8/8/2019 Metodos de Trabajo Con Acidos Nucleicos

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Isolation of Nucleic AcidsGoals: removal of proteins DNA vs RNA isolation of a specifictype of nucleic acid

Types of Methods: differential solubility adsorption methods density gradientcentrifugation

Types of DNA: genomic(chromosomal)

organellar (satellite) plasmid (extra-chromosomal) phage/viral (ds or ss) complementary

(mRNA)

General Features: denaturing cell lysis (SDS,alkali, boiling, chaotropic) enzyme treatments

- protease- RNase (DNase-free)- DNase (RNase-free)

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High MW Genomic DNA Isolation

Typical Procedure1 Cell Lysis 0.5% SDS + proteinase

K (55o several hours)

2 Phenol Extraction gentle rocking severalhours

3 Ethanol Precipitation

4 RNAse followed byproteinase K5 Repeat phenol extrac-

tion and EtOH ppt

Phenol Extraction mix sample with equal volumeof sat. phenol soln

retain aqueous phase optional chloroform/isoamyl

alcohol extraction(s)

aqueous phase(nucleic acids)

phenol phase(proteins)

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High MW Genomic DNA Isolation

Typical Procedure1 Cell Lysis 0.5% SDS + proteinase

K (55o several hours)

2 Phenol Extraction gentle rocking severalhours

3 Ethanol Precipitation

4 RNAse followed byproteinase K5 Repeat Phenol Extrac-

tion and EtOH ppt

EtOH Precipitation 2-2.5 volumes EtOH, -20o high salt, pH 5-5.5 centrifuge or spool out

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Isolation of RNASpecial Considerations RNAse inhibitors!

extraction in guanidine salts phenol extractions at pH 5-6

(pH 8 for DNA) treatment with RNase-free DNase selective precipitation of high MW

forms (rRNA, mRNA) with LiCl oligo-dT column

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Plasmid Miniprep Protocol1. Solubilize bacteria in alkali

solution2. Neutralize with Na-acetate3. Centrifuge, discard pellet4. Mix supernatant with resin

+ chaotropic agent5. Wash resin6. Elute DNA with low salt

buffer

Adsorption Methods nucleic acids selectively absorb to silica or diatomaceous earth in presence of certain

chaotropic agents or salts

applications: plasmid preps fragments after

electrophoresis PCR templates

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Density Gradient Centrifugation rate zonal/sucrose (size fractionation)

electrophoresis more common

isopycnic/CsCl (density) DNA ~1.7 g/cm

3

protein ~1.3 g/cm 3 RNA > DNA ssDNA > dsDNA GC content

20 40 60 80

% GC base pairs

1.68

1.70

1.72

1.74

d e n s i t y ( g / c m 3 )

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CENTRIFUGACIN EN GRADIENTE DE CsCl

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Cuantificacion de ADN

Bromuro de etidio

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Evaluation of Nucleic Acids

A260 1.0 50 g/mlDNAA260 /A 280 1.6 - 1.8A260 1.0 40 g/mlRNAA260 /A 280 ~2.0

spectrophotometrically quantity quality

fluorescent dyes gel electrophoresis

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Geles de Agarosa y Poliacrilamida

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Geles de Agarosa

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ELECTROFORESIS DE CIDOS NUCLEICOS

oporte:(restrictivo)

Gel de Agarosa molculas grandes (0.1-60 kpb)Gel de Poliacrilamidamolculas pequeas (6-2000 pb)

lectroforesis horizontal(agarosa)o vertical(poliacrilamida)

Separacin slo porTAMAO

Densidad de carga igual para todas lasmolculas por los grupos fosfato

cidos nucicos = carga(-)

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Aplicaciones:

* Separar, identificar y purificar fragmentosde DNA o RNA

* Determinar tamao de un fragmento de DNA* Separacin de cromosomas enteros

* Secuenciacin de DNA* Identificacin de regiones de unin a

protenas

* Detectar la presencia de un gen (o secuenciaespecfica de DNA) en una muestra

* Determinar si se expresa un gen especfico

ELECTROFORESIS DE CIDOS NUCLEICO

Gel de poliacrilamida

Gel de agarosa

Southern Blot

Northern Blot

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EN GEL DE AGAROSA

muestra (-)

+ -

Campo elctrico ( V)

1. Preparacin del gel

2. Aplicacin de la muestra3. Electroforesis4. Deteccin por tincin conBromuro

de Etidio(BrEt): se intercala en elDNA y al irradiarlo con luz UVemite fluorescencia

Electroforesis horizontal

Soporte:(restrictivo) Gel de agarosa

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ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

% Concentracin Rango pb

0.5 1000-30.0000.7 800-12.000

1.0 500-10.000

1.2 400-7000

1.5 200-3000

2.0 50-2000

Xileno de cianolAzul de bromofenol

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Geles Agarosa II

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PULSE FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE)

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Curvas Cot

Las curvas Cot sirven para estimar la complejidad de los genomas.Se entiende por complejidad lacomposicin, con respecto a la frecuenciade secuencias de ADN repetitivas.A > rapidez, < complejidad y viceversa.

La tcnica se basa en el calentamientoy posterior enfriamiento de las hebras

ADN. Durante este proceso la doblehlice se separa al alcanzar unadeterminada temperatura (Tm).Al enfriarse estas se vuelven a unir,la rapidez con que esto ocurra,se relaciona con la mayor o menor complejidad de las secuencias.

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HIBRIDACION DNA

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HIBRIDACION DE COLONIAS

SOUTHERN BLOT

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* InteraccinDNA-DNA(hibridacin por complementariedad de cadena)* Detectar en una mezcla una secuencia de DNA concreta mediante el u

sondas de DNA especficas (muy sensible)

* Detectar la presencia de un gen, etc.

Gel Agarosa Southern BLOT

Todos losDNA DNAde inters

Resultado

1. Electroforesis en gel de agarosa

molculasde DNA

SOUTHERN BLOT

2. Transferencia a membranamolculasde DNA

3. Hibridacin con la sonda radioactiva

DNAintersATTGCA

TAACGT

Sondade DNA 32P

e-

4. ReveladoDNAinters

32P

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SOUTHERN BLOT

NORTHERN BLOT

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* InteraccinRNA-DNA(hibridacin)* Detectar en una mezcla una secuencia de RNA concreta mediante el u

sondas de DNA especficas (muy sensible)

* Expresin gnica

Gel Agarosa Northern BLOT

Todos losDNA

RNAde inters

Resultado

1. Electroforesis en gel de agarosa

molculas

de RNA

NORTHERN BLOT

2. Transferencia a membranamolculasde RNA

3. Hibridacin con la sonda radioactiva

RNAintersAUUGCATAACGT

Sondade DNA 32P

e-

4. ReveladoRNAinters

32P

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GEL SHIFTFactor proteco

Anticuerpo

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Geles Acrilamida

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Geles Acrilamida

Secuencia

A c G T

AFLP

DH5

Southern Blot

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DNA FOOTPRINTING

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Endonucleasas :

DNAasa I: rotura completa, tipo a

DNAasa II: rotura completa, tipo bRNAasa pancretica: rompe (b) enlaces Py-XRNAasa T-1: rompe (b) enlaces G-X

Endonucleasas de restriccin

Exonucleasas :

Exonucleasa de bazo: libera 3-nucletidosExonucleasa de veneno de serpiente: libera 5-nucletidos

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Endonucleasas de restriccin, 1 :

1. Reconocen secuencias especficas, por lo general palindrmicas :

5- ATCGTTGCCTACAATT GAATTC CCAATAACCCTT -3

3- TAGCAACGGATGTTAA CTTAAG GGTTATTGGGAA -5

La secuencia reconocida en este caso es GAATTC

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Endonucleasas de restriccin, 2 :

2. Suelen romper el polinucletido dejando extremos cohesivos :

5- ATCGTTGCCTACAATT GAATTC CCAATAACCCTT -3

3- TAGCAACGGATGTTAA CTTAAG GGTTATTGGGAA -5

5- ATCGTTGCCTACAATT G

3- TAGCAACGGATGTTAA CTTAA

AATTC CCAATAACCCTT -3

G GGTTATTGGGAA -5

Lo que permite la soldadura de fragmentos de DNA rotos por lamisma endonucleasa de restriccin

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Supongamos la secuencia reconocida por la endonucleasade restriccin EcoRI, que es

5-GAATTC-3

En un DNA que contenga 30% de A, 30 % de T, 20 % de G y20 % de C, la probabilidad de encontrar esta secuencia al azar sera de

0.2 x 0.3 x 0.3 x 0.3 x 0.3 x 0.2 = 0.000324

O lo que es lo mismo, aproximadamente una cada 3086 nucletidos

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RFLP

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Reaccion en Cadena de la Polimerasa

DNA fragment

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PCR TIEMPO REAL

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42/70

PCR TIEMPO REAL

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43/70

PCR TIEMPO REAL

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Mutagenesis Dirigida

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- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G

- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G

- * T A G G C A C G

3

3

3 5

5

5

1 . S e a u n D N A q u e s e d e s e a s e c u e

2 . D i s p o n e m o s d e u n o l i g o n u c l e t i dc o n e l D N A c u y a s e c u e n c i a d e s e ao l i g o n u c l e t i d o e s t m a r c a d o r a d i

T A G G C A C G

Mtodo de Sanger para secuenciacin de polinucletidos

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3 . L a m u e s t r a s e d i v i d e e n c u a t r o p

A ) L o s c u a t r o d e s o x i n u c l e s

B ) D N A p o l i m e r a s a I ( f r a g my e s p e c f i c a m e n t e c a d a u n a ,

C ) u n d i d e s o x i n u c l e s i d o t r il a s n t e s i s d e D N A a l l d o

d A T Pd G T Pd C T Pd T T P

d d A T P

d A T Pd G T Pd C T Pd T T P

d d G T P

d A T Pd G T Pd C T Pd T T P

d d C T P

d A T Pd G T Pd C T Pd T T P

d d T T P

M u e s t r a AM u e s t r a B M u e s t r a CM u e s t r a

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- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G G G T

- * T A G G C A C GA AG *

- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G G G T T

- * T A G G C A C GA A GG *

- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G G G T- * T A G G C A C GA A G G C A C A T T CG *

- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G G G T

- * T A G G C A C GA A G G C A C A T T C G A TG *

- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G G G T- * T A G G C A C GA A G G C A C A T T C G A T G C A A T CG *

- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G G G T

- * T A G G C A C GA A G G C A C A T T C G A T G C A A T C G A A T CG *

3

3

5

5 3

4

1 2

1 5

2 1

2 6

Sntesis en presencia de ddGTP

8/8/2019 Metodos de Trabajo Con Acidos Nucleicos

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- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G G G T

- * T A G G C A C GA *

- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G G G T

- * T A G G C A C GA A *

- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G G G T

- * T A G G C A C GA A G G CA *

- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G G G T

- * T A G G C A C G AA G G C A CA *

- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G G G T

- * T A G G C A C GA A G G C A C A T T C GA *

- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G G G T

- * T A G G C A C GA A G G C A C A T T C G A T G CA *

3

3

5

5

1

2

6

8

1 3

1 7

Sntesis en presencia de ddATP

Sntesis en presencia de ddCTP

8/8/2019 Metodos de Trabajo Con Acidos Nucleicos

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- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G G G T T T

- * T A G G C A C GA A G GC *

- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G G G T T T

- * T A G G C A C GA A G G C AC *

- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G G G T T T

- * T A G G C A C GA A G G C A C A T TC *

- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G G G T T T

- * T A G G C A C GA A G G C A C A T T C G A T GC *

- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G G G T T T

- * T A G G C A C GA A G G C A C A T T C G A T G C A A TC *

- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G G G T T T

- * T A G G C A C GA A G G C A C A T T C G A T G C A A T C G A A TC *

3

3

5

5

5

7

1 1

1 6

2 0

2 5

Sntesis en presencia de ddTTP

8/8/2019 Metodos de Trabajo Con Acidos Nucleicos

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- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G G G T T

- * T A G G C A C GA A G G C A C AT *

- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G G G T T

- * T A G G C A C GA A G G C A C A TT *

- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G G G T T

- * T A G G C A C GA A G G C A C A T T C G AT *

- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G G G T T T

- * T A G G C A C GA A G G C A C A T T C G A T G C A AT *

- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G G G T T T

- * T A G G C A C GA A G G C A C A T T C G A T G C A A T C G A AT *

- A T C C G T G C T T C C G T G T A A G C T A C G T T A G C T T A G C T T G C A G G G T T

- * T A G G C A C GA A G G C A C A T T C G A T G C A A T C G A A T C G A A C GT *

3

3

5

5

9

1 0

1 4

1 9

2 4

3 1

Sntesis en presencia de ddTTP

G A T C

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6 0

5 0

4 0

3 0

2 0

1 0

+

-A continuacin, las cuatro mezclasse someten a electroforesis en poli-acrilamida-SDS. Este mtodo sepa-

ra polinucletidos en funcin de sutamao, de forma que los ms cortosse desplazan ms rpidamente. Comoel cebador est marcado radioactiva-mente, revelamos la plancha deelectroforesis por autorradiografa.

Con esto leemos directamente lasecuencia complementaria del poli-nucletido inicial:

5-AAGGCACATTCGATGCAAT-CGAATCGAACGTCCCAAAAG-GATTCCGGGAAAATG-3

8/8/2019 Metodos de Trabajo Con Acidos Nucleicos

53/70

8/8/2019 Metodos de Trabajo Con Acidos Nucleicos

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VECTORESVECTORES

Construidos a partir de plsmidos y bacterifagos naturalesConstruidos a partir de plsmidos y bacterifagos naturales

CaracteristicasCaracteristicas

1) REPLICON ESTABLE1) REPLICON ESTABLE:: Posee secuencias que permiten suPosee secuencias que permiten su propagacin propagacin

2) MCS: (multiple cloning site)2) MCS: (multiple cloning site)sitio para insertar el DNA asitio para insertar el DNA aclonar- Posee sitios nicos para varias ER clonar- Posee sitios nicos para varias ER

3) MARCADORES DE SELECCIN:3) MARCADORES DE SELECCIN:Confieren propiedadesConfieren propiedadesfentpicas a la clula huesped.fentpicas a la clula huesped.

8/8/2019 Metodos de Trabajo Con Acidos Nucleicos

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TIPOS DETIPOS DE VECTORESVECTORES

1) VECTORES DE CLONADO-1) VECTORES DE CLONADO-Aislamiento de fragmentos deAislamiento de fragmentos deDNADNA

2) VECTORES DE EXPRESION-2) VECTORES DE EXPRESION-Expresin de genes clonadosExpresin de genes clonados

3) VECTORES ESPECIALES-3) VECTORES ESPECIALES-Permiten estudio de promotores yPermiten estudio de promotores ysecuencias regulatorias de la expresin gnicasecuencias regulatorias de la expresin gnica

8/8/2019 Metodos de Trabajo Con Acidos Nucleicos

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TIPOS DE VECTORES DE CLONADOTIPOS DE VECTORES DE CLONADO

PLASMIDOSPLASMIDOS

::

Lmite clonado 0.1- 10 KbLmite clonado 0.1- 10 Kb

FAGOSFAGOS::Derivados del bacterifago Lambda, 8-25 KbDerivados del bacterifago Lambda, 8-25 Kb

COSMIDOSCOSMIDOS::Combinacin fagoCombinacin fago y plsmido, 35-50 Kby plsmido, 35-50 Kb

BACBAC(Bacterial Artificial Chromosomes)(Bacterial Artificial Chromosomes)Derivados plsmido F, 75-300 KbDerivados plsmido F, 75-300 Kb

Vectores derivados deVectores derivados deBacteriofago P1BacteriofagoP1 , 100 Kb, 100 Kb

YACYAC (Yeast artificial Chromosome)(Yeast artificial Chromosome)cromosoma de levaduras artificial, 100-1000 Kbcromosoma de levaduras artificial, 100-1000 Kb

8/8/2019 Metodos de Trabajo Con Acidos Nucleicos

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PLASMIDOSPLASMIDOS

Molcula DNA doble cadena circular extracromosomalMolcula DNA doble cadena circular extracromosomal

que replica en forma autnoma dentro de la bacteriaque replica en forma autnoma dentro de la bacteria(1.6-300 Kb)(1.6-300 Kb)

FUNCIONES CODIFICADAS POR LOS PLASMIDOSFUNCIONES CODIFICADAS POR LOS PLASMIDOS

Resistencia a antibiticosResistencia a antibiticos

Degradacin de compuestos orgnicos (Pseudomonas)Degradacin de compuestos orgnicos (Pseudomonas)Produccin de toxinas (ej E.coliProduccin de toxinas (ej E.coli

enterotoxinas)enterotoxinas)

Produccin de bacteriocinas (colicinas, subtilicinas)Produccin de bacteriocinas (colicinas, subtilicinas)

Induccin de tumores (plantas)Induccin de tumores (plantas)

Sistemas de Restriccin-modificacinSistemas de Restriccin-modificacin

Produccin de antibiticos (ej Streptomyces)Produccin de antibiticos (ej Streptomyces)

Resistencia a metales pesadosResistencia a metales pesados

8/8/2019 Metodos de Trabajo Con Acidos Nucleicos

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CLASIFICACN DE PLASMIDOSCLASIFICACN DE PLASMIDOS

N DE COPIAS:N DE COPIAS:Alto o bajo N de copias.Alto o bajo N de copias.El N de copias depende del tipo de ori de replicacinEl N de copias depende del tipo de ori de replicacin

30 Replicones diferentes30 Replicones diferentes

Bajo N de copias:1-5 copiasBajo N de copias:1-5 copias

Alto N de copias : 20-40 copias (hasta 300 copias)Alto N de copias : 20-40 copias (hasta 300 copias)

CONJUGATIVOS O NOCONJUGATIVOS O NO

GRUPO DE COMPATIBILIDADGRUPO DE COMPATIBILIDAD

8/8/2019 Metodos de Trabajo Con Acidos Nucleicos

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Grupos de compatibilidadGrupos de compatibilidad

Grupo de compatibilidadGrupo de compatibilidad

: set de plsmidos cuyos miembros son: set de plsmidos cuyos miembros son

capaces de coexistir en la misma bacteriacapaces de coexistir en la misma bacteria

Plsmidos incompatibles: cuando NO pueden ser diferenciados unoPlsmidos incompatibles: cuando NO pueden ser diferenciados unodel otro en algn aspecto que es esencial para su mantenimiento: oridel otro en algn aspecto que es esencial para su mantenimiento: oride replicacin y/o sistema de segregacinde replicacin y/o sistema de segregacin

Sistema de segregacin: protenas que permiten la segregacin deSistema de segregacin: protenas que permiten la segregacin delos plsmidos en las clulas hijaslos plsmidos en las clulas hijas

8/8/2019 Metodos de Trabajo Con Acidos Nucleicos

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PLASMIDOS -VECTORES DE CLONADOPLASMIDOS -VECTORES DE CLONADO

CARACTERISTICASCARACTERISTICAS1) ORI (derivados de ColE1)1) ORI (derivados de ColE1)

2) POLILINKER (MCS)2) POLILINKER (MCS)

3) MARCADORES DE SELECCIN3) MARCADORES DE SELECCIN4) SECUENCIAS PARA SCREENING:4) SECUENCIAS PARA SCREENING: GalactosidasaGalactosidasa

8/8/2019 Metodos de Trabajo Con Acidos Nucleicos

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MARCADORES DE SELECCIONMARCADORES DE SELECCION

Permiten la seleccin de aquellas clulas que poseen el vector :Permiten la seleccin de aquellas clulas que poseen el vector :- Marcadores de resistencia a antibioticos- Marcadores de resistencia a antibioticos

- Marcadores de auxotrofa (permiten S! de un componente- Marcadores de auxotrofa (permiten S! de un componente

esencial ej aminocidos)esencial ej aminocidos)Antibioticos, ej:Antibioticos, ej:

Ampicilina , Tetraciclina , Kanamicina, ZeocinaAmpicilina , Tetraciclina , Kanamicina, Zeocina

8/8/2019 Metodos de Trabajo Con Acidos Nucleicos

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Ampicilina:Ampicilina:Interfiere con sntesis de pared bacterianaInterfiere con sntesis de pared bacterianaResistencia:Resistencia: gengen blabla lactamasalactamasa

Tetraciclina:Tetraciclina: Inhibe sntesis de protenas por unin a subunidadInhibe sntesis de protenas por unin a subunidadribosomal 30sribosomal 30sResistencia:Resistencia: gengen tet tet protena protena que se une a membranaque se une a membrana

bacteriana y impide transporte deantibiotico bacteriana y impide transporte deantibiotico

Kanamicina:Kanamicina: Se une a ribosomas 70s , produce misreading delSe une a ribosomas 70s , produce misreading delmRNAmRNAResistencia:Resistencia: gengen kankan aminoglicosido fosfo transferasaaminoglicosido fosfo transferasa

modifica el antibioticomodifica el antibiotico

Zeocina:Zeocina:Se intercala al DNA genSe intercala al DNA gen zeo zeo protena que protena quese une a antibiotico y evita su unin al DNAse une a antibiotico y evita su unin al DNA

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VECTORES DE CLONADO

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VECTORES DE CLONADO

MCS

Plasmido clonado promotor Plasmido clonado fragmento DNA

COMO SE ELIGE DONDE CLONAR?

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PROTEINA BLANCO

CONTIENE HIDRATOS DE CARBONO?CONTIENE HIDRATOS DE CARBONO?

SI NONO

CONCONMETIONINAMETIONINA

INICIAL?INICIAL?

TIENENTIENEN

IMPORTANCIAIMPORTANCIA

CLINICA?CLINICA?

PROTEINA DE FUSIONCLONADO DIRECTO

CELULAS Y

LEVADURAS

SI NONO

BACTERIAS

SI NONO

COMO SE ELIGE DONDE CLONAR?

CLONADO EN PLASMIDOSCLONADO EN PLASMIDOS

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CLONADO EN PLASMIDOSCLONADO EN PLASMIDOS

DIGESTION ER :DIGESTION ER :Plsmido y DNA a clonar Plsmido y DNA a clonar

LIGACIONLIGACION(in vitro, ligasa)(in vitro, ligasa)

TRANSFORMACIONTRANSFORMACION( bacterias competentes)( bacterias competentes)

SELECCINSELECCIN

SCREENINGSCREENING

TRANSFORMACION Y SELECCIONTRANSFORMACION Y SELECCION

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TRANSFORMACION Y SELECCIONTRANSFORMACION Y SELECCION

TRANSFORMACIONBacterias competentes:

Mtodos qumicos: Cl 2Ca, DMSO, etc

Eficiencia:10 7 cel/ g DNAMtodos fsicos: Electroporacin (pulsos electricos )

Ef: 10 8cel/ g DNA

SELECCINPresin de seleccin : crecimiento en presencia de antibitico

SCREENINGSCREENING

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SCREENINGSCREENING

ScreeningScreening :

para detectar la mlecula de plsmido que posee inserto para detectar la mlecula de plsmido que posee inserto

galactosidasa (no es concluyente)galactosidasa (no es concluyente)

Mapeo de restriccinMapeo de restriccin

PCR (colony PCR)PCR (colony PCR)

Hibridizacin in situ en la colonia con sondaHibridizacin in situ en la colonia con sondaespecficaespecfica

TRANSFORMACIN DEE coli con CaCl

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TRANSFORMACIN DEE. coli con CaCl2

Aspectos Tcnicos1 Seleccin del ADN de inters Dnde buscarlo ?

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1- Seleccin del ADN de inters Dnde buscarlo ?Qu expresamos ?

Cunto necesitamos ?2- Seleccin del vector

Expresin en eucariotas

Expresin en procariotas

3- Preparacin del vector y del insertoI- Digestin con Ez. de restriccin

II-Purificacin4- Ligacin vector-inserto5- Transformacin6- Cultivo en medio de seleccin7- Induccin