficiency, generated
in collaboration with other research
laboratories, will be studied.
Representación del sitio activo de polimerización de la Pol ß humana, en la que se indican una serie de
residuos implicados en la catálisis y fidelidad de inserción del nucleótido entrante (en amarillo), en base
a la complementariedad con un nucleótido molde (en verde). Los residuos coloreados en marrón son
invariantes entre Pol ß y Pol . La falta de conservación de Lys280, Asp276 y Ala185 sugiere importantes
diferencias entre la Pol ß y la Pol . La figura ha sido realizada con los programas GRASP, MOLSCRIPT
y RASTER3D, utilizando el fichero 1BPY del banco de datos PDB.
The active polymerization site of human Pol ß, indicating the sites involved in catalysis and incoming
nucleotide insertion fidelity (yellow), based on the complementarity with a template nucleotide (green).
Brown-colored residues are invariant in Pol ß and Pol . The lack of conservation in Lys280, Asp276 and
Ala185 suggests important differences between Pol ß and Pol . The figure has been prepared using
GRASP, MOLSCRIPT and RASTER3D software, using the 1BPY file and the PDB database.
113
Resumen de Investigación
El objetivo general de nuestra línea de
investigación es el estudio a nivel molecular
de la expresión génica específica de tejido
en células humanas. Nuestro sistema
modelo principal lo constituye el gen
humano HGH-N que se transcribe
específicamente en la hipófisis anterior y
que se localiza en el cromosoma 17q23.3
dentro del locus "HGH-HPL". A este locus
pertenecen genes que comparten una gran
homología de secuencia pero que se
transcriben en tejido placentario: HGH-V,
HPL-3 y HPL-4. Asimismo, hemos iniciado
el estudio de los mecanismos de restricción
especifica de tejido de otro locus génico
humano: "HLH-HCG", localizado en el
cromosoma 19q13.3 y que también
presenta un patrón de expresión tisular
semejante: hipófisis vs placenta. Para ello
se están analizando las regiones
promotoras y enhancers de estos genes,
identificando los elementos que confieren
restricción de expresión específica de tejido,
así como la purificación de los factores de
transcripción que las regulan.
Otra área de desarrollo dentro de nuestra
línea de investigación, es la puesta a punto
de técnicas de análisis de expresión
diferencial de mRNAs: "Differential Display
RT-PCR" y DNA Microarrays" que nos ha
permitido establecer dos nuevos objetivos:
(1) Identificación y clonaje de genes
específicamente expresados en tumores
hipofisarios humanos, que nos permitirán
profundizar en los mecanismos moleculares
de expresión génica hipofisaria, así como
en el desarrollo de nuevos marcadores de
progresión tumoral hipofisaria.
(2) Identificación y caracterización de genes
específicamente expresados en tejido
endometrial humano durante la "ventana"
de implantación, para clonar nuevos genes
marcadores de implantación embrionaria.
Jefe de Línea / Group Leader:
José Luis Castrillo Díez
e-mail: [email protected]
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Silvia Avila Flores
Olga Bassy Alvarez
Job García Liévana
Juan Ignacio Imbaud
Angelina Rodríguez Torres
Técnico de Investigación /
Technical Assistance:
Enrique Martín-Francés
Científicos Visitantes /
Visiting Scientists:
Estela Bastos
(ICETA-UTAD, Portugal)
Ivan Delgado
(UANL, México)
Regulación de la expresión génicaespecífica de tejido
E.7
Microscopía Confocal del Factor de Transcripción GHF1/Pit1 (verde) y de la
Hormona de Crecimiento hGH (rojo), en células hipofisarias.
Confocal Microscopy of GHF1/Pit1 transcripción factor (green) and growth
hormone GH (red), in pituitary cells.
Regulación de laexpresión génica
Regulation of geneexpression
114
Martin, J., Avila, S., Jiménez, O., Pellicer, A., Castrillo,
J.L., Simon, C. (2001) Detection of novel genes
associated to high versus low endometrial receptivity
status. J. Soc. Gynecol. Invest. 8,115-118
Avila, S., Castrillo, J.L. (2002) Terapia Génica.
In: Hernandez, E., Simon, C. (ed.) Biología Molecular
en Medicina Reproductiva. FIVIER Press, España,
pp 200-210
Martín, J., Domínguez, F., Avila, S., Castrillo, J.L., Remohí,
J., Pellicer, A. Simon, C. (2002) Human Endometrial
Receptivity: Gene Regulation. J. Rep. Immunol. 55,
131-139
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Marina Romero Prado. 2002. “Mecanismos de regulación
transcripcional de los genes humanos de las hormonas
de crecimiento hipofisaria (hGH-N) y placentaria (hGH-
V): efectos de la glucosa y estados de metilación del
DNA sobre su expresión”. Universidad Autónoma de
Madrid.
Martha Y. Díaz Gallardo. 2002. “Identificación de proteínas
coactivadoras del factor transcripcional PIT1/GHF1”.
Universidad Autónoma de Madrid.
Otras Actividades / Other Activities
ORGANIZACIÓN CURSOS ESPECIALIZACIÓN CSIC:
"Cursos Prácticos de Regulación Transcripcional y
Expresión Génica": Septiembre-2001 y 2002.
Regulation of the tissue-specific gene expression
Publicaciones/Publications:
Research summary
The overall goal of this project is to study
at molecular level the tissue-specific gene
expression in human cells. Our working
model is the human growth hormone
gene (HGH-N) specifically transcribed in
the anterior pituitary and mapped at
chromosome 17q23.3 in the "HGH-HPL"
locus. This is a gene-cluster with other
four closely related genes (HGH-V, HPL-
3 y HPL-4), but specifically transcribed
in placenta tissue. In addition, we started
the study of the tissue-specific
transcriptional control of the human "HLH-
HCG" locus, located at chromosome
19q13.3, and also expressed in pituitary
or placenta tissues. We are analyzing
the promotor and enhancer regions,
identifying the cis-DNA elements, and
cloning the transcription factors involved
in the tissue-specific transcriptional
control.
A new area of research and development
in our laboratory, is to set-up new
approaches to study differential
expression of mRNAs: DD-RTPCR and
DNA Microarrays techniques. We are
involved in two new goals:
(1) Identification and cloning of genes
specifically expressed in human pituitary
tumours. This approach can lead us to
improve our understanding of pituitary
gene-expression control, and use this
knowledge to develop new therapeutic
agents.
(2) Identification of genes diferentially
expressed in receptive versus non-
receptive human endometrium. Using
two cell lines with extreme receptive
phenotype and screening genome-wide
gene expression using DNA Microarrays
and DD-RTPCR, we are finding new
genes involved in the receptive or non-
receptive status. This approach can lead
us to improve our understanding of
endometrial receptivity and use this
knowledge to optimize it in infertility
patients or to alter it as an interceptive
procedure.
Differential Display (DD-RTPCR) gel.
Differential Display (DD-RTPCR) gel.
115
Resumen de Investigación
Regulación de la traducción en células
eucarióticas. Papel del tallo ribosómico
Nuestros estudios previos indican que el
tallo ribosómico puede regular la traducción
eucariótica. Este nuevo mecanismo de
control de la expresión génica puede jugar
un papel clave en la traducción de proteínas
relacionadas con determinadas condiciones
de estrés. El objetivo último de nuestro
trabajo es aclarar este mecanismo de
regulación usando como modelo
Saccharomyces cerevisiae, cuyo tallo
ribosómico esta constituido por las proteínas
P0, P1 , P1 , P2 , P2 y L12. Como
objetivos inmediatos nos proponemos:
A) Caracterizar las interacciones entre los
distintos componentes del tallo y de éste
con los factores solubles de la síntesis de
proteínas, en especial del factor EF-2. Se
aplican técnicas de “doble híbrido”, puenteo
químico, etiquetado de proteínas con
diferentes marcadores, incluyendo la GFP.
La técnica “Fluorescence Correlation
Spectroscopy” (FCS) utilizando un
microscopio de fluorescencia de dos fotones
nos permite estudiar estas interacciones
en el interior de la célula (Colaboración con
Dr. E. Gratton).
B) Síntesis y ensamblaje del tallo
ribosómico. La acumulación de los
componentes del tallo está regulada por
degradación por un sistema diferente al
proteasoma y la vacuola. Se está
abordando el estudio de este desconocido
sistema degradativo caracterizando las
señales de degradación e intentando
identificar las proteasas implicadas.
C) Identificación de mRNAs cuya traducción
responde a alteraciones del tallo ribosómico.
Se obtendrá información de la comparación
del “transcriptoma” y del “traductoma”
(mRNas en polisomas) de mutantes con
alteraciones en el tallo ribosómico.
Igualmente se identificarán mediante
microarrays los mRNAs asociados a
polisomas en ensayos de traducción in vitro
derivados de los mismos mutantes. Se
caracterizarán elementos en cis y en trans
que afecta su traducción preferente.
D) Compuestos antifúngicos derivados de
la sordarina afectan directamente la función
del tallo ribosómico. Se están identificando
genes que afectan a la actividad inhibidora
y que pueden relacionarse con la función
ribosómica.
Jefe de Línea / Group Leader:Juan Pedro García Ballestae-mail: [email protected]
Personal Científico /Scientific Staff:Miguel RemachaAntonio Jiménez Díaz
Postdoctorales /Postdoctoral Fellows:Cruz SantosGretel NusspaumerSonia Zúñiga
Becarios Predoctorales /Graduate Students:Pilar ParadaPatricia González SantamaríaJorge Pérez FernándezDe-yi QiuAlberto García MarcosVerónica Briceño
Estudiantes /Undergraduate Students:Arancha SánchezRuben Hervás
Técnicos de Investigación /Technical Assistance:Mari Carmen Fernández Moyano,Rebeca GalisteoJuan Luis Alberruche
Científicos Visitantes /Visiting Scientists:Prof. David Jameson,Dept. Biología Molecular, Universidadde Hawaii, USADra. Sophia Kouyanou,Dept. Biología, Universidad de Atenas,GreciaProf. Wanxiang Xu,Fudan University, Shanghai, R.P. China
Estructura y función del ribosomaE.8
Aumento de la fluorescencia intrinseca de
S. cerevisiae en un microscopio de fluorescencia
de dos fotones
Regulación de laexpresión génica
Regulation of geneexpression
116
Gómez, E. B., Medina, G., Ballesta, J. P. G., Levin, M.J.,
Téllez-Iñón, M.T. (2001) Acidic ribosomal P proteins are
phosphorylated in Trypanosoma cruzi. Int. J. Parasitol.
31, 1032-1039
Guarinos, E., Remacha, M., Ballesta, J.P.G. (2001)
Asymmetric interactions between the acidic P1 and P2
proteins in the Saccharomyces cerevisiae ribosomal
stalk. J. Biol. Chem. 276, 32474-32479
Santos, C., Ballesta, J.P.G. (2002) Role of the ribosomal
stalk components in the resistance of Aspergillus
fumigatus to the sordarin antifungals. Mol. Microbiol.
43, 227-237
Lalioti, V.S., Pérez-Fernández, J., Remacha, M., Ballesta,
J.p.g. (2002) Characterization of interaction sites in the
Saccharomyces cerevisiae ribosomal stalk components.
Mol. Microbiol. 46, 719-729
Lázaro, E., Sanz, E., Remacha, M., Ballesta, J.P.G.
(2002) Characterization of sparsomycin resistance in
Streptomyces sparsogenes. Antimicrob. Agents
Chemother. 46, 2914-2919
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Pilar Parada Valdecantos. 2001. “Estudios bioquímicos,
biofísicos y celulares de la estructura del tallo ribosómico
se Saccharomyces cerevisiae”.
Patricia González Santamaría. 2002. “Rpn6 es una
proteína esencial para mantener la estructura y actividad
del proteasoma 26S de Saccharomyces cerevisiae”.
Ribosome structure and function
Publicaciones/Publications:
Research summary
Regulation of translation in eukaryotic
cells. Role of the ribosomal stalk
Our previous studies have indicated that
the ribosomal stalk may regulate
translation in eukaryotes. This new genetic
expression control mechanism can play
a key role in the translation of proteins
related to some stress conditions. The
final objective of our project is to
understand this regulatory mechanism
using as a model Saccharomyces
cerevisiae, whose stalk is formed by
proteins P0, P1 , P1 , P2 , P2 and
L12. As short term objectives we intend:
A) Characterizing the interactions between
the different stalk components as well as
between the stalk and the translation
soluble factors, especially EF2. The two-
hybrid method, chemical cross-linking,
protein tagging using different tags, like
GFP, are being used for in vitro studies.
Fluorescence correlation spectroscopy
(FCS) and two-photon fluorescence
microscopy are allowing us to study these
interactions inside the cell (collaboration
with Dr. E. Gratton).
B) Synthesis and assembly of the
ribosomal stalk. The cellular accumulation
of stalk components is regulated by
proteolysis through a system that is
different from the proteasome and the
vacuole. We are studying this unknown
degradation pathway by characterizing
the protein degradation signals and trying
to identify the proteases involved in the
process.
C) Identification of mRNAs whose
translation is affected by ribosomal stalk
alterations. Information will be gathered
from comparison of the “transcriptome”
and the “translatome” (mRNAs in
polysomes) from mutants having stalk
alterations. Similarly, mRNAs in polysomes
from in vitro translation systems derived
from the same mutants are being identified
using microarrays. Cis and trans acting
factors, which affect these mRNAs
translation will be characterized.
D) Antifungal sordarin derivatives directly
affect the stalk function. New genes that
affect the sordarin inhibitory activity, and
consequently can be related to the stalk
function, are being identified.
117
Resumen de Investigación
Control de la traducción por las eIF-2
quinasas (C. de Haro)
Cuatro proteínas quinasas diferentes
regulan la síntesis de proteínas en respuesta
a varias situaciones de estrés. Estas son,
el inhibidor regulado por hemina (HRI), la
proteína kinasa inducible por interferón y
activada por dsRNA (PKR), la quinasa
asociada al retículo endoplásmico (PERK)
y el GCN2. Clonamos el primer miembro
de esta familia de embriones de Drosophila
(Santoyo et al. JBC, 272, 12544-50, 1997).
Ahora, hemos caracterizado la segunda
eIF2 quinasa de Drosophila, un homólogo
de PERK (Pomar et al. EJB, 270, 293-306,
2003). La expresión de DPERK está
regulada durante el desarrollo embrionario.
También, hemos identificado el primer
homólogo de GCN2 en mamíferos
(MGCN2) (Berlanga et al. EJB, 265, 754-
62, 1999). Estudios recientes han
demostrado que ratones desprovistos del
gen Pkr, muestran una respuesta antiviral
casi normal; lo cual sugiere la existencia
de otra eIF2 quinasa(s) que compense la
pérdida de función de la PKR. Existe la
posibilidad de que el MGCN2 juegue ese
papel, por ello, estudiaremos la función y
los mecanismos de control de MGCN2 en
las células de mamífero. Estos estudios nos
permitirán profundizar en la importancia de
las eIF2 quinasas y su papel en el control
del crecimiento celular y la respuesta
antiviral.
Regulación del crecimiento y
diferenciación celular durante el
desarrollo embrionario a nivel de la unión
del mRNA al ribosoma (J.M. Sierra)
Las proteínas eIF (eukaryotic initiation factor)
4E, eIF4G, eIF4A y eIF4B forman parte de
un complejo proteico implicado en el
reconocimiento y unión del mRNA al
ribosoma. Resultados previos de nuestro
laboratorio permitieron el aislamiento y
caracterización de estas proteínas a partir
de embriones de Drosophila melanogaster,
la clonación de los genes correspondientes,
y el estudio de su expresión durante el
desarrollo embrionario. Actualmente
estamos interesados en encontrar
evidencias que apoyen el papel de alguno
de estos genes en la regulación del
crecimiento y diferenciación celular durante
el desarrollo. Para ello, disponemos de
mutantes defectivos en alguno de estos
genes así como moscas transgénicas que
los sobreexpresan. También nos
proponemos identificar mRNAs cuya
traducción se active preferentemente en
respuesta a un aumento en los niveles
activos de estas proteínas. De esta manera
esperamos identificar genes importantes
en el crecimiento y proliferación celular cuya
expresión esta regulada a nivel de la
traducción.
Jefes de Línea / Group Leaders:
César de Haro, José M. Sierra
e-mail: [email protected]
e-mail: [email protected]
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Natalia Pomar
Damariz Rivero
Mónica Elías
Isabela Alonso
Técnico de Investigación /
Technical Assistance:
José Alcalde
Síntesis de proteínas y su regulación eneucariontes
E.9Regulación de laexpresión génica
Regulation of geneexpression
118
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Natalia Pomar Ballestero. 2001. “Regulación de la
iniciación de la traducción en Drosophila melanogaster:
Caracterización del factor eIF2B y de una nueva eIF2
quinasa”. Universidad Autónoma de Madrid.
Simposios Organizados /Organized Symposia
César de Haro
Co-organizer: “Translational Control in Development and
Neurobiology”, a joint Serono Foundation- EMBO
Workshop, Palma de Mallorca, 2002.
Protein synthesis and its regulation in eukaryotes
Publicaciones/Publications:
Research Summary
Translational control by eIF-2 kinases
(C. de Haro)
Four distinct eIF2 kinases regulate
protein synthesis in response to various
environmental stresses. These are the
hemin-regulated inhibitor (HRI), the
interferon-inducible dsRNA-dependent
kinase (PKR), the endoplasmic reticulum-
resident kinase (PERK) and the GCN2
protein kinase. We found the first member
of this family, from Drosophila
melanogaster embryos (Santoyo et al.
JBC, 272, 12544-50. 1997). Recently, we
have characterized the second eIF2
kinase found in Drosophila, a PERK
homologue (Pomar et al. EJB, 270, 293-
306, 2003). Expression of DPERK is
developmentally regulated. We also found
the first mammalian GCN2 homologue
(MGCN2) (Berlanga et al. EJB, 265, 754-
62, 1999). Recent studies demonstrated
that mice lacking Pkr, show a nearly
normal antiviral response after interferon
treatment, suggesting the existence of
another eIF2 kinase(s) that must
compensate for loss of PKR function. It
is a possibility that the function of MGCN2
could explain some of the open questions
raised by these findings. Thus, we will try
to understand the function and the
mechanisms of control of MGCN2. These
studies would allow further elucidation of
the importance of eIF2 kinases and their
role in control of cell growth and anti-viral
response.
Regulation of cell growth and
differentiation during embryonic
development at the level of mRNA
binding to the ribosome (J.M. Sierra)
The proteins eIF (eukaryotic initiation
factor) 4E, eIF4G, eIF4A y eIF4B are part
of a protein complex involved in the
recognition and binding of the mRNA to
the ribosome. Previous results from our
laboratory led to the isolation and
characterization of these proteins from
Drosophila melanogaster embryos, the
cloning of the corresponding genes, and
the study of their expression during
embryonic development. At present, we
are interested to find evidences supporting
the role of some of these genes in the
regulation of cell growth and differentiation
during development. To this end, we have
mutants lacking some of these genes as
well as transgenic flies overexpressing
them. We also intend to identify mRNAs
whose translation is preferentially
increased in response to a rise in the
active levels of these proteins. In this way
we hope to identify critical genes in cell
growth and differentiation whose
expression is regulated at the translational
level.
119
Resumen de Investigación
Se han obtenido levaduras industriales
amilolíticas que contienen DNA derivado
exclusivamente de levaduras. La
transformación se realizó mediante una
estrategia integrativa dirigida a una región
adyacente al locus ILV2, determinante de
resistencia a sulfometuron. El estudio llevado
a cabo sobre la regulación de la expresión
del gen SWA2 de Schwanniomyces
occidentalis en Saccharomyces cerevisiae
ha permitido localizar las secuencias
promotoras de este gen, ubicadas entre las
posiciones -223 y +15, implicadas en
repression catabólica, activación por etanol
y modulación por cAMP.
Se ha aislado y estudiado el repressor
catabólico SoMIG1 de la levadura
Schwanniomyces occidentalis. El gen
codificaría para una hipotética proteína de
458 aminoácidos que muestra una alta
homología de secuencia con los homólogos
a Mig1 y CreA descritos en distintos
organismos. El dominio de unión al DNA y
el efector de las proteínas de Schw.
occidentalis y S. cerevisiae presentan
identidades de un 71% y 15%,
respectivamente. El gen SoMIG1
complementa la mutación mig1 de S.
cerevisiae.
Se ha estudiado el gen SCR1 de Schw
occidentalis que induce resistencia a
cicloheximida (cyh), a nivel ribosomal, en
S. cerevisiae. El gen dirigiría la síntesis de
un polipéptido altamente hidrofóbico (SCR1)
con 14 dominios transmembrana, que
presenta una alta homología de secuencia
con proteínas de levaduras pertenecientes
a la familia MDR, que confieren resistencia
a diferentes antifúngicos. Sin embargo,
SCR1 confiere resistencia únicamente a
cyh y no a agentes como el benomilo o el
metotrexato. Se propone un nuevo
mecanismo de resistencia ribosomal donde
los ribosomas de las levaduras que
expresan SCR1 podrían sufrir un cambio
conformacional durante el transporte desde
el núcleo al citoplasma que mermaría el
efecto del antibiótico.
En relación a Streptomycetes, se ha
continuado el análisis de varios pasos
enzimáticos para completar la
caracterización de la ruta de biosíntesis del
antibiótico puromicina en el organismo
productor. También se ha continuado el
estudio del cluster ata de la ruta de
biosíntesis del antibiótico A201A. Éste es
un aminonucleósido similar a puromicina.
Su organismo productor (Streptomyces
capreolus) no pudo ser transformado, por
lo que no fue posible iniciar el análisis
genético y bioquímico de este cluster. Sin
embargo, se ha logrado integrar ata en
Streptomyces lividans lo que se espera
permita el estudio de los genes y los
enzimas implicados en la biosíntesis de
A201A.
Jefe de Línea / Group Leader:
Antonio Jiménez
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
María Fernández-Lobato
(responsable de laboratorio)
Investigador Visitante /
Visiting Researcher:
María Josefa
Elena Fernández-Fernández
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Eloísa Sanz Martínez
Irene Saugar
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Dolores Marín Alberdi
María Blanca Sánchez Martínez
Patricia Barrado Guerrero
Laura Martínez Fernández Yáñez
María José Rodríguez Benito
Sara Mesa García.
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
Asunción Martín Redondo
Expresión génica en levaduras y streptomycesE.10Regulación de laexpresión génica
Regulation of geneexpression
120
Marin, D., Jiménez A., Fernández Lobato. M. (2001)
Construction of an efficient amylolytic industrial yeast
strain containing DNA exclusively derived from yeast.
FEMS Microbiol. Lett. 201, 249-253
Carmona, T. A., Barrado, P. Jiménez, A., Fernández
Lobato, M. (2002) Molecular and functional analysis of
a MIG1 homologue from the yeast Schwanniomyces
occidentalis. Yeast 19, 459-465
Carmona, T. A., Jiménez, A., Fernández Lobato. M.
(2002) Analysis of the Schwanniomyces occidentalis
SWA2 gene promoter in Saccharomyces cerevisiae.
FEMS Microbiol. Lett. 207, 69-73
Hoenicka, J., Fernández Lobato, M. Marín, D. Jiménez,
A. (2002) The SCR1 gene from Schwanniomyces
occidentalis encodes a highly hydrophobic polypeptide,
which confers ribosomal resistance to cycloheximide.
Yeast 19, 735-743
Saugar, I., Sanz, E., Jiménez, A. (2002) Identification of
a set of genes involved in the biosynthesis of the
aminonucleoside moiety of antibiotic A201A from
Streptomyces capreolus. Eur. J. Biochem. 169, 5527-
5535
Gene expression in yeast and streptomyces
Publicaciones/Publications:
Research summary
Amylolytic industrial yeast strain of
Saccharomyces cerevisiae contains DNA
derived exclusively from yeast were
obtained. Yeast transformation was carried
out by an integrative process targeted to
a dispensable upstream region of the
ILV2 locus, which determines
sulfometuron resistance. Expression in
S. cerevisiae of the SWA2 gene from
Schwanniomyces occidentalis was
studied. Deletion analyses (-223 to +15)
permitted the identification of different
fragments involved in glucose repression,
ethanol activation and cAMP regulation.
A glucose repressor MIG1-homologue
(SoMIG1) was isolated from the yeast
Schw. occidentalis. The gene encodes a
putative protein of 458 amino acid that
showed a high homology with Mig1 and
CreA analogues from different organisms.
The DNA binding and effector domains
of this protein showed an identity of 71%
and 15%, respectively, to those of the
Mig1 protein from S. cerevisiae. The
SoMIG1 gene complemented a mig1
mutant of this yeast.
The SCR1 gene from Schw occidentalis
that induce ribosomal resistance to
cycloheximide (cyh) in S. cerevisiae has
been studied. It would encode a highly
hydrophobic polypeptide (SCR1) with 14
transmembrane domains, highly similar
to a variety of yeast proteins of the
multidrug-resistance (MDR) family.
However, SCR1 only conferred resistance
to cyh but not to benomyl or metothrexate.
So, these findings would disclose a novel
ribosomal resistance mechanism where
the ribosomes of yeast cells expressing
SCR1, would undergo a conformational
change during transport from the nucleus
to the cytoplasm, which lowers their affinity
for cyh-binding.
Concerning Streptomycetes, the study of
a number of enzymatic steps of the
puromycin biosynthetic pathway was
continued in order to end its
characterisation.
The study of the A201A biosynthetic gene
(ata) cluster was also continued. This
antibiotic contains, in addition to an
aminonucleoside moiety identical to that
of puromycin,.a polyketide and two
monosaccharide moieties. This complexity
is a stimulus to dig into its biosynthetic
and genetic systems. However,
transformation of Streptomyces capreolus,
the producing organism, was not
achieved. This handicap did not permitted
to initiate a gene inactivation program in
order to isolate intermediates an
characterise enzymatic steps.
Nevertheless, the whole ata cluster was
isolated in the model Streptomyces
lividans, which will most probably permit
a straightforward study of these subjects.
121
Resumen de Investigación
La iniciación de la traducción de mRNAs
eucarióticos que codifican proteínas
necesarias en etapas en las que la iniciación
dependiente de cap está inhibida (apoptosis,
infecciones virales, etc.) está dirigida por
elementos IRES (sitios de entrada interna
del ribosoma). La comparación de IRES
muestra gran diversidad de secuencias y
estructuras secundarias del RNA. Nuestro
grupo se ha centrado en el estudio de
regiones estructurales del IRES del virus
de la fiebre aftosa (FMDV) y hepatitis C
(HCV) esenciales para su actividad. La
relevancia funcional de estas regiones
proviene de su participación en
interacciones RNA-proteína así como RNA-
RNA estabilizadoras de la arquitectura del
IRES. Por otro lado, debido a su capacidad
de funcionar independientemente del
contexto genético que los rodea, los IRES
son herramientas para la construcción de
vectores de expresión policistrónicos en
células animales.
Hemos identificado el sitio de interacción
de los factores de iniciación de la traducción
eIF4B, eIF4G y eIF3 en el IRES de FMDV,
siendo la interacción de eIF4G esencial
para la actividad del IRES. La interacción
de eIF4B es más fuerte que la de eIF4G
aunque accesoria. Sin embargo, ni eIF4G
ni eIF4B interaccionan con el IRES de HCV.
La diversidad de interacciones RNA-proteína
observada en distintos IRES no permite
establecer un modo de acción común a
todos ellos (Figura 1). El desciframiento de
la estructura terciaria del IRES, todavía
desconocida, es uno de los requisitos
necesarios para entender el mecanismo de
iniciación interna de la traducción. Con este
fin, estamos estudiando motivos
estructurales GNRA y RAAA como
candidatos para organizar la estructura
tridimensional del IRES (Figura 2).
La región 3´ no traducida del RNA de FMDV
estimula la actividad IRES, aún en situación
de rotura de eIF4G e inactivación del puente
RNA-proteína con PABP. Estamos
interesados en identificar los factores
implicados en esta estimulación, que podría
generar una pseudocircularización del RNA
(Figura 1), además de la búsqueda de
proteínas de interacción con RNA que
contribuyan a la modulación de la actividad
del IRES en función de su concentración o
su modificación postraduccional en distintas
líneas celulares.
Jefe de Línea / Group Leader:
Encarnación Martínez-Salas
e-mail: [email protected]
Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Ricardo Ramos Ruiz
Sonia López de Quinto
Sandrine Reigadas
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Olga Fernández Miragall
Almudena Pacheco García
Paula Serrano Pérez-Nievas
Personal Técnico /
Technical Assistance:
Emilio Cano Cabezas
Jorge Ramajo Alonso
Científicos Visitantes /
Visiting Scientists:
Jordi Gómez Castilla
H. Vall d´Hebrón, Barcelona
Iniciación interna de la traducción en mRNAseucarióticos
E.11
Diversidad de interacciones RNA-proteína implicadas en la
iniciación de la traducción.
Diversity of RNA-protein interactions involved in translation
initiation.
Regulación de laexpresión génica
Regulation of geneexpression
122
López de Quinto, S., Lafuente, E., Martínez-Salas, E.
(2001) IRES interaction with translation initiation factors:
functional characterization of novel RNA contacts with
eIF3, eIF4B, and eIF4GII. RNA 7, 1213-1226
Martínez-Salas, E., Ramos, R., Lafuente, E., López de
Quinto, S. (2001) Functional interactions in internal
translation initiation directed by viral and cellular IRES"
J. Gen. Virol. 82, 973-984
Schneider, R., Martínez-Salas, E. et al. (2001) New ways
of initiating translation in eukaryotes? Mol. Cell. Biol. 21,
8238-8246
Sáiz, M., Gómez, S., Martínez-Salas, E., Sobrino, F.
(2001) Deletion or substitution of the aphthovirus 3´ NCR
abrogates infectivity and viral replication. J. Gen. Virol.
82, 93-101
Martínez-Salas, E. (2001) Los sitios de entrada interna
del ribosoma (IRES) y sus aplicaciones en vectores de
expresión. Virología 8, 1-11
Lafuente, E., Ramos, R., Martínez-Salas, E. (2002) Long-
range RNA-RNA interactions between distant regions
of the hepatitis C virus internal ribosome entry site
element. J. Gen. Virol. 83, 1113-1121
Martínez-Salas, E., López de Quinto, S., Ramos, R.,
Fernández-Miragall, O. (2002) IRES elements: features
of the RNA structure contributing to their activity. Biochimie
84, 755-763
López de Quinto, S, Sáiz, M; de la Morena, D, Sobrino,
F, Martínez-Salas, E. (2002) IRES-driven translation is
stimulated by the FMDV 3´NCR and poly(A) sequences.
Nuc. Acids Res. 30, 4398-4405
Gutiérrez, C., Martínez-Salas, E. (2002) DNA plant and
animal virus replication. Encyclopedia of Life Sciences
London, Nature Publishing Group pp. 556-564
Internal initiation of translation in eukaryotic mRNAs
Publicaciones/Publications:
Research summary
Initiation of translation in eukaryotic
mRNAs encoding proteins required at
times when cap-dependent translation is
inhibited (apoptosis, viral infections, etc.)
occurs internally, under the control of a
region named IRES (internal ribosome
entry site). The primary sequence of the
growing list of IRES elements is not
conserved, neither their predicted
secondary structure shows a significant
degree of homology. We have focused
our work to understand the relationship
between structural organization and
activity of the IRES of foot-and mouth
disease virus (FMDV) and hepatitis C
(HCV). The relevance of these regions is
likely related to their contribution in RNA-
protein and RNA-RNA interactions,
determinant of IRES spatial organization.
Moreover, IRES are unique tools to
construct policistronic biosafe expression
vectors. Because of their capacity to work
efficiently independently of the genetic
background, they are instrumental to
control gene expression in animal cells.
During the last years we have
characterized the biological role of
initiation factors eIF4G, eIF4B and eIF3
in FMDV IRES activity. Whereas eIF4G-
binding is essential for FMDV IRES
activity, that of eIF4B seems to be
dispensable. However neither eIF4G nor
eIF4B interacts with the HCV IRES. The
pattern of RNA-protein interaction
observed in different IRES suggests a
diversity of strategies to recruit the
ribosome internally (Figure 1). To date,
the tertiary structure of IRES elements is
still unknown. Structural elements in the
FMDV IRES including GNRA and RAAA
motifs which are candidates to mediate
in tertiary folding of the RNA structure,
have been shown to be essential for IRES
activity. Therefore, experimental analysis
is in progress to investigate their structure
(Figure 2).
We have shown IRES-translation
stimulatory effect of FMDV 3´ noncoding
regions in cells where eIF4G was
proteolyzed, thus, independent of the
PABP-eIF4G RNA circularization. We are
therefore interested in the identification
of factors responsible for such stimulation,
which may lead to the generation of a
functional bridge connecting the 5´ and
3´ ends of the mRNA (Figure 2). In
addition, we are interested in the study
of RNA-binding proteins likely contributing
to modulate IRES activity in different cells
as a function of their concentration or
their posttranslational modification state.
Diferencias en la estructura secundaria
del RNA causadas por la substitución
del motivo GNRA por UNCG.
Secondary RNA structure changes
induced by UNCG substitution at the
GNRA motif.
123
Resumen de Investigación
Durante estos dos años hemos continuado
el estudio de las relaciones básicas entre
estructura y función en moldes
oligonucleosómicos definidos, empleando
como ensayo funcional la transcripción con
RNA polimerasa del bacteriófago T7. Se ha
completado la investigación de los tres
niveles en que la histona H5 podría afectar
a la síntesis de RNA : nucleosomas
individuales, fibra de 30 nm y agregados
de las cadenas oligonucleosómicas. Para
alcanzar este objetivo, se han determinado
paralelamente el grado de compactación,
la eficiencia transcripcional y la velocidad
de elongación de las cadenas de RNA. Los
resultados muestran que, a nivel de
nucleosomas individuales, la incorporación
de una molécula de H5 por cada elemento
nucleosómico no afecta la síntesis global
ni la elongación del RNA. En
oligonucleosomas con elementos
regularmente espaciados, la estabilización
del nivel de compactación correspondiente
a la fibra de 30 nm, producida al
incorporarse una molécula de histona H5
por cada unidad nucleosómica, no tiene
ningún efecto sobre la velocidad de
elongación de las cadenas de RNA. Sin
embargo, la unión de dos moléculas de
H5 por nucleosoma sí va acompañada por
inhibición de la elongación. Por último, la
asociación de oligonucleosomas que tiene
lugar en presencia de iones magnesio
produce agregados de alto peso molecular
que no permiten la síntesis de RNA.
Nuestros resultados indican que el
plegamiento de la cromatina para formar la
fibra de 30 nm, estabilizado por la histona
H5, no ofrece ningún obstáculo al
funcionamiento de una maquinaria
biosintética sencilla como es la T7 RNA
polimerasa. Este comportamiento básico
contrasta con la explicación, generalmente
admitida, según la cual el efecto represor
de las histonas H1/H5 se produciría como
consecuencia del plegamiento de la
cromatina al nivel de la fibra de 30 nm.
Jefe de Línea / Group Leader:
Enrique Palacián
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
Francisco Hernández
Becario Predoctoral /
Graduate Student:
Lara Velasco
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
Santiago Arenas
Miguel Ángel Sánchez
Estructura cromatínica y transcripciónE.12Regulación de laexpresión génica
Regulation of geneexpression
124
Chromatin structure and transcription
Publicaciones/Publications:
Research summary
In these two years we have continued the
study of the basic structure-function
relationships in well-defined
oligonucleosome templates using as a
functional probe transcription by RNA
polymerase from bacteriophage T7.
Research on the effects of histone H5 on
RNA synthesis has been completed at
three different levels: individual
nucleosomes, 30-nm fiber, and
oligonucleosome aggregates. To
accomplish this goal, compaction level,
transcriptional efficiency, and rate of
elongation of RNA chains have been
determined in a parallel way. The results
show that, at the level of individual
nucleosomes, incorporation of one
molecule of histone H5 per nucleosome
has no effect on the overalll RNA synthesis
or chain elongation. In oligonucleosomes
with regularly-spaced nucleosomes,
stabilization of the compaction level
corresponding to the 30-nm fiber, which
is produced by incorporation of one
molecule of histone H5 per nucleosome
element, does not affect the rate of
elongation of RNA chains. However,
binding of two molecules of H5 per
nucleosome causes significant inhibition
of elongation. In addition, the
oligonucleosome self-association that
takes place in the presence of magnesium
ions, with formation of high-molecular-
weight aggregates, is accompanied by
complete loss of RNA synthesis.
Our results indicate that the stabilized
folding of chromatin by histone H5 to form
the 30-nm fiber is no obstacle whatsoever
to the function of a simple biosynthetic
machinery like T7 RNA polymerase. This
basic behavior is in contrast with the
generally admitted assumption according
to which the repressor role of histones
H1/H5 would be achieved by the induced
chromatin folding to the level of the 30-
nm fiber.
125
Resumen de Investigación
Nuestro tema de estudio es la biología de
la envoltura celular bacteriana como
elemento morfogenético, de relación con el
medio y con otros organismos. Nuestro
trabajo se centra en dos aspectos
principales:
a) Morfogénesis de Escherichia coli ;
Continuamos nuestros estudios sobre la
generación y función de regiones
topológicamente diferenciadas en el sáculo
y en la membrana externa de la bacteria.
Durante este periodo hemos demostrado
la implicación de la penicillin binding protein
5 en la diferenciación de sitios de síntesis
activa y de regiones inertes. Estamos
estudiando las bases estructurales y
metabólicas de las heterogeneidades así
como su relevancia en la morfogénesis
bacteriana mediante métodos de marcaje
específico y microscopía de alta resolución.
b) Implicación de la pared celular en la
colonización de células eucarióticas por
Salmonella typhimurium. La envoltura
celular de S. typhimurium sufre cambios
estructurales radicales durante las primeras
etapas del proceso de colonización de
células eucarióticas, fenómeno base de la
patogenia de dicho organismo. Estamos
estudiando la participación en dichos
procesos de enzimas relacionadas con el
metabolismo del sáculo. Recientemente
hemos obtenido información que indica que
las N-acetil-muramil-L-ala amilasas, de las
cuales existen al menos tres (amiA, amiB
y amiC), en S. typhimurium, afectan a la
capacidad de proliferación intracelular que
es mayor en el caso de mutantes sencillos
y dobles. También hemos obtenido
información que indica que una infección
abortiva por mutantes autolíticos de S.
typhimurium induce una fuerte protección
en la célula huésped frente a una segunda
infección. En estos momento estamos
trabajando en caracterizar la influencia de
las proteínas morfogenéticas PBP1B, la
principal actividad mureín sintasa, y BolA
uno de los componentes de respuesta a
estrés que regula la expresión de las PBPs
5 y 6, en el proceso de colonización
intracelular en células cultivadas.
Jefe de Línea / Group Leader:
Miguel Angel de Pedro Montalban
e-mail: [email protected]
Postdoctoral / Postdoctoral Fellow:
Silvia Gutiérrez Erlandsson
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Katysulla Costa
Miguel Angel Serrano Melgar
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
María Teresa Villalba Villacorta
Envolturas celularesE.13Regulación de laexpresión génica
Regulation of geneexpression
126
Castán, P., de Pedro, M.A., Risco, C., Valles, C.,
Fernández, L.A., Schwarz, H., Berenguer, J. (2001)
Multiple regulatory mechanisms act on the 5’ untranslated
Region of the S-layer gene from Thermus thermophilus
HB8. J. Bacteriol. 183,149-1494
de Pedro, M.A., Donachie, W.D., Höltje, J.-V., Schwarz,
H. (2001) Constitutive septal murein synthesis in
Escherichia coli with impaired activity of the
morphogenetic proteins RodA and penicillin-Binding
protein 2. J. Bacteriol.183, 4115-4126
Heidrich, C., Templin, M.F., Ursinus, A., Merdanovic,
M., Berger, J., Schwarz, H., de Pedro, M.A., Höltje,
J.-V. (2001) Involvement of N-acetylmuramyl-L-alanine
amidases in cell separation and antibiotic induced
autolysis of Escherichia coli. Mol. Microbiol. 41, 167-178
Sánchez, M., Vicente, M.F., Cercenado, E., de
Pedro,M.A., Gómez, P., Moreno, R., Morón, R.,
Berenguer, J. (2001) Diversity among clinical isolates of
penicillin-resistant Streptococcus mitis: indication for a
PBP-1-dependent way to reach high levels of penicillin
resistance. Int. Microbiol. 4, 217-222
Castán, P., Zafra, O., Moreno, R., de Pedro, M.A.,
Vallés, C., Cava, F., Schwarz, H., Berenguer, J. (2002)The
periplasmic space in Thermus thermophilus: Evidences
from a regulation-defective S-layer mutant overexpressing
an alkaline phosphatase. Extremophiles 6, 225-232
de Pedro, M.A., Höltje, J.-V., Schwarz, H. (2002) Fast
lysis of Escherichia coli filament cells requires
differentiation of potential division sites. Microbiology
148, 79- 86
Santos, J.M., Lobo, M., Matos,A.P.A., de Pedro, M.A.,
Arraiano, C.(2002) The gene bolA regulates dacA (PBP5),
dacC (PBP6) and ampC (AmpC), promoting normal
morphology in Escherichia coli.Mol. Microbiol. 45,1729-
1740
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Katysulla Costa. 2002. “The Peptidoglycan of Helicobacter
pylori”. Universidade do Porto, Portugal.
Cell envelopes
Publicaciones/Publications:
Research summary
Our research topic is the molecular biology
of the bacterial cell envelope as a
morphogenetic element, and as an
element mediating interaction with the
environment and other organisms. Our
work is focused on two main directions:
a) Morphogenesis of Escherichia coli; we
continue our investigations on the
generation and function of topologically
differentiated regions in the bacterial
sacculus and outer membrane. A direct
implication of PBP5 in the differentiation
of active synthesis and inert regions has
been demonstrated. At present we are
investigating the structural and metabolic
basis for the generation of heterogeneities
in the cell envelope s by means of specific
labeling and high resolution microscopy.
b) Involvement of the bacterial envelope
in eukaryotic cell colonization by
Salmonella typhimurium. The cell
envelope of the intracellular pathogen S.
typhimurium is modified early in
eukaryotic cell colonization, a key process
for pathogenesis. We are currently
investigating the influence of
macromolecular murein metabolism on
the ability of S. typhimurium to invade and
replicate inside host eukaryotic cells.
Information indicating that the N-
acetylmuramyl-L-alanine amidases (amiA,
amiB, and amiC) modulate intracellular
replication of S. typhimurium has been
recently gathered. Single and double
mutants do replicate to a higher extent
than wild type, indicating that amidase
deficiencies interfere with cellular
mechanisms restrictive for bacterial
proliferation. Evidence showing that an
abortive infection with S. typhimurium
autolytic mutants triggers a strong
protective response in the host cells
against a second challenge with a fully
virulent strain has been obtained. The
detailed molecular mechanisms
underlying this protective response are
under investigation. At present we are
also investigating the roles of the
morphogenetic proteins PBP 1B, the main
murein synthase activity, and BolA a
member of the stress response system
controlling expression of PBPs 5 and 6,
in S. typhimurium intracellular proliferation
and persistence in cultured cells.
127
Resumen de Investigación
El objetivo de nuestro trabajo es el
diagnóstico de enfermedades metabólicas
y la identificación y caracterización de los
genes implicados en algunas de ellas, así
como el análisis funcional y estructural de
las diferentes proteínas mutantes.
En los dos últimos años, se ha ampliado el
número de técnicas diagnósticas para la
identificación de pacientes con defectos de
la ß-oxidación mitocondrial de ácidos
grasos, enfermedades peroxisomales,
defectos congénitos de glicosilación,
defectos de la biosíntesis del colesterol y
defectos del metabolismo de purinas y
pirimidinas.
En los aspectos básicos, se han estudiado
las bases moleculares de la fenilcetonuria
causada por defectos en el gen de la
fenilalanina hidroxilasa (PAH), así como las
bases moleculares de la acidemia
propionica y la 3-metilcrotonilglicinuria
debidas a defectos en los genes nucleares
que codifican para las proteínas
heteroméricas mitocondriales propionil-CoA
carboxilasa (PCC) y metilcrotonil-CoA
carboxilasa (MCC), respectivamente.
Recientemente, se ha iniciado el análisis
de SNPs funcionales de genes del
metabolismo del folato y su relación con
enfermedades cardiovasculares y con el
riesgo de tener hijos afectados con
Síndrome de Down. Asimismo, se ha
iniciado el estudio del metabolismo
mitocondrial de cobalaminas mediante una
aproximación proteómica.
En 3-metilcrotonilglicinuria, se han
caracterizado estructural y funcionalmente,
tanto a nivel genómico como de cDNA, los
genes nucleares que codifican para las dos
subunidades de la proteína MCC, usando
herramientas bioinformáticas y las bases
de datos de EST y HTGS. Asimismo, se
han identificado mutaciones causantes de
enfermedad en ambos genes.
Para el análisis del efecto estructural y
funcional de las diferentes variantes alélicas
en las patologías en estudio, se han
desarrollado diferentes sistemas de
expresión, analizando el efecto de
mutaciones PKU, PCC y MCC sobre la
actividad, oligomerización y estabilidad de
la proteína en sus correspondientes
compartimentos subcelulares. Los
resultados sugieren que, en general, la
mayoría de las mutaciones son estructurales
y que su actividad puede ser modulada in
vivo por el sistema de control celular
proteico, sentando las bases de nuevas
terapias mas individualizadas.
Jefe de Línea / Group Leader:
Magdalena Ugarte
e-mail: [email protected]
Personal Científico / Scientific Staff:
Mª José García Muñoz
Begoña Merinero
Belén Pérez
Celia Pérez-Cerdá
Eva Mª Richard
Pilar Rodríguez-Pombo
Lourdes Ruiz Desviat
Pedro Ruiz Sala
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Sonia Clavero
Mª Angeles Martínez
Angel Luis Pey
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
Nuria Caballero
Margarita Castro
Mª Jesús Ecay
Isaac Ferrer
Silvia Pizarro
Rosa Navarrete
Ascención Sánchez
Paloma Sanz
Fátima Leal
Lorena Velazquez
Gema Palmeiro
Científicos Visitantes / Visiting
Scientists:
Enna Gutierrez
Cezary Zekanowski
Bases Moleculares de las EnfermedadesMetabólicas
E.14
Estructura de la fenilalanina hidroxilasa humana, localización y conservación
de residuos implicados en mutaciones expresadas, causantes de fenilcetonuria.
El modelo ha sido generado mediante un cálculo de variabilidad tras el
alineamiento de proteínas ortólogas de diferentes organismos. El grado de
variabilidad se representa por un código de colores.
Regulación de laexpresión génica
Regulation of geneexpression
128
Molecular basis of metabolic diseases
Publicaciones/Publications:
Research summary
The goal of our work is the diagnosis of
inborn errors of metabolism the
characterization and identification of the
genes involved, as well as the functional
and structural analysis of the different
mutant proteins.
In the last two years, we have included
more diagnostic techniques aimed at the
identification of patients with mitochondrial
ß-oxidation defects, peroxisomal diseases,
congenital glycosylation defects,
cholesterol biosynthesis defects and
purine and pyrimidine metabolism
disorders ().
We have studied the molecular basis of
phenylketonuria caused by defects in the
phenylalanine hydroxylase (PAH) gene
and of propionic acidemia and 3-
methylcrotonylglycinuria caused by
defects in the propionyl-CoA carboxylase
(PCC) and methylcrotonylCoA
carboxylase (MCC) genes, respectively.
Recently, we are analyzing the association
between SNPs in genes involved in folate
metabolism and cardiovascular disease
and with the risk of having a child with
Down syndrome. We have also started
a proteomic approach to study cobalamin
mitochondrial metabolism.
In 3-methylcrotonylglicinuria we
characterized structurally and functionally,
at genomic and cDNA levels, the nuclear
genes encoding both MCC subunits, using
bioinformatic tools and the EST and HTGS
databases. We have also identified
disease-causing mutations in both genes.
For the analysis of the structural and
functional effects of the different allelic
variants of the disorders studied, we have
developed different expression systems,
analyzing the effect of PKU, PCC and
MCC mutations on activity, oligomerization
and stability of the protein in its cellular
compartment. The results reveal that the
majority of the mutations affect the
structural properties of the enzyme, and
the activity can be modulated in vivo by
the quality control system, being the basis
to apply new therapies tailored to each
patient.
Gallardo, M.E., Desviat, L.R., Rodriguez, J.M., Esparza-Gordillo, J., Perez-Cerda, C., Perez, B., Rodriguez-Pombo, P., Criado, O., Sanz, R., Morton, D.H., Gibson,M.K., Le, T.P., Ribes, A., Rodriguez de Cordoba, S.,Ugarte, M., Peñalva, M.A. (2001) The molecular basisof 3-methylcrotonylglycinuria, a disorder of leucinecatabolism. Am. J. Hum. Genet. 68
Desviat, L.R., Perez, B., Gutierrez, E., Sánchez, A.,Barios, B., Ugarte, M. (2001) Molecular basis ofphenylketonuria in Cuba. Hum Mutat. Mutation in Brief#440 online.
Campeau, E., Desviat, L.R., Leclerc, D., Wu, X., Perez,B., Ugarte, M., Gravel, R. (2001) Structure of the PCCAgene and distribution of mutations causing propionicacidemia. Mol. Genet. and Metab. 74, 238-247
Muro, S., Perez, B., Desviat, L.R., Rodriguez-Pombo,P., Perez-Cerda, C., Clavero, S., Ugarte, M. (2001) Effectof PCCB gene mutations on the heteromeric andhomomeric assembly of Propionyl-CoA Carboxylase”.Mol. Genet. and Metab. 74, 476-483
Nakamura, K., Fukao, T., Pérez-Cerdá, C. LuqueHinojosa, C., Song, X-Q., Naiki, Y. Kohno, Y., Ugarte,M., Kondo, N. (2001) A novel single base substitution(380C>T) that activates a 5-bases downstream crypticsplice-aceptor site within exon 5 in almost all transcriptin the human mitochondrial acetoacetylCoA thiolasegene. Mol. Genet. and Metab. 72, 115-134
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Pérez-Cerdá, C., Merinero, B. (2001) Acidemia isovaléricay otras alteraciones en el catabolismo de leucina y valina.Déficit múltiple de carboxilasas. En: Sanjurjo, P. y BaldellouErgon, A. (eds.) “Diagnóstico y tratamiento de lasenfermedades congénitas del metabolismo”, pp. 263-274
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Goicoechea de Jorge, E., Lorda, I., Esther, M., Gallardo,B. , Perez, C., Perez de Ferran, Mendoza, H., Rodríguezde Cordoba, S. (2002) Alkaptonuria in the DominicanRepublic. Identification of the founder AKU mutation andfurther evidence of mutation hot spots in the HGO gene.J. Med. Genet. 39 (7)
Clavero, S., Martinez, M.A., Perez, B., Perez-Cerda, C.,Ugarte, M., Desviat, L.R. (2002) Funtional characterizationof PCCA mutations causing propionic acidemia. Biochim.Biophys. Acta 1588, 119-125
Fukao, T., Nakamura, H., Nakamura, K., Pérez-Cerdá,C., Sweetman, L., Baldellou, A., Girona, F., Kohno, Y.,Ugarte, M., Kondo, N. (2002) Characterization of 6mutations identified in 5 spanish patients withmitochondrial acetoacetyl-CoA thiolase deficiency: Theeffect of an aminoacid substitution on tertiary structure.Mol. Genet. and Metab. 75, 235-243
Castro, M., Pérez-Cerdá, C., Merinero, B., García, M.J.,Bernar, J., Gil Nagel, A., Torres, J., Bermúdea, M.,Garavito, P., Marie, S., Vincent, F., Van den Berg, G.,Ugarte, M. (2002) Screening for adenylosuccinate lyasedeficiency: clinical, biochemical and molecular findingsin four patients. Neuropediat. 33, 186-189
Arranz, J.A., Piñol, F., Kozak, L., Pérez-Cerdá, C.,Cormand, B., Ugarte, M., Riudor, E. (2002) Splicingmutations, mainly IV&-1g->t, account for 70% offumarylacetoacetate hydrolase gene alterations, including7 novel mutations, in a survey of 29 tyrosinemic type Ipatients. Human. Mutation 20, 180-188
Wolf, B., Jensen, K., Huner, G., Demirkol, M., Baykal,T., Divry, P., Rolland, M.-O., Pérez-Cerdá, C., Ugarte,M., Straussberg, R., Basel-Vanagaite, L., Baumgartner,E.R., Suormala, T., Scholl, S., Das, A.M., Schweitzer,S., Pronicka, E., Sykut-Cegielska, J. (2002) Seventeennovel mutations that cause profound biotinidasedeficiency. Mol. Genet. Metab. 77, 108-111
Urbón, A., Aldana, J., Reig, C., Nieto, C., Merinero, B.(2002) Aciduria metilmalónica con homocistinuria deinicio neonatal: mejoría bioquímica y clínica con betaína.An. Esp. Pediatr. 56, 337-341
Merinero, B. (2002) Caracterización clínica, bioquímicay molecular de la deficiencia de piruvato carboxilasa.An. Esp. Pediatr. 57, suplem 2, 9-11
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Alejandra Gámez Abascal. 2002. “Fenilcetonuria: Análisisgenético de la hiperfenilalaninemia benigna y efecto demutaciones en la proteína fenilalanina hidroxilasa”.
Publicaciones/Publications:
129
130
Responsables de LaboratorioPersons in charge of laboratories
131
Responsables de Laboratorio
Persons in charge of laboratories
132
Regulación del mantenimiento de la expresión de losgenes homeóticos de Drosophila melanogaster
Maintenance of homeotic gene expression in Drosophilamelanogaster
Ana de Busturia,
Publicaciones / Publications:
Busturia, D., Lloyd, A., Bejarano, F., Zavortnik, M., Xin, S., Sakonju, S. (2001) TheMCP silencer of the Drosophila Abd-B gene requires both Pleihomeotic and GAGAfactor for the maintenance of repression. Development 128, 2163-2173
Estrada, B., Casares, F., Busturia, A., Sanchez-Herrero, E. (2002) Genetic andmolecular characterization of a novel iab-8 regulatory domain in the Abdominal-Bgene of Drosophila melanogaster. Development 129, 5195-204
Estudio de la regeneración del sistema osteocondral apartir de células pluripotenciales humanas.
Bone and articular cartilage regeneration from humanpluripotent mesenchymal cells
Predestinación García Ruiz,
Publicaciones / Publications:
Ogueta, S., Muñoz, J., Obregón, E., Delgado-Baeza, E., García-Ruiz, J.P. (2002)Prolactin is a component of the human sinovial fluid and modulates the growth andchondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. MolCell Endocrinol 190, 51-63
Manso, M., Ogueta, S., Herrero-Férnandez, P., Vázquez, J., Langlet, M., García-Ruiz,J.P. (2002) Biological evaluation of aerosol-gel derived hydroxiapatite coatings withhuman mesenchymal stem cells. Biomaterials. 23, 3985-3990
Manso, M., Ogueta, S., Pérez-Regeiro, J.P., García, J.P., Martinez-Duart, J.M. (2002)Testing biomaterials by the in-situ evaluation of cell response. Biomolecular Eng 19,239-242
Manso, M., Martínez-Duart, J.M., Ogueta, S., García-Ruiz, J.P., Pérez-Rigueiro, J.(2002) Development of human mesenchymal stem cells on DC sputtered titaniumnitride thin films. Journal of Material Science:Materials in Medicine 13, 289-293
Manso, M., Ogueta, S., García-Ruiz, J.P., Perez-Rigueiro, J., Jiménez, C., Martínez-Duart, J.M., Langlet, M. (2002) Mechanical and in-vitro testing of aerosol-gel depositedtitania coatings for biocompatible applications. Biomaterials 23, 349-356
133
Unidad de Bioinformática
Bioinformatics Unit
Angel Ramírez Ortiz,
Publicaciones / Publications:
Fischer, D., Elofsson, A., Rychlewski, L., Pazos, F., Valencia, A., Rost, B., Ortiz, A.R.,Dunbrack, R.L. Jr. (2001) CAFASP2: the second critical assessment of fully automatedstructure prediction methods. Proteins Suppl 5, 171-183
Perez, C., Ortiz, A.R. (2001) Evaluation of docking functions for protein-ligand docking. J. Med. Chem. 44, 3768-3785
Kmunicek, J., Luengo, S., Gago, F., Ortiz, A.R., Wade, R.C., Damborsky, J. (2001)Comparative binding energy analysis of the substrate specificity of haloalkanedehalogenase from Xanthobacter autotrophicus GJ10. Biochemistry 40, 8905-8917
Fabrega, C., Farrow, M.A., Mukhopadhyay, B., de Crecy-Lagard, V., Ortiz, A.R.,Schimmel, P. (2001) An aminoacyl tRNA synthetase whose sequence fits into neitherof the two known classes. Nature 411, 110-114
Ortiz, A.R., Strauss, C.E., Olmea O. (2002) MAMMOTH (matching molecular modelsobtained from theory): an automated method for model comparison. Protein Sci. 11,2606-2621
De Las Rivas, J., Lozano, J.J., Ortiz, A.R. (2002) Comparative analysis of chloroplastgenomes: functional annotation, genome-based phylogeny, and deduced evolutionarypatterns. Genome Res. 4, 567-583
Regulación de la Miogénesis en Drosophila
Regulation of myogenesis in Drosophila
Mar Ruiz Gómez, [email protected]
Publicaciones / Publications:
San Martín, B., Ruiz-Gómez, M., Landgraf, M., Bate, M., (2001) A distinct set offounders and fusion competent myoblasts make visceral muscles in the Drosophilaembryo. Development 128, 3331-3338
Ruiz-Gómez, M., Coutts, N., Suster, M.L., Landgraf M., Bate, M. (2002). Myoblastsincompetent encodes a zinc finger transcription factor required to specify fusioncompetent myoblasts in Drosophila. Development 129, 133-141
Dutta, D., Bloor, J.W., Ruiz-Gómez, M., VijayRaghavan K., Kiehart, D.P. (2002) Real-time imaging of morphogenetic movements in Drosophila using Gal4-UAS drivenexpression of GPF fused to the actin binding domain of moesin. Genesis 34, 146-151
Seminarios
ServiciosApoyo a la investigación
Lecciones Conmemorativas
Seminars
Research and SupportFacilities
Memorial Lectures
12 de Enero
Dr. Eugenio Santos (Centro deInvestigación del Cáncer, Salamanca)
“Activación de proteínas Ras porintercambio de nucleótidos”
25 de Enero
Dr. Francisco Sánchez - Madrid (Hospitalde la Princesa, Madrid)
“Estudio dinámico de la polaridad celulardel linfocito durante la migración y lasinteracciones inmunes”
2 de Marzo
Dr. Jim Smith (National Institute for MedicalResearch, Londres)
“Making mesoderm: upstream anddownstream of Brachyury”
16 de Marzo
Dr. Kim Nasmyth (Institute of MolecularPathology, Viena)
“Does a common mechanism trigger thesegregation of chromosomes during mitosisand meiosis?”
6 de Abril
Dr. Victor de Lorenzo (Centro Nacionalde Biotecnología, Madrid)
“Regulación transcripcional enPseudomonas: promotores en el tubo deensayo y en el medio ambiente”
20 de Abril
Dr. Richard Jackson (Department ofBiochemistry, University of Cambridge)
“Internal initiation of hepatitis C virus andpicornavirus RNA translation: contrasts withcapped mRNA translation”
4 de Mayo
Dr. Salvador Moncada (The WolfsonInstitute for Biomedical Research, Londres)
“NO and the physiology andpathophysiology of cell respiration”
25 de Mayo
Dr. Tony Kouzarides (Wellcome/CRCInstitute and Department of Pathology,Cambridge)
“Histone methylation in transcriptionalcontrol”
21 de Junio
Dr. Alain Fischer (Hôpital Necker Enfantsmalades, Paris)
“Severe combined immunodefiencies,models for the studies of T lymphocytedevelopment and gene therapy”
27 de Noviembre
Dr. Hans Clevers (University MedicalCenter, Utrecht)
“Wnt signaling establishes boundaries inthe gut”
11 de Enero
Juan Valcárcel (European MolecularBiology Laboratory, Heidelberg)
"Regulación del procesamiento alternativode ARN mensajeros"
1 de Febrero
Jorge Galán (Yale School of Medicine,New Haven)
"Mimetismo estructural y funcional durantela patogénesis por Salmonella"
8 de Marzo
José Ramón Naranjo (Centro Nacionalde Biotecnología, Madrid)
“Regulación transcripcional por DREAM:vías, dianas y dominantes negativos”
22 de Marzo
Michael Rossmann (Department ofBiological Sciences, Purdue University,West Lafayette, U.S.A.)
“Structure of Dengue Virus: Implicationsfor Flavivirus maturation and fusion”
5 de Abril
Matthias Hentze (European MolecularBiology Laboratory, Heidelberg)
“Principles of translational control, theinterface between ‘Genomics’ and‘Proteomics’ ”
26 de Abril
John Diffley (ICRF Clare Hall Laboratories,South Mimms, Inglaterra)
“DNA replication and cancer: lessons frombudding yeast”
10 de mayo
Michael Bate (Department of Zoology,University of Cambridge)
“Making sense of developing behaviour inDrosophila”
24 de Mayo
Reinhard Jahn (Max Planck Institut fuerBiophysikalische Chemie, Goettingen)
“Molecular mechanisms of membranefusion in the secretory pathway”
24 de Octubre
Raúl Andino (University of California, SanFrancisco, USA)
“The interactions of poliovirus with the hostcell during replication”
22 de Noviembre
Lisardo Boscá (Instituto de Bioquímica,CSIC-Universidad Complutense, Madrid)
“Resolución de los procesos inflamatorios”
Severo Ochoa
Avances en BiologíaMolecular
2001 2002Seminarios Seminars
136
Affolter, Markus (Zellbiologie,Biozentrum der Universitat Basel, Suiza)
“Novel tools to study cell migration indevelopment”
Antón, Luis (Instituto de Salud CarlosIII, Madrid)
“Estructuras celulares implicadas en ladegradación de proteínas por elproteasoma”
Bárcena Alicia (Department of Surgery,University of California, San Francisco,USA)
“Distribución de precursores de células NKen hígado fetal humano”
Bustelo, Xosé R. (Centro deInvestigación del Cáncer, Salamanca)
“Mecanismos de activación y señalizaciónde las oncoproteínas VAV”
Castelli-Gair, James (Departamento deZoología, Universidad de Cambridge,Reino Unido)
“Control de la morfogénesis de Drosophilapor genes ‘Downstream’ de abdominal-B”
Colaço, Camilo (Immunolobiology Dpt.,Babraham Bioincubator, Cambridge. U.K.)
“CDs, HSPS and the integration of innateand acquired immunity”
Desvoyes, Bénédicte (University ofBordeaux 1, Francia and Texas A&MUniversity, College Station, USA)
“Translation regulation and movement ofTombusviridae”
Diez del Corral, Ruth (Universidad deDundee, Escocia, RU)
“Regulación del inicio de la diferenciaciónneural en la médula espinal por elmesodermo paraxial y FGPs”
Elliot, David (The Victor Chang CardiacResearch Institute, Darlinghurst,Australia)
“Analysis of cardiac NK-2 proteins frommice, men and octopuses”
Fain, Jhon N. (Department ofBiochemistry, Un of Tennesse, Memphis,USA)
“Hormonal regulation of leptin release byhuman adipose tissue”
Fasiolo, Franco (IBMC Estrasburgo,Francia)
“A novel yeast EF-2 like GTPase is requiredfor ribosome export and a late cytoplasmicstep of ribosomal assembly”
Franze-Fernández, Mª Teresa (Centro deVirología Animal, CONICET, BuenosAires, Argentina)
“Un sistema reconstituido de transcripcióny replicación basado en RNAs y proteínasde virus tacaribe expresados por plásmidos”
Gómez, Jordi (Hospital Valle de Hebrón,Barcelona)
“Corte específico del genoma del virus dela hepatitis C por la ribonucleasa P humana”
González Reyes, Acaimo (Instituto deParasitología y Biomedicina LópezNeyra, Granada)
“Diferenciación celular durante la oogénesisde ‘Drosophila’”
Guzmán, Manuel (Departamento deBioquímica y Biología Molecular I,Facultad de Biología, Universidadcomplutense, Madrid)
“Cannabinoides como posibles agentesantitumorales”
Knust, Elisabeth (Heinrich-HeineUniversitaet Duesseldorf, Institut fuerGenetik, Germany)
“Protein scaffold and cell polarity indrosophila”
Lever, Andrew M.L. (Addenbrooke’sHospital, University of Cambridge,Departement of Medicine, Cambridge,UK)
“Understanding how retroviruses packagetheir RNA genomes: Implications forlentiviral (HIV) based vectors”
Paro, Renato (ZMBH, Universidad deHeidelberg, Alemania)
“Chromosomal elements conferringepigenetic inheritance”
Puertollano, Rosa (Cell Biology andMetabolism Branch, National Institutesof Health, Bethesda, USA)
“GGAs: una nueva familia de adaptadoresde clatrina implicada en el transporte delos receptores de manosa-6-fosfato”
Rheinberger, Hans-Jörg (Director delInstituto Max Planck de Historia de laCiencia, Berlin, Alemania)
“Gene concepts: perspectives from thehistory of molecular biology”
Roch, Fernando (Centre de Biologie duDeveloppement, Universite PaulSabatier, Toulouse, Francia)
“La señal de EGFR llega al núcleo: funcióndel represor CIC en el ala de Drosophila”
CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR"SEVERO OCHOA"
2001
137
Sevilla, Noemí (Dept. ofNeuropharmacology, Division ofVirology, The Scripps ResearchInstitute, La Jolla, California, USA)
“Mecanismos virales deinmunosupresión y persistenciamediante la infección de célulasdendríticas”
Simpson, Pat (Department of Zoology,University of Cambridge, England)
“Gene duplication and the developmentand evolution of bristle patterns indiptera”
Viguera, Enrique (Centro deAstrobiología (INTA), Torrejón, Madrid)
“Análisis del error de replicación pordeslizamiento de hebra”
Villarreal, Luis (Director, Center forVirus Research, University ofCalifornia, Irvine, USA)
“The role of polyomavirus oncogenes indifferentiating tissue: evaluation in scidmice”
2002
Borlongan, César V. (Department ofNeurology and Institute of MolecularMedicine and Genetics, School ofMedicine, Medical College of Georgia,Augusta, USA)
"Immunosuppression and neuraltransplantation for Parkinson's disease"
Canelles, Matilde (Laboratory ofMolecular and Cellular Immunology,National Institute of Immunology andInfectious Diseases, NationalInstitutes of Health, Bethesda, USA)
"Señalización por TCR durante ladecisión CD4/CD8 en el timo"
Casal, José (Laboratory of MolecularBiology, Cambridge, UK)
"Polaridad planar en Drosophila: unaaproximación"
Cohen, Philip (University of Dundee,MRC Protein Phosphorylation Unit,School of Live Sciencies, Scotland,U.K.)
"How to cure diabetes without causingcancer?: a signal transduction approach"
Coll, Miquel (Instituto de BiologíaMolecular, CSIC, Barcelona)
"Procesamiento y transporte del ADNen la conjugación bacteriana"
Conway, Everly (Department ofBiomedical Sciences, School ofPublic Health, University at Albany,NY, USA)
"Transcription of stress genes in archaea:prokaryotes with eukaryotic factors"
Davis, Mark (Stanford University,California, USA)
"Visualizing T cell recognition"
Finley, Daniel (Department of CellBiology, Harvard Medical School,Boston, USA)
"The proteasome and its associatedproteins"
Franco, Rafael (Departamento deBioquímica y Biología Molecular,Universidad de Barcelona, Barcelona)
"Interacciones proteína-proteína yregulación de receptores acoplados aproteínas G"
Galbiati, Laura (International Centerfor Genetic, Engineering andBiotechnology, Triestre, Italy)
"p300/CBP promotes acetylation andubiquitination of transcription factorE2F-1"
García-García, María Jesús (MemorialSloan-Kettering Cancer Center, NewYork, USA)
"Estudio de la gastrulación mediantemutagénesis con ENU: caracterizaciónde la mutación Lazy Mesoderm, unnuevo componente de la vía FGF"
Goldberg, Alfred L. (Professor of CellBiology, Harvard Medical School,USA)
"The role of the proteasome in proteindegradation and antigen presentation"
Gotte, Matthias (McGill UniversityAIDs Centre Montreal, Canada)
"The translocation equilibrium of HIV-1reverse transcripatse and implicationsfor enzymatic functions"
Gubb, David (Department of Genetics,University of Cambridge)
"Drosophila Necrotic mutations activatethe innate immune response to fungalinfections and mirror human variantsassociated with serpin polymerdiseases"
Ingham, Philip (MRC IntercellularSignalling Group, Centre forDevelopmental Genetics, School ofMedicine and Biomedical Sciencie,University of Sheffield, U.K.)
"Mechanisms and roles of hedgehogsignalling in vertebrate development"
Inzé, Dirk (Department of PlantGenetics, VIB, University of Ghent,Belgium)
"How do plants coordinate cell divisionand development"
Seminarios Seminars
2002
CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR"SEVERO OCHOA"
138
Jiménez, Gerardo (Centro deInvestigación y Desarrollo, CSIC,Barcelona)
"Control materno del desarrollo deDrosophila mediante señalesextracelulares y represión génica"
Kappes, Dietmar (Fox Chase CancerCenter, Philadelphia, USA)
"Control of T cell development byCD3delta and HD genes"
Kavelaars, Annemieke (WilhelminaChildren Hospital, Utrecht, Holanda)
"G protein coupled receptor kinases inthe inmune system: a role inautoimmunity?"
Kokaia, Zaal (Section of RestorativeNeurology, Wallenberg NeuroscienceCenter, Lund. Sweden)
"Neural stem cells and brain insults"
Lawrence, Peter FRS (MRCLaboratory of Molecular Biology,Cambridge, Inglaterra)
"Polarity and compartments inDrosophila development"
Macario, Alberto (Wadsworth Center,Department of Biomedical Sciences,The University at Albany, NY, USA)
"Molecular biology of stress genes inarchaea: lessons from experimental dataand genome analysis"
Martín-Bermudo, Dolores (Institutode Parasitología y Biomedicina
"López Neyra", CSIC,Granada)"Integrinas: moléculas claveen morfogénesis"
Martínez Menárguez, José Angel(Departamento de Biología Celular,Histología y Embriología General,Facultad de Medicina, Universidad deMurcia)
"Tráfico de membranas en la víasecretora temprana"
Medina, Miguel (Instituto CavalieriOttolenghi Scientific, Universidad deTurin, Italia)
"Análisis funcional de la interacción entrepresenilinas y cateninas"
Muñoz, Emilio (Instituto de EstudiosSociales Avanzados, CSIC, Madrid)
"Nuevas estrategias para la formaciónen Biotecnología"
Pedersen, Irene M. (The BurnhamInstitute, La Jolla, USA)
"Induction of apoptosis in CLL (ChronicLymphocytic Leukemia) B-cells"
Prehn, Jochen H. M. (WestphalianWilhelms University, Faculty ofMedicine, Ctr Interdisciplinary ClinicalRes (IKF), Muenster, Germany)
"Mitochondrial function/dysfunctionduring apoptosis"
Regan, John W. (Prof. ofPharmacology and Toxicology,University of Arizona, EEUU)
"Prostaglandin receptor signaling: novelinteractions of G protein-coupledreceptors with elements of the Wnt/beta-catenin signaling pathway"
Reiner, Orly (Weizmann Institute,Rehovot, Israel)
"Interaction of LIS-1 with microtubules"
Tercero, José Antonio (ImperialCancer Research Fund, UK)
"Regulación de la replicacióncromosómica en respuesta al daño enel DNA"
Thome, Margot (Universidad deLausanne, Suiza)
"CARMA 1, a lipid-associated proteininvolved in T-cell activation"
Van Den Heuvel, Marcel (MRCFunctional Genetics Unit, Departmentof Human Anatomy and Genetics,University of Oxford, U.K.)
"Hedgehog signalling and HDL receptorproteins: a possible link"
Villarreal, Luis P. (Department ofMolecular Biology and Biochemistry,Center for Virus Research 3232,Biological Science 2, University ofCalifornia, Irvine, USA)
"Study of human papillomavirus inhuman cervical tissues transplanted intoscid mice"
von Kobe, Cayetano (Laboratory ofMolecular Gerontology, NationalInstitutes on Aging, NIH, Baltimore,USA)
"La proteína del síndrome deenvejecimiento prematuro deWerner:localización, proteínas de interacción ypapel en respuesta a estrés oxidativo"
Yewdell, Jonathan W. (Laboratory ofViral Diseases, NIAID, HIH, Bethesda,MD, USA)
"Generation of MHC-Peptide complexesin vitro and in vivo"
139
Animalario
Producción y mantenimiento de ratay ratón.
Producción y mantenimiento deestirpes transgénicas ygenéticamente modificadas de ratón.
Manipulación animal con equipo deanestesia y campanas de gases.
Laboratorio para infecciónexperimental con patógenos nivelP-2.
Celdas para trabajo con diversasespecies animales.
Laboratorio de criopreservación deembriones y semen.
Fermentación
Equipo para cultivo y recolección demicroorganismos aerobios-anaerobios (fermentadores Chemupde 20 1 y Braun de 30 1).
Equipo para cultivo y recolección demicroorganismos extremófilos (Airliftde 100 1 y un reactor agitado STR).
Equipo para fraccionamiento celularde microorganismos.
Química de Proteínas
Síntesis de péptidos.
Control de calidad de péptidossintéticos madiante HPLC yespectrometría de masas.
Secuenciación de Edman depéptidos y proteínas.
Digestión de proteínas y aislamientode péptidos mediante HPLC.
Análisis de péptidos y proteínasmediante espectrometría de masastipo MALDI-TOF.
Análisis y secuenciación de péptidosmediante espectrometría de masastipo nanospray-trampa iónica.
Microscopía Electrónica
Preparación convencional demuestras para microscopíaelectrónica de transmisión: fijaciónquímica e inclusión en Epon.
Criofijación en propano o etanolíquidos.
Criosustitución e inclusión a bajatemperatura en Lowicryl (K4M,HM20).
Ultramicrotomía convencional.
Crioultramicrotomía.
Inmunomarcado post-inclusión conoro coloidal.
Hibridación “in situ” a nivelultraestructural.
Tinción negativa.
Microscopía de ácidos nucléicos.
Criosecado y criofractura.
Microscopía óptica y confocal
Microscopía de Luz Transmitida.
Microscopía de fluorescencia.
Microscopía confocal y espectral.
Microscopía de células vivas.
FRET (Fluorescence ResonanceEnergy Transfer).
FRAP (Fluorescence Recovery AfterPhotobleaching).
Procesamiento y deconvolución deimágenes.
Construcciones de proteínasfluorescentes.
Secuenciación de DNA
Equipo para secuenciación (AppliedBiosystems), PCR y análisis desecuencia.
Los servicios del CBMSO disponen de los siguientes equipamientos y técnicascomo apoyo directo a los grupos de investigación.
Servicios Técnicosde Apoyo a la Investigación
140
Research and SupportFacilities
The following facilities and techniques are regularly provided by the Central Servicesof the CBMSO in direct support of research teams.
Animal Facility
Breeding and maintenance of ratand mouse.
Breeding and maintenance oftransgenic and genetically modifiedmice.
Animal surgery and manipulationunder anesthesia.
Laboratory for experimental infectionwith P-2 level pathogens.
Embryo and sperm criopreservationfacility.
Fermentation
Facilities for medium-scale growthand harvesting of aerobicmicroorganisms (Fermentors 20 1Chemup and 30 1 Braun).
Facilities for large scale growth andand harvesting of extremophiles (1001 Airlift
and a STR stirred reactor)
Cellular fractionation ofmicroorganisms.
Protein Chemistry
Peptide synthesis.
Quality control of synthetic peptidesby HPLC and mass spectrometry.
Peptide and protein Edmansequencing.
Protein digestion and HPLC peptidepurification.
Peptide and protein analysis byMALDI-TOF mass spectrometry.
Peptide and protein analysis andsequencing by nano-spray ion trapmass spectrometry.
Electron Microscopy
Conventional processing of samplesfor “check spelling” of transmissionelectron microscopy.
Plunge cryofixation in liquid propaneor ethane.
Freeze-substitution andcryoembedding in Lowicryls.
Conventional ultramicrotomy.
Cryoultramicrotomy.
Postembedding immunogoldelectron microscopy.
Ultrastructural “in situ” hybridization.
Negative staining.
Electron microscopy of nucleic acids.
Freeze-drying and freeze fracture.
Optical and Confocal Microscopy
Transmitted light microscopy.
Fluorescence microscopy.
Confocal and spectral microscopy.
Microscopy with living cells.
FRET (Fluorescence Resonanceenergy Transfer).
FRAP (Fluorescence Recovery AfterPhotobleaching).
Image processing anddeconvolution.
Construction of fluorescent proteinsplasmids.
DNA sequencing
Equipment for DNA sequencing(Applied Biosystems) and PCRanalysis.
141
LeccionesConmemorativas
Memorial Lectures
2001-2002
VIII Lección Conmemorativa Severo Ochoa
Dr. Bruce Stillman
(Director of Cold Spring Harbor Laboratory)
“Duplication of the genome: Cell cycle and control of genomeduplication”
30 de Noviembre de 2001
IX Lección Conmemorativa Severo Ochoa
Dr. Nahum Sonenberg
(Department of Biochemistry, McGill University, Montreal, Canada)
“Signaling to translation initiation factors: effects on cell growthand proliferation”
8 de Noviembre de 2002
II Lección Conmemorativa Eladio Viñuela
Prof. Charles Weissmann
(Imperial College School of Medicine, London)
“Prions, mad cows and transgenic mice”
15 de Febrero de 2001
III Lección Conmemorativa Eladio Viñuela
Sir Aaron Klug
(MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK))
“The use of zinc finger peptides for the regulation of gene expression”
25 de Febrero de 2002
CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
"SEVERO OCHOA"
142
