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13-3-2004 Supplemento ordinario alla GAZZETTA UFFICIALE Serie generale - n. 61

Metodi I . 1.

DETERMINAZIONE DELLA BIOMASSA MICROBICA DE PER FUMIGAZIONE

l. Oggetto Il presente documento ilssa i metodi per la dctcrrnina~ionc della bio suolo.

Rletodo I,1.1.

Fumigazione con cloroformio

l. Principio I ti2elodi che prevedono la furiiiga2iotic del icrrcno c rmio si basano sul ratto che i vapori dcl lii~nigarite provocarto la lisi, quindi la le celliilc microbichc con il c o ~ i ~ e g ~ l c n l ~ rilascio di tnaterialc ci~oplasmatico.

2 Reattivi 2.1. CloroSorrnio per erotnutogralla, ci06 stabil con atniler-ic (2-atliino-butcnc); 2.2. grasso al s i l ico~~c; 2.3. carta bibula.

3. Apparecchiatura 3.1. Camera termostatabilc; 3.2. cappa chirilica aspirante; 3.3. pulilpn I i itdr~lc da ~ucrtv, 3.4. apparecchiatura per la sii a capacita di casnpo; 3.5. cssiccatore da vuolci; 3.6. bcakcrs in vctm da 3.7. palline anticbollizio

4. Procedimento )*mio .rf~?l~iliz.,-alo CL'»@ ef~zt~»l(>

na cappa aspirante ben fun~lonantc ed avere 2 bottiglie Pircx con rnducorio 500 mL di CHCl, i11 una bottiglia c ci aggiiingono 25

ntraio (96%). Si tappa e agita energicamente per 2-3 minuti; si vcrsa in un ndc per qualche sccondo la separazione dclla fase CHCII

l'acido soliOrico; quindi si \essa i l CHCI$ t~cll'altra bottiglia c si scarta l'acido

nuovo. si ripctc 3 volle i l lavaggio dcl cloroformio. Dopo o s ~ l ~ o r i c o ~ si trasfcriscc i l CHC'l? in utl bcakcr di vctro da 2 litri

e si aggiunge clrca 1 Iiiro di acqua di rubinctto; quindi SI nlcscola bcnc con una bacchetta di vetro, si allcndc la separa~ioric dcllc Sasi c si scarta l'acqua. Si ripete 3-4 volte cambiando ogs~i


valla l'acqua. Quindi si distilla il CHC13 così lavalo, avendo cura che la temperatura non superi tnai i 66°C. Iniinc si raccoglie i l distillato in bottiglia di vclro scura, si aggiungono I O g di K2rT): anirfro e ci cnnqerva in rrigo A qiicqln piiriln i l C'HC'I: piih csscrc iisatri pcr a rc i l terreno se appare perfcttar~ienic limpido.

4.2. fi~nr-miorre La fiiriiiga~ione con cloroforn~io consiste nel niantcr~crc i l campione di suo1 di cloroforniio per 20-24 ore. al buio cd a 2sDC'. Si introduce i t1 un am beahcr di vciro con 30-40 i: di ogni carnpionc di siiolo fresco aggiiislalo al di r i len~io~lc idrica. No11 ciccorre siglare dirctlarneiitc i beakcr cori pcnnarclli poichc il CHCI; scioglie la scrittura, ma piuttosto è bene inirndurrc in ogni bcakcr un pcir~ctto di carta bibula siglato a matita. Pnggiarc quindi Lutti i bcakcr cori i suoli sulla porcellana forata dcll'cssiecatore (circa 30 cm di dianiclrtl), sul cisi Sondo sia messo iin beakcr canlctlcnte circa 50 nlL di CHCl; pcr crc?rnatogralia, cioC sl con 2-amino-bulcrre e qualche pallina at~ticbolliziot~c. Si pub anchc u t i l i ~ ~ a r c cloro ~ a t o con ctanola, purchC l'alcool venga previarriet~ic eliminato. Sul rondo i dcll'cssiccatorc è bene sistemare ar-iche qualche striscia di carta bibula imbc qua in modo da evitare I'abbassatnenio dell'iirnidiia dei suoli durante la l i l r , Quindi a~ioriarc la pompa rotarilc da vuoto per creare un'atniosfera di CHC'I; all'i Iicssiccatorc. Una volta che si forniar~o niitiicrose bollicir~c nel CHC'13, si lascia e la pompa ancora per un minuto. Quindi, chiuso l'essiccalor~., si incuba per 20-74 uiu e a 25°C. Dopo talc lasso di tempo i l CIICl; deve essere con~pletamcntc r ai pori del terreno. Per qucsto occorre aprire l'essiccatorc, rin~uoverc il hcakcr con i 1 miga~ionc C stata condotta bene i l livello del CHCI; dopo le 24 ore si è not bassato), riporre i suoli fumigati dentro l'essiccalore; quindi, sempre con la oto, si eSSettuano 8 successive evacua~ioni di 2 minliti ciascuna, intercalale da reimmissioni di aria per 30 secondi. I l clorofTorrmio deve essere prcviam rificato dalle sostanze stabili~ranti (di solito etanoln) con cui le diii orio sul mercato. poichC divcrsamcntc i risultati vengo110 largamcnle sovras~iinati

Metodo 1.1.2.

Determinazione del bonio della biomassa mici-obica (E,, ) col metodo Funiiga

Nel metodo dclla Incubazione (FI). i residui dcllc ccllulc uccisc dal cloroformio a C'@ c NH&-. durante un'incubairionc di 10 giorni a 25'C. dai

fissuti alla Sumiga~ioile od inoculati iicl tcucno dopo l'cliinina~ionc del controllo si ilsa i l tcrrcno non Sunligalo con dclcrmiiia~ionc di COI c NHJ-

alle stessc condizioni sopra riportatc, I l limitc maggiore di cl crinlrollci c dcl rclrilivo pcriodo d'incuba~iritic. Non 6 pcissibile,

plicare i l rnetodo FI ncl caso di terreni acidi, sorttrncrsi o di rcccntc antrncndati o. La dimctisionc del Ililsso di cfecomposi~ionc puo csscrc messa

uto i t i carbonio della biorriassa del suolo allyni~io dclla

Bc = I;; /Kc


dovc Bc 6 i l coriicnutn di carbonio dclla bioti-iassa nsicrobica in pg C suolo secco, Fc è la quantiti di C prodotta conlc C.'O7 durarstc l'incubazione d quantità dcrivai~ic dal suolo non iiimigato (coritrclllo) e iiicubaio alle stesse con precedente, Kc. (in genere è uguale a 0,45) k la li-azione di carbonio provcni biomassa uccisa che vicne mincralizzata a 102 durantc I'incubairionc in condizio

2. Reattivi 2.1. Soluziotze di iizdicatorc acido-basc: sciogliere 1 00 m

elanolo allfXO%; 2.2. soluzione di bario eloruro 0,75 N: introdurre O 1,61 g

1000 niL. sciogliere con circa 701) mL di H 2 0 dcionizz rc a volumi: con acqiia;

2.3. soluzione di idrossido di sodio 1N: diliiire una soliiici a contcncntc I mole di NaOH fino a 1000 mL con acqua deionixxata;

2.4. soluzion~ iitolante di acido cloridrico 0,1 N: diluire un c voliitnctrica contenente 0,l moli di HCI litm a 1000 mL con acqua dcionizxata.

3. Apparecchiatura 3.1. Camera termnstatabilc; 3.2. ti tnlatore aiitomatico (se possibile}; 3.3. liasche di vetro ermetiche di circa 1000 mL 3.4. buretia a cariea~ner-ito autoina~ico (divisior-ic 3.5. bcakers da 250 tiiL, ancorettc n~agt~ctichc. p tavolo clcvatorc.

4. Proeedimento Sia i l bcaker contenente i l suolo Fumigaio che quello con i l suolo di controllo vengono messi singolarmcnic in fiaschc da l000 n1L a ermetica. assieme a 2 bcakcrs più piccol~, uno

l u ~ i o n e che assorbirà la COI) c l'altro di vetro con 4 mL di acqua (per impedir ascamcnlo di umidita durante l'incuba~ionc). Si chiudono luttc le fiaschc c si in una camcra tcrn~crstata a 25OC. Inoltrc si incubano arichc 2 fiaschc c h ~ neri conlc pmva i n bianco). Eisc s~rvirrinnci a valutari; la

oda durante 16 varie fasi della titola~ionc. Dopo

si aggiungono 8 ~ I L di BaC l2.2Hz0 0,75N nei bcakcrs contenenti la su lorma un precipitato lattiginoso di BaC'O;); quindi sl tappano

n ogni fasc dclla dctcrmina~ionc, non rcspirarc i si procede alla titolazione della soda rcsldua con HC1 O, I N . Sc

aulomalieo, i1 pH di Iìne titolaxionc C 8,UL. Allrimcntl sl devono cll'indicatore acido-base (dopo l'aggiunta dcll'indicalorc, la solu~ione

re rosa ed il punio di viraggio ir dato dalla sconlparsa del colore rosa,

dei risultati d u ~ i o n c di COL G stata cvidcn~iata pcrr assorbimcrnto s u NaOII sceondo la

CO1 + 2011- ==2 coi '- + //?O dclla C02 vicne così calcolaia:

v g l'O?-C g-' suolo umido = (b-a} . O . I . h . IOCIO/pcso suolo umido (g),


dove: b 6 il volume (mL) di HCl 0 , lN usato per tilolare i l bianco; a i l volurt~c (rnL) di HCL O.1N per titolare le prove rn l qiinlri; [) , l 1s rinrrrislili del liinlarile; h i l pcw rrli~ivalcntr dcl (peso atonlico diviso i l numcro di ossidrili con cui rcagiscc la CC)?); 1000 il coiiversiot~i: da rng a lig. Il contenuto in carbonio della biomassa rnicr preceden~a (Br = Fc / l+}. Naturaln~cnte occorrc considcrarc la quantiti di s

h. \,te Il probletna nzaggiore del tnctodo FI C la scelta tulta la C02 cvoliita dal suolo Eiiniigalo duranle I' ri~icrotlrganisn~i lisati dal CHC'Il: una aliquota basale (degradadione di substrati orgaiiici cxtraccllulari). 11 melodo FI per la misilra di Bc non 6 applicab 111 sommersi e a quelli che abbiano ricevuto d~ recente un substrato or c o n d i ~ i o n ~ r~iolto spesso la C02 prodotta dal con risulta csscrc supcrlorc yuatltitativame~ztc rispetto alla CO: prodotta dal artdo così origine a \alari di Bc negativi. Si coiisiglia, prima dclla liiinigaxioiic già ambiente i suoli pcr 7 giorni in presenza di alcali (Na dcrihante dalla respiraLione di frammenii di ra caso cii suoli calcarci.

Determinazione dellbzcito della biomassa rnicrobica (B,) col metado Fumigazione-Incu bazione (F

1. Principio 11 nirtnrin c i basa sijlla minrrali ne ad amin ammnniaralc dcllc fnrnic nrpnichc afn fa fc

lisate dal cloroformio, ad opera dei microrganisr-rri . Si pub quindi dctct-ininarc il

Dove: Fu C il Ilusso ad di N amrnot-iiacalc prodotto durante I'incuba~ionc chc scgiic la

1110; E;y C la Era~ione di N contctluto nella bioniassa irccisa chc ttn Ic particolari condi~ioni di incubazione usate. Quindi, Fu risulta N minera l i~~a to dal siiolo liimigato e ineubato c l'N minera l i~~a to dal

c stcssc coridi~ioni.

ossido (MgO). Scaldare circa 200 g di MgO "pesante" in fornace a 600-700°C RaiT?cddare i l prodolto in un cssiccaiorc coiltenentc granuli di KOH e

rarlo in una boiiiglia bctl tappata; cstraetiic (potassio clonrro I N). Introdurrc 74.56 g di KC'I in un pallone da 1 L,

sciogliere cori circa 7C1C1 mL di acqua dcionizrata c portare a volurrtc con acqua;


2.3. solu~ionc di acido horico-indicaiore. Scioglicrc 20 g dl H3B02 puro in circa 700 mL di acqua calda, lrusl'crirc la solu~ionc rallicddala in iin pallone da 10110 mL già contenente

200 IL di clanolo e 211 n1L di una mi verde bromncrcsolo e 0, 165 g di rosso (a questo punto la soluziotie appare rosa). aggiungere NaOH 0,05 N fino a colore verde pallido. Quindi portare a volurnc con acqua d c i o n i ~ ~ a t a (Kec 1082);

2.4. soluzionc titolanic di acido solforico 0.005 N. Preparare diluendo soluzionc volumclrica contenente 0.005 niol i di H2S04.

3. Apparecchiatura 3.1. Agilatore a scuolitnerilo liriearc alternalo; 3.2. distillatorc riiicro-Kjcldahl; 3.3. ti tolatore autoniatico (se possibile); 3.3. spcltroSotometro (se possibile); 3.5. conlcnilori di plastica da 250 rnL cor1 t 3.6. imbuti, filtri di caria Whatnlan 42 e co

4. Procedimenta I canzpiotli di suolo. sia Sumigati che non, ed incu 11 giorni a 2S°C, u t i l i ~ ~ a t i per la dctcrriiina~ione di Bc (la COI prodotta durante l ' i

suoli yuir~di non sono stati distrutti). vcn media e a tctnperat~ira arnbierilc) con una s ( n L ) l :4. I1 suo10 (30 g), Sumigato e non, vien c trattato con 120 mL di KC'I I N . quindi estra~iorlc lc sospensioni di si~olo vengono filtrate per m c ~ m di imbuti contcncnti dischi di caria W h a t m a ~ ~ 42, cd il liltra to in contenitori tappabili di plastica. 11 cotltcriulo in a ~ o t o amm il trato piib csserc dctcrtt~inato mcdiantc diversi rilc~odi. 1 ) disiillaziotic dell'cstrait rrentc di vaporc. in prcscn~a di MgO, con un apparato micro-Kjel dahl e succ istillazionc c titolaziotic; 2) con una dcllc r c a ~ ~ o n i coloritnetriche tipiche dcll'ant ndolbnolo, Ncsslcr, cec.).

S. Espressione dei risultat i n ogni suolo. tuniigato c tion, vicne calcolato corni: segue:

g-' suolo umido = V . 0,005 14 1000ib

V E i l z,olurnc ( ~ n usato per la ti tola~ionc, 0,005 & la norrilalita dcl titolantc, I 4 il Iàltorc di conversione da rng a pg, b i gramrni di sudo

al volumc di estratto in basc al rapporto di cstrazionc iisato. Cosi, sc di estratto. in base al rapporto di cstraziot~c l :4 &:mi-), b sarà ugualc a

r a l i~~a~ ic>r ie dell'uoto dopo hmiga~irinc, FN. sarà uguale alla dirfcfcrcn~a tra bilc prcscriic ne l tiirnigato dopo 10 giorni d'incubazioric mcno i l corrispcttivo

non fumigato (controllo). Assumendo KV = 0.54. ne conscguc la rcla~ione: B,\ =I; v /O, 54

ti dcvono csscrc riportati a g' suolo sccco.


Metodo I,1.4.

Determinazione di BR. e BC col metodo Fumigazione-Estra~ime (FE)

1. Principio I1 n~ctodo dclla futiiigaliionc-cstraliim si bas seguito alla lisi cellulare, it~doita dalla Tumiga~ionc, possono csscrc estratti salina. Si 6 accertato che esiste una str rnisurato col mctodo FI (Ec) c il contcnilto di C cstratto cori KLS04 0.5 secondo l'eyua~ione:

B( = ?,O4 E(

dove. E( è la dif7fcrcn~a Tra il C organico csiraiio dal siinlo fiimiga Ilo cstratto dal suolo non fun~igato (controllo). Inollre C stata osservala una eorrela~iot~e lincarc cativa tra l ' a~oto totale cslral1c-i con una solu~iorie salina, dopo lun~ iga~ ionc con valutalo sccondo il inctodo FI. Da qucsla correla~ione si t potuta ricavare la relaliio

ciovc BY 6 il co~~lcriuto in N della biomassa t ea; EV C I 'uoto totalc cstratlo con KlSOf 0.5 M dal suolo fumigaio tiieno quello estra olo non rirtiiigato (controllo); 2 2 2 C un fiillorc di proporliionalità cmpiricanicntc dctcrtiiinato c basaio su una stitna di Bu ottcnuta ponendo Ky uguale a 0,57. Assum invece, un balorc di KY di O,h8 il Cattorc di propor~iorialita divcr-ita 1.85.

2. Reattivi 2.1. Soluliione estraente (dipot to Il,:, M). Introdurrc 8 i. 13 g di KzSU4 in un pallone

da 1001) mL, sciogliere c a 700 mL di acqua dcionililiata c portare a volurnc con

2.2. acido solforico al ,29 M. Ititrodurrc 4,63 g di CuSOd in un pallone da 100 mL,

L di acqua deionililiata c portare a v o l u t ~ ~ c cot~ acqua, i NaOH a scaglie in un bcakcr di plastica da 1000

rea 700 mL di acyua dcionili~ata (porre il beakcr i11 acqua Iiedita per ne) C portare a volcirnc con acqua:

borico-indicaiore. Prcpararc comc i n 1.3.3.3. 05 N. Prcpararc comc in 1.3.3.3;

to di potassio 0.3 N. Scioglicrc 19,613 g di K2Cr207 (cssiccato a 105°C) in 200 o con acqua. C'otlscrvarc a tcmpcratura ari-ibientc;

olo i. molto stabile;


2.10. soluzionc titolante di sale di Mohr 3 3 2 mN. In un pallonc da 1000 mL introdisrrc

13.06 g di F C ( N H ~ ) ~ S O ~ + ~ H ~ O e 50 tnL di HZS04 9690; dopo che i l salc i: sciolto, portare a volutne con acqua dcionizzata. A causa della Icr-ita ossidazioi-ic dello ioric Ièrrosa lale soluzione deve essere titolata al tnornento dell'uso con dicromato;

2.1 I . soluzionc indicatore rcdox (compl 1,485 g di I ,IO-fcnanlrolina motloidr deionizzaia.

3- Apparecchiatiira 3.1. Agilalore a scuotimcnto lineare alternato; 3.2. litolatorc automatico (se possibile); 3.3. bagi~oi~~ar ia coi1 agitazioric; 3.4. distillatorc n~icro-Kicldahl; 3.5. contenitori di plasiica da 250 mL, pall

palline anlicbollizionc di vctro; 3.6. imbuti. filtri di carta Whatman 42 e contenitori da 100 m

4. Procedimento I campioni di suolo, Sumigati c non, preparali metodo FI, non devono essere incubati nla irnmcdiatan~cntc estraili con K2S03 l ,4 ~ G I 30 I I I ~ I I U L ~ a L G [ I I ~ J G I G L U [ ~ ~ I I I ~ J ~ G [ I I L GLI a Whalman 42. Gli cstraiti tosi ottenuti p organico, N totale e di allri clementi. Da not e anche col mctodo FE ti consigliato di portclrc i suoli al SO%i dcllct ~ilpitcitii di ritcn

Per determinare i l conicnuio i n N assa microbica occorrc analizzare i l contenuto in N totalc dcgli estratti. Operando nic? 20 niL di cstratto vcngono introdotti in tubi da digcstionc da 75 bile mantenere tali tubi ncll'idonco supporto metallico per evilart: un risc disomogeneo durante la successiva Sasc di digestione);

HzS04 al 96%, 0,s mL di CuS04 0,29 M c qualchc pallina antiebollizi di i tubi vcngonn IrasScriti, tramitc supporlo

uminicì e, al finc di eliminare l'eccesso di acqua, condurre due pre-diges na di 2 ore a 120°C c l'altra di un'ora a 1XOoC'. Quindi si opera

per 7; ore. I l tlunlcro c la durala dcllc prc-digcstioni pui, variarc in funzioric del Imcntc durante la digcstionc a caldo, i tubi

irarionc per la condcrisa~iorie dei Cumi acidi. Se re aiitomatieo, si ciigcriscc anche un bianco che dil*Ccrisec dai campioni

un volunic uguale di soluzione cstracntc (20 niL iia la digcsiionc7 si lascia rat'l-rcddarc. si aggiungono ad ogni tubo 15 niL di

rtex pcr staccare l'eventuale sedimento minerale c (75 rnL) con acqua deiorii~zala. Si tappano i

arafilm c si miscela energicatiicntc. Quindi, con un apparato ri-iicro-Kjcldahl riiL contctluti in ogni tubo, aggiungendo 8 rnL

I) N. Naluralrncntc., per noil làr volatilizzarct NH,, la soda deve essere aggiunta attraverso l'imbuto raccoglitore dopo che i l pallone di distillaxionc C stato bcn avvitato. Per li


accorgimenti durante la disiilla~ionc. la raccolia del disiillaio c la iitola~ionc, scguirc la procedura adottala col metodo FI per la dclcrmina~ione dcll'azoto amnioniacalc. Al solito, disponendo di un litolatort: automatico, i l punlo di Iine titola~ionc sari il pH del1 raccolia del disiillato del bianco (di solito circa 5-4).

4.2. Espr.tissione dei risr(/fcrfi

I l contenuto in N totale estrailo da ogni suolo, prinia e dopo rurnigaxionc, sarà

pg N g-' suolo umido = V - 0,005 . l4 . 3 .1000/5

dovc: V i. i l volumc (in rriL) di H 2 S 0 4 usalo pcr In titolazior~c. 0.005 la norm 1 titolantc, 14 il peso cquivalcnte dell'azoto~ 3 rapporta i 25 rriL distillati ai 7-5 1 tubo da digestione, 1000 converle i mg a pg c 5 sono i gramrni di suolo umido eorr* enti a 20 mL di cstratlo usali per la digestione, iti base al rapporto di cstrazionc usato I l flusso addiziorialc di N toialc cstraibilc indotto dalla aziotic, Ex, i: uguale alla differenza in pg N g-' suolo ira suolo tumigato c non (co

AI iinc di siirnarc i l conicnuto in C della biornass ica occorrc dctcrrninarc i l contenuto in C orgailico degli cstrlilli di suolo, sia Iùtni non Surtiigato. Talc dctcrrnina~ionc si effettua per ussida~ione in antbicntè acido a introdilcotto 8 mL di cslralto, 2 mL di K7Cr2O7 0,4 N, 71) rng di HgO (evita la t‘orm I composti in grado di intcrrcrirc col tipo di delcmina~iune), l0 mL H7SO4 al 96Oh e 11'85%) in palloncini da 100 mL. Si prepara anchc un bianco che invccc dcll'cstratto di suolo conticnc la solu~ionc cstracntc (8 ~ T L

agtiola c si tiiantcngono i palloni a 160°C per 30 one. Dopo raflreddamcnto si potqa a volumc con

acqua deiot l i~~ata , si agita Ilrich ione dibenla omogenea, c si tilola i l dicromato che lc di Mohr) 33,3 rnN in an~bicntc acido, iisairdo

conle indicaiorc redou il com antrolina-FcSO? 25 mM. Più prccisanicntc, in un 100 t i~L di ogni pallotic, 50 tnL di H2SQ1 al 3% c

2-3 gocce di i~ldieali~rc. ione si aggiunge goccia a goccia il titolantc. 11 punto di line lilola~ionc al tiraggio dclla soluzione da aranciune a rosa-rosso (bastano poche goccc affinchC 1 la di titola~ionc. dopo aver raggiunto una colorarrione incolorc-

icnc ossidato dal dicromaio secondo la rca~ionc

i l rtlnicniiin in f r~rganietì cli ogni esiratio si r ica~a dalla scgiicnte rcla/ionc+

pg C'& . s z , d o u'l~ido = (h - a) (1,11333 - 3 . 4 . 10(10/2


dovc; b G i l volume di litolanlc (mL) necessario a tilolare i l bianco; a i l volume di tilolante (mL) usato per il campione; 0,0333 la normalità del sale di Milhr; 3 i l rappnrla i 25 mL lilolati ai l00 iotali nel pallone; 1000 convcric i m suolo corrispondenli a 8 mL di estratto, in base al rapporto di cstraz I1 flusso addizionale di C organico totale cstraibile causalo dalla tumigazionc alla dilTesenza in pg C g-' suolo tra suolo lbmigalo e non (controllo).

4.5. Defenninazione dei' contenufo di zoitb delicr biomassa microbi F ~ t m igazio 17e-Estruzione (FE) E' possibile csirarrc i crin~posti organici dcllo zolfo dal tcrrcno, fu O? 1 M o C'aC'l? 10 mM ncl rapporto suolo (g)/estracntc (mL} 1 :5.

4.6. E,spressione &i risz/lruli 11 valore di Bs può essere stimato, se si usa i l NaHC'O? cstracntc, dalla scgucnrc rcla~ione:

Bs = FS /Ks

dove Bs sono i pg di S della biomassa g-' suolo, pg di S totale estratti dal suo[o fumigato snitratti di quelli esfratii dal suolo non fu controllo) G Kc, C la propor~ione di S-biomassa aggiunto, rilasciato con la Sumiga~io ratto. Usando conle cstracntc il CaCll. i l valore di KS C: 0,412. Analogamcnte alla determinazione di Bc c contenuio di Bs si riduce alla valuta~ionc del flusso addizionale di S iotalc c dalla fumigazinnc.

4.7. D~rc~nnr/rirzro,lt3 &I fi)sfi.wo co ,teliC~ IJ~CIPP~C~..I'.YCI m i r r o h ~ c i ~ L 01 t~tetodo i;iirnigir,-iur~r-Est~~~z~o~~t~ ((;il)

Anehc in qiiesto ne del terreno liitnigato c non. Si dctcrn~ina quindi i l flusso addizior~alc (Fp) di Tosfr, tlico (P, ) causalo dalla fum1ga;rionc con CHCIl per 24 orc. I l valore al suolo runiigato sottralto dcl P, rilasciato dal suolo non fhmig Si psedispongon ammi di suolo; si liitniga la prima coppia per 24 orc a 25OC, e si i t~c obicanlcntc a 25'C per 24 ore. la seconda c tcrm coppia. Quindi estrarre le priitiie 200 rnL di NaHC'O? 0,s M (pH 8,5) i: la t e r ~ a con 200 mL della stess onc addizioilata di 250 pg di P,.

4.8. Esj?f+~r\~lo/rc~ Il eotlienuio in P a ~ a dalla relarionc:

pg P, g' suolo estratti dal suolo rion iùrnigato, b i pg P, g-l suolo estratti dal L (seconda c prima coppia di suoli, rispcttihamenlc), C sono i pg P, g- suolo

i e r ~ a coppia di suoli. P, di ngi-ii cstiaitn di sunln puri c s s ~ t c dc~c~tninato ~~iloi i incti icain~ntc ~ O P O

aggiunla di an~milnio tnolibdato c acido asct>rbico.


DETERMINAZIONE DELL'ATP ESTRATTO CON ACIDO FOSFORICO

1. Oggetto Il presente docrrmento fissa un mtodo per la determinazione dell' ATP estratto dal

2. Principio Il coritcnuto di ATP fadcnusinn 5'-trifosfatu) ncl suolo può della biomassa microbica o come indice della attività microl? di suolo fresco viene analizzato siibiro dopo i l prelievo, i1 indice del1 'attivita microbica. Se invece il carnpior~e di s u d o giorni a 25'C ad umidità costante prima di essere analizzato, il c o di ATP rappresenta i l contenuto di biomassa microl~ica.

3. Reattivi 3 1 . Estraente: SoIuzione A (Es A) - 0.67 , 20I4 (in volume) DhlISO,

0.02% (in peso) adenosina, 20 rnh4 EDTA (sale uzione B (Es B) - Differisce dalla soluzior-ie A poiche viene aggiu TP (ir-i quar-itita tale da raggiungere un conteniito di 5-1 0 12g nella cuvet surazione deII'ATP) come "spike" (standard interno).

3 2 Tampone Tris 0 2 M, ERTA 4rnM ed ac 15 mhlI potTatoapH 10 2 - 108 con NaOH I M; i l pH finale del tampor-ie k di soluziorie estraente impiegata per la cfetertnina~inne dell' di pH delIa solrrzione irnpiegata nel lurninometro oscillare tra 7 3 e 7 8.

3 3. Si stetna enzimarico lucifenna/Iuciferasi (Monitor Reagent, BioOrbit, Turku Finland) 3 4. ATP standard interno (ATP Standard, BioOrbit, Turku Finland)

4. Apparecchiatura 4.1. Lurninometro e cuvette; 4.2. beakers (50 mL); 4.3. sistema di agitazione a 4.4. ultrasonicatore con assirna di 20 KHz; 4.5. bagno di ghiaccio.

ngono setacciati irnmediatamente dopo i1 prelievo e pesati ( 1 -2 g) nei asgiunge I'estraente (1 : 20, rapporto suolo: estraente) ed i l mi scuglio

o su agitatore magnetico e sonicato per 2.5 minuti al 60% della frequenza dalla sonda di medio Tornato di un sonicatore. Il beaker durante tali

no di ghiaccio. Dopo averlo chiuso con parafilm, il beaker, uolo, viene posto in bagno a 4'C ed agitato a 150 colpi min.' per

filtrata su filtro a pieghe (Whatman 42). L'estratto (da 0.0 1 8 mL con tarnpone Tic-EDTA-Mg acetato sino ad avere un pH rocedirnenro viene seguito impiegando lo stesso suolo ma con Ia

soluzione estraente B per quantificare l'efficienza di estrazione.


5 2. I)t"tt"~~i~~i~mazre dei/ 'A IY Una aliquota ( O 2 mL) dr Monitor Reagent viene agsiunta aII'estratto tamponato ( O 8 mL), fresco o consewato a -IS0C, in una provetta di polietilene e quindi i l tutto 1 agitato. Si consiglia di effettuare la lettura su tre ripetizioni per ciascun estratto ta suolo e la luce emessa da ogni campione viene misurata per mezzo di un Lumino1 (LKB-WALLAC, Finland) con leffure intesrate, da tre a sei, (pe"do di i secondi) Dopo ciascuna determinazione si agslunge alla stessa provetta una ATP (p es 50 7 ng) quale standard interno per correggere I'infiu sull'ernissione di luce

6, Espressione dei risultati Il contenuto di ATP del terreno viene prima cluantificato attrav cedimento dello srandard interno e poi, considerando l'efficienza di estraz colato secondo quest'ul tirna grandezza Per cui

b - a ATP = " d

e dove: a= valore del bianco (estratto tamporiato), b= valore del campiorle (dopo l'agg~unta deI m C= valore mtsurato dopo I'aggturta dello stand diminuito del valore b); d= quanrita di ATP srandard a&>' YaIunto

) - f A I P c o n b s A ) Eficier~za di estrazione de1l'ATP =

DETERNIINAZIO LLA RESPIRAZIONE DEL SUOLO

a i metodi per la deteminaziorie della respirazione del suolo

one deIIa sviIup~iata dalIa hiomassa mier-ohica del suolo

Durante l'incubazione del suolo alliinterno di rrn sistema chirrso, la C02 evoluta viene intrappoiata da una soluzione di NaOH e successivamente titoIata con HCl.


2, Reattivi 2. l .HZO distillata (C'02-rrcc); 2.2.NaOH 1 N; 2.3.HC'l 0.1 N; 2.4.BaC12 0.75 N; 2.5.indicatorc fcnolftalcina (sol. a l l ' l% i n ctanolo 95% viv) sc non si dispone

aulomatico.

3. Apparecchiatura 3. I . K C C I ~ I G ~ ~ I in vctro con lappo a vttc a ch~usura crmclica da I L; 3.2.lermostato seltato a 25°C'; 3.3.titolatorc automatico c materiale di corredo o burctta in vctr 3.4.beakers in vclro da 50 mL; 3.5.rccipicnti in plastica da 5 0 mL circa.

4, Procedimento Si pesano 20 g di suolo sciaccialo (al 55% WHC) in un bc si posiziona il bcaker sul fondo della liasca. Si pipettano 4 mL di NaOH 1 N ne ientc di plastica che vicne riposto ncll'inlemo dclla Iiasca adiacente al beakcr olo. Si chiude immediatamcntc il tappo a vite c si acccria che la fiasca sia chiusa c

Si preparano 3-5 controlli costituiti dalle liasch G emcticamcntc con all'intemo il rccipientc con 4 mL di NaOH senza i l bcakcr co Si incubano tutte le Ilaschc a 25'C' per un peri sinlo di 3 giorni (un pcriodo piil lungo potrebbe creare una condi~ione di anaerobios

Al Icrrnir~c dell'incilba~ione si aprono le Ilasche, si prclcva il rccipierilc con NaOH, si aggiungono 8 n1L di Ba ~rattro gocce dcll'indicaiorc fcnnlrtalcina, Si titola i l contcriuto del rccipie no al viraggio dal colorc rosa al bianco neutro. Sc si dispone di un tilolature autom posta uri pH di flnc iitolarionc pari a 8.8. InTalli, a questo valore di pH la solubil aCO; equivale a 4,55.10-" valori di pH minori porirrchhcrn a cnliihili//are a p p ~ / ~ & i l i di Ral'C7: c qiiindi ilna parfr dcll'HCI cor~sumato sarebbe da ascrivc

5. Espressione dei risultati La quantità di C-CO? pr calcolata sceondo la scgueritc cqua~ione:

cccssari pcr titolare NaOH del controllo (mcdia di tuiii i controlli) H del campione

quivalcntc del carbonio nella C'O-. E-6 se i risultati vengono csprcssi in termini di risultati vci~gorio csprcssi i11 tcrmiili di COI (ad €5. mg di


Metodo II.i.2,

Determinazione della respirazione del suolo nel SAPROMAT

1. Principio Questa stinia è basata sulla misura dell'O? assnrbit sislcma chiuso. L'O? é rilasciato da un sisicma clcitrochin~ico.

2. Procedura L'apparato Sapromat tipo B h o B I ~ . consisic in un conlenentc gli sinitlicnti di riiisura c uti sistcnia di rcgistrariion ti. I 1 sisteri-ia di misura C castiti~ito da un rccipicrilc cilrttcricritc urla sol sistema chc prodilce O? c LIII misuralorc di pressio gomma a forn-iare un circuito chiuso per cui i cambia atmosEcrica al di fuori del sistema non intlucnzano le misurc di assor L'assorbimento di 0 2 durante la respirazione del suolo cau diminu~ionc di pressione indicalo da un misuralore che regola la prc?duzione v i sua l i~ ra~ ione c la registraliione dei risultati.

3. Espressione dei risultati I,'assorbimcnto di 0 2 viene visilrili~~atn si11 displ i 0 2 .

4, Yote Si cor~siglia di usarc 50-100 g di suolo incii pcraturc che vanno da 20°C a 30°C C al 55% ciella WHC (Capacità di rilcn~ioric i ssorbimeilto di O, non viene rcgislralo ncllc prime 2 ore al fine di consenti I l rapporto C0~4.22 dclla fase gassosa i l campiorle di suolo dcvc ritilancrc costante per tutto i l periodo di ~nisura~ionc. In q do t cngoito evitate le eortdi~ioili di anacrobiosi.

Stima della res ne del suolo con l'apparato WfESTHOFF

1. Principio I l nietodo si dcicrmit~azione della C 0 2 con l'analizzatorc WmsthofE Ultragas 3.

nto ~pioni sono riempiti con suolo urnido c sctacciato (1ClOg al 5504 della WHC) e

'C' (Andcrsot~ atld Dotiisch 197Xb). Ad intervalli di 1 ora victic insuftlata aria iiraverso i l suolo e la conccntraziot~c di COr vicnc niisurata per 10 minuti.


3. Espressione dei risultati L'anal i~~aiore di gas Ultragas 3 misura variazioni di conducibilila causate dalla reaLione della C'02 ciin la solu~icint: acquosa di NaO all'intcrno dcll 'anali~~aiore. Qucsic variazioni sono proporzionali e si possono registrare i risultati oiicnuii.

4. Yote La versione più moderna dcll'Ultragas US4-C02 C cara t tcr i~~ata da una a pertanto é consigliabile operare a basse concentrazioni di C02. Conccnt inceriori ad 1 ppm di CO1 possono essere làcilmcnte determinate su Ppm'

Metodo I I . 1.4.

Analisi del gas evtlluti dalla bioniassa microb el suolo mediante la tecnica a infrarossi

1- Principio I1 rnetodo si basa sulla stitna automatica della C rso un a n a l i ~ ~ a l o r e di gas inli-arosso (IRGA). I campioni di suolo sono insullla~i eosi c11c problcmi di difllisiorrc c accuri~ulo di C07 possorio esscre evitati.

2. Procedioieritu Un sistema di entrata dcll'aria rcaliz~ato in tubi di PVC (32 n m ) é installato a l2 m da terra ( o comunyilc rii 1 m al di icurare iin apporto continuo di aria pulita esterna c con conccntra~ionc stabile. I1 sistc mato da 24 lincc di campiunamento, indipendenti le une dalle altre. in modo da poter flusso in ciascurla da 100 a 1000 niL miri-'. Ogni circuito contienc una poti~pa per cmbratla. una bottiglia di lavaggio pcr gas da 500 m L con acqua d c i o n i ~ ~ a t ioria da umidilìcatorc c un tiibo (25n4cn-i) di campionan~cnto di persp il campiot-ic di suolo. 11 tubo C chiuso ai lati da cuscinetti di polisiircne c sistcnia da raccordi in gonlma. Valvolc a spillo sono t~lc pcr inipostarc lo stcsso fl i lsso sulla linca dcl campione it~dipcndentc e sia o no diretto all'IRCA.

3. Espressione dei I

Un Ilussimciro m a vclocilà di Ilusso dcl gas e un IRGA vienc usato per misurarc le conccnlra~ioni (Heincmeycr cl al. 1989). L'in~ero sistema 6 eomputc r i~~a to e un tubo

ato comc controllo. I quaniitativi di suolo uiilizzati sono gencralmcnte di H C e lutto i l sisten~a G nlanlenulo a 22°C.

4. SI La l Il'cvolu~ione di C'O1 è assicurata pcr quaniiia di suolo da 5 a I O C I g. Si possono

diverse temperature d'incubazionc. ema risulta ccsprc molto piìi sensibili. dcl Sapromat c gode cii Lina buona

riproducibilila.


Metodi Il,2.

DETERMINAZIONE DEL POTERE MINERALIZZANTE DEL SUOLO

1- Oggetto Talc documenio fissa i metodi per la determinazionc dcl potere mincrali~zante d

Metodo 11.2.1

Metodo di estrazione con accliia bollente

1. Principio Questo riietodo consente I'cstrazionc dcll'azoto prcscntc ti c la sua dctcrniinazionc quanlitativa u l i l i ~ ~ a n d o la proccdura K-ieldahl.

2. Reattivi 2.1 Acido sollòrieo (H,S04) concentrato; 2.2. tniscela di sollàlo di potassio (K-SOj), sollà le (CuSOd) e seletlio CSc) (rapporto

p/p l O; 1 ; 0.1); 2.3. idrnssido di sodio (NaOH) I [IN; 2'4, acido solforicu (H2S04), 0,005N standard; 2.5. sriluzianc indicairice di acido borico. Sci acido borico puro (H?BO7) in

circa 700 mL di la solu~ione rafsreddata in un pallone da I litro conlenente 200 indicalore (ottenuto sciogliendo 0.300 g di vcrdc bromocrcsoln i metile in 500 IL di ctanolo). Dopo aver

a volume aggiungendo Icntan~cntc NaOH 0.05 N zionc c trattandolo con 1 mL di acqua. non si

a rosa a verde pallido.

3. Apparecchiature

3.2. apparccchiaiura K.1

4. Procedimento n un matraccio Erlcnmeycr C trattare con 60 m L di acqua. Collcgarc il cnsatorc Licbig vcrticalc c riscaldare per mantcncrc la miscela acqua-

per 60 minuti. Rallreddarc la misccla, tiltrarla sotto vuoto (carta da filtro cssario, ri fil~rarc per rimuovcrc i l n~atcrialc sospcso,

di a ~ o i o nel filirato con la procedura semimicm Kjcldahl: o con 2 IL di acido sol forici) concentralo G 0.7 g di una misccla di

porto pip 10:l:O.l) in un pallone Kjcldahl da 50 mL u t i l i ~ ~ a t o per la e in corrente di vapore. Riscaldare il pallone in un sislcma di digcstionc micro-

zLa. Dopo la chiarifica~ionc coniinuarc la digcstionc pcr I ora.


Distillare succcssivan~ente i l contenuto del pallone in corrente di vapore con 10 mL di NaOH 10N e raccogliere l'an~monio liberato durante la distilla~ic>ne in un matraccio eontcncnte una solii~ione indicalrice di acido borico. Delerminare lkn~motlio per iitola~ione con acido solrorico 0.005 N.

Metodo II.2.2,

Metodo del permanganato di potassio in ambiente acido

1. Principio I l metodo prevede I'ossida~ione e I'idrolisi dcll 'a~oto organico C di solu~ioni di peimanganato di potassio in antbicntc acido. 11 pcrmanga~~ato acido pcrrneltr: di tstrarrc l ' a~oto dal pool del rganico del siiolo pcr ossidazionc ed idrnlisi.

2. Reattivi 2.1. Solu~ioni di permanganato di potassio (KMn04) 0.0 0.2 N in H ~ S O J 1N; 2.2. acido solforieo (HzSOd) IN.

3. Apparecchiatura 3.1. Apparalo per la disrillarionc in corrcnlc di va

4. Procedimento La procedura di cs t ra~ionc 6 praticamcntc ~q c a q u ~ l l a proposla da Stanford G Smith ma gli estratti ottenuti dopo centrilugazione a seguito della ini~ialc, agita~ionc dei campioni

I N. vengono conscrvaii per l'analisi dcll 'a~oto ammoniacalc. Preparare le solu~iuni es~raenli di p anato acido nel giorno dcll'estra~ionc scioglicndo aliquote di KMn04 in solu~ioni ?SCI4 tali da ollcncrc una normalità finalc di KMnOl

porre 2 g di campiunc di tubi da ccntriluga c tcncrc in agita~ionc con 50 rnL di C . Dopo la ccntrifugzionc a 1000 g analiuarc il

surnatante per la dctcrm ne di N-NH4- mcdiante la distillazionc in corrente di vaporc

in a g i l a ~ i r i n r rnn 50 m1 rli iIna i;ti l i~~ir.inc ar ida di KNlnO* pcr I ora a temperatura successivamcntc centri lugare. A n a l i ~ ~ a r c il sumatantc raccolto

di NH4- come descritto sopra.

Metodo II.2.3,

Met strazione con una soluzione di GaGlz in autoclave

l . P o todo si basa sulla dctcrmina;rionc dell7N-NEI4- [Ormatu quando un campionc di

suolo viene trattato in autoclave a 12 1 "C per 16 ore.


2. Reattivi 2.1. Solu~ione di clor~iro di calcio (CaC12) 0.01 M. Sciogliere 1.5 g di CaC12x2H20 in I Litro

d'acqila; 2.2. soluzionc di clnruro di potassio (KE'I) 3 M . Sciogliere 300 g d 2.3. ossido di magnesio. Riscaldare MgO i n una t i~i lfhla clcilr

RaSlli.eddarc i l prodouo in un disscccatorc coitteiicnte idrossido di potas gocci: e conservare in una bouiglia a tenuta d'aria;

2.4. soluzione indicatricc di acido horico.

3. Apparecchiatura 3.1. Apparalo per la distilla~ioric; 3.2. palloncino da disiillazionc da I50 mL: 3.3. micrnburctia, 5 mL, graduata a intervalli di 0.0 1 mL.

4. Procedimento Porre l O g di suolo i n uti tubo d~ pjrcx d 5 mL di CaCI? 0.0 1 M ed agilarc dclicatari~cnte per mescolare i l con1 glio di alliitninio c porrc il tubo in auioclavc. Poriarc la temperatura a anicnto in auioclavc pcr 16 ore. Laseiarc quindi il tubo a raSSrcddare cratura ambiente c IrasEerirc qtiantitativamcnte la nlisccla suolo-CaC'I? i da 150 rnL. Ltiiso di circa 25 mL di KCI 3 M iàcilita i1 trasrcrinlcnto. crc 0.2-0.3 g di MgO c dctcrri-iinarc l'aminuiilarc di N-NH4 liberato dalla disti rc dopo quattro ininuri. Detcm~inarc i1 conlcniito di arolo ammon ente nel suolo prima dcll'incuba~ione secondo la procedura uiilixxata per I'anal a c calcolare lhaoto disponibile per d i f k r e n ~ a Tra I r~sultati dl q

Metodo 11.2.4,

Metodo biochimico di Br

1. Principio i1 campione di suolo C mes con sabbia di quarm in rapporto 1:3 c la miscela 6 inumidita con acqua ed incubata per due settimane in condizioni che permettano un'adcguaìa acrca~ione del campi za pcrdilc d'acqua. L'ammontare di azoto nitroso, nitrico ed ammoniacalc del c e incubato vicnc poi stimato n~cdianie cstrazionc con KCI 2 N c successiva de tem dcll'a~oto ammoniacale prodotto pcr niczzo di una distilla~ione, in

in prcscnLa di ossido di magnesio e lega di Dcvarda. La quantità di ed an~n~oniacale prcscnic nella misccla suolo-sabbia di quarLo prima

cicrminata con lo sicsso promdimcnio. L'azaio rnincral i~~abilc ncl viene calcolato dalla dill'crenza u a i risultati di queste due analisi,

i Devarda. Preparare qucsio reagente n~acinando una lega di buona qualità (Fisher iIìc C'o., Pittsburgh, o J.T. Bakcr Chemical Co., Phillipsburg, N.Y.) lino a che il to non passi atlravcrso un sctaccio di 100 mcsh e per almeno il 75%) attraverso uno

di 300 mcsh. Conscrvarc la lcga così prodoila in una boitiglia a icnuta d'aria;


2.2. soluzionc indicatricc di acido borico (kcdi 11.2.1 ., 2.5.); 2.3. acido solforico (H2S04) 0.005N standard; 2.4. solu~ione di clorilro di potassio ( KCl) 2N: sciogliere 1 2.5. ossido di niagncsio (MgO) (vcdi lI.2.1.. 2.5.).

3. Apparecchiatura 3.1. Apparalo per la distilla~ionc in eornx-itc di vapore; 3.2. palloni da disiillazionc; 3.3. micrnburciia, 5 niL, graduata a intemalli di 0.01 tiiL.

4. Procedimento Mcsc~larc 10 g di suolo con 30 g di sabbia di quarzo i n un bca trasfcrirc la misccla in una botiiglia a collo largo da 250 mL Distribuire la misccla unilbrmemcnte sul Sondo della bolt paralilm ed incubare a 30°C per 14 giumi. Alla fine aggiungcrc 100 mL di KCl 2 N cd agitare per un'ora. scdin~cntarc c p~pcttarc unkliqquta dcl surnaiantc liquido (circa 20 mL) in un pallnn Dctcminarc i l conlenulu di a ~ o t o nitrosu, nitrico ed ammoniacale nclla misccla suolo-sabbia di quar.co medianle raccolta e t i~oluione dell'ammoniaca liberata dalla distilla~ionc in carrcntc di vapnrc in presenza di MgO c Icga di D Dctcrminarc I'arnrnontarc di azoto nilroso, nitrico cd amn~oniacalc presente nel la suolo-sabbia di quarzo prima dcll'incuba~ione segucndo la stessa metodologi alla misccla incubata e calca[arc I'azolri mincralizzabilc dcl can~pionc di suolo ~crcnza esistcntc fra I risultati dcllc due analisi.

Metodo I I .2,5,

Metodo biochimico di S e Smith

1. Principio IJna miscela di siiolo c s di qiiarm vicnc incubata in condi~ioni idrichc c di lcmpcraiura ollimal i pcr l'attivi16 a. L'azoto minerale Eorriiatci vicnc rirnosso c dctcrminato ad inlcncalli di icmpn per la durata di 311 scttimanc.

atricc di acido bnrico (vcdi 11.2.1 ., 2.5.); (H7S04) 0.005N standard;

c di cloruro di calcio (CaC1:) 0.0 l M; (11.002 M CTaS04w2H20; 0.002 M MgS04; 0.005 RII La(HP04)2xH20


3- Apparecchiatiira 3.1. Tubi da dilavamento da 50 rnL o imbuti buchiicr di porcellana j t3 = 113cm); 3.2. apparato per la dislilla~ionc in corrente di vapore; 3.3. pallori1 da disiilla~ionc; 3.4. microburciia, 5 KIIL, graduata a itiienalli di 0.01 niL.

4. Procedimento 4.1 . hfelodo c*c~/.r fzfhr dt d i I ~ ~ ~ ~ l m c ~ ~ l t f ~

Un campione di 15 g di suolo essiccato all'aria c vagliato a 2 mril vicnc n di qiiarLo in rapporto 1:l cd irtserito irt tubi da dilatarner-ito da 50 m sisletnato un lillro di lana di vciro. Rimuokcre l ' a~o to rliit~crale ini~ialti~cnte pr 100 mL di CaCI? 0.01 M. seguito dalla sornrilinistra~ic7ne d tiva priva di a ~ o t o (0.002 h4 C ~ S O J * ~ H I O ; 0.002 M R4gSO c 0.11025 hl K-SUJ). Allontanare l'acyisa in ccccsso sotto vuo ed iiicilbarc a 35°C. Lo scanibio gassoso attraverso la porzione vamento i: sufficiente a rilantencrc un sisiema aerobicn. Dopo d l 'a~oto ri.iinl:ra[c tnediantc dilavatnerilo cori CaCl? 0.01 M c con la solwioit ciall'applica~ione del viioto eornc dcserit Rin~elterc I tubi ad ir~cubare ed eKet dopo 2, 4, X, 12, 16, 22 c 30 sett~niane). Ktprisl~riarc i1 conteriuli, ottitnale di acqua nel su ni dilavamerito. I1 dilabalo vierie Lrasfèrito in pallorli Kjclda dislil lata. In scguito al l'aggiunla della Icga di (0.5 g) c di NaOH I(1N ( 2 mL). l ' a~oto minerale (NO;, N O ? , NH4-) vlenc determin diantc iiiola~ionc acida cori HzSO4 O.UU3N dopo dislilla~ionc con acido borico.

4.2. lIlPt'fo~fo COI? ~tt?hlffi hu~'ltr?c'r 50 g di suolo vengotio miscelati con sabbia di quarLo c disposti in un imbuto buchner cii porcdlai~a (diametro esterno 1 Iòndo dcl qiialc C stato sistcrnato un filtro di stoflk di acciaio. La rnisccla dcvc fb lo omogeneo cfi uno spessore rion siipcsiorc ai 2 cm. Partii;olare aiicn~ione lorilctria della sabbia di q u a r ~ o chc dmrà csserc

sull'aerca~ione del campione inlluisce in cslracnle di CaC12 C stata sostituita con

c con rnelodi potcn~iometrici date lc notc inlcrfcrcn~c chc lo o esercita in questo tipo di misure. Infinc E stata apportata una

ionc cort la realtà di campo. Liumidilà vieilc

ionc con filtro a pieghe vicnl: dctcrniinato il N- NH4- ed N- NO:- con i metodi più convcnicnti (colorimetrico,


Metodi 11.3.

ATTIVITA AZOTOFISSATRICE;:

l . Oggetto I l presentc docuniento tissa i tiictodi per la dctcrmina;rinnc della attiviti a;r suolo

Determinazione dell%tti\rità azototlssatrice su canipio renco

1. Principio La ricii~~ione dell'acclilcnc (ClH:) ad ctilcne (C2H4) è in t i l i ~ ~ a t a per una stima dcll'altikili nilrogenasica nei sisteti~i naturali. Etitranibi i ti. i ti fatti, possono vcnirc facilmeritc dosati. anche a concentra~ioni molto basse. co c gas-crotnatcigrafiche e la rca~ione è altarnenll: spccillea pereh6 nessun altro siste imaticci C in grado di ridurre l'acclilene.

2. Reattivi

2.3. fonte di gas con f7unn;riot~ di slandard (ve tecniche) sc dcsidcratn; 2,4, sorgcnie di Ar o 11~; 2.5. fonte di 07, 2.6. gas vellorc N7 per analisi con C:

3. Apparecchiatura e o barattoli in vetro con tappo a tenuta;

3.2. sacchi in plastica a bass I sacchetti possono csscrc fermati per n l c u o di lubi con tappo a tenuta o dircttan~cntc saldata alla supcrficic una pallina di siliconc oppure setti dci quali sia possibile

r i l trasferimento dei scdimcnii,

I 'i taglia appropriata per l 'addi~ione di C2HZ o NZ al campione in esame;

c monouTo in plasiica da l mL ed ago con o scnLa valvola in tcflon,

3.16. pcr analisi con "N: occorre uno spcitromctro di massa.


4. Procedimento Trasferire i l campione scelto per l'analisi ncll'opporluno contenitore. Campioni comc p c ~ ~ c t t i di radice possono essere trasSeriti intatti o tagl superficialmentc sierilizzati con appropri cloran~mina T, nitraio di argento}. C' racc attivi (piante o animali) che i l rapporto tr rispetto al peso fresco del campiono (gram cambiamenti rapidi della con~posizionc d campione introdotto puì, essere convcnicntcmcntc determinato dopo 1 contenuto di umidità. PuO essere necessario aggiusiare l'umidità del campione di suolo o fornita un opportuna fase acquosa a parii di piante acquatichc, se azotofissatricc puì, csserc necessario aggiungcrc fo ri t i organi arbonio o azoto conibit~aio. Prima dell'ittcuba~ionc occorre cliiildcrc. i coi~tenitori coi1 ppropriati n saldarc le superfici dei sacchetti di plastica. Occorre stabilire l'atmosfera appropriata dclllC,H~ I'alinusfc?ra del cisterna iion dovr concct~trazioni di O-, i l sistema deve essere satiirato arricchimento dcll'atmosfcra con N?. Quando si con-ipletan~entc dall'attiiosfcra l'N7 e sostit 13er inirodurre C2H? o "N2 ncl sistctna atinuslkra uguale a quèllo del gas che dovrà qtiantiti lale da ottcticrc una prcssintic parzial pub essere necessaria alla satiira~ionc.

15 n~icrorganismi e in particolari tipi di sedimenti), o N7 itl quaniit5 talc da ottcncre una pressione parziale di alriicno 0,4 airn. Introdiirre un gas con liiit~ione di sta ~ c m o , so dcsidcraro (vedi Note), quindi incubare In siftc, o a temperalura cotitrollat boratorio. Condi~iorti di liiecibiiio possono esscre ulilizza~c in base all'obicttivo pr Alla fine dcll'inciibaziotlc cari la fase gassosa ad intervalli di 1er11p0, iitilizzando una siringa (0.1-1,0 n&) per an rornatc>gsal?chc.. La i?cquc~ua di campicrr-iarncntn dipcnde dall'auivitci del cari-ipinnc c condizioni di campionanicnto, anchc se analisi ogni 1-4 orc sono quelle maggior csidcrabili; attivith nicdianicntc basse possono richicderc campinnanlenti nun-iern periodi di tempo piìi lunghi.

Metodo II.3,2.

Determinazione dell'attività azoto "issatriee effettuata su carote

sote di suolo o sedimenti, con o senza piante intatte, ha il vantaggio di limitarc gli agcriii di distiirhn ricpciin alln sti~rlin di parti iqnlatc dal siqicrna riì, ì: vcrn i;ripratfi~ttn pcr campioni racchiusi nei contcn itori di prclcvarncnio.


2. Reattiki 2.1. Una Sonle di C2H2 o di "N- adatta (vc 2.2. una [onte di gas con Sun~ionc di stand

unicanicnte a qucsio scopo; 2.3. sorgerllc di A r o He; 2.4. sorgente di O?.

3. Apparecchiatura 3.1. Trivclle o tubi eilirtdrici in acciaio o altro materiale di a l r ~ ~ c n o

l u n g h e ~ ~ a variabile (usualn~cnlc 15-70 ctn) che possotio avere i bur alcuni cspcriri~cnti puh csscre desidcrabilc chiudere i l h n d o del cili con fogli plastificati 0 metallici saldati c

3.2. catnera di analisi. Dcve esscrc sullicicrilemenic ampia pcr il campiot~c iniaiio, a nel caso di curnpioni con lbttdo crrneticarncntc ve csserc saldata opportunanlcnte alla parte superiore dcl porlacan~pior~c. L pui, csscrc in vetro, in rnerallo rigido a icnura gassosa. o in plastica c deve av to per l'inic;rionc cd il prelievo della Iàse gassosa;

3.3. siringhe di taglia appropriata per l'addi~ionc. di C2H2 al carnpionc in esame; 3.4. siringhe per i l campionamcnto. Le siringhc più

monouso in plastica da l m L munitc di ago con o Ivola in tcflon. Siringhe di vetro con o senm valvolc possono uguulm tuslusc. Sc si ~ I G ~ L I I ~ J . la ricc~ssild di riporlalo ncllc nntc tccnichc,

3.5. poriipa a vuoto elettrica o manuale.

4. Procedimento Quando viene eflettualo il carotaggio, re desiderabilc campionare piantc individuali o

o mcno uniforme. Pcr alcuni sistcrni (p. cs. zone saln~astrc) puO risultare noicvol pratico utilizrarc sczioni orizzontali di suolo piuttosto che i l melodo dcl carotag Si chiude i l campione appon C sul Sondo C la camcra di misuraziunc sul coperchio O

chiudendo l'intera carota eparato. Quindi. si stabilisce l'atmosfcra appropriata pcr l'analisi: si come descritto pcr i campioni isolati dal

andard intcrno. se desiderato (vedi Notc). rollata in laboratorio. Condizioni di lucc/buio

SG all'obic~iivo preposto. assosa ad inlcrvalli di tcn~po con siringa (0-1-

gaseromatograliche. La Ikcqucn~a di campionamento dipende onc c dallc condi~ioni di campionamcnto. I1 manilkstarsi della rase qucnic, in questo tipo di analisi rispetto a quella effettuata sui campioni

, pcrch6 le pcriurbazioni sono rninimizzatc. Pcriodi di incubazione di 2-6, ono i più appropriati pcr queslo tipo di analisi.

'N in ccccsso dell'almoslkra spcrimcntalc c il rniinati ad inicrvalli appropriati.

I. ioni con Nz si dcvc cscludcrc la prcscnza di terminazione dci diversi isotopi dcll'azoto.

ento in ''N? ne1 campione prclcvato vienc dctcmiinato come descritto da Bcrgcnsen ( 1980).


5. Espressione dei risultati In ntolii casi la prcsenta~ionc dei dati in base alla superlicic o al volume t2 adeguata e d c ~ e essere calcolala dalle dimensioni notc dcl campione. I dati possono inoltre ess sulla base dci pesi freschi o secchi dci catiipioni di suolo o radici, cscg dctcrri-iina~ione dell'umidiià.

Metodi, II.3,3,

Misura dell'attiviti azotofissatrice i~ sÉt&d con sisterria ape

1. Principio I l prirlcipio su cui si basa C rclativan~ct~te sctiiplicc: in un rcci o, inserito ncl suolo, vicnc inieuato acciilcne cd un opportuno gas che tungc da s ; ad appropriati it2icrvalli di tcmpo, v cngono prclcvati campioni di gas da an on il gas-cromatografo.

2. Reattivi 2.1. Fonte di gas da uiiliirirarsi come standard intcrt~o; 2.2. Fonte di CIHI. CaC2 o C2H, in bombola.

3- Apparecchiatura 3. l . Rccipienii cilindrici di grandcxza appropr 0-30 crii di diamciro c 15-30 cril di

di acqua, ecc.) in plastica acrilica o in materiale meiallicn. Ciascun tipo di VG ~ V G ~ C : S L I I bi~rdo S I I ~ G ~ ~ O T G rina

serva per l'inscrimcnto della parte superiore da sigillare a tenuta. L supcriorc puh essere rigida (Ibgli o cilindri in

gli o sacchi in plastica a bassa pcrrncabilità o policlilcnc). Essa i: manicnuta ia alla paric infcriorc o pcr inscrimcnto nella scanalatura dcl cilindro inferi mezzo di un bordo rinlbrzato c rigido in PVC oppure

ca. butilica o collanti simili. In ogni caso, questa n pallinc di silicnnc che pcrrncttono di prclcvarc

campioni di atmosfera 3.2. Una siringa della c almeno 500 mL C richiesta sc vicnc utilizzato CsHs in

urairionc dclla tcnipcraiura all'inlerno del sistema. ionamento. Lc siringhe piu convcnienli da utili~zarc sono siringhe

a 1 mL ed ago con o senza valvola di tcllon. Siringhe di vetro con o no ugualn~cnte csscrc uiilizzaic, nia sono gcncralmcntc più costose. Sc

ccssita di conservare i campioni, fare rifcrimcnio a quanto riportato ncllc

luogo di analisi ed inscrirc i l cilindro nel suolo. La scclta di campioni alivi, pub rivelarsi dillicilc o addirittura impossibile per vcgcla~ioni natui-li, dove è un posi~ionamcnto "casuale" all'interno delle conlunita tipo. In studi diuini, 1c

analisi dcvono csserc ini~iatc in momcnii divcrsi dcl giorno.


Introdurrc nel cilindro un tcrmomciro (se desideralo) c un bcakcr o una bcuta contcncntc carburo di calcio sullieicnte per generare 0,l alm di C2Hz, se viene scelta questa forma di produ~ione di aectilenc. Applicare la parte supcriorc del rccipicnte c s Introdurrc CrHz attraverso iniezione dell'oppo acqua sul carburo subiio prima di fissare sottostante (prima dcll'inic~ionc di C2H2 un introdotto dcvc ccscrc prclcvaio, ma questo non risulta sempre strctiamcntc n Introdurrc propano o un altro tipo di gas con fun~ionc di iitandard inicrno Campionare la Iàsc gassosa ad intervalli di gascromatografichc. La Srequen~a di campio ma C raccnn~andabilc che i campioni siano pr che possano csscre osservale varia~iotii nel tcmpo. Can~pioi~ainenti rapidi dclla durata di 2-5 ore n i ~ ~ a r e i cambiamci~ti nclllalmosSera e la pcrdiia di C?Hl dal sislc ecessilà di conscrvarc i canipioni, farc rifcritiiento a quanto riporiato

5. Espressione dei risultati UII csenipio di calcolo che coinvolge uno tecniche. I tassi calcolati di C'IHJ prodotto poss all'arca d~ saggio o, per alcune applicazioni, la rn csscrc prelevala e i tassi messi in rcla~ioric al p

6. Sote 6. l . ..fftn»sfc.rt. nt.ct..\s L ~ I K Eor t e L ~ P I C,>/ Nci suoli che sono rosilà la salurazionc dei sili di a~oloiìssa~ioiic avviene facilmente cilrz uria prcss a r~ ia lc di C:H2 di 0.05 atm ma, a caiisa dcll'alta solubilità dcl C2HI, an o csscrc richicstc in suoli saturi di acqua. In alcuni casi- per es. in radici isolarc d a r a t i c r i ~ ~ a ~ o da basse pressioni di ossigeno, si puo verificare l'inatti si; tale inconvcnicrite può csscrc eliminato riducendo i l più possibile 1' pionc alltaria c riducendo la pressione par~ia lc dclllOz ad iin valnrc into

6.2. Standaid interni i11 niulti casi 10 ste 2 ~pub fu11gc1-c da s ta~idard iritcrriu. Tuttavia iri canipiurii datati di

osa o per saggi da cffcituarsi in sitt~? sarebbe meglio utilizzare altri di carattcristichc di diffusione vicine a quelle posscdutc da C?Hz,

e c propano. Nella tabella 1 sono riportate alcune proprietà di questi gas e di C1H2 C C ~ H J .

o non solo in relairionc alla solubilit6 in acqua nia anche nel grado di cluizionc Porapak u ~ i l i ~ ~ a t c comuncmcnti; ncll'analisi d¢i campioni; inoltrc, il [oro

cscc nell'ordine seguente: propilenc> metano> etanor- propano. o deve essere latta molto accuratamente considerando il tipo di nnlisi c Irt compniibilii& con i l sistcn~a di gas cromatogrnfic

utilizzalo.


Tabella 1 . Alcune propricia di gas siandard intcrni con~paratc con qucllc di acctilcne cd eiilenc. da Knowels ( l 980).

pann, possono csscrc cscguiti

campioni presi ai tempi i l e t2 i n m01 mL-l, i volumi in n1L occupati dai gas ai tempi 11 e 12. Poiché:

dove nipiorii prcsi ai tempi t l c t2 in mol-' r i - i ~ ~ ' ,

ollcnuta in tale ca

I propano iniettata c la porti dcllc a l t c ~ r c dei

ncLbe.r.sanc per t I .yaggt» ib»n ',V, saggio è necessario riniutlkcrc l 'N- prcscntc ncll'atn~osfcra c sostituirlo con la

uat~lila di "N> possibile. PcrciA k I I C ' C C S S ~ T ~ O Sar Iluirc nel campiotic da a n a l i ~ ~ a r e nie di Ar o Hè scgiiiia dall'aggiun~a della neccssaria quantità di ''N?. La prcssiorre

par~iale di '?N? dovrcbbc essere conipresa Ira 0.4-1 ,O atm.


6.4. Appro~~~~igionam~'nii di ~ I . S p w usi in L'U~?VO

Assai spesso, in qucsio tipo di analisi, risultanii utili piccoli contenitori per gas in nzetalIo o palloni in gomma. Tuttavia, C& può essere generato anche calcio). L''$NZ viene preparato preccdenicmcnie in laborainri eventualmente trasporiato in campo in siringhe di vciro a tenuta.

6.5. finseivaiune dei cl.rrnpiuni di gas yreicivafi per analisi La canscrva~ione dci campioni da sottoporre allianalisi gas-crnrnatografica con uno dci modi seguenti: - in siringhe di vetro (p. cc. Glaspak) dotate di valvola per ridurre le per - in tubi tipo Vacutainer o bottigliette in cui sia sialo litto il vu - iniettando i campioni da analizzare in boiiiglictic ricn~pite ecccden~a esce da un secondo ago inscrito nel setto; in questo c cowe~ione per la solubilità dci componenti di interes5e nell'ac nuta nel recipiente.

Metodo 11.3.4.

1. Principio Pnirht Iharntnfizc;aarinriir r Is dcn~frific-a nn ai~vcnirc rnnirr~ipnrancamrntr nello

stesso suolo. può esscre utile determin porancanzcntc C ~ H J e N@. Poiché in prcsen~a di CzH? la ridil~ionc di N20 C ente inibita, la misiira dcllbccunzulo di N;O prcsentc nel sisicnia risulta ess a stima del grado di dcnitrificazionc totale di un suolo.

2. Procedimenta Per cffettuarc la conteriipo rmina~ionc di ('?H4 c di N-O sono ticccssari t i p di

per la determinazione dcll'ctilcnc, ctic devono risultare più libità termica, ad ultrasiioni, a i o i l i ~ ~ a ~ i o n e di elio o a

cattura di eletlroni. anca dci duc gas puri csscrc ottenuta ponendo una dcriva~ionc a

braccio del T è connesso ad una colonna adatta pcr la . una colonna di 2-3 m ?; 3 rnm Porapak C?, di 811-100 di porosità) e

tcrrnica (TCD). L'altro braccio e connesso ad iiria cparazione degli idrocarburi (pcr cs. una colotina di 2 m x 3 nim Porasil

rosilk) c tcrriiitia con un dcicctor a ion i r~a~ ion i : di u s o del gas di traspono (elio) 2 regolato a circa 16 itlL tniil-' per il FID C a

della colonna & marzlcniila a 50°C c i due dctcelczr con due pennini per registrare i daii.


Metodi, II,4,

1- Oggetto I l prescntc docunietiio rjssa i meiodi per la Jcicrminazionc dclla attiviti ammo ciel suolo.

Metodo II.4,1,

Misura dell'attiviti nitrifieante potenziale (PNA)

1, Principio La misura della PNA viene dctcrn~inata secondo le di Bclscr C Mays, 1980 C, dato che si svolge in un tempo ristrclto, viene presa co ndicc istantaneo della popolazione ammonio ossidante attiva.

2. Procedimento 20 g di suola vengono pe~at i in una bcuta E ycr di 250 mL; si aggiungono 50 mL di tampone iosfato 2mM (pH 7.2 - 7. tenente (NH4)-S04 alla conccntratione di 0.5 o ImM; la sospcnsionc vicnc incubata su un agitatore rotante. La produ~ionc di nitriti o di nitriti più nitrati viene tervalli regolari durante un pcriodo di 4-6 orc prelevando un'aliquoia del l ( 1 o più n1L) e ccntriTugandola a 15000 x g pcr 5 minuti; i l sumalanle viene un iiolume identico di 2M KCl per arrcslare la nitrilica~ione. Per la leltura riti aggiungere alla sospensione 1 mL di 1 M KCIO;. Per dctcrminarc la PNA n ~ a funzione del pH. aggiungcrc I N HC'I o I N NaOH alla sospcnsionc al fine di ottcnc i pH tra 4.5 e 8.5 con intervalli di 0.5. L'acctilcne (conc.- 1 OPa) inibisce la niirilica~ione autotrola, ma non quella ctcrotrola; questo coiiscnle, elimi loruto dalla sospeiisioiie, di rnisurarc la produ~ioric di NO;- in presenza cd in ass I acetilenc: la differenza rapprcsct~ta i l valore dclla nitrificazionc cterotroia. La dclcrtnitla~ior riti, nitrati c amrnoriio nei suoli viciic misurata in estratti da solu~iuni 1 :5 (suolo: 2

dei risultati stabilisce dcicrtiiitlatldo la p rod i l z i~ l t~~ di NOi- II NO; da NH4- tnediantc

cr o cot~ procedure spcitrorotonictrichc dirette utiliz~ando i l reattivo di Gricss-


Metodi Il,5.

VALUTAZIONE UELL~ATTIVITA UENITRIFIC'ANTE DEL SUO

1. Oggetto I1 presente docunicnto lissa i rnetodi per la detem~inuionc della allivita d suolo.

Metodo 11.5.1.

Valutazione dell'attività denitritìcante ifz ssific

1. Principio La dctern~ina~ionc dcll'attività dcnitri ficantc pu6 esprim ondo qualc sia la mctodologia adonaia, la realc intetlsiti dcl processo nel suolo i crmitialo tnomcnto o la sua pilteri~ialilà (po te~~~ia l i : di dcnitrifiea~ione). Tale metodo pcm-iettc la determinuionc delllN

. . . . dalla superlicic iridisturbata del

suolo. tramitc A.I.T. c disposiilvi infissi nel s ~ i o l o

2.Reattivi L. l .carburo di calcio in granuli; 2.2.clomro di rame C'uC'lz in soluzione acquosa all'X%.

3. Apparecchiatura 3.1. Cilindri in acciaio di 40 cm e 35 cm di altezza, apcrli infcriomentc e muniti

superiomenle di coperchio plexiglas, a tenuta di gas c provvisto di un loro con sello pcrforabilc;

3.2. siringhc monouso da I da I mL; siringhe di p r ~ c i s i o n ~ pcr gas cromatografia da 0.1 mL. 0.5 mL e 1 mL;

erforabilc e ghiera di protc~ionc in alluminio (tipo llacone per antibiotici) a tcnuta , riempiti con cloruro di calcio granularc (pczzatura 1-2 mn~);

in alluminio, di forma tronco conica C, superiormcntc di 8 cm ca. di

C'O/T riveli~torc a catlura di ielenmni JECD), equipaggiato con colonna m c con diametrn interno di 2 mm, impaccata con Poropak Q 80-100

serito nel suolo i cilindri metallici (non mcno di due per ogni trattamento) alla di 5 cm, si procede alla somminislruionc dell'acctilene ponendo all'intcrno di ro un conicnitore di alluminio con 25 rnL di soluzione di cloniro di ramc in cui si


versano K g di carburo. Questa opcrazionc conscntc Io sviluppo dclla quantitb di acctilcnc necessaria per raggitingere una conccntraliionc della medesima nel suolo mediamente non inferiore a1 4-5??0. Si chil~dc rapidamente il cilindr per favorire la coniplcta diffusiotic dell'acclilc ternpo si effettua uti priti~o prelievo di ainiosfera del setto di golnma inserito nel coperchio con una siringa da 10 mL, per prcsenie al ternpo Lero e si ripete il prelieto dopo diic ore. In cr-iirambi i gassoso prelevaio vsenc rapidan~cnie irasfcrito cloruro di calcio permeite 1'elsma;rionc del vap potranno esscre eflèttuate crilro breve tempo dal carnpiortamcrtto o artc avendo cura però di cor-iservarc i tial a 5°C. L'analisi della riiisccla gassosa bicne cffcttuat con rivclatorl: a caitura di elettroni dopo passaggio in colonna c i clio di 40 nlL x

- 1 min. e make-up di amto con Ilusso di 20 m immessa in colonna C di 1 mL. Iriimile siringa i ago in acciaio per gas cmmalografia. Le condizioni sinimcntali più ullatc csscrc qucllc chc seguono: teriiperaiura all'itiicitore 225°C. tcmpcraiura rivelatori: 350°C; Icnsionc d'in~pulso (yrdsr, i.ilicitIz) 1 50 Volt; la corre~ttc che rcgola 13 f req~ icn~a a I e 1,s i-iA e a questa dcvc corrispondcrc una frequenza non inferiore a 3000 H

5. Espressione dei risiiltati

Lc concenlra~ioni di NIO misurate dallo stru vengono calcolatc tramite rircrimcnto ad urin rc~tci di ~ a r ~ t ~ u r a ~ s e g u i ~ a ~ ~ C ; V ( ; [ I L ~ L ~ [ I I G irasTcirrria~iorir; dc;llc c;oric;c~i[ra~iurii i11 - quantiti assolute di N 7 0 richiede la conoscenza del volume libero intcrno dei cilindri. Questo . , puo essere calcolalo in modo molto malivo, qiialora la silpcrlicie del suolo sia quasi pcriètlamente piana. misura edia da terra del cilindro, o in maniera esatta tramite dcllc pmve in bianco ferinicnio (p. cs. i l propano) chc vicnc introdotto ncl cilindro in quantità noia.

6. Sote

L'csccurinnc della prova dc ncllc nrc più calde dclla giorno dato l'cfl-cttr, radiante che i cilindri ntctallici possono svolgere coi1 conscguei-ilc notevole aumcttto dclla

dell'almoslèra al loro interno. Qualora non sia possibile procedere d r l n ~ s t l i n n (rhr qnnn r i < i i l i a i r rw-rr I r pii1 IIRI~CIC a n c h r a l f inr liaii alle 24 ore} C ncccssario proccdcrc alla coibcnta~ione dci

rgirner-ili. Tra qucsli i l piu talido risulta essere qiicllo di rivcstirc il oliurcianica e schcrrnare il coperchio con paglia o simili.

'N20 in acqua ncl caso di suoli saturi o prossirrii alla saturazione colo del protossido di azoio disciolto ncll'acqua dcl suolo che va

nello spazio di testa. I1 calcolo pub essere Satto usando il i Bunserz nella scgucritc equaliione:

M = C'g(k!g + b'jori


dovc M 6 la quantità totale di N20 (ncll'acqua c nella fase gassosa}, C'g la conccntra~ionc di N 2 0 nella fase gassosa, Vg i l volume della Iàse gassosa, V1 il volilrnc dclla Sasc liqiiida cd rx i l cocfficientc di Burlsen. Per comodità del lettore si ri coefficicnte relativi al protossido di a ~ o t o .

Tcnip. coeff. di "C Bunscn

1 O 0.882 15 0,743 20 0,632 25 0.544

Metodo I I .5.2.

t'alutazione della denitriticazione poten l suolo D.E,A.

1. Principio Talc saggio, tramite A.I.T. ed incubaxione nrlc di suolo in anacrobiosi, pcrmcttc di dcrcrn~inarc del polcn~iale c n ~ i m a ~ i c o dcn cl suolo (Uc.nirr.ifying Eflqyme Acrivi~v. D. E.A.).

2. Reattivi 2. l . Acqua sterilc; 2.2. soluzione 1,4 rnM di KNO;; 2.3. soluzione 1 rnM di dora 2.4. acetilenc PP in bombola;

nLa bordo, da 50 mL; la al silicone. con bordo ribaltabile;

~matografia da O, 1 mL, 0,5 rnL e I mL; l i per gas da 1.5 L, a volume variabile;

e ghiera di protc~ionc in alluminio (tipo llacone pcr i con cloruro di calcio granularc jpczzatura 1-2 rnrn);

ra di N? (80%). C02 (1 5%), H1 (5%); cattura di clcttroni (EC'D), equipaggiato con colonna in~erno di 2 rnm, impaccata con Posopak Q 80-100

rncsh.


4. Procedimento Campioni d~ 20 g di suolo (tlcl caso dei suoli agrari o degli ori;r;rorlti minerali) o di 10 g (ncl caso dcgli orizzorlii o-anici dei suoli agrari) vengono disposti in bcu unzidificati prevei~livatneiilc lino al 50?0 della loro capacità di ritciluta idrica slcrile. Quindi si trasferiscono le hcute nella cabina per atlacrobiosi c si procedc alla mL di solu~ione cristiiuiia da una miscela delle solu~ioni di nitrato cloramferiicolo in modo da ollcncrc urta ci'inccntruioilc del primo pari a 20 e pari a 300 pg per g di sirolo del secondo. Si tappano le beuic e si aggiunge C2H2 cori una siringa da I O m raggiungcrc la concc~ltraliione di questa del 10 '?/o viv. Tcrrninata qucst'illtima oper i ilispongono le bcute su un agitatorc orbitale a 120 r.p.rn. in rnodo da ottcr~c farighiglia. Qucsto consenlc di favorire al massimo le reaxioni tra i l substrato c la cari ~atica dcnitri iicantc presentc t~cl suolo e di ridurre al n~assitlio la durata della prova. to momento si in i~ ia a calcolare i l ternpo di incuba~ionc (2 h) nel corso del quale si ualio Ire prelievi dcl gas nello spazio di tcsia delle beuic: i l primo imnlcdiatatlicntc o dell'incuba~ionc fteri~po LCTO), il sccondo dopo un ora e i l ~ c r ~ o dopo duc ore. I iotli gassosi prelevati vengono trasièriti nei >zia/, corne descriuo ariche rtella rrtetodic ente, c ivi eonsewati in attesa ciell'arialisi a1 gas cron~atograh. La metodologia analitica gas croniaiograiica non da quella descritta sopra per la valuta~ionc dcll'aiiività det~iirificanic in .vitu c a nianda, tcncndo prcscntc chc, in questo caso. é sernpre ncccssaricl proccdere a1 ca cll'N?O dicciollo nclla Tace acquosa.


Metodi III,I.

DETERMINAZIONE DEL POTENZIALE NITRIFIGANTE

l. Oggetto Il prcscntc documento fissa i rnctodi per la determinanionc del potcn~ialc

' ntc dcl

suolo.

Melodu III.1 . l .

Determinazione del potenziale nitrificante del suol zionato alla. capacità di caiiiyo

1- Principio I l nletodo, si basa sull'incuba~ione dcl suolo tratiah con amn solfato C sulla misura dcl conlenuto di nitrati prodotti dopo 3 sctlimanc di incubaxionc

2. Reattivi Nel corso dell'analisi si u l i l i~~a i io acqua distillala e re qualità analitica riconosciuta. 2.1. Ariinionio solrato, (NH4):S04, stsluzionc 0.2 : in un bcchcr da 1000 mL si

sciolgono 26,428 g di (NH4):SOd con circa 7 i acqua. Si travasa in un rnatraccio larato da 11100 rnL e quindi si porta a tolumc

2.2. solii~iorie cstraet~tc di potassio sollàto /L o di potassio cloruro 2 mol/L: si sciolgono 87,13 g di K 2 S 0 4 o 149.12 p di on circa 700 rnL di acqua in un bcchcr da 10UO rnL. Si travasa in un ri~alraccio tarato porta a volunic con acqua.

3. Apparecchiatura Corrente attrezzatura da laboratorio c ticolare: 3. l . centrifuga; 3.2. agilalorc ~necca~lico; 3.3. canlera lennilslatiea.

4. Procedimentci 4.1 . Defen?7i,imiotic dea cc.» in ìzicrìc di moto n iirico prc.\ cwfc ncT .r iiolo

bottiglia di polietilcnc da 2511 rnl. si aggiungono 100 mL agita per SO rninil~i. Si ccntrifìlga, si liltra (Whatman n.42) c

onlcnuto di a ~ o i o nilrico.

uolo fresco i n un bcchcr C si aggiungono 2 mL dclla solurionc di cd acqua in quantità suflicicnte per portare i l suolo alla capacita di

cher con un velo di paralilm leggermente forato, si pesa c si pone in luce per 3 scttinianc. E' nc~cssario pcsarc i l bcchcr

tc C, sc occoit~ . ~ ~ E ~ U I I ~ G I G acqua allo 5~np0 di ~ I ~ ~ I I ~ G I I G I ~ ; I'u~l~iditb d ~ 1 suolo

Si cfSettua parallclamcnte una prova in bianco ncllc stcssc condizioni, omcttcndo il solfato di ammonio.


4.4. Esfruzione dell'oiofv nifi.ic.u Alla fine dell'incuba~ionc si pcsano 20 g di suolo in una bottiglia di policlilcnc da 250 mL c si aggiungono 100 mL di colu~ionc cstracntc Si agita su agitatorc meccanico pcr h0 temperatura ambicnic, si centrifuga a 4.000 giri/min pcr 5-1 0 minuti (oppurc si riposo 30 minuti) e quindi si filtra su liltro Whatman n. 42. Su un'aliquota dcl I poi I ' a~oto nitrico.

5. Espressione dei risultati I risultati vcnyono c ~ p r c s ~ i i n pg di N-NO:- g-l di suolo 5cccato in stura a Il valore dellrattività nilrificanlc "putenzialc" sarà ricavato per diSSeren~

No = N1-Ni rfavc: No i: l'atlivita nitril'icante polcn~ialc; Nt C. il conlcnilto di a ~ o t o riitrico rtcl campiortc trattalo cori sollà Ni 6 il contenuto in i~ia lc di azoto nitrico. 11 valore dcll'aliiviii t~itrificanic "attuale" sari ricavato pcr di

Nc = Nri-Ni ciovc: Nc è I'allività nilrificanic attuale; Nn è il conlcnulo di ami0 nitrico tic1 canipionc tion (prova in bianco); Ni C. il conlcnuto in i~ia le di a~otc? nitrico.

Metodo 111.1.2.

h4isura del potenzi lla sospensione del suolo (n)

1. Principio In questo niciodo. i car~ipioni ilali con un ccccsso di liquido (.ioil s1tii.1.v) cd incubati per 24 ore so n condizioni otiimali di umidila, acra~ionc c corilenuto di Sosforo I1 conlcniito di nitrati viene misuralo culla sospensione del siiolo prelc i tempo prestabiliti.

2, Reattivi Nel corso dcll'analisi si lala c reagenti di qualiti analitica riconosciuta. 2.1. Ammonio soliàto, (NH4)2SOIi soluxionc 50 rnmol/L: in un bcchcr da 1000 mL ci

sciolgono 6,607 g di (NH4)?S04 con circa 700 mL di acqua. Si Iravasa in un matraccio tarato da 1000 IL c quindi si porta a volumc con acqua.

2.2. Fosfato bipotassicn, K7HP04, solu~ionc 0.2 mril/L: i n un bcchcr da 100 mL si sciolgono 3,484 g di KzHP04 con circa 70 mL di acqua. Si travasa in un matraccio tarato da 100 mL

porla a volurnt: con acqua. nnnpntassico, KH2PCj4 wlrifinnr 0.7 rnoli l : in iIn bcchrr da IO0 m1 si

,722g di KHzPO4con circa 70 mL di acqua. Si travasa in un matraccio tarato mL e quindi si porta a volumc con acqua.

inne iamprinc a pH 7,2 11,5 mmriliI di NH,,- c 1 n~mol / I . di PC)$-'). % i prelevann ?,!i mL dclla solu~ionc di K2HP04. 1.5 mL dclla soluzione di KHIPOJ C 15 mL dclla saluzinnc di (NHl}?SO$ c si introducono in un n~alraccio tarato da 1000 mL. Si porta a


volume con acqua dopo aver aggiustato i l pH a 7,2 con una solu~ionc diluita di HzS04 o di NaOH. La soluzione C chimicamente stabile ma occorre riprepararla dopo un certo periodo perchf può csscrc cnnian-iinata da crescita microbica C'onscrvarc Ic s frigorifero.

3. Apparecchiatura Corrcnle attrezzatura da laboratorio C in pariicolarc: 3. l . Centrifuga. 3.2. Agilatore oscillante. 3.3. Camera tcmostatica.

4. Procedimento 4.1. r'rzcrrbaziont. Si pesano 15 g di suolo frcsco ( l 0 g se i l sucrlo prcscnta un elevato di sos tan~a organica) in una bcuta da 250 mL e si aggiungono 100 niL ne tarnponc a pH 7-2. Si chiude la bcuta con un tappo di cotonc o di gomma IOralo c r 24 orc a 75°C.

4.2. Cot~ipiot?o1~7ct?ro Si effeituano 4 campior-iatnenti (2. 4, 22 e 24 ore) al li inare la cinetica del processo. Si prclcvano. nel rnorner-ito in cui cessa l'agiia~iortc, 1 sospensione omogenea o riria quanti13 supcriorc. nel caso che la sospcnsionc v Itrata. cor~ una pipctta autori~aiica provvista di punialc con apertura adcguaia. Si c in tubi da centrifuga da 15 rilL a 8000 giritiriin per S rninuti oppiire si Illtra su li11 Sull'cstratlo li~npido si delcm~ina i l contcnutcl

5. Espr essioire dei r isultali I sisullali vengono espressi in pg di N-NO;- h-' g-' di suolo seccato in stida a 1115°C. Alcuni consigliano di dcicrrninarc an conccntrazionc di N-NO2- c di snmri-iarc questo valore a qucllo dcll'a~oin nitrico al fi Icolarc la vclociia di nitrifica~ionc.

Metodo 111.1.3.

R'lisura del potenziale rii nte sulla sospensione del suolo (h)

1. Principio Tale melodo prevede l'i ione per 6 OTC di campiorli di suolo trattati con una solulrione (suil S ~ L I ~ Y ~ ) coritene so, asnmonio c sodio clorato. 11-1 prcscillra di clorato la quantità di niti-ilo che si accu rrispondc alla yuanlila di solo amn~oniacalc ossiciaro. Il conicnulu di nitriti viene io sulla sospensione del suolo prclcvata ad intervalli di tempo prestabilili.

2. Reattivi analisi si utilizzano acqua distillata e rcagcnti di quali15 analitica riconosciuta. loruro, KCl, solu~icinc 4 mol/L: in un bcchcr da 1000 mL si sciolgono 298 g di rea 700 mL di acqua. Si travasa in un matraccio larato da 1000 mL c quindi si

volume con acqua. n hipntaccirn, KZHPT)j, qnl i l~inne n.2 rnnI/I . in iin herhcr da I O 0 m1 <;i ~;cinlgnno

3.484 g di K2tIP04 con circa 70 mL di acqua. Si travasa in un matraccio tarato da 100 mL i: quindi si porla a volume con acqua.


2.3. Foslato monopotassico, KH2P04, solu~ione 0,2 mol/L: in un bcchcr da 100 IL si sciolgono 2,722 g di KH2P04 con circa 70 mL di acqua. Si travasa in un matraccio taralo da 100 rnL c quindi si porta a volunic con acqua.

2.4. Soluzionc stock A: si prclcvano 28 IL di soluzione di KzHP04 c si introduc matraccio taralo da 100 mL, si aggiungono 72 mL di solu~ione di KHIPO volume con acqbia.

2.5. Soluzionc stock B: Sodio clorato. NaCIO;. soluzione IM: in un bcck sciolgona 10,64 g di NaClO; con circa 70 rnL di acqua Si travasa in un da 100 mL e quindi si porta a volume con acqua.

2.6. Soluzione lampone a pE-1 circa 7,2: si prelevano 10 rnL dclla s G stock A G si introducono in un n~airaccio tarato da un litro. Si aggiungono 15 n1 soluzione stock 5 c 0.5 y di (NH417SOd. Si porta a volumc con acqua.

3. Apparecchiatura Corrente a l t r e ~ ~ a t u r a da laboratorio e in particolare: 3.1. Centrifuga. 3.2. Agitatore oscillanic ( l 75 rprn). 3.3. Catnera teimostatica.

4. Procedimento 4.1. fi?czibmlrinc Si pesar10 25 g di suolo i'rcsco in una bcula da si aggiiingono 1110 niL di solu~ionc tamporie a pH 7.2. Si chiude la be~ita e si agila p

4.2. CT~rtipio~rai??tirltu Dopo 2 e 6 ore si prclcvano, nel rriomtnto in cui cessa I1agila;rionc, in modo da mantcncre costatite i l rapporto siiolo: solu~ioitt, della sospensione in L J ~ I tubo da centrifuga c si aggiungono 2 mL di KCI. Si centrifuga a 3000 giriitiiin per 2 n c ncccssario si filtra con carta Wtiatman n. 42, Sull'estratlo limpido si delc

5. Espressiarie dei risultati 1 risultati vengono espressi o10 sccca1o i n stufa a 105@1.

Ncjr~

iluto di N-NOI- richiede una ntaggìorc quanlita di cslrattu, si di sdz~rgc per ogni can~pionatlicnto c di prclcvarc il surnatarrtc

casa. la centri fugazionc o la lilrra~ionc poircbbcro non csscrc

ttuare immcdialarncnlc l'analisi gli estratti dcvono csscrc conscrvari in cr non più di 24 ore. Si consiglia di non congclarc gli estratti. i fanghi 11 contenuto di ossigeno dcllo .sltrrr;v polrcbbc csscrc limitante, in

corre acrarc i contenitori o aggiungervi direttan~cnte ossigcno.

lo possono essere determinali per vla colorimctrica, per re o n?cdianic I'uw di un clcilrodo spcci fico.

Per la dettagliata descizione dei metodi di determinazione, rimando al Manuale di Metodi Chimici della medesima collana


Metodi II1,2,

ATTIVITA AMMONIFICANTE POTENZIALE

1. Oggetto

I1 prcscnle documento fissa i metodi pcr la de~erminuionc della attivit nificantc del suolo.

Metodo III.2.1.

Metodi, della piastra di terra

1. Principio

11 rnetodo si basa sull'aggiunta ad un campion uolo di una quantita nota di sosran~a a~olala proteica tnisuratidonc ogni giorno la q di arnmoniaea liberata ncll'atn~osllera.

2. Reattivi

2.1. Polvere di sangue cssiccato; 2.2. acido solforico Ni50; 2.3. idrossido di sodio Ni50.

stra Petri di 10 cti~ di diametro scnda coperchio 50 g di suolo C

ccato. Aggiungere 12 mL di acqua (259; di urniditi). Porre la ioni maggiori (15 cm di diametro). Versare nella piastra piir

Ni50 csaltamenle misurati e qualche goccia di rosso di rnetilc raggio. Chiudere la piastra grande con i l suo coperchio ed incubare a voltc ciascuna dcicrn~ina~ione. Ogni giorno titolare la quantità di

nel seguente modo: quella contenente i l suolo;

ndo di quella più piccola Con una spruLLctta;

ico Ni50 per la tiloladione del giorno dopo. lito la produ~ionc dcll'ammoniaca alla Iinc di

questo pcriodn i. molto debole).


4. Espressione dei risultati Si Iraccia una curva dcllo sviluppo quotidiano di ammoniaca su un Ibglio di calra n~illimctrata riportando sull'ascissc i l tcn-ipo (giorni) c s~illc ordinatc la quan (millililri di soda N/50 oppure azoio od ammoniaca). La curva di an~monificajrionc massimo in genere intorno al 5" giorno. In modo analogo si calcola la q~iantita totale di ammoniaca liberata durante dcll'espcrin~cnto.

Metodo 111.2.2.

Metodo della caseina lattica

1. Principio I1 rnetodo si basa sisll'aggiilt-ita al siiolo di una n~aerornolc a cui n~ ine ra l i~ ra~ io r i e cait~volge tutti i rnicrorganismi an t rno i t i~~an~i . In pa 1111 cantpionc di suolo viene incubato pcr 6 cctiimar~c i t l presenza di un eccesso di suolo vicnc lisciviato ad irilcrcalli di tenipo definiti c I ' a~oto ammotiiacal inato cc>lorinl~tricarncntc.

2. Reattivi 2.1. Soluzione satura di CaSO,; 2.2. s o l u z i ~ ~ l c nutritiva esente da amto (0.1)02

M K2S04. 0.002 M MgS04).

3. Procedimento sabbia di quarm e disposto i11 buchncr (diametro

m. vicnc incubato alla tcnlpcratura di 3Q0C i 0.5 ed ella quantit6 di 250 rngikg sotto forrna di cascina

ad it-itcrballi di tempo di 7 giomi si procede a lisciviare di CaSO.1 e, succcssivari~cntc, a rcintcgrare gli

elementi nutritivi tralta L di una solu~ionc cscntc da a ~ o t o (0.002 h11 CaSO1*2H-O, 0.005 M K:SO4, 0.002 M bIgSO4).

loritnctrica, sia I ' a~oto nitrico (che dovrebbe ammoniacale. La durata dcll'incuba~ionc C di 6 scttimanc.

ianco del tullo analoga alla prcccdcnte fatta dclla ca~cina latiica.

i ~ ~ a ~ i n n c del la sosianLa organica cndogcna cr g di suolo) dovr5 csscrc sottratta di volta in

aggiunLa di cascina laiiica (detta "B") sccondo la


Metodo 111.2.3.

Metodo deIIqarginina

I. Principio Tale niclodo. u t i I i~~ato adottarido delle rnodilichc tcc~iichc niinori. si preccdentc, sirll'aggiunta al suolo di una quantità nota di sosian~a organica a c misurando la quantità di amri~oniaca prodotta dopo incuba~ionc.

2. Reattivi 2.1. Solu~ione di arginina a110 (3.294. SciogIierc 2

Crinscrvarc in ErigoriEcro a 14°C; 2.2. solri~ionc di KCI 2M. SciogIicrc 139.1 g di KCI in 1000 rnL

3. Procedirnerito In 3 bottiglie di polictilene da I50 niL si pcsano i l corrispci g di suo10 sccco a1Iqaria, si aggiungono 2.5 inL di argii~ina allo 0.29./, C

congcIare. Ripetere i'opcra~ione irzocriiando altri 3 pioni con 2.5 mL di acqua distillata. Si scongclano i campioni, si estraggono con filtra su Whatman No 42 e si conserva in frigorifcr partc. ciel eontetluto itl acqua dci eatnpioni.

4, Espressione dei risuItati I1 curitenuru iri NH4 scembiabiIe può ess inetu ~u lo~met r i camen te e esprime i risultati secondo la seguente espressione:

m g ~ ~ z / ( g suolo xora)= g suolo xore incubazione


Metodo 111.3.

RESPIRAZIONE DEL SUBSTRATO (METODO SIR)

1, Oggetto I l prrcciztc docuincilto tisia un Incta

2, Principio Il ~nctodo si basa siilla dctcnnitla c il cunsuinu di ossigcito o la prodi~zionc della CO? iiti~ncdiatainci~tc dopo di subspatu a coitccittraziot~i snturailtt. I l SIR L;

dctcm.iinazioitc dclla biornaisa nticrobica.

3, Prorcdimrnto La dcteririiiia7iuiii: del SIR piici es verse ripot-tatc i11 letteratura da \.ari autori c di seg~iito ricscrittc. 111 liiica gciicrcilc i1 rnctodu SlR p r c ~ c d c lc scgucnti fasi: - prcparazioiie del canipioiic; - aggiuiita a1 suolo dclla cui~cciitrazio~~e satiira cosio in soluzioile o 111 polvere cd ori~ugciieizzazioiic iicl siibstrato iicl suolo. bc i1 utilizzato 111 pulverc si aggiLitigc uii i~~atcrialc iilcrtc (talco) pcr facilita - iitcilbazioitc dcl silolo (gct~walt~tct~tc a 25°C) - dctcnnina71ni1e dcl la rcspira~io scguito; - calcolo dcll'aliquota di CC)? pr a di iitcubazionc per 100 gramini di suolo (peso sccco) c calcolri della bioinassa n ciluivalctitc alla rcspirazio~~c inassitna iiiizialc utilizzaildo l'cquaztoite descritta in (4

3 . l . Pi-ep~rrtziiouc c i r e i c ~ r r ~ g t ioi7cj

Il rat l~pioi~c di suolo vicnc ( C 2 nlnt) per climitiarc i residui dcllc radici c la o rcilde il suolo niaggiormciltc omogcilco facilitaildo sia La

all'aria no11 risulta corretta iil cluaritv una par-tc dclla biomassa vara o ~iccisa. In suoli naturalmciltc secchi o cori uil hascio

iiiiiiuc possibile applicare il n-ictodci SIR pcr la stiina della biomassa rcre all'uniidificazioric u alla prc-inciibazioi~c.

Ila cnncec-ntrazione .s~rlur~-Infc- di ghrc-osir) in soirizionr o i17 polvere ~itilizzarldu il glucrisio i11 soluzione o iri polvcrc. I i i

glilcosiu vicile dispcrso in talco (0.5 g di talco pcr 100 g di siiolu) al finc iii iea la coiiceiitrazioilc del gliicosio i~c l suolo. La cciricciltrazioiic cittin~alc iii


glucosio da aggiuiigcrc al suolo dcvc essere stabilita di volta in volta cscguciidci dcgli cspcririicilti prcliini~iari; la coiicciitrazioilc ottiri~alc di glucosio i: gcilcralmcritc cumprcsa tra 1 e 8 ing a scco~ida dcllc tipologic di suolo. Se il siibstrato i: disciolto in acqua la curiceil

l solrizioiie varia da 8 a 30 mg rnr .

3.3. Incubt-r;it?ne dei srtolt3

Ui~~aliquota di suolo pari a 1 g cii siiolo secco, al clualc i: stato aggiunto i l siibstrat uri rccipiciltc di vetro clie a stia volta i: iilscrito in bottiglic il cui vulun~c C siriiiglic coli t111 voluri~c di 60 1111. Lc bottiglie o lc siriiighc, chiuse crinctic scambi gassosi coli l'atmosfera, vciigcirio incubatc a 25°C per circa 5-6 stibstrato.

3.4. Deierm iriirrzi~31~~ deblcr r.esp ìrt-r,-ir?ni. massima iniziaie

LC detcrmiiiazioiii della LO2 scirio cscgiiitc sia sui suoli a ciii i1 o aggiurito il substrato (coritrollo) sia sui suoli lasciati incubare per 3-61 ore dall%uggiuilta Per la dctern~iilaziuiic della C 0 2 possoilu cssere utilizzat apparcccliiaturc. le piii c o i n u n ~ n ~ c i ~ t c iitilizzatc sono: 3.4.1. gas cromatiigrafii JGC); 3.4.2. sistc~na a flusso di aria: 3.4.3. rcspiroinctru (Sapromat); 3.4.4. ultragas 3 [Wostl-ioff) analizzatorc di CC)?; 3.4.5. ailalizzatorc ad inli-arossi.

La dcteriniiiazioiic della (107 mcdiantc l'uso dclla tecnica della gas cruinatografia E scinplice e vcloce C coiiseiite di leggere circa 40 campioili per ora.

sta mcdiailtc uiia siringa i. gcricralineiltc di 1 inL. I costituita da coloiiile Porupak (T, Q) 111 acciaio

1-2 mm c utilizzano come gas di trasporto l'elio la C 0 ? suno gencralmcilte cluelli a tcm-iocoriducibilita

~;b i ;g l l i ~d 11ll;didllt~: I ' u ~ v di btdllddld di LO2 d coilcciitrazioiic nota.

i~sistc i11 uti apparato costih~ito da bcutc 11 25 m L f cui~tci-ici~ti 30 g di s vicnc ii~sut'flata aria pi-iva di LO7. I l gas i11 uscita

I ~ L L l i i t [JrlbiidIL I - I ~ ~ I ~ V L I S U 50 , [ IL di NaOII 10-20 possa csscrc traspoi-tata dalla coi~ciaitc di aria C

catturata dalla s glucosio i11 soluzioilc porta~ldo il siiolo al 120

g di sut-810. La iluat~titi di CO? catturata dalla cipita7io1ic dci carbonati coi1 I'riggiuilta di Bacii, lariti nota cd utili77ando cun-ic it~dicatorc di p11 la


I rcspimmetri sollo coilsiderati sisteilii di misura migliori rispetto ai sistcr.ili statici dclla gas cromatografia i~cile d~tcminaziot~i su suoli alcaliili. irlfatti, a seguito JeIi soluzione alralina il siste~na provvcdc alla misurazione sia del coi.isumo di 0 7

produzione di COz, così r o ~ n e F stato descritto i~cilo spccifjco capitolo rciativo al1 dcl suolo. Si IJtilizzano 0 5 g di suoio posti iil un volurnc di 19 i71L C O 3 IIIL di KOJI la COz pmdotta. 1 mL di glricosio C aggiuilto al sriolo i11 solu7ioilc (30 i-iig 117

ì. inisirrata rigiii 70 n-tii-rrif i lcegcn(in rlircttan?ci-rfc lc varia-/ioi-ri d i prcssioi-rc a

3.4.4. U / ~ I - R ~ L ~ & S 3 (Wo~JI?(?ffl a ~ ? ~ I i z z ~ ~ » r e di Coi

Lo strunlcilto l'ultragas 3 (Wostl-ioiI), arializzatorc dr C'U?, cu dr suttrar-re la L'Q2 daII'an~bici-itc in cui i. stata prodotta inediantc una correritc di a ' o di che Ia CO:! viene cattumta da lilla soluzioric di NaOll 0.04 N. La conducibiiit uzionc aIcalina varia ii-i ii~rizioilc della rjuaiitith di C0: canurata c pel-tarrtu le lettur<: ibilitii dopo essere state registrate vengono a~itomaticaineiltc convertite i11 conccnticizioi La ijuailtiti~ di suolo ricccssaria per ogni cainpionc i. l<).01 g a cui viclic aggiunto i l glucosio i r i poivere mescolato con talco ricl rapporto I1 suoIu c i l substrcito vcriguilu oinugcncizzati assicumrido uila distribuziuric ~iriifor ,I~icosiu iicl suoio. I cainpioni da ailaiizzare vcngoilo posti iil provctte di plastica (25 n) cl-iiusc coi1 tappi di poiiurctailo e co1Iegutc coi1 I'allaIizzati>l-e di 602. I1 flusso di aria priva di C0z è intcrinittcntc m. per circa 20 iniririti) c i1 tasso di respirazioile vierie rilisurato per 10 minuti.

L'ai1aIizzator- di gas a i i ~ h r o s s i uri per la ilctcr-rilii~azioile della C02 inulto sensibiie ed F stato utilizzato anche pcr la dctcnnin cila respirazione dcl suolci.

4. Esprcssfonc iicl rlsuItatf

La differciiza tra la respira po 5-5 ore di iricubazioi~c dei srioli a cui i. stato aggiunto giuccisio c qriella basale (con

x = 6x6 - SO)/ 63

(rcspiraziui-il: iiliiotta dall'aggiunta di substrato-SIR): re di ii1cubazionc dall'aggiunta di substrato;

ve aila rcspimzionc basale (contruIIo);


Metodi Ifr.1.

~l'~'l'1t'l'l'À UKEASIC'A DEI SCIOLI

1. Oggetto I l prcscnte documento fissa i tliciodi per la dcicrn~inazionc della attivitj urcasi

Metodo Ih.1. l .

Determinazione mediante la misura dell'urea non

1. Principio 11 nietndo di deterriiitiaziotic prcvedc l'incubazione, p ipo prcfissatri, di un campionc di suolo con una solu~ionc. rion tainponata di urc. isura della quantità di urca non irasforn~ata mcdianic dctcm-iirta~ionc. colorimetrica. L'incubaxionc va ctTctiuata in asscnsa di u n hattc

2. Reattivi U ~ i l i ~ ~ a r e dcyua bidislilidld o ultrapurd c: rcdgc 2.1. solu~ione di urca 2 mg m ~ - ' in acqua: sciogliere 2.0 g di urca in circa 700 mL di acqua, e

portarc a volumc finalc di I litro c a; 2.2. soluzione di acctato di fenilrncrc A) 50n1g L-' in acqua, 2.3. solu~ione di lknilmcrcurio acel oruro polacsico (KCI-PNA) (2 M KC1-5 mg L-'

PMA): sciogliere 1.5 g di K itri di acqua e aggiungere 1 litro di solu~ionc di PMA (2.2.);

2.4. solu~ione di diacctilmon DAM): sciogliere 2.5 g di D A M in 100 mL di acqua; 2.5. solu~ione di tiosemicarb SC): sciogliere 0.25 g di TSC in 100 mL di acqua; 2.6. soluzionc ncida: aggiung~rc 300 n2L di acido Eosfririco (H ,P04) allfX59G G 10 mL di acido

salforico concentrato (H1S04) a I00 n11 di acqua e portare a volumc finale di 500 rnL con

2.7. so lu~ione culo cscolarc immediatamcnte prima dcll'uso 25 mL di so lu~ionc di .) c 10 n11 di s01uzi~)nc di tios~micarbazide (2.5.) con 500 mL di

rca (250 rng/rnL: scioglicrc 0.5 g di urca in circa 1500 mL di 1-PMA (2.3.), c diluire a 2 litri con la stessa solu~ione. Talc solu~ione

pg di urca r n ~ . ' , se I'urea utilizzata 6 pura.

sono stabili per parecchie settimane se conservati a 4°C: in frigorifero, traline i1 orante (2.7.) che deve essere preparato immediatamente prima dell'uso.


3. Apparecchiatura Normale a t t r e ~ ~ a t u r a da laboratorio c in particolarc: 3 1 bcutc iaratc da 511 n?L, provviste di tappo di vciro; 3.2. bagno termosiaiico; 3.3. bagnomaria bollente; 3.4. imbuti filtranti da vuoto (di polictilcne); 3.5. spcurrifotan~ctro o colorinictro.

4. Procedimento 4.1. Sag-io di aftivitù Incubare in una bottiglia di vciro chiusa 5 g di su prcvcntivamcntc setaccialo (<2 rnm sulla basc di un cani ufaI, con 5 mL di solu~iotlc di urea 2 mg m ~ - ' (10 rng di ~irca) per 5 ore a rrnostatico. Alla fine dcll'ineuba~ioi~c. rirnuoverc il tappo e aggiungere 50 inL di re . Chiudcre di niiovo la bottiglia c agitare per I ora. Filtrare la sospctisionc di s di carta Whatman n. 42. Ei'fcttuare i l saggio in tre repliche.

4 .S. Dt.rt.n?7i,?nzio,?c ~'oiclrirrtefricrr Lbc~bl'211"~'i1 Pipctlare una aliquota (1-2 rnL) di cslratlo c7Llcn lillrazione, contenenti: al niassimo 200 pg di urea in una hciita tarata da 50 mL, por volume di 10 mL con la solu~ione KCl-PMA, e aggiungere 30 mL della sollizio ntc (2.7.). Agitare ~igorosan~cntc pcr alcuni secondi pcr rricscolarc bene i con~pon rrc in bagnon~aria bollcntc. Dopo 30 minuti di inciibazior~c, raffreddare in~rnedia la hcuta ~(3110 acqua corrcntc per altncno 15 minuti (o ponendo it i bagno di acqua Cr 12-20°C). Portare i l volutnc a 50 mL con acqua c mcscolarc accuratatiicnte. l'intcnsii6 della colorazione rossa prodotta a 500- 550 tlin (i l rnassin~o di assosbimcitto rlato a 527 nrn) con lo spettroEotornctro (nel casa che venga usaio un colorimetro 11s so verde n. 54).

4.3. Prq?iwuzi""t' di ditala c'urtia di rrdthr~r-' L ~ ~ H L ~

Diluire l 0 mL di solu~iorte slandard di urca (2.8.) a 100 rtlL con la solii~ionc (KCl-PMA) (2 .3 . ) in una beuia tarata c n~cseolarc accuratarncnte. Pipettarc, poi, 0, 1.7,4, 6, c E; mL di tale

a 50 mL. aggiustare i l volunie a I O rnL la solu~ionc KCl Ph4A e proccdcrc csattanicnt descritto prcccdcntcmcntc per la deterrnina;rionc del l'urea ncll'cslratto di suolo. I rnpioni conterranno rispeltivainentc 0, 25, 50, 100, 150 c 200 pg

esprime in quantita (g o moli) di urca idrolizzata da 1 g di suolo in 1 ora

tiià di urca riniasia (A) mcdiantc la curva di calibrazionc prcparata Lione standard di urea. La quantita di urca idrolizzata da 1 g suolo in 1 ora

iflcrenza h a i g di urca inizialmente aggiunti (10 g) c quelli l'estratto (A), il tuiio diviso per 5 (g di suolo incubati) C ancora pcr 5 (ore totali di


Metodo IV.1.2.

Determinazione mediante misura dell'ammoniaca prodotta

1, Principio

I1 melodo di de iemina~ione prevede l ' incuba~inne per un tcrnpu prclis suolo con una solu~ionc non tamponata o tamponata di urca. Sul li effettua la misura della quantità di amn~otliaca prodotta dctcrmina~ione calorimctrica. L'incuba~ione va el'l'cttilata i11 a s s c n a di un bat~eriosiatico. L'ammoniaca fTorn~aiasi rcagisce con i l sodio salicila presenza di sodio

abilc di colore vcrdc. La presen~a del sodio nitroprussiato nclla miscela di incub agisce da calalirratorc e aumenta la sensibililà del n~elodo di circa 10 voltc.

2. Reattivi

U i i l i ~ ~ a r e acqua bidistilla~a o iillrapura c rea 2.1. soluzior.tc cor~ccntrala di urca (O 72 M ) ir-I ac ioglicrc 43.2 g di urca in circa 700 rnL

di acqua, e portare a volurrie tinale d~ 1 lilr 2.2. solu~ionc diluita di i1rc.a (0.08 M) in ac

portare a volume lfit~alc di 1 litro co n~olarith liriali: 0.08 M ([attore di

2.3. solu~iune di oridrico ( 1 N KCI-0.01 N HCI): sciogliere 74.56

rnL di 11.025 M Na2BaO.r x I O H 7 0 (9.525 g E') con

2.5. soluzionc di sodio sa nitropnissiato l). 12% ( l IO0 mL di sodio salicilaio 17% ( 1 70 g L-') c 100 niL di acqua distillala:

2.6. soluliione di dieloroi uruio sodico C). 1 O/): scioglicrc 1 g di dicloroisocianuralo sodico

2.7. soluzionc stan

3. Apparecc

ura da laboratcirici c in particolare: 1 ,, provvisic di iappo di vclm:

filtranti da vuoto (di policiilcne): 3.5. spcttroSotometro o colorimctro.


4. Procedimento

4.1 . Sixggio cili ~~trivirit a) Saggio in asscn~a dl tar~~potle: 5 g di S U O I prevet~tivametiie sctaeciati (<2 inrn) c conser~ati in buste i11 beuti: da 100 n?L e umettati con 2.5 mL di soluxionc Q . con tappo di veiro, vengono incubate per 2 ore inciiba~ione, i tappi vetigono rimossi e ai cariipioni v KCl/HCl (2.3.) e le niiscc.lc. vcngorio tcnilte in agita~ion 30 mitzuti. Le risultatiti sospensioni sono poi liltrate sotto vuoto Whaiman n 42. Sui filtrati si erettua la dctcrnlina~ionc colorirncirica d I l saggio v a cffettuaio i n triplicaio. b) Saggio in prcs~rira d i tampnnc. A 5 g di siiol 1oCI mL. vcngono aggiunti 2.5 rnL di solulrionc eonccnlrala di urca 0.72 h4 tampone borato pH 10.0 (2.4.). 1 campioni vengono iricubaii per 2 ore a 30 ml di solu~ionc di KCIII-ICl (2.3.) e succcssivariieriic filtrati come dcscritt cmcntc. I filtrati ottenuti vengono poi a n a l i ~ ~ a t i per i l coiltenuto di ammoniaca. I1 sag Ikttuato in triplicato

Per ambedue i metodi si allcsiiscono carripioni di con ubando il suolo con 2.5 mL di acqua distillata e aggiut~gendo urea alla tlnc dcll' nc c imti~cdiatanicntc prima dcll'aggiunta della solu~ione KCI/HC'L.

4.2. Defenninuzione coiorin7eti.ic.a del1 'ammoni 1 mL di liltrato viene diluito a 10 mL con ae ata c si aggiungono in succcssionc 5 mL della ~soluzionc di sodio salicilato (2.5.) c di solu~ionc di sodio diclornisocianurato (2.6.). Si incuba a temperatura ambicnie per nuii C si Icggc I'assorban~a a 690 nm. I1 calore G stabile per almeno X orc a temperatura ambiente.

La s~andardizza~ionc del metodo a1lcl;icndn una curva di calibra~ionc u t i l i ~ ~ a n d o la soluloione standard di NH4C1. C , 0.5, 1 .O, 1.5 e 2.0 pg per niL di NH4--N vengono solloposti al procedi

L-allivita ureasica si csp quantilà (g o moli) di ammoniaca prt)dolta da 1 g di suolo in 2 ore di incubazione.

ianic l a curva di ca1ibra;oionc preparata standard di clorurn di ammonio. Nel calcolo vanno considcratc lc

successiva dctcrmina~ionc colorimctrica.


Metodi IV.2.

ATTIVITA PROTEOLITICA DEL SUOLO

l. Oggetto I l prcscnte docun~cnto fissa i n~ctndi per la dctcrn~inazione dell'altivili protcol

Metodo IV.2.1.

Attività proteasica verso substrati di alto peso molecola

l , Principio I l n-ieiodo si basa sulla deterrriit~azionc di an~minoacidi rilasci o incubairionc dcl suolo i11 prcsetua di cascina.

2. Reattivi 2.1. Soluzione tatiipone (Tris 50 mM a pH 8.1). Si s lo 6.05 g di Tris (idrossinietil)

amrninotnctario i11 700 mL di acqua distillata si aggiusta i l valore di pH della solu~ione a S,I con una solil~ione di HCl; si di1 inc ad 1 1 con acqua distillata:

2.2. soluzione di cascitln. Si sospendono 10 g nto sodico i n ~cq i ia distillata cnlda (circa 50°C) e dopo agita~ione pcr alrlietio I porta a 500 mL con acqua distillata. Se si dispone di cascina si cortsiglia di sospc.rt O g del composto in tampone tris (1) C di portare eueriti~alrncnte il valore di pH a 8.1 lu~ionc di NaOH; dopo avcr agitato la sospensione per uln~cno 1 ora si porla a 500 mL con tampone lris;

2.3. solii~iorie di acido tricloroacciic lgorto 75 g di acido tricloroacetico (TCA) in diluisce a 500 tiiL con acqua distillata;

2.4. sriluzioric di carbonaio sodico. o 50 g di Na2C'03 in h0 mL di una solu~ionc di NaOH IN che sono stati iri nza diluiti con acqua distillata: inline si diluisce ad I

uS04.5H20 in acqua distillata c si porta 11 volunic della sol 100 riiL coti acqua distillaia;

g di tartrato sodico (C4H4KNa0,, 4 H 2 0 ) in acqua distillala e si a 100 rnL con acqua distillala;

ico c tartrato sodico. SI diliiiscono 1000 rriL della qnlii/inne neln (4) rnn 211 n71 drlla ~;nlii/innt- 5 r rnn 20 m[ rlclla srilii/~nnt?

l67 mL dcl reagcntc di Folin con 500 mL di solu~ione 6 iniitabilc c dcvc csiicrc prcparaia in~mcdiatamcntc prima

dard di tirosina. Si sciolgono 50 mg di lirosina in circa 70 mL di tan~ponc

3.1. Speltrolbtomctro; 3.2. bagno ad acqua con dispositii.~ pcr agitare c controllart: la lempcratura; 3.3. centrifuga.


4. Procedimento 4.1. Sug"6"io di altivitd Si pone 1 g di suolo frcscn in Lin i~rbo da ccntrif~iga c quindi si aggiungono 5 mL di Tris e 5 mL dclla soluzione di cascina. Dopo aver tappato i l tubo da centrifuga, si contenuto e si incuba pcs 2 ore a 50°C sotto agituione in un bagno termostat della incuba~ione si aggiungono 5 m[.., di TCA e si agita i l contenuto. conlrnllo si scguc lo stesso proiocollo spcrimcntalc dclla prova con la aggiungcrc la soluzione di cascina alla fine dclla incubazione cd immc dell'aggiunla di TCA. Si consiglia di replicare il saggio. Quindi si ccnt (1 0.000-20.000 g) pcr 10 minuti.

4.2. Deren~? innzioiw coiorimc)frica idegli i ~ m in»acid/ Vengorio aggiunti 5 mL del sumatante a 7,- rnL della solu~ionc nato sodico, solfato sarneico e Irastrato sodico; si incuba per 15 rninuti a tcmpcratur ltc c poi si aggiungono 5 mL della soluzione di Folin. Si filtra la sospcnsionc c do a si determina la dcnsitg ottica a 700 nni; si consiglia di eseguire diverse dctcrniin rima di ottcncrc un valore costante.

4.3. Pre[>nrnzi»nc Lbci E l r ~ ciwtw di rcrmfilm

Si pipcliano 0, 1, 2, 3, 4 e 5 mL della sol ositia i t i palloni volumctrici della capacita di 10 rnL; si aggiungono 5 rnL dcl ne di cascina in ciascun pallone \iolun~clrico e quindi si porta a voliirnc con il tan ris. Si detem-iirta la densità ottica come descritto in precedenza.

5. Espressione dei risultati L'attività proicasica si cspr i r~~c i n g) di tirosina prodotta da I g di tcrrcno sccco in 2 ore di incuba~iorie. Si soltrae la densilà ottica dcl coritrol uclla delle prove c si calcola la quantità di tirosina prodoila n~ediantc la curva di ca c preparala u t i l i ~ ~ a n d o la soluirionc standard di tirosina. Dopo si calcola l'atiiuità pro1 campione di suolo secondo la segliente forrnula:

C x 15 o sccco/2 ore =

pcso sccccr di 1 g di suolo

dovc 15 rapprcsc lume finale della soluzione dopo l'aggiiinta del TCA c C è la c n n c r n t r a ~ ~ n n c d~ 1 cicrminziz siilla ciirva di ralihra/innc

e dell'attivita proteasica verso un substrato a basso peso

si basa sulla determinazione dell'ammoniaca liberata per catalisi di un derivato dipeptidico (N-a-ben~oil-L-argininamidc, BAA) mediante misure polcn~iometrichc. I l metodo può csscrc applicato per tuiti i iipi di suolo, compresi quclli fortcrncntc organici.


2. l Tan~pone KZHP04/KHZP04 O. I M pH 7.00: 2.2. soluzioni: A: disciogliere g 27.8 di K H i P 0 4 in 1000 rnL di acqua dcioni 2.3. solu~ione B: disciogliere g 53.65 di K2HP04 . 7H20 o g 71.7 di KzHP

mi,; 2.4. miscelarc 390 mL di A con 6 10 riiL di i3 e diluire a 2000 riiL: pH 7.00; 2.5. NaOH 10 M: scioglicrc 40 g di idrossido di sodio INaOH. esente da a

mi, di acqua d e i o n i ~ ~ a l a , lasciare raSSrcddarc e diluire a l00 mL; 2.6. (substiato). N-a-bcri~oil L-ai-gii~iriari~nlidc idrocloruro morioidi-ato 0.0

deve esscre conscrvaln a 4°C (stabilc per circa 2 settimane), 2.7. KC1 2 M: scioglicrt: 149.1 g di sale anidro in 1000 rnL di acqua; 2.8. S U ~ L I L ~ U I I I : CuilCclltlata 11i NHJCI 1000 i~ig/L, pesaic, coi1 l'a a~iui le di t/- I ing,

3.819 g di cloruro di ammonio anidro (NH4CI) scccato a scioglicrc in acqua c diluire ad 1 litro,

2.9. soli i~ioi~e slandard di NH4CI 10 mgi'rnL. Dalla sol~ixiori trata di cloruro ainmonio si prepara per dilili~ioni: una solu~iont: a 10 rngL c una a per tararc lo striimcnlo.

3. Apparecchiatura

3.1. Poten~iornetro munito di clcttrodo sclct niaca; 3.2. bcigrio (ad a~ r jua ) ribcillarite, riscaldriici G Lcrr 3.3. agilalorc inagnetico; 3.4. pH-inciso; 3.5. vctr-cr ia da laborator-io.

4- Procedimento

!? prefctribile. coine in tutti i saggi e ici cscguirc proke in triplo, compreso i controlli.

3.1. Saggi» rfi ~rl'rivirrl

nlL; si aggiut~gono 4 t i~L di tarriponi: fosfato i: I si aggiunge solo tampone rosfato ( 11 substrato si aggiiinge dopo

di ammoniaca). Si pone ad incubare in bagno tcrmostatalo pctr 2 rio tappare con "paraliln~" o altro per impedire I'cvaporazinnc dcl agno e si aggiungono 4 m L di KCl 2M (volume

no Ic dctcrmina~ioni di ammoniaca libcrata dalla idrolisi cnzimatica a ~ i o n e contenenti suolo c 10 mL di solu~ionc. La

c eseguila al potcn~iornetro come qui di scguito riportato (taratura dello

le l'uso di potcnziomelri provvisti dclla lun~ionc "CONCENTRAZIONEi' oltre che a dei rnV, in q~iantn riperalivamcnte pii1 semplici. Possono comiinqilc csscre

ulilizzati tutti gli clcttron~clri in grado di apprczzaruariazioni di +/- 0.5 mV.


Prima dellruso assicurarsi della cl l lcicn~a dcll'clcttrodo sclcttivo e in particolare dclla integriti dclla membrana (altcnersi al manuale di istru~ione della dilta costruttricc). In generale i controlli da cscgulrc sono

- penden~a dclla reita di iaratura - conccnir temperatura); - Icmpo di risposta (è Iùn~inne della conccntruicinc di ammoniaca); - riproducibiliia (inicrvallo di conccntra~ionc con riiiposia lineare). Si esegue la dcicrmina~ione dclla solu~ionc solu~ione in un beaker da 25 mL, si immcrg con agilalore clcttromagnciico ( s c n ~ a creare vonici), si aggiungono 0. IL di NaOH 10 M (pH iniarno a l I ) . Si registrano i valori i ammoniaca, si cscguc quindi la dctcrmina~ionc dcl potcn~ialc da lu~ ionc avcnte la conccntra~ione di 1 mg/L. Le soluzioni a i un valore 10 rn concentra~ione danno approssimalivamente pcndcn~c di 57 C 59 mV a 25°C. Se si lavora con un apparecchio provvisto si imposta il valarc dello standard (p. cs. 1 mg/L) a cui corrispond tempo in mV sulla scala dcllo strumento; si imposla la pcndcn~a tr i sperimentali C lo strumento pronio per ulteriori dctcrmina~ioni, che saranno date i strumento non C provviiiio dclla funzionc "CONC". si ai vari campioni su una retta di taratura che forni5 in corrisponden~a dei valori di po~enzialc (mV). Dopo 10 delermina~ioni circa, c osserva ni operalive dcllo strumento, si devc canlrnllarc la concenira~ione di uno standard pcr rimuovere cvcniuale depositi di idro Qucsle prccau~ioni sono prcsc a d iscrc~i di "risposta" dell'elettrodo C del tipo di suola in esame.

5. Espressione dei risultati I valori di concentrazione di N misurati direttamente al potcn~iometro per i singoli campioni devono essere souraui

Quindi si calcola I'aiiiviia e a in base alla scgucntc csprcssionc:

;rgN - ?\I H, /mL Attività enzimatica ( k H,/g h - ' ) = xlO tnL

peso secco suolo x ore di incubazion e


Metodi Ifr.3.

DETERMINAZIONE DELL~ATTIVITÀ FOSF-ATASICA DEL SUOLO

l. Oggetto I l prcscntc documento fissa i n~ctodi per la dctcrn~inazionc dcll'attivit$ fosfatica

Metodo IV,3,1.

Metodo per la determinazione della fasfomonoester

1. Principio I1 principio del rnelodo per la determinazione del1 omotio-esterasi coiisistc nel dctcrniinarc spettrofoton~ctricmcnte a 400 t ~ m i l p- lo rilasciato quando il suolo C tilesso ad ir~ciibare con solu~ioni tamponate di p-nitro Lo di sodio (fosfomonocstcrasi) cvcnlualmet~tc in prescna di loluc.ric. come agente

2. Reattivi 2.1. Tanipone Universale Modificato (TIJM-s adrc; vedi "C'nniml:nti"i; sciogliere

12.1 g di tris(idrossimctil)arnrni~~orn~tano ido malcicn, 14,O g di acido citrico c 6,3 g di acido borico in 488 mL di NaO di diluire la solu~ionc ad un litro con H 2 0 distillala (cot~serva

2.2. tarilpone Univcrsalc M I ,O (TllM-6,5 C TLIM-I 1) : porrc 200 tnL di TUM-solu~ cr da 500 rnL, portare i l pH a 6.5 con iiria solu~ionc di HCI O, 1 N H 2 0 (TUM-6.5). Prclc~arc altri 200 tnL di TIJM-solu~i una s o l i l ~ i o n e di NaOH 0.1 N e quindi diluire ad un litro

2.3. p-Nitrofenil fosfato (p-N 5 M: i n un matraccio da 50 mL solubiliz~arl: 0,420 g di p- nitrofknil fosfato tctraidrnio (sale bisodico) in 41) tiiL di TIJM-6,s pcr saggi di foslbrnorioesterasi acida O in 40 inL di TCIh4-I l per saggi di IOsSomoiloestcrasi alcalina.

con i l TUh4 u l i l i ~ ~ u l o per la solubilizza~ione; 2.4. cloruro di calc rnatraccio da un litro solubili~zarc 73-5 g di LaLI2.H2O

, quindi portare a volun~c con H-O; 0,5 M: in un matraccio da un liiro scioglicrc 20 g di NaOH con circa

quindi portare a kolume con acqua; rd di p-nilroiènolo: sciogliere 1.0 g di p-nitrol'enolo con circa 70 rnL di

re ad un liiro cori H 2 0 (conscnrarc in tì-igorikro).


4. Procedimento Porre l g di icrrcnn in un n~airaccio da 50 mL. aggiungere 0,2 tiiL di tolucnc, 4 rnL di TUM- 6.5 per i saggi di fosfornonc>csterasi acida o di alcalina. ed 1 mL della solii~ionc contencntep-itilr per alcuni scco~tdi, chiudere i l ntatraccio c. porlo in incubaiorc a 37 "C pcr un'or rca~ione mediantc aggiunta di 1 niL di C'aC12 0.5 M c di 4 niL di NaOH 0,5 tullo per alcuni secondi quindi filtrare la sospcnsiot~c su un filtro a fascia n.2). Eseguire la letlurii spcltroSotornctrica del liltrato a 400 nm coittro iii1 '" da lutti i reagenti tranne la solu~ione del p-nitrolènil hslàto sostituendola appropriato. Contcmporancamcnic ai saggi di attività va eseguito un di controllo con lo slcsso procedimenio, rria aggiungendo la soluzione di p-nitrot'cnil aggiunto le solu~iuni di CaCl2 0,5 M e di NaOH 0,5 M (cioti im liltra~ionc della sospensione di terreno). La concentra~iont: del p-nitrofenolo contenuto nel Illtrato vicn o tramite una rctla di taralura costruita con le densità oltichc di coluzio pg di p-nilrnfcnoln. (Prcpararc tali soluzioni diluendo I o lu~ionc di p-nitrofcnolo 0.025 M a 100 mL con i l TUM appropriato, e prelevando ta solu~ionc aliquote di O, 1. 2, 3, 4 e 5 m]. Dopo aver aggluclalo i l volume a 5 soluloione 1 rnL di f'af'lz 0,5 M e 4 rnL di NaOH fillrata cscguirc la Icitura spcttrofoiomcirica a 400

5. Espressione dei risultati I risultati sono esprcssi in ~crmini di pg di p-ni

Metodo IV.3.2.

Metodo per la determina della fosfodiesterasi

terminazione delle tbsfodiestcrasi consiste nel determinare i l p-nitroSenolo rilasciato q~iando i l silolo C. messo ad

ilnaic di bis-11-nitrofctlilfosfato di sodio (fosfodicstcrasi), come agcntc s tcr i l i~~antc .

ssin1cii1)-an~minoriictano 0.05 M a pH X,0 (TRIS-8): scioglicrc h, 1 g di n~miniltiictano i n circa 800 rnL di H20 cd aggiilstarc i l pH ad 8,O con

i H2S04 0,2 N, quiridi diluire lino ad un litro; 11,005 M: sciogliere 0,18 1 1 g di bis-p-ilitrofcnil Sosfato

on circa 80 rnL di tampone TRIS-8, quindi diluire a 1110 mL con il tampone


2.3. coluzionc cstracntc di iris-iidro~simeti1)-amn~inomctano-idrossido di sodio 0, 1 M a pH 12 (TRIS-NaOH): sciogliere 12,2 g di tris-(idrtyssi-meti1)-amn~inometano con circa 800 mL di H 2 0 ed aggiustare il pH a 12 con NaOH 0,5 N, quindi diluire ad un litro con H

2.4. cloruro di calcio 0,5 M: scioglicre 73,5 g quindi diluire fino ad un litro con H20 ;

2.5. coluzionc di tris-(idrossimet11)-amminomcta g di tris-(idrassimeti1)-amn~inonictano con circa 800 m L di H 2 0 . quindi litro con H20;

2.6. so lu~ione siandard di p-niuolknolo (vedi Ibsibmonocsicrasi).

3. Apparecchiatura 3. l . Spciiraforomcrro UV-VIS; 3.2. pHmclro.

4, Procedimento Porre I g di terreno in un matraccio da 5 0 mL. aggiun n1L di tolucnc. 4 mL di lamponc TRIS-8 ed 1 mL della soluzione di b-PNP 0,0 Agitarc per alcuni secondi la miscela di rea~ione. Chiudere il matraccio e porlo in u la rea~ione mediante aggiunia di 1 mL di CaCI2 0.5 di TRIS-NaOH. Agitare 11 tutto pcr alcuni sccondi, quindi filtrare la ~ n ~ p c n ~ i o n c Eseguire la lettura ~peltrn fmomctrica sul Il ltrat nm operando come descritto pcr 1c Sosfumunoesierasi.

5- Espressiune dei risultati I risultati sono espressi in tcrmini di pg di p-nitrofcnolo g-l h- ' ,

Metodo IV.3,3.

ne della pirofosfatasi

I1 principio del m cr la dcicrn?ina~ionc della pirofosfatasi consistc nel dctcrminarc i l fosrato rilasciato quando i l suolo C mcsso ad incubarc

con una s o l u ~ i o fbslàto di sodio.

i sodio I N; riro 0,l N;

Univcrsalc Modilicalo (TUM-solu~ione madrc) (vedi fòsSomonocsterasi); a pH K,O (TUM-X}: prclcvarc 200 mL di TUM-~nluzionc niadre e portarli a pH K,O

C1 0 , I N, diluirc quindi fino ad un litro con H20 ;


2.5. soluzione di piroI%sEaio di sodio 50 niM; scioglicrc 2.23 g di NadP207.10H-O con 20 mL di TUhII-X; aggiuslarc il pH ad X.0 con urla solu~ionc di HC'I O. I N , quindi diluirc fino a 1 Ol) ml. c i ~ r i H 2 0 (preparare la colil/inne gii.irnalmerite):

2.6. solu~ione di acido asctlrbico O,! M-acido tricli'iroacetico 0,s M (Rcagcntc A): 8-8 g di acido ascorbico a 41 g di acido tricloroacciico con circa 400 tnL di aggiustare i1 volutiic a 500 t11L (preparare la solu~ionc giornalnicntc);

2.7.anlmonio ri~nlihdato icira~drato 0.015 M (reagente B): sclogl (NHq)~Mo702.4H20 con circa 450 rnL di HzO, quiridi diluir

2.8. citr alu di sodio (0.15 M)-arscriitv di sudic~ (0,3 M)-acido acc scioglieri: 44.1 di citrato di sodio C 39 g di Na3As03 con aggiungere 75 mL di acido acctico glaciale (99."S~s) c diluire fi

2.9. soluzione standard di tòsl'rito: sciogliere 0.439 g dl KH:PC>q c a 700 mL di H20 C

diluire quiridi fino ad l litro scrripre con H 2 0 (tale solunio tlc 100 pg di P-P04- "imL).

3. Apparecchiatura 3. l . SpcHrofnn~ciro UV-VIS; 3.2. pHtriclro.

4. Procedimento Porre 1 g di terreno in iin tubo da ccntrir~~ga ggiungcrc 3 niL della solurione di pirofosl'slto di sodio 50 mM cd agitare pcr aleli d i , chiudere i l tubo c porlo ad incubare a 37°C per 5 orc. Dopo iiicilba~ionc aggiunge ncdiatamentc 3 itlL di TLIM-8 c 25 mL di H2S04 1 N. Agitare la miscela per alrrieno ndi ccnirirugarc la sospcnsionc per 30 secondi a 1 2.000 rpm. Porre I niL rnatantc in un matraccio da 25 mL contenr=ntc 10 niL di rcagentc A, succcssivaniet~tc crc 2 mL di reagente B c 5 tnL di rcagcnte C. Dopo agila~ioizc porla 2 0 . Dopo qiiii~dici minuti Sarc la lcttiira al[o

spctloibtoinetro a 700 nin. La coneetztra~ione in P po4-3 clcmtinata lran~ite u~ta retta di taratura costri~ita c01-t le

dcnsità ottiche di soluzioni si contenenti O. 5, 111, 15, 20 c 25 pg di P - P C ~ - ' . (Preparare tal i solu~inni diluendo ione statldard di fosfato in matracci da I UU riiL c pndando a

5. Espressione dei 1 risiiltati sono espr termini di pg di P-PO~-> g-' [I-l.


l. Oggeffia Il presente documento fissa un metodo per la determinazione dell'attività suolo.

Metodct IV,4,1.

Metodo per la deterirriifiraziarie delfa arilsolf-fasi

1. f rincipio prlneipio del metodo, cmsiste nei determinrure , sptfs carnente il p-nitrofeno f o

nlmciato quando Iì suo10 4 messo ad incubase con om tamponata ch p- nitrcrfeniIs~~fat~ di sodio eventualmente in presenza di come agente steilizzante.

2. ReaEivi 2. t. Totuene; 2.2 tampnc: acetato 0,5 M a pH 5,8. sciogliere 6 CK3COONa.3I-fsO con circa 700 mL

di H20, %giungere 1,70 mL di acido ac aciate (99%) f: diluire ad un litro con HzO;

2.3. sollfziom di p-nitrofenils io 0,025 N: sciogliere 0,312 g di p nitrofenilsotfato di potassio con o, quindi diluire fino a SO TnL con il tampone. (Conse

2.4. c l o m di edcio (CaCl2) 0,5 IG fosfomonoestemsi; reparare come descritto per le fosfomonoesterasi; . Preparare come desentto per Ie fosfononoestcrasi.

3, Apparecchiatura 3. l. Speffrofotometro W

matraccio da 50 mL, aggimgre 0,25 rnL di toIuene, 4 mL di di soluzione di p-nitrofeni1 solfato di potassio. Agitare fa miscda

ubare a 37 "C per wi'ora. Bloccare Ia reazione M e 4 rxiL di NaOH 0,5 M agtando la miscela per

quindi "rltrare la sospensione su filtro a fascia blu (o Wfiatman n. 2). Sul la valutazione del p-nitmfenolo rilasciato seguendo le moddità descritte per erasi.

S. Espressione dei risultati I nsuItati sono espressi in temini di rng di p-nitroflenoIo g-' h-"


Metodi N.5,

DETERMINAZIONE DELL'ATTIVIT~ DEIDIIC)GENASIGA DEL

1. Oggetto I1 presente documento fissa i metodi per la determinazione dell'a~ività deidr

Determinazione do?! P stttivtfiài deidrogenastc

1, Principio II metodo si basa sulfa detemlndone del prodotto di r

) d o p iricubazlone per 2 ore di I g d nitrote@aoIiocIonuo (m). Le deteminazioni vanno in qumto I'agivltk puO variare considerevolmente e

2. Rmffivi 2. i Substrato: 2 (p-iodofeni1)-3 -(p c I o m

(iodonitrofeniI~t~oazoIio, N). 2.2. 500 mg dì IlrJT sono miscelati con , agitati

vigorosamente, trasfefiti in un matraccio d distillata e bppati; si disciolgo soluzione viene preparata a l momento de12'uso e tenuta a l buio;

2.3. tampone: TRIS 0.1 in 800 mL di acqua distiflab;

2.5, soluzione estraente del ano10 f l: I); compresi nell'int11~~allo 0-

do prelevato di fI-sco è posto in una provett, rniscelato con 1.5 di M, p33 7.0 e 2 mi, di s u b s ~ m INT 0.5 %; per deterniinart: YaRivili5.

ggfruzg acqua invece del t m p n e . Le provefte vengono leggermente e Incubaie a 4Q°C al buio per 2 ore. Viene preparato un contrailo

per 20 minuti e tratbto corne i campiorli. Le analisi si preparano in triplo. Dopo 2 ore di incubazione, i campioni vengono trattati con 10 d defIa


niiscela N,N-dimetilfo ideletanolo, al buio e agltando vigorosmente ogni 20 minutj. per 1 ora, per estrarre 1 La soldone ottenuta viene filt-ah e Lmmediatamente si esepono le le spemofotome@o a 464 m, usando la soluzione; estraente come bianco, 11 colore k s circa 3 ore; se occorre, si può diluire con la stessa soluzione estraente, per abb delle letnire, La concentrazione di R.STF prodotto viene calcolata da ma reEa di ta l'assorbanza in funzione di concentrazioni note di NTF.

5. Espresstoxie del rIsuItati I valoi delle assortianzi: relativi ai controIlt (che rappresentano 1 one "chimica" o "abiotica" del siihstrato) si sottraggono da qtielli delle prove. 1L"attivita deidrogenasica viene espressa in moli INTF g1 suolo se

Metodo di determlnaziont: d~ill'attivitzi de nasica sempl*cato

1. Principio 111 metodo si basa sulla deteminazione del Q rehone, iodo-nitrofenilformazano (INTF) dopo incubazione per 20 ore di suo10 con una soluzio~tie di Iodo nikrotetrazol iocloruro (N),

2, Procedimento Le deteminazioni nei carn controlli vengono eseguiti in triplo. E' preferibile eseguire le detem~nazioni e orc dal prelievo, in quanto l'attività puC1 vanmc considerevolmente con il tern ecorida del suolo. Il suolo f l g) prelevato di fresco viene pesato, posto in provette di v , e umidihcato al 60% della sua capacita di ritenzione idrica. Si aggiungano 0.2 alto allo 0.4% in acqua distillab (per sciogliere l'm in acqua occorre agfhre vigorosaniente o utili ul&asuorri). Si pone ad incubare al

ambiente o, se dispon in camera buia temostatata a 20°C. soluzione estraente c m p s t a da tetracloroetjlene e acetone a mano per 1 minuto (I'estraente si addiziona subito prlma di

Watmann No 4 1 (se possibile si centrifuga a 4000 giri mln", per 5

estratto si determina mediante lettuxa spetbrofotometnca a 490 m, soluuone estraente.


3. Espressione dei rkuttati

Le letture di ass 723 delle prove, sottraee ri relativi ai controlli, wasf~mate in mg rnL" mmediank una r& di preparata con concerrt di ENTF ( I , 2, 2.5, 5.0, 10 mg disciolto nella soluzione estrae deidro-nasica si esprime come rng prodoEo per g di suolo secco (c contenuto di midit j ) per ora di incubazione (mg NTF C' h-'). CaIctrlo:

v* = volume di acqua necessano per mantenere iI suoto a capacita massima di ntenzione idnca -t volume di substmto aggunto.

04A02195

GIANFRANCO TATOZZI, direttore FRANCESCO NOCITA, redattore

(G40302911) Roma, 2004 - Istituto Pol' e Zecca dello Stato S.p.A. - S.

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