Metoder och tillämpningar av CRISPR-Cas9 i...

Linköpings universitet | Institutionen för fysik, kemi och biologi

Examensarbete, grundläggande nivå, 15 hp | Lärarprogrammet

Vårterminen 2020 | LIU-GY-L-G--20/183--SE

Metoder och tillämpningar av CRISPR-Cas9 i cancerforskning. – Samt hur CRISPR-Cas9 kan implementeras i

skolundervisningen.

Methods and applications of CRISPR-Cas9 in cancer

research.

– And how CRISPR-Cas9 can be applied in teaching.

Rodrigo Valladares

Hanna Briheim

Handledare: Jenny Hagenblad

Examinator: Thomas Östholm

Linköpings universitet

SE-581 83 Linköping, Sweden

013-28 10 00, www.liu.se




Institutionen för fysik, kemi och biologi 581 83 LINKÖPING

Seminariedatum 2020-06-02

Språk Rapporttyp ISRN-nummer x Svenska/Swedish Engelska/English

Examensarbete grundläggande nivå

LIU-GY-L-G—20/183--SE

Titel Metoder och tillämpningar av CRISPR-Cas9 i cancerforskning. – Samt hur CRISPR-Cas9 kan implementeras i skolundervisningen. Title Methods and applications of CRISPR-Cas9 in cancer research. – And how CRISPR-Cas9 can be applied in teaching. Författare Rodrigo Valladares Hanna Briheim

Sammanfattning CRISPR-Cas9 är ett effektivt genredigeringsverktyg som har upptäckts på senare år. Verktyget härstammar från ett adaptivt immunförsvar hos prokaryoter. Tekniken används för att modifiera DNA hos växter, djur och människor på ett enkelt och billigt sätt. CRISPR-Cas9 har visat sig ha stor potential vid bekämpning av olika sjukdomar däribland cancer som idag är ett globalt hälsoproblem. Inom cancerforskningen ses CRISPR-Cas9 som ett lovande verktyg vid cancerterapi och läkemedelsutveckling. I denna studie sammanställer vi aktuella metoder och användningsområden med CRISPR-Cas9 inom cancerforskning. Dessutom undersöker vi hur denna form av genteknik kan lyftas upp och tillämpas i biologiundervisningen. Abstract CRISPR-Cas9 has recently emerged as an effective genome editing tool. The tool derives from an adaptive immune system in prokaryotes. The technology is used for modification of DNA in plants, animals and humans in a simple and inexpensive way. CRISPR-Cas9 has shown great potential in fighting different diseases like cancer which today is a global health issue. It is seen as a promising tool for cancer research when it comes to cancer therapy and drug development. Here we summarize current methods and applications of CRISPR-Cas9 for cancer research. Furthermore, we explore the possibilities of introducing and applying this kind of genetic engineering in biology teaching.

Nyckelord CRISPR, Cas9, Cancer, genredigering, genteknik Keywords CRISPR, Cas9, Cancer, genome editing, genetic engineering




Sammanfattning

CRISPR-Cas9 är ett effektivt genredigeringsverktyg som har upptäckts på senare år.

Verktyget härstammar från ett adaptivt immunförsvar hos prokaryoter. Tekniken används för

att modifiera DNA hos växter, djur och människor på ett enkelt och billigt sätt. CRISPR-Cas9

har visat sig ha stor potential vid bekämpning av olika sjukdomar däribland cancer som idag

är ett globalt hälsoproblem. Inom cancerforskningen ses CRISPR-Cas9 som ett lovande

verktyg vid cancerterapi och läkemedelsutveckling. I denna studie sammanställer vi aktuella

metoder och användningsområden med CRISPR-Cas9 inom cancerforskning. Dessutom

undersöker vi hur denna form av genteknik kan lyftas upp och tillämpas i

biologiundervisningen.

Nyckelord: CRISPR, Cas9, Cancer, genredigering, genteknik

Abstract

CRISPR-Cas9 has recently emerged as an effective genome editing tool. The tool derives

from an adaptive immune system in prokaryotes. The technology is used for modification of

DNA in plants, animals and humans in a simple and inexpensive way. CRISPR-Cas9 has

shown great potential in fighting different diseases like cancer which today is a global health

issue. It is seen as a promising tool for cancer research when it comes to cancer therapy and

drug development. Here we summarize current methods and applications of CRISPR-Cas9 for

cancer research. Furthermore, we explore the possibilities of introducing and applying this

kind of genetic engineering in biology teaching.

Keywords: CRISPR, Cas9, Cancer, genome editing, genetic engineering




Tack

Vi vill rikta ett stort tack till vår handledare Jenny Hagenblad för professionell och stöttande

handledning genom detta arbete.

Tack till Jennifer Doudna, Rotem Sorek, Edward Benz, Xiaoling Deng, Michael Boutros och

deras kollegor som givit oss tillåtelse att använda figurer från deras tidigare arbete.

Stort tack till vår kära vän, och svensklärarstudent, Björn Carlsson för värdefull återkoppling

och korrekturläsning.

Till sist vill vi även tacka våra opponenter Cassandra Heiskanen, Sanna Svanberg och

Sebastian Reznik för givande synpunkter.




Innehållsförteckning

1. Inledning ................................................................................................................................................................. 1

2. Metod..................................................................................................................................................................... 2

2.1 Urval .................................................................................................................................................................................. 2

2.2 Databaser .......................................................................................................................................................................... 2

2.3 Sökord ................................................................................................................................................................................ 3

3. Cancer .................................................................................................................................................................... 4

3.1 Vad är cancer? ................................................................................................................................................................... 4 3.1.1 Orsaker till cancer ..................................................................................................................................................... 4 3.1.2. Gener relaterade till cancersjukdom ....................................................................................................................... 5

3.2 Mekanismer och faser ....................................................................................................................................................... 6 3.2.1 Carcinogenes ............................................................................................................................................................. 7 3.2.2 Metastas ................................................................................................................................................................... 8

3.3 Framsteg i cancerforskning ............................................................................................................................................... 8

4. CRISPR-Cas ............................................................................................................................................................ 10

4.1 Vad är CRISPR-Cas? ......................................................................................................................................................... 10 4.1.1. CRISPR .................................................................................................................................................................... 10 4.1.2 CRISPR-Cas – immunförsvar hos prokaryoter......................................................................................................... 11

4.2 CRISPR-Cas maskineriet ................................................................................................................................................... 11

4.3 CRISPR-Cas uppbyggnad och klassifikation..................................................................................................................... 13

4.4. Cas9 ................................................................................................................................................................................ 13 4.4.1 CRISPR-Cas9: Ett genredigeringsverktyg................................................................................................................. 15

5. CRISPR-Cas9 i cancerforskning ................................................................................................................................ 17

5.1 Metoder ........................................................................................................................................................................... 17 5.1.1 Knockout av onkogener .......................................................................................................................................... 17 5.1.2 Reparation av tumörsuppressorgener.................................................................................................................... 17 5.1.3 Knockdown av miRNA:s .......................................................................................................................................... 18

5.2 Tilllämpningar ................................................................................................................................................................. 18 5.2.1 CRISPR-Cas9 screening ............................................................................................................................................ 19 5.2.2 Cancermodeller....................................................................................................................................................... 20 5.2.3 CRISPR-Cas9 i immunoterapin ................................................................................................................................ 22

5.2.3.1 CAR-T-celler .................................................................................................................................................... 22 5.2.3.2 PD-1 knockout ................................................................................................................................................ 23

5.2.4 Kliniska prövningar ....................................................................................................................................................... 24

6. Pedagogisk tillämpning .......................................................................................................................................... 27

6.1 Styrdokument .................................................................................................................................................................. 27

6.2 CRISPR-Cas9 & etik .......................................................................................................................................................... 28 6.2.1 Etik i biologiundervisningen .................................................................................................................................... 28

6.3 Laborera med CRISPR-Cas9 ............................................................................................................................................. 29

7. Slutsats ................................................................................................................................................................. 30

8. Referenser ............................................................................................................................................................ 31




1

1. Inledning

Cancer är idag ett stort globalt hälsoproblem (Siegel et al., 2019). Under 2018 rapporterades

18.1 miljoner nya cancerfall och 9.6 miljoner dödsfall (IARC, 2019). I Sverige uppskattas i

dagsläget att en person av tre kommer att få ett cancerbesked under sin livstid och att två av

tre kommer att överleva sin cancerdiagnos (Cancerfonden, 2020). Samtidigt är det mycket

svårt att behandla cancer. Detta beror dels på att cancercellerna kan bete sig olika från person

till person, sprida sig och evolvera, men också för att framtagning av läkemedel är en

utmaning på grund av eventuella bieffekter samt resistensproblem. Dessutom kan det vara

svårt att tidigt upptäcka och identifiera cancer, om personen inte har några symptom

exempelvis (Chakraborty & Rahman, 2012; Benz, 2017).

Cancerforskningen har på senare år tagit viktiga kliv framåt, bland annat tack vare det relativt

nyupptäckta genredigeringsverktyget CRISPR-Cas9. Denna teknologi, som bygger på en

form av immunförsvar hos prokaryoter, har visat sig ha stor betydelse när det kommer till

exempelvis behandling av tumörer och läkemedelsframtagning (Jiang et al., 2020; Zhan et al.,

2019).

Syftet med denna litteraturstudie är att ta fram information om hur CRISPR-Cas9 används

inom cancerforskningen. Vilka tillämpningsområden finns det? Vad finns det för metoder och

hur fungerar dem? Vi undersöker också pågående kliniska cancerstudier med CRISPR-Cas9

för att få en överblick kring hur det används på människor med cancer idag. Slutligen tar vi

reda och ger förslag på hur vi som framtida lärare kan implementera CRISPR-Cas9 i

biologiundervisningen.




2

2. Metod

2.1 Urval

Vi har valt att avgränsa vår litteraturstudie till de metoder och tillämpningar som finns med

CRISPR-Cas9 i cancerforskning. Eftersom CRISPR-Cas9 som genredigeringsverktyg är

relativt nytt var avgränsningen av studier ett mindre problem. Det fanns ett fåtal studier som

sammanställde metoder och tillämpningar av CRISPR-Cas9 i cancerforskningen generellt.

Genom att välja ut de mest aktuella från 2019 och 2020, som dessutom byggde på tidigare

sammanställningar, tyckte vi att vi fick ett bra och välgrundat resultat. Specifika studier som

behandlades i sammanställningarna och som vi lyfte upp som exempel, valdes med hänsyn till

komplexitet och cancertyp. Detta för att det ska vara så enkelt som möjligt för läsaren att

förstå, men också för att uppmärksamma framsteg i olika typer av cancersjukdomar. I den

didaktiska delen av vårt arbete har vi avgränsat undersökningen till hur genteknik och dess

etiska dilemman som kan uppstå kan behandlas i undervisningen. Vi ger även exempel på hur

man kan laborera med CRISPR-Cas9 i gymnasieundervisningen.

2.2 Databaser

Vår litteraturstudie bygger till största del på primärkällor som är peer reviewed med några

enstaka undantag. De studier som vi har valt att använda oss av har varit på engelska eftersom

vi inte hittade relevanta studier på svenska. För att hitta källor har vi framförallt använt oss av

databaserna Google Scholar och Unisearch. Google Scholar är en bra databas om man ska

söka efter vetenskaplig litteratur, nackdelen är att man inte kan begränsa sökresultaten till

peer reviewed-texter. Vid tveksamheter säkerställde vi materialets kvalitet med hjälp av

Unisearch, som är en databas skapad av Linköpings universitetsbibliotek. Där kan man bland

annat sortera källorna efter peer review. En annan fördel med Unisearch är att källorna ingår i

universitetets bibliotekskatalog men också andra databaser och hemsidor som är kopplade till

Unisearch. För den didaktiska delen av arbetet har vi även använt oss av databasen ERIC. Den

är specialiserad på utbildningsvetenskap där man också kan begränsa sökresultaten till

vetenskapliga peer reviewed-texter.




3

2.3 Sökord

Gene editing, CRISPR/Cas9, CRISPR, cancer, cancerresearch, applications, methods,

techniques, knockout, genetic screening, screening, immunotherapy, T-cells, CAR-T-cells,

PD-1 knockout, cancermodels, genetic engineering, ethics, education, teaching, classroom,

school, high-school




4

3. Cancer

3.1 Vad är cancer?

Cancer är ett samlingsnamn för mer än 200 sjukdomar som orsakas av en serie förändringar

eller mutationer i genomet hos somatiska celler (Benz, 2017; Hassanpour, 2017). Dessa

förändringar rubbar cellernas funktion och skapar särskilda problem i cellcykeln. Framförallt

medför det att celler delar sig okontrollerat, vilket kan leda till tumörer som sedan kan

fortsätta att växa och sprida sig (Luzzatto, 2011; Hassanpour, 2017). Eftersom cancer

förekommer i flera komplexa former och ständigt evolverar är det svårt att förebygga och

behandla sjukdomen i sin helhet (Dai, 2019; Benz, 2017).

Tumörer, eller neoplasma, är de termer som används för att definiera en skada eller förändring

i vävnader, som kännetecknas av onormal cellförökning (Baba & Catoi, 2007).

Tumörutvecklingen som sker i samband med cancertillväxten inträffar när tumörcellerna

undkommer värdens immunförsvar, vilket de gör till följd av spontana mutationer som i detta

fall gynnar deras överlevnad (Wu & Cao, 2018). Vissa tumörer kan också sänka uttrycket för

vissa proteiner, vilket leder till att T-celler i vårt immunförsvar inte kan identifiera dem (Zindl

& Chaplin, 2010).

Tumörer kan delas in i två huvudkategorier, godartade (benigna) och elakartade (maligna).

Benigna tumörer växer långsamt och utvecklar inga metastaser, även kallade dottertumörer,

vilket ger endast en lokal spridning av tumören utan att invadera närliggande vävnader och

organ. Maligna tumörer däremot, utvecklar metastaser som gör det möjligt för dem att spridas

till andra organ och vävnader via blod- och lymfsystem. Maligna tumörer karaktäriseras av

snabb spridning samt risk för återfall efter kirurgiskt avlägsnande till skillnad från benigna

tumörer som inte riskerar återfall (Baba & Catoi 2007).

3.1.1 Orsaker till cancer

Cancersjukdomar uppstår genom en serie av somatiska mutationer som ändrar DNA-

sekvensen i genomet. Mutationerna kan antingen vara driver-mutationer som ökar cellens

tillväxt och kan leda till cancer, eller passenger-mutationer där tillväxten inte påverkas och

ger därmed inte upphov till cancer men kan fortfarande förekomma i tumörer (Stratton et. al.,

2009). Dessa mutationer kan orsakas av genetiska- och miljöfaktorer (Hyndman,




5

2016). Genetiska faktorer involverar somatiska mutationer som sker spontant vid DNA-

replikation eller överförs vid nedärvning (Luzzatto, 2011). Cancer som utvecklas utifrån

genetiska faktorer tros vara blott 5 % vilket tyder på att det finns ett starkt samband mellan

genetiska faktorer och miljöfaktorer när det kommer till utveckling av cancer (Perera, 1997).

Miljöfaktorer involverar livsstil, diet och infektioner som bidrar till genetiska och

epigenetiska förändringar (Hyndman, 2016).

3.1.2. Gener relaterade till cancersjukdom

Mutationer som leder till cancer uppstår i många olika typer av gener. I vanliga fall arbetar

generna tillsammans för att säkerställa att cellerna fungerar som de ska genom att bland annat

upprätthålla en balans mellan cellbildning (mitos) och celldöd (apoptos). Dessa gener kan

betraktas tillhöra fyra kategorier: proto-onkogener, tumörsuppressorgener, DNA-reparerande

gener och apoptosgener (Benz, 2017). MikroRNA-gener kan ses som en femte kategori även

om de inte kodar för proteiner som de andra utan är snarare involverade i genuttryck (Croce,

2008). Förändringar i alla dessa gener är vanligtvis av somatisk karaktär men även mutationer

som ärvs vidare kan vara en underliggande faktor till cancer (Croce, 2008; Sherr, 2004).

Proto-onkogener kodar för proteiner som är inblandade i cellernas förökning. Det innefattar

bland annat tillväxtfaktorer och deras receptorer samt proteiner som är involverade i bland

annat transkription, cellsignalering och apoptos. Onkogener är muterade former av dessa

gener som är farliga för cellen och kan öka celltillväxten. (Croce, 2008; Benz, 2017;

Hassanpour, 2017).

Tumörsuppressorgener kodar för proteiner som bromsar celltillväxten (Benz, 2017). I

majoriteten av alla cancersjukdomar tenderar dessa gener att bli inaktiverade, vilket leder till

okontrollerad celldelning (Benz, 2017; Hassanpour, 2017). Tumörsuppressorgener är

recessiva och kräver att båda alleler inaktiveras för att en tumör ska kunna växa och sprida sig

(Sherr, 2004). Risken för att bilda tumörer ökar om ena föräldern bär på en muterad allel i en

tumörsuppressorgen, då det endast krävs en mutation till för att genen ska förlora sin funktion

(Sherr, 2004).

Ett kännetecken för cancer är ett icke-fungerande reparationssystem i DNA:t, som har

försämrats eller rubbats helt i de flesta cancerceller till följd av mutationer i DNA-reparerande




6

gener. Dessa reparationsmekanismer innefattar nucleotid excision repair (NER), icke-

homolog rekombination (NHEJ, eng. nonhomologous end joining) och direct reversal (DR)

för att nämna några (Chae et al., 2016; Yi & He, 2013). I etablerad cancer tenderar dessutom

befintliga mutationer att generera ännu fler mutationer till följd av att reparationssystemen

inte fungerar som de ska (Benz, 2017).

Apoptos är cellernas metod för att ta död på sig själva på ett kontrollerat sätt på grund av att

cellerna är skadade, slitna eller inte längre behövs (Benz, 2017). Flera proteiner utövar pro-

eller anti-apoptotisk aktivitet hos celler där förhållandet mellan antalet av dessa proteiner

spelar en viktig roll i regleringen av celldöd (Wong, 2011). Mutationer, som inaktiverar pro-

apoptotiska gener eller aktiverar anti-apoptotiska gener, förskjuter jämvikten av antalet

proteiner och leder till att celler undgår apoptos vilket är en avgörande del i cancerutveckling

(Benz, 2017; Wong, 2011).

MikroRNA-gener producerar små icke-kodande RNA-strängar (miRNA:s) som reglerar

genuttryck i olika gener däribland ovannämnda proto-onkogener, tumörsuppressorgener m.fl.

Flera studier har visat att uttryck av miRNA:s dysregleras i cancerceller. Det sker genom

amplifikation eller deletion av miRNA-gener, bristande kontroll av transkriptionsfaktorer

involverade i uttrycksprocessen, epigenetiska faktorer samt förändringar hos enzymer och

proteiner som styr produktion av miRNA:s. Den onormala regleringen av miRNA:s leder till

att cellerna kan upprätthålla proliferering, undvika suppressorgener, stå emot apoptos och

invadera bland annat närliggande vävnader (Peng & Croce, 2016).

3.2 Mekanismer och faser

Cancerutvecklingen är lång och komplicerad och kan delas in i två processer: carcinogenes

och metastas. Carcinogenes definieras olika från fall till fall och är ofta synonymt med

onkogenes som kan översättas med tumöruppkomst. I huvudsak kan det betraktas som den

process där elakartade tumörer bildas genom att normala celler omvandlas till cancerceller

(fig 1) (Hyndman, 2016; Hassanpour, 2017; Baba & Catoi, 2007). Metastas innebär att

cancerceller sprider sig från sin ursprungliga plats till andra organ där de bildar fler tumörer

(Baba & Catoi, 2007).




7

Figur 1: Exempel på hur cancer kan utvecklas över tid, till följd av en rad olika mutationer. Från: The Jeremiah Metzger

lecture cancer in the twenty-first century: an inside view from an outsider. BENZ Jr, E. J. (2017). Transactions of the

American Clinical and Climatological Association, 128, 275. Använd och översatt med tillåtelse från författare.

3.2.1 Carcinogenes

Carcinogenes är omvandlingen av vanliga celler till cancerceller som är aggressiva, med

potential att sprida sig till andra delar av kroppen (National Cancer Institute, u.å; Sporn &

Suh, 2002). Dessa celler påverkar det normala förhållandet mellan epitelceller och deras

underliggande celler som utgör bindväven i vissa organ. Av den anledningen kan man se

carcinogenes som en form av vävnadssjukdom (Sporn & Suh, 2002). Carcinogenes kan delas

in i tre faser: initiering, promotion och progression (Siddiqui et al., 2015).

Under initiering sker mutationer i somatiska celler, vilket leder till att celler delar sig

okontrollerat och ökar risken för tumörbildning (Willis, 2016).

Promotionsfasen kännetecknas av att vara en lång process där tumörbildande celler, redo att

spridas, ackumuleras. Det är en reversibel fas vilket innebär att de olika stegen kan bekämpas

med kemoterapi som påverkar cellernas tillväxthastighet. Med andra ord bestäms det i




8

promotionsfasen huruvida tumörutveckligen stannar vid en premalign förändring eller om det

utvecklas till invasiv cancer (Siddiqui et al., 2015).

Den tredje fasen, progression, rör tumörens utveckling. Progressionsfasen är början till

instabilitet i genomet, högre tillväxthastighet av celler, samt metaboliska och morfologiska

förändringar (Willis, 2016). Cellerna genomgår fler mutationer och risken för att sprida sig till

andra vävnader ökar (Siddiqui et al., 2015).

3.2.2 Metastas

Metastas beskriver spridningen av cancerceller från den primära tumören till omgivande

vävnader och till andra organ, vilket är orsaken till cirka 90 % av alla dödsfall i cancer

(Seyfried & Huysentruyt, 2013; Chaffer & Weinberg, 2011). Processen kan delas in i två

faser: translokation och kolonisering (Seyfried & Huysentruyt, 2013).

Under translokationsfasen lösgör sig cancerceller från den primära tumören och invaderar

kringliggande vävnad. Därefter tar de sig in i kroppens blod- och lymfsystem som fungerar

som en förbindelse till andra mer avlägsna organ (Seyfried & Huysentruyt, 2013; Chaffer &

Weinberg, 2011).

Koloniseringsfasen kännetecknas av att de cirkulerande tumörcellerna tar sig ut från blod- och

lymfsystem och invaderar andra vävnader och organ. Där måste de klara av att undvika

diverse angrepp från immunförsvaret samt anpassa och acklimatisera sig, för att därefter växa

och sprida sig (Seyfried & Huysentruyt, 2013; Hyndman, 2016). En viktig del i

acklimatiseringen är att bland annat främja bildandet av nya blodkärl (angiogenes) som kan

tillförse cellerna med syre och näring (Nishida et al., 2006; Seyfried & Huysentruyt, 2013).

3.3 Framsteg i cancerforskning

Trots cancerns komplexitet har det gjorts framsteg inom cancerforskningen som lett till en

högre överlevnadsgrad för många cancerpatienter (Benz, 2017). På senare år har det, genom

nya sekvenseringsmetoder, blivit lättare att identifiera och studera de genetiska förändringar

som leder till cancer. Från sekvenseringen kan man därefter rekonstruera tumörernas

förändring över tid och utveckla olika modeller som kan användas för att beräkna och

precisera när mutationer har skett. På så sätt kan man bland annat förutse vad de mutationerna

kommer att få för konsekvenser och gör utvecklingen av cancermodeller till en viktig del i




9

cancerforskningen (Ben-David et al., 2019). Förståelsen för den underliggande tumörbiologin

har lett till utvecklingen av små molekyler och antikroppar som kan användas för att störa

tumörens signalväg. Genredigering har setts som ett lovande verktyg för att utveckla

cancerterapin och det relativt nya genredigeringsverktyget CRISPR-Cas9 har öppnat upp för

nya möjligheter inom cancerforskningen (Zhan, 2018).




10

4. CRISPR-Cas

4.1 Vad är CRISPR-Cas?

Ordet CRISPR är en förkortning av engelskans clustered regularly interspaced short

palindromic repeats. CRISPR tillsammans med Cas (eng. CRISPR assosicerade proteiner) är

en form av försvarssystem hos prokaryota mikroorganismer som ger ett effektivt och specifikt

skydd mot främmande genetiska element. Den centrala mekanismen bakom systemet är

förmågan att memorera delar av en okänd DNA-sekvens, för att senare kunna identifiera

samma sekvens och avlägsna den (Barrangou et al. 2007; Garneau et al. 2010). CRISPR

upptäcktes år 1987, men det är först under det senaste årtiondet som forskningen kring

CRISPR-Cas har tagit stora kliv framåt och revolutionerat gentekniken genom modifiering av

DNA hos växter, djur och människor (Ishino et al., 1987; Knott & Doudna, 2018). Inom

jordbruket har man bland annat lyckats förbättra olika grödors egenskaper, som exempelvis

näringsinnehåll och skörd (Yin et al, 2017). I den kliniska världen bekämpas diverse

sjukdomar som exempelvis cancer (Xia et al., 2019) och HIV (Wang et al., 2018) för att

nämna några.

4.1.1. CRISPR

CRISPR är korta palindromiska sekvenser i DNA som upprepar sig med jämna mellanrum

och som endast existerar i prokaryota organismer (Jansen et al., 2002). Vad som utmärker

CRISPR är dess speciella kassett, eller struktur, som följer ett specifikt mönster bestående av

korta repetitiva DNA-sekvenser som avbryts av unika mellanliggande sekvenser, så kallade

spacers (fig 2) (Mojica et al., 2000). Intill kassetterna anträffas Cas-gener frekvent och tyder

på att CRISPR och Cas hänger ihop (fig 3a) (Jansen et al., 2002; Haft, 2005). Tillsammans

bildar de så kallade CRISPR-Cas-system.




11

Figur 2: (A) Olika CRISPR-repeats med palindromiska sekvenser (gulmarkerade) med tillhörande spacers: S1, S2, S3. (B)

Förslag på hårnålsstruktur i CRISPR-kassett som bildas genom basparning mellan nukleotiderna i de palindromiska

sekvenserna. Från Predominance of single prophage carrying a CRISPR-cas system in ”Candidatus Liberibacter asiaticus”

strains in southern China. Zheng, Z., Bao, M., Wu, F., Chne, J., & Deng, X. (2016) PLoS One, 11 (1). Använd och översatt

med tillåtelse från författare

4.1.2 CRISPR-Cas – immunförsvar hos prokaryoter

De mellanliggande sekvenserna i CRISPR-kassetten har visat sig vara av annat DNA än

cellens egna (Bolotin et al., 2005; Mojica et al., 2005). Det har medfört till förståelsen

gällande CRISPR-Cas-systemets funktion som en form av adaptivt immunförsvar mot

plasmider och virus som riskerar att skada det egna genomet (Barrangou et al. 2007).

Bakterier som överlever virusinfektioner memorerar och integrerar en liten del av virusets

DNA i sitt eget genom. Denna lilla del kallas för protospacer innan det kopieras och införs

som en unik mellanliggande sekvens i CRISPR-kassetten (Westra et al., 2012). Spacer, som

den mellanliggande sekvensen kallas, kan sedan transkriberas till CRISPR-RNA (crRNA)

som är komplementär till protospacern (Jiang et al., 2017; Jinek et al., 2012). På så sätt känner

bakterien igen viruset nästa gång och kan med hjälp av Cas-proteiner klyva det främmande

DNA:t vid den specifika nukleotidsekvensen och avvärja angreppet (Garneau et al., 2010;

Jinek et al., 2012). Specificiteten hos CRISPR-Cas-systemet bygger därmed på de

mellanliggande sekvenserna som transkriberas till crRNA medan effektiviteten grundar sig i

interaktionen mellan crRNA och Cas-proteiner, där RNA:t fungerar som en guide för Cas-

proteinerna (Jinek et al., 2012; Koonin et al., 2017).

4.2 CRISPR-Cas maskineriet

Immuniseringen med CRISPR-Cas sker i tre steg: anpassning, uttryck och interferens (fig 3)

(Amitai & Sorek, 2016; Jinek et al., 2012).




12

Figur 3: (a) Schematisk överblick över CRISPR-kassett med intilliggande Cas-gener. (b, c, d) Illustration av de tre olika

stegen i CRISPR-Cas immuniseringsprocess. Från: CRISPR-Cas adaation: Insights into the mechanism of action. Amitai, G.,

& Sorek, R. (2016). Nature Reviews Microbiology, 14(2), 67. Använd och översatt med tillåtelse från författare.

Anpassning, som är det första steget, börjar med en infektion av ett virus eller en plasmid.

Bakterien svarar då med att integrera korta sekvenser från det främmande DNA:t

(protospacer) i CRISPR-locin hos bakterien (Jinek et al., 2012). När den främmande DNA-

sekvensen inkorporeras som en ny spacer i CRISPR-kassetten i bakteriens genom lagras den

som ett minne (Amitai & Sorek, 2016). För att inkorporera nya spacers till CRISPR-kassetten

krävs proteinerna Cas1 och Cas2, samt en nukleotidsekvens, även kallad ledarsekvens, som

anträffas i någon av ändarna i CRISPR-kassetten (Yosef et al., 2012). Cas1 och Cas2 bildar

tillsammans ett stabilt proteinkomplex, Cas1-Cas2. Komplexet förvärvar en protospacer och

inkorporerar den som en ny spacer mellan ledarsekvensen och den första CRISPR

upprepningen. Slutligen dupliceras CRISPR upprepningen på så sätt att den nya spacern

ligger mellan två upprepningar (fig 3b) (Amitai & Sorek, 2016).




13

När den nya spacern har inkorporerats i det egna genomet påbörjas det andra steget, uttryck,

där CRISPR-kassetten transkriberas och bearbetas vidare till crRNA (fig 3c). Det består utav

en del av CRISPR-sekvensen och den transkriberade spacer-sekvensen (Amitai & Sorek

2016; Gasiunas et al., 2014). Tillsammans med Cas-proteiner bildar crRNA effektorkomplex

(Gasiunas et al., 2014).

I det sista steget, interferens, söker effektorkomplexet efter främmande nukleotidsekvenser

som identifieras genom basparning mellan målsekvensen och crRNA:t. Igenkänning av

målsekvensen sker genom en protospacer-adjacent motif (PAM), som är en kort

nukleotidsekvens bestående av 2–5 bp och indikerar vart klyvning av DNAt ska ske (fig 3d)

(Amitai & Sorek 2016; Gasiunas et al., 2014).

4.3 CRISPR-Cas uppbyggnad och klassifikation

CRISPR-Cas-systemets effektivitet baseras på RNA samt proteinkomponenter (Cas-proteiner)

som tillsammans bildar effektorkomplex. Två varianter av RNA är involverade i CRISPR-

Cas: crRNA som finns i alla CRISPR-Cas-system och innehåller målsekvensen, samt trans-

activating crRNA (tracrRNA) som aktiverar crRNA och förekommer i typ II system

(Charpentier, 2015; Jinek et al., 2012).

Det finns två huvudklasser av CRISPR-Cas-system som i sin tur delas in i sex typer och flera

subtyper (Hille & Charpentier, 2016). Klassificeringen bygger på antalet Cas-proteiner och

deras interaktion med crRNA i skapandet av effektorkomplex (Jiang & Doudna, 2017;

Koonin et al., 2017). Klass 1 (typ I, III och IV) består av ett multiproteinkomplex medan

klass 2 (typ II, V och VI) utgörs av ett enda stort protein (Hille & Charpentier, 2016).

4.4. Cas9

Cas9 är ett endonukleas som används inom typ II CRISPR-Cas-system med syftet att känna

igen och klyva dubbelsträngat DNA (fig 4) (Jiang & Doudna, 2017). Aktiviteten hos Cas9 är

beroende av inbindningen till ett RNA-komplex bestående av crRNA och tracrRNA.

Komplexet är en form av guide-RNA (gRNA) (Jiang & Doudna, 2017; Jinek et. al., 2012).




14

Cas9 består utav två lober som innehåller olika funktionella enheter: REC-loben och NUC-

loben. Dessa medverkar vid identifiering respektive klyvning av målsekvensen med hjälp av

de två enheterna HNH och RuvC (Zuo & Liu, 2017; Jiang & Doudna, 2017).

När Cas9 binder in till ett guide-RNA aktiveras komplexet och kan då identifiera främmande

DNA (Jinek et al., 2014). Det kräver komplementär basparning mellan spacer-sekvensen och

protospacern i mål-DNAt, samt närvaro av en PAM-sekvens som indikerar var klyvningen

ska ske (Jiang & Doudna, 2017; Jinek et. al., 2012). Denaturering och invasion av DNA leder

till att DNA:t snurras upp samtidigt som den komplementära strängen vrids om för att baspara

med guide-RNAt (Jiang & Doudna, 2017). Därefter sker klyvning av målsekvensen vilket ger

dubbelsträngsbrott i DNA:t (Zou & Liu, 2016).

Figur 4: Schematisk representation av CRISPR-Cas9 system och dess igenkänning och klyvning av målsekvenser. I denna

figur binder Cas9 in till sgRNA, en form av guide-RNA. Från: CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Jiang, F., &

Doudna, J.A. (2017). Annual reviews of biophysics, 46, 505-529. Använd och översatt med tillåtelse från författare.




15

4.4.1 CRISPR-Cas9: Ett genredigeringsverktyg

År 2012 gjordes en studie som visade att Cas9 kan programmeras för att klyva specifika

DNA-sekvenser. Detta sker genom design och konstruktion av så kallade single-guide-RNA:s

(sgRNA:s) som efterliknar dubbelkomplexet crRNA-tracrRNA och dess egenskaper (Fig 5).

Figur 5: crRNA-tracrRNA-komplex som basparar med varandra och binder in till målsekvensen (vänstra bilden). sgRNA

som liknar crRNA-tracrRNA-komplexet i utseende och funktion (högra bilden). Från: A Programmable Dual-RNA–Guided

DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., &

Charpentier, E. (2012). Science, 337(6096): 816-821. Använd och översatt med tillåtelse från författare.

Immunförsvaret med CRISPR-Cas hos prokaryoter bygger på att eliminera främmande DNA

genom klyvning. Vid genredigering med CRISPR-Cas9 är målet att klyva det egna DNA:t för

att därefter genomföra modifieringar med hjälp av naturliga reparationsmekanismer.

Reparation av DNA sker antingen via icke-homolog rekombination (NHEJ) eller homology

directed repair (HDR) (fig 6). NHEJ reparerar DNA:t genom att föra samman ändarna i

dubbelsträngsbrotten med varandra. Mekanismen är effektiv, men kan bidra till indel-

mutationer som i sin tur skulle kunna leda till att gener förlorar sin funktion (Xia et. al., 2019;

Sanjana, 2017). Till skillnad från NHEJ ger HDR en mer exakt reparation på grund av att det

krävs en DNA-mall, vilket gör det möjligt att introducera nya DNA-sekvenser. Genredigering

med CRISPR-Cas9 bygger därmed på reparationsmekanismerna som antingen inaktiverar

gener eller ger möjlighet för introduktion av nya gener (Xia et. al., 2019; Joung et al., 2017).




16

Figur 6: DNA reparation efter dubbelsträngsbrott orsakat av CRISPR-Cas9. Skapad av, Mariuswalter / CC BY-SA

(https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0) hämtad 2020-04-28

Unikt för Cas9 är att det kan kombineras med flera olika sgRNA:s (Jinek et. al., 2012) På så

sätt är det möjligt att klyva och därmed redigera en eller flera gener samtidigt, vilket även kan

kallas för multiplex genome editing. Denna flexibilitet gör CRISPR-Cas9, i kombination med

att det är enkelt att designa gRNA:s (exempelvis sgRNA:s), till ett billigt och lättanvänt

genredigeringsverktyg (Jinek et. al., 2012; Najera et al., 2019).




17

5. CRISPR-Cas9 i cancerforskning

5.1 Metoder

Eftersom cancer orsakas av flera mutationer i olika gener ses CRISPR-Cas9 som ett lovande

verktyg för att få en djupare förståelse kring sjukdomen och på så sätt utveckla strategier för

att bekämpa den (Jiang et al., 2020; Kaushik, et. al. 2019). Inom cancerforskningen används

CRISPR-Cas9 för att bland annat reparera och slå ut specifika gener. Metoderna bygger på

korrigering respektive skapande av mutationer som kan uppstå naturligt eller framkallas vid

klyvning med Cas9. I praktiken innebär det att man modifierar plasmider på så sätt att de

uttrycker Cas9 och sgRNA (Wang, 2013; Sakuma et al., 2014). sgRNA:s kan designas digitalt

och konstrueras med hjälp av oligonukleotider (Zhan et al., 2019; Sanjana, 2017). Dessa kan

sedan klonas in i olika typer av vektorer, antingen tillsammans med Cas9-proteiner eller

separat, samt med eventuella DNA-mallar för HDR-reparation (Sakuma et al., 2014; Gori et

al., 2015). Därefter överförs vektorerna, som kodar för klyvning av olika gener, till celler med

hjälp av virala metoder (transduktion) eller icke-virala (transfektion) (Sakuma et al., 2014;

Sanjana, 2017).

5.1.1 Knockout av onkogener

Knockout av gener med CRISPR-Cas9 är en vanlig metod som används inom

cancerforskning. Det innebär att man framkallar en mutation i en gen som resulterar i att den

förlorar sin funktion (Baranwal, 2013; Jiang et al., 2019).

Genom knockout med CRISPR-Cas9 kan man bland annat inaktivera onkogener för att hindra

tillväxten av en tumör. I en studie av Koo et al. (2017) visar de, in vitro och in vivo, hur

CRISPR-Cas9 inaktiverar genen EGFR, vars ena allel ofta muterar och bidrar till

tumörutveckling i en form av lungcancer hos människan. Plasmider transfekterades till en

grupp av dessa lungcancerceller vilket framkallade indel-mutationer hos den muterade allelen,

vilket ledde till att cancercellerna dog och att tumören minskade i storlek (Koo et al., 2017).

5.1.2 Reparation av tumörsuppressorgener

Genom reparationsmekanismen HDR kan man korrigera mutationer i tumörsuppresorgener

(Valetta et al., 2015). Valetta et al. (2015) visade i deras studie att det gick att korrigera en




18

punktmutation hos tumörsuppressorgenen ASXL1, som i vanliga fall är involverad i reglering

av celldifferentiering och cellproliferering (cellförökning) hos leukemiceller, in vivo.

Plasmider transfekterades in i cellerna tillsammans med en DNA-mall som genom HDR

ersatte den klippta och felaktiga sekvensen. Resultatet visade att celltillväxten hämmades i

den cellpopulationen som redigerades med hjälp av CRISPR-Cas9 (Valetta et al., 2015).

5.1.3 Knockdown av miRNA:s

Med hjälp av CRISPR-Cas9 kan man utföra knockdowns av miRNA:s som främjar

tumörutveckling. Detta innebär att man slår ut mikroRNA-gener för att sänka genuttrycket av

miRNA:s, vilket kan inhibera tumörtillväxten (Jiang et al., 2019; Han, 2018). Chang et al.

(2016) lyckades med att nedreglera uttrycket av miRNA:s hos celler i tjock- och

ändtarmscancer genom att hämma produktionen av miRNA:s. Dessutom visade de att

egenskaperna från dessa knockdowns upprätthålls på lång sikt in vitro och in vivo.

Målgenerna i denna studie var miR-17, miR-200c och miR-141. Modifierade plasmider

konstruerades där målsekvenserna, som de riktade in sig på, låg intill regioner som är

involverade i produktionen av Drosha och Dicer, två viktiga enzymer som är delaktiga i

framställningen av miRNA:s. Därefter transfekterades plasmiderna in i cellerna där de

uttryckte Cas9-aktivitet som ledde till indel-mutationer. Resultatet visade att nivån av

miRNA:s minskade med upp till 96% (Chang et al., 2016). Knockdown av miR-17 visade

dessutom ökad aktivitet hos genen ZEB1 som ligger i närheten vars protein förbättrar de

hämmande egenskaperna hos tumörsuppresoren E-cadherin (Chang et al., 2016; Petrova et al.,

2016). Analys av cellerna efter 10, 20 respektive 30 dagar efter transfektion, visade att

nedreglering av miRNA fortsatte hos miR-17 både in vitro och in vivo (Chang et al., 2016).

5.2 Tilllämpningar

Med hjälp av CRISPR-Cas9 kan man alltså bland annat framkalla och rikta mutationer som

slår ut genfunktioner. Detta kan man använda för att studera fenotypförändringar och

identifiera de gener som ger upphov till dem och på så sätt bidra till en djupare förståelse för

tumörers uppkomst och utveckling (Zhan et al., 2019; Jiang et al., 2020).




19

5.2.1 CRISPR-Cas9 screening

Genetic screening är en teknik för att identifiera gener i DNA som påverkar en viss funktion

eller egenskap (Schneeberger, 2014; Joung et al., 2017). Detta kan bland annat göras med

hjälp av knockouts för att framkalla olika fenotyper i celler eller organismer. Därefter väljer

man ut önskad fenotyp för att studera de genetiska egenskaper som ger upphov till

förändringen (Joung et al., 2017; Schneeberger, 2014). För att identifiera flera gener parallellt

kan man använda sig av ett sgRNA-bibliotek, som är en samling (pool) av olika sgRNA:s,

som klonas in i olika vektorer och introduceras till celler genom transduktion (fig 7) (Joung et

al., 2017; Zhan et al., 2019).

Ett av målen med CRISPR-Cas9 screening i cancerforskningen är att hitta gener som kan vara

potentiella måltavlor för läkemedel (Zhan et al., 2019). I en studie av Tzelepis et al. (2016)

identifierades 492 gener som är involverade i akut myeloisk leukemi (AML). Inhibering av en

Figur 7: Screening med CRISPR-Cas9. Produktion av sgRNA:s som klonas in i virala vektorer. Viruspartiklar från

vektorerna som bär på en specifik sgRNA infekterar cellerna som man studerar och som innehåller Cas9 sedan

tidigare. Efter antibiotikaselektion återstår en cellpopulation där varje cell har en specifik gen som är knocked-

out. Från CRISPR/Cas9 for cancer research and therapy. Zhan, T., Rindtorff, N., Betge, J., Ebert, M. P., &

Boutros, M. (2019, April). In Seminars in cancer biology (Vol. 55, pp. 106-119).Academic Press. Använd och

översatt med tillåtelse från författare.




20

gen som de valde ut, KAT2A, ledde bland annat till apoptos hos cancercellerna. Därmed

visade de att KAT2A är en potentiell måltavla vid läkemedelsbehandling (Tzelepis et al.,

2016).

En annan strategi, för att hitta möjliga måltavlor för läkemedel, med CRISPR-Cas9 screening

är att försöka förstå hur läkemedel verkar utifrån konceptet synthethic lethality. Det innebär

att en kombination av genuttryck från olika gener exempelvis kan leda till celldöd. Om en

tumörsuppressorgen stängs av eller en onkogen aktiveras i en cell kan mutationer i andra

gener leda till att den cancercellen dör (Zhan et al., 2019; Nijman, 2011). Steinhart et al.

(2017) identifierade, med hjälp av CRISPR-Cas9 screening, gener som var involverade i

bukspottkörtel- och tjocktarmscancer. Cellerna bar på en mutation i genen RNF43, som kodar

för proteiner som reglerar uttrycket av FZD-gener och deras receptorer. Receptorerna bidrar

till att aktivera en form av cellsignalering som triggar cellproliferering och dämpas i normala

fall av RNF43. Mutationer i genen leder således till ett högt uttryck av FZD-gener. Steinhart

et al. upptäckte dock att cancercellerna med mutationer i RNF43 var känsliga för knockout av

en specifik FZD-gen, FZD5. Med antikroppar visade de sedan hur inbindning till FZD5-

receptorn slog ut genen och cellerna (Steinhart et al., 2017; Zhan et al, 2019).

CRISPR-Cas9 screening används även för att undersöka hur cancerceller svarar på olika

mediciner. Genom att kombinera screening med läkemedel kan man identifiera gener som har

förlorat sin funktion och som leder till resistens mot läkemedlet i fråga (Zhan et al., 2019).

Shalem et al. (2014) påvisade i en studie att fler gener relaterade till hudcancer, än man

tidigare hade trott, bidrog till resistens mot ett läkemedel avsedd för sjukdomen (Shalem et

al., 2014; Sala et al., 2008). Med hjälp av CRISPR-Cas9 genomfördes knockout av de gener

som man sedan tidigare misstänkte var inblandade i resistensprocessen. Vid exponering för

läkemedlet dog de flesta celler. Vidare studier på de resistenta cellerna ledde till upptäckten

om att andra gener, utöver de man hade slagit ut från början, inaktiverades (Shalem et al.,

2014).

5.2.2 Cancermodeller

Sjukdomsmodeller används för att skapa en djupare förståelse för sjukdomars utveckling och

samtidigt testa potentiella behandlingar. En sjukdomsmodell är antingen djur eller celler som




21

uttrycker alla eller några av de patogena processerna som observeras hos sjukdomen i fråga.

(Nature, hämtad 2020-04-22).

Traditionellt sett har det varit svårt att konstruera tumörmodeller från cancerceller eftersom

cancertumörer orsakas av många mutationer i flera olika gener. Med hjälp av CRISPR-Cas9

har man dock lyckats ta fram tillförlitliga tumörmodeller för att kunna studera tumörens

utveckling och mekanismer, tack vare systemets förmåga att framkalla mutationer i flera olika

gener samtidigt (fig 8) (Jiang, et. al. 2020).

I en studie av Platt et al. (2014) visades hur de med hjälp av CRISPR-Cas9 framkallade

mutationer som ledde till tumörer hos möss. Mutationerna framkallades i gener som är

associerade med en form av lungcancer hos människor: proto-onkogenen Kras och de två

tumörsuppressorgenerna p53 och Lkb1. Dessa tre gener är de som muterar oftast i den typen

av lungcancer. Mössen utvecklade sedan patologiska förändringar likande dem hos människor

med den formen av cancer som man sedan studerade (Platt, et. al. 2014). Tack vare CRISPR-

Cas9 kan sjukdomsmodeller över cancer tas fram snabbt, effektivt och billigt (Tian, 2019).

Figur 8: Identifiering av fenotypförändringar och exempel på sjukdomsmodellering med CRISPR/Cas9 screening.

Plasmider med sgRNA:s levereras till Cas9-uttryckande celler. Gener genomgår knockout, där återstående muterade

celler överförs till musen via transplantation. Cellerna förökar sig och sprider sig vilket går att analysera och

slutligen identifiera vilka gener som är involverade i cancerutvecklingen. Från CRISPR/Cas9 for cancer research

and therapy. Zhan, T., Rindtorff, N., Betge, J., Ebert, M. P., & Boutros, M. (2019, April). In Seminars in cancer

biology (Vol. 55, pp. 106-119).Academic Press. Använd och översatt med tillåtelse från författare.




22

5.2.3 CRISPR-Cas9 i immunoterapin

De senaste åren har immunoterapi kommit att ses som en lovande strategi inom

cancerbehandling (Xia, et. al. 2019). Behandlingen verkar genom att förstärka det egna

immunförsvaret för att bekämpa cancer (Palucka, 2012). En metod av immunterapi som har

visat sig ha positiv effekt vid behandling av cancer är en form av T-cells terapi. Metoden

bygger på att T-celler från patienten tas ut och modifieras för att öka dess effektivitet och

specificitet vid identifiering och eliminering av tumörer, innan de återförs in i patienten (Xia,

et. al. 2019). CRISPR-Cas9 har visat sig vara effektivt i samband med produktion av

modifierade T-celler men också vid knockouts av gener som kodar för programmed cell death

protein 1 (PD-1), ett protein som reglerar T-cellernas försvar mot tumörer (Jiang, et. al. 2020;

Xia, et. al. 2019).

5.2.3.1 CAR-T-celler

Chimeric antigen receptors (CARs) är antigenreceptorer som riktar T-cellers specificitet och

bekämpande aktivitet mot ett bestämt tumörassocierat antigen (TAA). När CAR:s binder in

till TAA aktiveras T-celler som börjar bekämpa och slutligen eliminerar cancercellerna

(Abreu, et. al., 2019).

Idag är den vanligaste metoden för att framställa CAR-T-celler (chimeric antigen receptor T

cells) att modifiera patientens egna T-celler, så kallade autologa CAR-T-celler (fig 9).

Tillverkningen av dessa celler är tidskrävande och dyr, dessutom har det visat sig vara svårt

att erhålla T-celler av god kvalité från en del patienter. Begränsningarna har gjort att man har

börjat se över allogeniska CAR-T-celler istället; där T-celler tas från friska donatorer för

modifiering. Dock måste dessa modifieras ytterligare för att undvika komplikationer som kan

uppstå mellan värden och transplantatet och resulterar i att värdens eget immunförsvar stöter

bort de allogeniska CAR-T-cellerna (Xia, et. al., 2019). CRISPR-Cas9 kan användas för att

utföra dessa modifieringar genom att slå ut generna som ger upphov till komplikationerna.

CRISPR-Cas9 kan också användas för att slå ut vissa receptorer som, vid inbindning till sina

ligander, framkallar apoptos hos T-celler och leder till att CAR-T-celler förlorar sin funktion

(Ren, et. al., 2017).




23

Figur 9: Immunoterapi med CAR-T celler. 1) T-celler hämtas från patienten eller en donator. 2) Antigen receptorer

inkorporeras i T-cellerna (gul romb). 3) CAR:s (orange kors) uttrycks på ytan av T-cellerna och bildar därmed CAR-T-

celler. 4-5) CAR-T cellens population växer ex vivo innan de överförs till patienten. Från Reyasingh56 / CC BY-SA

(https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0), hämtad 2020-05-04

5.2.3.2 PD-1 knockout

PD-1 är en inhiberande receptor, som återfinns på cellytan av aktiva T-celler, vars uppgift är

att förhindra överreaktion av immunförsvaret. (Jiang et al., 2020; Tumino et al., 2019) PD-L1

och PD-L2 är två ligander till PD-1 som bland annat uttrycks på ytan av många tumör- eller

antigenpresenterande celler (APCs, eng. antigene-presenting cells). När receptorn och

liganderna binder in till varandra hämmas T-cellernas immunaktivitet, vilket kan leda till att

tumörcellerna undkommer det egna immunförsvaret (Jiang, et., 2020; Kok et al., 2020).

Checkpoint-hämning är en indirekt metod för att eliminera cancerceller. Istället för att

stimulera T-cellers aktivitet för att verka direkt på tumörer, riktas dem mot proteiner som kan

förhindra immunsystemet från att attackera cancerceller, exempelvis PD-1 och PD-L1. Med

hjälp av konstgjorda antikroppar som binder in till PD-1 receptorer, hindras inbindning

mellan receptor och ligand som annars hämmar T-cellernas immunrespons. Metoden har haft

goda resultat hos patienter, men det har också konstaterats att det finns risker. En av dem är

att T-cellerna ska angripa även den friska vävnaden. De flesta vävnader är nämligen beroende

av PD-L1 för att kunna kontrollera att T-cellernas immunrespons inte blir för hög. Detta är

vanligt vid frånvaro av PD1/PD-L1 interaktion eftersom T-cellers proliferering ökar under

dessa omständigheter (Su, et. al. 2016).

I en studie av Su et al. (2016) testades möjligheten att, med hjälp av CRISPR-Cas9, modifiera

T-celler från människor in vitro och inaktivera genen som kodar för PD-1 för att förhindra

interaktion med dess ligand. Modifierade plasmider transfekterades till T-celler från både




24

friska personer och cancersjuka patienter. Knockout av PD1 ledde till att interaktion med dess

ligand hindrades utan att T-cellernas proliferering ökade avsevärt. Försöket, med dess goda

resultat, understryker potentialen av checkpoint-hämning som metod för att förstärka T-

cellernas immunrespons på ett säkert sätt (Su, et. al. 2016).

5.2.4 Kliniska prövningar

Vid tidpunkten för denna litteraturstudie (28 april 2020) fanns åtta studier registrerade på

clinicaltrials (tabell 1) som studerade möjligheterna med CRISPR-Cas9 som behandling mot

någon form av cancer. Clinicaltrials är en amerikansk databas som drivs av National Library

of Medicine och National Institutes of Health, som sammanställer kliniska studier från hela

världen (clinicaltrials, u.å). När det kommer till kliniska prövningar förekommer fyra faser

där läkemedel eller behandling testas utifrån olika parametrar, ju högre fas desto längre har

studien kommit. Alla studierna av de åtta som vi undersökte genomgår fas 1, vilket innebär att

fokus ligger på att bestämma säkerheten hos läkemedlet/behandlingen. Fyra av studierna

genomgår även fas 2 där effektiviteten hos ett läkemedel/behandling mot en specifik sjukdom

utvärderas och jämförs med andra likartade behandlingar.

De studier som finns registrerade involverar immunterapi där någon form av T-cells-

modifiering med CRISPR-Cas9 genomförs. Detta för att erhålla en starkare anti-

tumörrespons, genom att bland annat rikta T-cellerna mot specifika gener eller genprodukter.

Fyra av studierna undersöker möjligheten att öka anti-tumörresponsen hos T-celler genom att

slå ut PD-1 genen, vid behandling av olika former av cancer. De resterande studierna

undersöker CAR-T-cellers möjlighet att rikta in sig på specifika gener, för att på ett mer

effektivt sätt identifiera tumörer och bekämpa dem.

Tabell 1: Sammanställning av kliniska prövningar med CRISPR-Cas9 i cancerbehandling.

Studie Syfte Mål Sjukdom Fas

Study of CRISPR-

Cas9 Mediated PD-

1 and TCR Gene-

knocked Out

Mesothelin-

Utvärdera genomförbarheten

och säkerheten med CRISPR-

Cas9 modifierade CAR-T-

celler där PD-1 och T-cells

receptorer har blivit utslagna.

Framställa CAR-T-

celler.

Mesotelinpositiva

tumörer

1




25

directed CAR-T

Cells in Patients

With Mesothelin

Positive Multiple

Solid Tumors.

NCT03545815

Samt utvärdering av

överlevnadslängden hos CAR-

T-celler som överförs in vivo

till patienter med

mesotelinpositiva tumörer.

(Mesotelin: protein som

utrycks på många tumörers

cellyta)

Study of PD-1

Gene-knocked Out

Mesothelin-

directed CAR-T

Cells With the

Conditioning of PC

in Mesothelin

Positive Multiple

Solid Tumors

NCT03747965




celler där PD-1 har blivit

utslagen. Samt utvärdering av

överlevnadlängden hos CAR-

T-celler som överförs in vivo

till patienter med

mesotelinpositiva tumörer.

Framställa CAR-T-

celler där PD-1 är

utslagen

Mesotelin positiva

tumörer. Framförallt vid

bukspottskörtel-,

gallgång- och

äggstockscancer.

1

A safety and

efficacy study

evaluating CTX110

in subjects with

relapsed or

refractory B-cell

malignancia

NCT04035434

Utvärdera effektiviteten och

säkerheten hos allogeniska T-

celler, CTX110, konstruerade

med CRISPR-Cas9 ex vivo vid

behandling av patienter med en

form av lymfkörtelcancer.

Patienterna har visat återfall

eller gått igenom tidigare

behandlingar som inte har

hjälpt.

Framställa CAR-T-

celler.

Lymkörtelcancer 1 & 2

PD-1 Knockout

Engineered T Cells

for Metastatic Non-

small Cell Lung

Cancer

NCT02793856

Utvärdera säkerheten med

CRISPR-Cas9 modifierade T-

celler där PD-1 har blivit

utslagen vid behandling av

patienter med en form av

lungcancer.

Framställa T-celler

där PD-1 är

utslagen.

Lungcancer 1

A Safety and

Efficacy Study

Utvärdera säkerheten och

effektiviteten med CRISPR-

Framställa CAR-T-

celler

Benmärgscancer 1




26

Evaluating

CTX120 in

Subjects With

Relapsed or

Refractory Multiple

Myeloma

NCT04244656


celler, CTX120, vid behandling

av patienter med

benmärgscancer. Patienterna

har visat återfall eller gått

igenom tidigare behandlingar

som inte har hjälpt.

PD-1 Knockout

EBV-CTLs for

Advanced Stage

Epstein-Barr Virus

(EBV) Associated

Malignancies

NCT03044743

Utvärdering av säkerheten vid

användning av CRISPR-Cas9

modifierade T-celler, EBV-

CTL, där PD-1 har blivit

utslagen vid behandling av

patienter med EBV-positiva

tumörer.

Framställa T-celler

där PD-1 är

utslagen.

Tumörer som påvisar

Epstein-Barr Virus

1&2

A Study Evaluating

UCART019 in

Patients With

Relapsed or

Refractory CD19+

Leukemia and

Lymphoma

NCT03166878

Utvärdering av säkerheten och

effektiviteten, vid användning

av CRISPR-Cas9 modifierade

CAR-T-celler, UCART019, vid

behandling av patienter med en

form av leukemi eller

lymfkörtelcancer. Samt

fastställning av lämplig dos vid

behandling.

Framställa CAR-T-

celler och fastställa

dess lämpliga dos

vid behandling.

Leukemi

Lymfkörtelcancer

1&2

A Feasibility and

Safety Study of

Universal Dual

Specificity CD19

and CD20 or CD22

CAR-T Cell

Immunotherapy for

Relapsed or

Refractory

Leukemia and

Lymphoma

NCT03398967



Cas9 modifierade T-celler med

dubbel specificitet vid

behandling av patienter med

leukemi eller lymfkörtelcancer.

Patienterna har visat återfall

eller gått igenom tidigare

behandlingar som inte har

hjälpt.

Framställa CAR-T-

celler.

Leukemi

Lymfkörtelcancer

1&2




27

6. Pedagogisk tillämpning

6.1 Styrdokument

Biologiundervisningen på gymnasiet ska bland annat syfta till att utveckla elevernas kunskap

kring de begrepp, teorier, modeller och arbetsmetoder som rör ämnet. Undervisningen ska

även utveckla elevens egen förståelse kring biologins betydelse i samhället. Vidare ska

undervisningen bidra till elevers möjligheter att kunna delta i samhällsdebatten och diskutera

etiska frågor och ställningstagande utifrån ett naturvetenskapligt perspektiv (Skolverket, u.å).

Biologi 1 och 2 samt bioteknik är de kurser inom biologi på gymnasiet som lyfter och

behandlar den genteknik och dess tillämpningsområden som vårt arbete bygger på. I det

centrala innehållet för biologi 1 och 2 ingår bland annat genetikens respektive

molekylärbiologins användningsområden, möjligheter och risker, samt etiska frågor som

uppkommer i samband med ämnet. Ett av kunskapskraven i kurserna är att eleven ska

diskutera frågor som rör biologins betydelse för individ och samhälle.

Bioteknikkursen lyfter fram gentekniken ytterligare och behandlar gentekniska verktyg och

metoder, samt deras användning inom industri, jordbruk, medicin och forskning. Kursen tar

även upp risker och möjligheter med genmodifiering ur ett etiskt och ett samhällsperspektiv

(Skolverket, u.å).

I styrdokumenten är det tydligt att den etiska aspekten av gentekniken och dess

tillämpningsområden har en central roll i biologiundervisningen. Dessa frågor är viktiga att

diskutera anser vi, men för att diskussionen ska vara givande krävs att eleven har

grundläggande kunskap kring området. CRISPR-Cas9 är ett genetiskt verktyg som är högst

aktuellt inom gentekniken men som även väcker många etiska frågor som vi tror kan öppna

upp för diskussion i klassrummet (Brokowski & Adli, 2019).

År 2018 rapporterade Världshälsoorganisationen att cancer är den näst största dödsorsaken

globalt där ca 70 % av alla dödsfall sker i låg- och medelinkomstländer (WHO, 2018). Detta

gör, enligt oss, cancer till ett relevant hälsoproblem värt att diskutera och fördjupa sig i ur

flera olika perspektiv. Biologiska och ekonomiska för att nämna några. Att koppla samman

CRISPR-Cas9 med cancer i biologiundervisningen sätter därmed flera kunskapskrav på prov

och öppnar även upp för ämnesöverskridande samarbete.




28

6.2 CRISPR-Cas9 & etik

I och med upptäckten av CRISPR-Cas9 och dess mångsidighet när det kommer till

genredigering uppkommer många nya möjligheter inom gentekniken, men även många nya

etiska frågor som kräver ställningstagande (Brokowski & Adli. 2019). I en intervju med

Jennifer Doudna, en av skaparna till genredigeringsverktyget CRISPR-Cas9, påpekar hon

vikten av att tänka på vilka möjligheter som denna kraftfulla teknologi ger upphov till och hur

vi kan förvalta dem på ett ansvarsfullt sätt (Kuchler, 2020, 31 januari). I slutet av 2019

dömdes en kinesisk forskare till fängelse för att ha genredigerat mänskliga embryon med

hjälp av CRISPR-Cas9. Forskaren bröt mot flera internationella riktlinjer och etiska principer

när det kommer till genredigering, vilket ledde till att han fördömdes i princip av hela den

internationella forskningskåren (Johnston, 2020; Li et al., 2019). Hans agerande kan ha varit

ett resultat av bristfällande kunskap i bioetik (Yarborough, 2019; Johnston, 2020).

Yarborough skriver i sin artikel (2019) om betydelsen av etikundervisning när det kommer till

genteknik. Han menar att ansvarslös användning av gentekniska metoder, som kan medföra

olika risker, kan förhindras genom etikundervisning (Yarborough, 2019).

6.2.1 Etik i biologiundervisningen

Ett av huvudmålen med undervisning är att elever utvecklar kritiskt tänkande och

beslutsfattande färdigheter. Genom att introducera olika former av dilemman i NO-

undervisningen ges elever möjlighet att öva på dessa förmågor (Gutierez, 2014; Araújo,

2017). Dessa dilemman kan sägas vara kontroversiella samhällsfrågor med naturvetenskaplig

förankring som involverar moral och etik och kan leda till debatt (Sadler & Zeidler, 2005).

Frågorna kan vara av bioetisk karaktär och kan användas för att skapa ett intresse och

utveckla socialt ansvarstagande bland elever (Araújo, 2017; Gutierez, 2014). Genom

kooperativt lärande i form av argumentation om de olika dilemman exempelvis, kan elever

lära sig att interagera med varandra, bli bättre på att resonera och ta beslut utifrån fakta och

värderingar. På så sätt måste de fördjupa sig i teoretisk bakgrund såväl som att försöka förstå

motpartens perspektiv och väga in etiska principer (Gutierez, 2014).

Införandet av aktiviteter av detta slag kan vara en utmaning för många lärare i och med

tidsbrist och att det skiljer sig från den traditionellt sett dominerande NO-undervisningen där

stor fokus läggs på laborationer (Araújo, 2017; Gutierez, 2014). Samtidigt finns en generell




29

uppfattning om att bioetik bör undervisas till gymnasieelever (Araújo, 2017), vilket också

framgår i de svenska styrdokumenten (Skolverket, u.å). Dessutom är det nödvändigt för NO-

lärare att främja konstruktiva samtal mellan elever för att de ska kunna identifiera styrkor och

svagheter i naturvetenskapliga argument (Gutierez, 2014). Konkreta exempel på aktiviteter av

dessa bioetiska former kan vara fallstudier, debatter och work-shops/seminarium som bygger

på etiska dilemman (Gutierez, 2014).

6.3 Laborera med CRISPR-Cas9

Den praktiska delen av biologi utgör en stor del av undervisningen enligt styrdokumenten.

Undervisningen ska göra eleverna bekanta med naturvetenskapliga arbetssätt såsom att

planera och utföra experiment (Skolverket, u.å). Laborationer kan ge elever ett annat

perspektiv på naturvetenskap samt väcka intresse och nyfikenhet. Genom att utföra praktiska

övningar i form av laborationer med CRISPR-Cas9 kan det underlätta för elever att förstå

dess funktion men också vilka möjligheter och risker som det medför (Ziegler & Nellen.

2019).

Eftersom CRISPR-Cas tekniken är en billig metod som är lätt att använda, blir det möjligt för

elever att utforska tekniken redan under gymnasiet. Dahlberg och Carmona ger två exempel

på hur elever på gymnasiet kan arbeta med CRISPR-Cas tekniken. Det ena exemplet bygger

på att låta eleverna själva planera strategier för att konstruera gRNA:s som kan klyva en

plasmid vid en specifik sekvens. Det andra exemplet är att låta elever använda sig utav

kommersiella CRISPR-kit för att klyva en viss gen (Dahlberg & Carmona, 2018).

Ziegler och Nellen har konstruerat en CRISPR-Cas9 laboration som lämpar sig åt elever på

gymnasiet. Laborationen är enkel och billig att bedriva. Den är uppdelad i två delar där den

första delen går ut på att, med hjälp av CRISPR-Cas9, omvandla blå E.coli bakterier till vita

genom att slå ut genen lacZ. I den andra delen av laborationen kontrolleras knockout av genen

med PCR (Polymerase Chain Reaction) (Ziegler & Nellen. 2019). Läraren kan själv välja om

hen vill utföra båda momenten eller endast det första för att demonstrera förmågan att

genredigera med CRISPR-Cas9.




30

7. Slutsats

CRISPR-Cas9 är ett relativt nytt genredigeringsverktyg som under de senaste åren haft stora

framgångar inom cancerforskningen. Tekniken har gjort det lättare för forskare att undersöka

tumörbiologi och få en djupare förståelse för cancerutvecklingen. Förmågan hos CRISPR-

Cas9 att redigera flera gener samtidigt med hjälp av flexibla sgRNA:s, har effektiviserat

framtagningen av nya läkemedel och behandlingsmetoder. Med hjälp av komplexet är det

möjligt att slå ut specifika gener, vilket leder till att de förlorar sin funktion. Muterade gener

kan också återställas genom klyvning av sekvensen och därefter reparation via HDR. Inom

immunoterapin har CRISPR-Cas9 visat sig vara användbar vid skapandet av modifierade T-

celler som kan bekämpa tumörer mer effektivt. Flera kliniska studier pågår för att avgöra

säkerheten och effektiviteten hos CRISPR-Cas9 i samband med behandling av människor in

vivo. Många av studierna beräknas vara klara i år och det ska bli spännande att se vad nästa

steg blir inom cancerforskningen med CRISPR-Cas9.

Eftersom CRISPR-Cas9 har revolutionerat gentekniken och har en stor utbredning inom

många tillämpningsområden anser vi att ämnet bör behandlas i biologiundervisningen. Trots

komplexiteten bakom tekniken, finns det utrymme för intressanta diskussioner om dess

eventuella konsekvenser som utmanar etik och moral. Det framgår tydligt i skolans

styrdokument att biologiundervisningen ska beröra etiska frågor, vilket öppnar upp

möjligheterna att diskutera CRISPR-Cas9 utifrån olika dilemman och perspektiv.

Genomförande av laborationer med CRISPR-Cas9 tror vi kan väcka nyfikenhet bland

eleverna och ge de något att förankra sin kunskap i för att lättare ta till sig den. I och med att

tekniken är billig och lätthanterlig så tror vi att det är genomförbart i skolan. Dess

tillgänglighet belyser även den eventuella problematiken som det kan leda till, att vem som

helst i princip skulle kunna utföra experiment med CRISPR-Cas9.

CRISPR-Cas9 är ett mäktigt verktyg i många avseenden. Dess upptäckt har öppnat upp för

nya möjligheter inom gentekniken. En av dem är nya strategier för att behandla sjukdomar,

som exempelvis cancer. Vi får dock inte glömma att genredigering i sig kan väcka kritiska

och etiska frågor, framförallt i andra sammanhang. Med denna form av makt följer ansvar och

professionalitet, vilket man uppnår genom kunskap och konsekvenstänkande. Med andra ord

är det vår plikt som lärare att se till att framtida samhällsmedborgare och forskare har rätt

grund att stå på när stora, och förhoppningsvis goda, beslut ska tas.




31

8. Referenser

Abreu, T., Fonseca, N. A., Gonçalves, N., & Moreira, J. N. (2019). Current challenges and

emerging opportunities of CAR-T cell therapies. Journal of Controlled Release.

Amitai, G., & Sorek, R. (2016). CRISPR–Cas adaptation: insights into the mechanism of

action. Nature Reviews Microbiology, 14(2), 67.

Araújo, J., Gomes, C. C., Jácomo, A., & Pereira, S. M. (2017). Teaching bioethics in high

schools. Health Education Journal, 76(4), 507-513.

Baba, A. I., & Cătoi, C. (2007). Comparative oncology. Bucharest: Publishing House of the

Romanian Academy.

Baranwal, D. K., Singh, P., Singh, R. K., & Shekhar, S. GENE KNOCKOUT

TECHNOLOGY AND ITS APPLICATION. BIOLOGIX, 55.

Barrangou, R., Fremaux, C., Deveau, H., Richards, M., Boyaval, P., Moineau, S., ... &

Horvath, P. (2007). CRISPR provides acquired resistance against viruses in

prokaryotes. Science, 315(5819), 1709–1712.

Ben-David, U., Beroukhim, R., & Golub, T. R. (2019). Genomic evolution of cancer models:

perils and opportunities. Nature Reviews Cancer, 19(2), 97–109.

BENZ Jr, E. J. (2017). The Jeremiah Metzger lecture cancer in the twenty-first century: an

inside view from an outsider. Transactions of the American Clinical and Climatological

Association, 128, 275.

Bolotin, A., Quinquis, B., Sorokin, A., & Ehrlich, S. D. (2005). Clustered regularly

interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal

origin. Microbiology, 151(8), 2551–2561.

Brokowski, C., & Adli, M. (2019). CRISPR ethics: moral considerations for applications of a

powerful tool. Journal of molecular biology, 431(1), 88-101.




32

Cancerfonden (2020) Forskningens betydelse -statistik. Cancerfonden: stockholm.

[https://www.cancerfonden.se/forskning] Hämtad 2020-04-03

Chae, Y. K., Anker, J. F., Carneiro, B. A., Chandra, S., Kaplan, J., Kalyan, A., ... & Giles, F.

J. (2016). Genomic landscape of DNA repair genes in cancer. Oncotarget, 7(17), 23312.

Chakraborty, S., & Rahman, T. (2012). The difficulties in cancer

treatment. ecancermedicalscience, 6.

Chang, H., Yi, B., Ma, R., Zhang, X., Zhao, H., & Xi, Y. (2016). CRISPR/cas9, a novel

genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo. Scientific reports, 6(1), 1-12

Charpentier, E. (2015). CRISPR‐Cas9: how research on a bacterial RNA‐guided mechanism

opened new perspectives in biotechnology and biomedicine. EMBO molecular medicine, 7(4),

363–365.

Clinicaltrials. (u.å). Hämtad 2020-04-28 från

https://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=CRISPR-

cas9&cond=Cancer&Search=Apply&recrs=b&recrs=a&recrs=d&age_v=&gndr=&type=&rsl

t=

Croce, C. M. (2008). Oncogenes and cancer. New England journal of medicine, 358(5), 502–

511.

Dahlberg, L., & Groat Carmona, A. M. (2018). CRISPR-Cas technology in and out of the

classroom. The CRISPR journal, 1(2), 107-114.

Dai, W., Xu, X., Wang, D., Wu, J., & Wang, J. (2019). Cancer therapy with a CRISPR-

assisted telomerase-activating gene expression system. Oncogene, 38(21), 4110–4124.

Deltcheva, E., Chylinski, K., Sharma, C. M., Gonzales, K., Chao, Y., Pirzada, Z. A., ... &

Charpentier, E. (2011). CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host

factor RNase III. Nature, 471(7340), 602–607.




33

Garneau, J. E., Dupuis, M. È., Villion, M., Romero, D. A., Barrangou, R., Boyaval, P., ... &

Moineau, S. (2010). The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and

plasmid DNA. Nature, 468(7320), 67–71.

Gasiunas, G., Sinkunas, T., & Siksnys, V. (2014). Molecular mechanisms of CRISPR-

mediated microbial immunity. Cellular and Molecular Life Sciences, 71(3), 449–465.

Gori, J. L., Hsu, P. D., Maeder, M. L., Shen, S., Welstead, G. G., & Bumcrot, D. (2015).

Delivery and specificity of CRISPR/Cas9 genome editing technologies for human gene

therapy. Human gene therapy, 26(7), 443-451.

Gutierez, S. B. (2015). Integrating Socio-Scientific Issues to Enhance the Bioethical

Decision-Making Skills of High School Students. International Education Studies, 8(1), 142-

151.

Haft, D. H., Selengut, J., Mongodin, E. F., & Nelson, K. E. (2005). A guild of 45 CRISPR-

associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic

genomes. PLoS computational biology, 1(6).

Han, H. (2018). RNA interference to knock down gene expression. In Disease Gene

Identification (pp. 293-302). Humana Press, New York, NY.

Hassanpour, S. H., & Dehghani, M. (2017). Review of cancer from perspective of

molecular. Journal of Cancer Research and Practice, 4(4), 127–129.

Hille, F., & Charpentier, E. (2016). CRISPR-Cas: biology, mechanisms and

relevance. Philosophical transactions of the royal society B: biological sciences, 371(1707),

20150496.

Horvath, P., Romero, D. A., Coûté-Monvoisin, A. C., Richards, M., Deveau, H., Moineau, S.,

... & Barrangou, R. (2008). Diversity, activity, and evolution of CRISPR loci in Streptococcus

thermophilus. Journal of bacteriology, 190(4), 1401–1412.

Hyndman, I. J. (2016). the Contribution of both Nature and Nurture to Carcinogenesis and

Progression in Solid Tumours. Cancer Microenvironment, 9(1), 63–69.




34

IARC – International Agency For Research On Cancer (2019). Latest global cancer data:

Cancer burden rises to 18.1 million new cases and 9.6 million cancer deaths in 2018. WHO –

World Health Organization: France

Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., & Nakata, A. (1987). Nucleotide

sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in

Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of bacteriology, 169(12),

5429–5433.

Jansen, R., Embden, J. D. V., Gaastra, W., & Schouls, L. M. (2002). Identification of genes

that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular microbiology, 43(6), 1565–

1575.

Jiang, C., Meng, L., Yang, B., & Luo, X. (2020). Application of CRISPR/Cas9 gene editing

technique in the study of cancer treatment. Clinical genetics, 97(1), 73-88.

Jiang, F., & Doudna, J. A. (2017). CRISPR–Cas9 structures and mechanisms. Annual review

of biophysics, 46, 505–529.

Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., & Charpentier, E. (2012). A

programmable dual-RNA–guided DNA endonuclease in adaptive bacterial

immunity. science, 337(6096), 816–821.

Jinek, M., Jiang, F., Taylor, D. W., Sternberg, S. H., Kaya, E., Ma, E., ... & Kaplan, M.

(2014). Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational

activation. Science, 343(6176), 1247997.

Johnston, J. (2020). Budgets versus Bans: How US Law Restricts Germline Gene

Editing. Hastings Center Report, 50(2), 4-5.

Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D.,

... & Zhang, F. (2017). Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation

screening. Nature protocols, 12(4), 828.




35

Knott, G. J., & Doudna, J. A. (2018). CRISPR-Cas guides the future of genetic

engineering. Science, 361(6405), 866–869.

Kok, V. C. (2020). Current Understanding of the Mechanisms Underlying Immune Evasion

From PD-1/PD-L1 Immune Checkpoint Blockade in Head and Neck Cancer. Frontiers in

Oncology, 10, 268.

Koo, T., Yoon, A. R., Cho, H. Y., Bae, S., Yun, C. O., & Kim, J. S. (2017). Selective

disruption of an oncogenic mutant allele by CRISPR/Cas9 induces efficient tumor

regression. Nucleic acids research, 45(13), 7897-7908.

Koonin, E. V., Makarova, K. S., & Zhang, F. (2017). Diversity, classification and evolution of

CRISPR-Cas systems. Current opinion in microbiology, 37, 67–78.

Kuchler, H. (2020, 31 januari). Jennifer Doudna, Crispr scientist, on the ethics of editing

humans. Financial Times. Hämtad från https://www.ft.com/content/6d063e48-4359-11ea-

abea-0c7a29cd66fe

Li, J. R., Walker, S., Nie, J. B., & Zhang, X. Q. (2019). Experiments that led to the first gene-

edited babies: the ethical failings and the urgent need for better governance. Journal of

Zhejiang University-SCIENCE B, 20(1), 32-38.

Luzzatto, L. (2011). Erratum to: Somatic mutations in cancer development. Environmental

health, 10(S1), S16.

Mojica, F. J., Díez‐Villaseñor, C., Soria, E., & Juez, G. (2000). Biological significance of a

family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and

mitochondria. Molecular microbiology, 36(1), 244–246.

Najera, V. A., Twyman, R. M., Christou, P., & Zhu, C. (2019). Applications of multiplex

genome editing in higher plants. Current opinion in biotechnology, 59, 93-102.

https://www.ft.com/content/6d063e48-4359-11ea-abea-0c7a29cd66fe

https://www.ft.com/content/6d063e48-4359-11ea-abea-0c7a29cd66fe




36

Nature (2020). Disease model. Hämtad 2020-04-22 från

https://www.nature.com/subjects/disease-model

Nijman, S. M. (2011). Synthetic lethality: general principles, utility and detection using

genetic screens in human cells. FEBS letters, 585(1), 1-6.

Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., & Kojiro, M. (2006). Angiogenesis in

cancer. Vascular health and risk management, 2(3), 213

Palucka, K., & Banchereau, J. (2012). Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nature

Reviews Cancer, 12(4), 265-277.

Peng, Y., & Croce, C. M. (2016). The role of MicroRNAs in human cancer. Signal

transduction and targeted therapy, 1(1), 1-9.

Petrova, Y. I., Schecterson, L., & Gumbiner, B. M. (2016). Roles for E-cadherin cell surface

regulation in cancer. Molecular biology of the cell, 27(21), 3233-3244.

Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., ... & Graham, D. B.

(2014). CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell, 159(2),

440-455.

Ren, J., Zhang, X., Liu, X., Fang, C., Jiang, S., June, C. H., & Zhao, Y. (2017) . A versatile

system for rapid multiplex genome-edited CAR T cell generation. Oncotarget, 8(10), 17002.

Sadler, T. D., & Zeidler, D. L. (2005). Patterns of informal reasoning in the context of

socioscientific decision making. Journal of Research in Science Teaching: The Official

Journal of the National Association for Research in Science Teaching, 42(1), 112-138.

Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., & Yamamoto, T. (2014). Multiplex

genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Scientific

reports, 4(1), 1-6.

https://www.nature.com/subjects/disease-model




37

Sala, E., Mologni, L., Truffa, S., Gaetano, C., Bollag, G. E., & Gambacorti-Passerini, C.

(2008). BRAF silencing by short hairpin RNA or chemical blockade by PLX4032 leads to

different responses in melanoma and thyroid carcinoma cells. Molecular Cancer

Research, 6(5), 751-759.

Sánchez‐León, S., Gil‐Humanes, J., Ozuna, C. V., Giménez, M. J., Sousa, C., Voytas, D. F.,

& Barro, F. (2018). Low‐gluten, nontransgenic wheat engineered with CRISPR/Cas9. Plant

biotechnology journal, 16(4), 902–910.

Sanjana, N. E. (2017). Genome-scale CRISPR pooled screens. Analytical biochemistry, 532,

95-99.

Schneeberger, K. (2014). Using next-generation sequencing to isolate mutant genes from

forward genetic screens. Nature Reviews Genetics, 15(10), 662-676.

Seyfried, T. N., & Huysentruyt, L. C. (2013). On the origin of cancer metastasis. Critical

reviews in oncogenesis, 18(1–2), 43.

Shalem, O., Sanjana, N. E., Hartenian, E., Shi, X., Scott, D. A., Mikkelsen, T. S., ... & Zhang,

F. (2014). Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human

cells. Science, 343(6166), 84-87.

Sherr, C. J. (2004). Principles of tumor suppression. Cell, 116(2), 235–246.

Siddiqui, I. A., Sanna, V., Ahmad, N., Sechi, M., & Mukhtar, H. (2015). Resveratrol

nanoformulation for cancer prevention and therapy. Ann. NY Acad. Sci, 1348(1), 20–31.

Siegel, R., Naishadham, D., & Jemal, A. (2012). CA Cancer. Cancer Statistics.

Skolverket (u.å). Ämne-biologi. från

https://www.skolverket.se/undervisning/gymnasieskolan/laroplan-program-och-amnen-i-

gymnasieskolan/gymnasieprogrammen/amne?url=1530314731%2Fsyllabuscw%2Fjsp%2Fsu




38

bject.htm%3FsubjectCode%3DBIO%26tos%3Dgy&sv.url=12.5dfee44715d35a5cdfa92a3

Hämtad 2020-05-05

Sporn, M. B., & Suh, N. (2002). Chemoprevention: an essential approach to controlling

cancer. Nature Reviews Cancer, 2(7), 537–543.

Stratton, M. R., Campbell, P. J., & Futreal, P. A. (2009). The cancer genome. Nature,

458(7239), 719–724.

Steinhart, Z., Pavlovic, Z., Chandrashekhar, M., Hart, T., Wang, X., Zhang, X., ... & Boj, S.

F. (2017). Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt–FZD5 signaling circuit as a druggable

vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature medicine, 23(1), 60.

Su, S., Hu, B., Shao, J., Shen, B., Du, J., Du, Y., ... & Sha, H. (2016). CRISPR-Cas9 mediated

efficient PD-1 disruption on human primary T cells from cancer patients. Scientific reports, 6,

20070.

Tian, X., Gu, T., Patel, S., Bode, A. M., Lee, M. H., & Dong, Z. (2019). CRISPR/Cas9–An

evolving biological tool kit for cancer biology and oncology. NPJ precision oncology, 3(1), 1-

8.

Tumino, N., Martini, S., Munari, E., Scordamaglia, F., Besi, F., Mariotti, F. R., ... & Moretta,

L. (2019). Presence of innate lymphoid cells in pleural effusions of primary and metastatic

Tzelepis, K., Koike-Yusa, H., De Braekeleer, E., Li, Y., Metzakopian, E., Dovey, O. M., ... &

Gozdecka, M. (2016). A CRISPR dropout screen identifies genetic vulnerabilities and

therapeutic targets in acute myeloid leukemia. Cell reports, 17(4), 1193-1205.

Valletta, S., Dolatshad, H., Bartenstein, M., Yip, B. H., Bello, E., Gordon, S., ... & Schuh, A.

(2015). ASXL1 mutation correction by CRISPR/Cas9 restores gene function in leukemia cells

and increases survival in mouse xenografts. Oncotarget, 6(42), 44061.




39

Veigl, M. L., Kasturi, L., Olechnowicz, J., Ma, A., Lutterbaugh, J. D., Periyasamy, S., ... &

Markowitz, S. D. (1998). Biallelic inactivation of hMLH1 by epigenetic gene silencing, a

novel mechanism causing human MSI cancers. Proceedings of the National Academy of

Sciences, 95(15), 8698–8702.

Wang, G., Zhao, N., Berkhout, B., & Das, A. T. (2018). CRISPR-Cas based antiviral

strategies against HIV-1. Virus research, 244, 321–332.

Wang, H., Yang, H., Shivalila, C. S., Dawlaty, M. M., Cheng, A. W., Zhang, F., & Jaenisch,

R. (2013). One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-

mediated genome engineering. Cell, 153(4), 910-918.

Westra, E. R., Swarts, D. C., Staals, R. H., Jore, M. M., Brouns, S. J., & van der Oost, J.

(2012). The CRISPRs, they are a-changin': how prokaryotes generate adaptive

immunity. Annual review of genetics, 46, 311–339.

WHO-world health organization (2018). Cancer- key facts. Från https://www.who.int/news-

room/fact-sheets/detail/cancer Hämtad 2020-05-06.

Willis, R. E. (2016). Targeted cancer therapy: vital oncogenes and a new molecular genetic

paradigm for cancer initiation progression and treatment. International journal of molecular

sciences, 17(9), 1552.

Wong, R. S. (2011). Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of

Experimental & Clinical Cancer Research, 30(1), 87.

Wu, H. Y., & Cao, C. Y. (2019). The application of CRISPR-Cas9 genome editing tool in

cancer immunotherapy. Briefings in functional genomics, 18(2), 129-132.

Xia, A. L., He, Q. F., Wang, J. C., Zhu, J., Sha, Y. Q., Sun, B., & Lu, X. J. (2019).

Applications and advances of CRISPR-Cas9 in cancer immunotherapy. Journal of medical

genetics, 56(1), 4–9.




40

Yarborough, M. (2019). Twentieth-century science education and 21st-century genetic

engineering technologies: A toxic mix. Accountability in research, 26(4), 271-275.

Yi, C., & He, C. (2013). DNA repair by reversal of DNA damage. Cold Spring Harbor

perspectives in biology, 5(1), a012575.

Yin, K., Gao, C., & Qiu, J. L. (2017). Progress and prospects in plant genome editing. Nature

plants, 3(8), 1–6.

Yosef, I., Goren, M. G., & Qimron, U. (2012). Proteins and DNA elements essential for the

CRISPR adaptation process in Escherichia coli. Nucleic acids research, 40(12), 5569–5576.

Zhan, T., Rindtorff, N., Betge, J., Ebert, M. P., & Boutros, M. (2019, April). CRISPR/Cas9

for cancer research and therapy. In Seminars in cancer biology (Vol. 55, pp. 106–119).

Academic Press.

Ziegler, H., & Nellen, W. (2019). CRISPR-Cas experiments for schools and the public.

Methods.

Zindl, C. L., & Chaplin, D. D. (2010). Tumor immune evasion. Science, 328(5979), 697–698.

Zuo, Z., & Liu, J. (2016). Cas9-catalyzed DNA cleavage generates staggered ends: evidence

from molecular dynamics simulations. Scientific reports, 6, 37584.

Zuo, Z., & Liu, J. (2017). Structure and dynamics of Cas9 HNH domain catalytic

state. Scientific reports, 7(1), 1–13.

Date post:	03-Mar-2021
Category:	Documents
Upload:	others
View:	1 times
Download:	0 times

Metoder och tillämpningar av CRISPR-Cas9 i...

Documents