Metodi post-genomici in biochimica cellulare

Metodi post-genomici

Quantitative analysis of systems biology by taking advantage of available genomic information at the level of

1. SNPs analysis associated to disease or drug response2. mRNA (transcriptomics)3. Protein (proteomics)4. Post-translational modifications (aka “modificomics”)5. Surface exposure (surfomics)6. Protein-protein interactions (interactomics)7. Small metabolites (metabolomics) and their relations

(metabonnomics)

Many other fantasy exercises (glycomics, lipidomics, allergenomics, degradomics, excluding – perhaps – comics...)

G.B Smejkal, “I’m an –omics, you’re an -omics... ” Exp. Rev. Proteomics 3 (2006) 383-385

Metodi post-genomici

Metodi post-genomici

• Modelli cellulari e animali• Trascrittomica• Proteomica• Systems biology

Modelli cellulari e animali(farmacologici e/o genetici)

Modelli cellulari(farmacologici e/o genetici)

• Facilità di mantenimento e trattamento

• Possibilità di combinare trattamento farmacologico e manipolazione genetica

• Utili per riprodurre un singolo meccanismo

• Cellule umane (o murine)

Modelli animali(farmacologici)

• Intero organismo vs. cellule isolate

• Trattamento sistemico o lesione chimica locale

• Possibilità di valutare l’effetto anterogrado/retrogrado

Modelli animali (e vegetali?!?)(genetici)

• Organismi modello• Genoma noto• Non solo topo!• Vita breve• Invertebrati (e piante…)

Trascrittomica

Trascrittomica

Trascrittomica

Trascrittomica

Trascrittomica

• Distanza Euclidea

• Correlazione di Pearson

Proteomica

• Non c’è correlazione tra quantità di mRNA e quantità di proteina (Gygi et al., 1999)

• Il proteoma è un’istantanea del fenotipo a livello biochimico

• Il proteoma tiene conto del processing delle proteine

S.P.Gygi et al., Mol. Cell. Biol. 19, 1720 (1999)

Proteomica

• Metodi basati su 2-DE• Metodi “gel-free”

Proteomica (2-DE)

Principi della 2-D elettroforesi

• I dimensione Isoelettrofocusing in condizioni denaturanti: separazione in base al punto isoelettrico

• II dimensioneSDS elettroforesi: separazione in base al peso molecolare

Proteomica (2-DE)Vantaggi• Possibilità di caricare campioni non purificati• Risoluzione estremamente alta• I gel 2 –DE sono collettori di frazioni proteiche molto efficienti • Proteine sono protette all’interno della matrice del gel

Problematiche • Gradiente di pH • Limiti nel determinare proteine poco rappresentate • Capacità di caricare campione • Proteine idrofobiche • Proteine ad alto peso molecolare

Proteomica (2-DE)

• A global, unbiased approach• Hypothesis-generating rather than hypothesis-driven• A “find the difference” game between two

conditions

Control Treated

Proteomica (2-DE)

Proteomica (2-DE)

ProteineProteine

ColorazioneAcquisizioneAnalisi di immagine

Proteomica (2-DE)

Find the difference…

ControlloControllo Esordio PrecoceEsordio Precoce Esordio TardivoEsordio Tardivo

Proteomica (2-DE)

Find the difference…

Proteomica (2-DE)

Metodi statistici

Proteomica (2-DE)

• Peptide mass fingerprinting• LC-MS/MS• Western blot (non globale)

Identificazione delle proteine

Proteomica (2-DE)

Peptide Mass Fingerprinting

Proteomica (2-DE)

Peptide Mass Fingerprinting

Proteomica (2-DE)

Peptide Mass Fingerprinting (Limiti)

• La proteina non è presente nel database• La proteina è ricca di modificazioni co/post-

traduzionali• Lo spot nasconde più di una proteina

Proteomica (2-DE)

Peptide Mass Fingerprinting (Limiti)

• La proteina non è presente nel database• La proteina è ricca di modificazioni co/post-

traduzionali• Lo spot nasconde più di una proteina

Proteomica (2-DE)

LC-MS/MS

Proteomica (gel-free)

• Metodi quantitativi (ICAT, iTRAQ, …)• Protein arrays

Proteomica (gel-free)

• ICAT

Proteomica (gel-free)

• iTRAQ

Proteomica (gel-free)

• Protein arrays (e SELDI)

Systems Biology

• Necessità di analizzare un elevato numero di informazioni (Network analysis)

• Necessità di arricchire un ridotto numero di informazioni (Network enrichment)

Systems Biology

• Interazione fisica• Stesso pathway (KEGG)• Stessa Gene Ontology

(GO)

Systems Biology

Un esempio(realizzato a Busto…)

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Un modello cellulare per identificare Un modello cellulare per identificare nuovi meccanismi e nuovi bersagli nuovi meccanismi e nuovi bersagli

terapeuticiterapeutici

Il modello cellulareIl modello cellulare

• La linea cellulare umana SH-SY5Y incamera dopamina, ma la immagazzina con difficoltà nelle vescicole

• La linea viene trasfettata stabilmente per esprimere α-sinucleina or β-galattosidasi

Simile a quello che succede nella malattia di Parkinson

Simile a quello che succede nella malattia di Parkinson

α-sinucleina

(Gómez-Santos et al., 2003)

I livelli di α-sinucleina sono alterati nella malattia di Parkinson

I livelli di α-sinucleina sono alterati nella malattia di Parkinson

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Le condizioni sperimentaliLe condizioni sperimentali

-SinucleinaD

opam

ina

Effetto combinato

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Trova la differenza!Trova la differenza!

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Trova la differenza!Trova la differenza!

• sintesi proteica

• mitocondri

• stress ossidativo

• citoscheletro

• trascrizione

• mitocondri

• trasduzione del segnale 42

Cosa hanno in comune?Cosa hanno in comune?

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Generare nuove ipotesiGenerare nuove ipotesi

NF-κB

Apoptosi

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Ritorno al modelloRitorno al modello

VDAC2 4h

ctr

ctr inib

DA inib

DA

Inibitore GSK3β

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Alberio, Fasano, Rizzuto e altri,in preparazione

VDAC2Ctr DA VDAC1 VDAC2 VDAC3

Ctr DA Ctr DA Ctr DA

Partendo dal modello cellulare, Partendo dal modello cellulare, verso nuovi bersagli terapeuticiverso nuovi bersagli terapeutici

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