Micro ARNProteína

Nature 435:834-838. 2005 Science 277:965-968.1997

miARN.Transcripcion y modificaciones co-post-transcripcionales

miRNA:Mutados o Expresión alterada

Mir-15.Mir16: LLCMir-143-145:CCLet-7:Ca Lung.Pronostico

Supresor de Tumores

Proc.Natl.Acad.Sci.USA.101:2999-3004.2004Cell.120:635-647.2005

ONCOGENES

MICRO ARN (miARN)

Co-activador amplificado

Ca.MamaCa.OvarioCa.PancreasCa.Estomago

AIB1 CO-ACTIVADOR: ENHANCER RE; E2F1;FT,IGF

+++++

Objetivo del TrabajoObjetivo del Trabajo

EVALUAR EL ROL DE MIR-17-5p COMO POTENCIAL REPRESOR TRANSCRIPCIONALDEL CO-ACTIVADOR AIB1 EN LA REGULACION DE PROLIFERACION CELULAR EN CANCER DE MAMA

ESTUDIAR LOS EFECTOS DE MIR-17-5P/AIB1 EN CELULAS TUMORALES RE+/- IGF

Material y MétodosMaterial y Métodos

CONSTRUCCION DE PLASMIDOS. VECTORES DE CLONADO Y EXPRESION PARA PROTEINA AIB1 Y MIR 17-5p

CULTIVOS CELULARES SOFT AGAR Y TRANSFECCIONES ESTABLES Y TRANSIENTES

PCR

NORTHERN BLOT

WESTERN BLOT

Vector De Clonado De MIR-17-5PVector De Clonado De MIR-17-5P

Expresión Proteína AIB1Expresión Proteína AIB1

VectorVectorExpresiónExpresiónProteína Proteína AIB1AIB1

3´UTR AIB1

MUTACION DIRIGIDA3´UTR AIB1

3´UTR AIB1NO MUTADA

Vector Vector ClonadoClonado33´́UTR AIB1UTR AIB1

PROTEINA AIB1 + 3´UTR AIB1

MUTADA (1)

NO MUTADA (2)

ConstrucciónConstrucciónProteína AIB1 Proteína AIB1 33´́UTRUTR

PGL3

3´ UTR PROTEINA AIB1

MUTACION 3´UTR 3´UTR NO MUTADA

PCDNA3.1

PROTEINA AIB1

PR+UTRm PR+UTR

Resumen:Resumen:ConstrucciónConstrucciónProteína AIB1-3Proteína AIB1-3´́UTRUTR

1)

2)

AIB1 es blanco de MIR- 17- 5pAIB1 es blanco de MIR- 17- 5p

– Analisis computacional

Area codificante 3` UTR

5` 3`

pGL3 AIB 3`utr

pGL3 AIBm 3`utr

2`O metil MIR-17-5p

2`O metil MIR-95

Celulas HELA

LUC-AIB 3`utrLUC-AIB m3`utr

MIR 17 MIR 95

• Conclusion: el sitio complementario a mir 17 en AIB1 es blanco de silenciamiento postrascripcional de la expresion genica

La traduccion del AIB1 La traduccion del AIB1 endogeno es suprimido por MIR-endogeno es suprimido por MIR-

17 -5p17 -5p

Mcf-7

2`O metil MIR-17-5p 2`O metil MIR-95

NORTHERN

WESTERN

NORTHERN

WESTERN

CELULAS HELA

siRNA MIR 17

Mir-17-5pMir-17-5p modula la señalización modula la señalización mediada por ER (1)mediada por ER (1)

Sabemos que…• AIB1:

• Miembro de la familia SRC-1• Coactivador transcripcional• Interactúa con el receptor de hormonas esteroides• transcripción ligando dependiente

• ER:• Factor de transcripción• Interactúa con ERE

Por lo tanto…• AIB1 la actividad transcripcional de ER

¿Qué queremos evaluar…?

• La modulación que ejerce Mir-17-5p sobre la acción de los ER

¿Cómo lo hacemos…?

Linea CelularLinea CelularCHO-K1CHO-K1

• ERE-Luc • Mir-17-5p

• Mir-95

• RE

• AIB1

• +/- Estrógenos

Resultados…

• Mir-17-5p 50% la actividad transcripcional

ER dependiente en presencia de Estrógenos

• Mir-95 no tiene efecto sobre la actividad transcripcional ER dependiente

Mir-17-5pMir-17-5p modula la señalización modula la señalización mediada por ER (2)mediada por ER (2)

Sabemos que…• AIB1:

• Coactivador transcripcional y factor limitante• ER:

• Factor de transcripción que interactúa con ERE• AIB1:

• actividad transcripcional de ER• Mir-17-5p:

• 50% la actividad transcripcional ER dep en presencia de Estrógenos

¿Qué queremos demostrar…?

• La modificación que ejerce Mir-17-5p sobre la acción ER dependiente, la hace a través de su target AIB1

¿Cómo lo hacemos…?

Linea CelularLinea CelularCHO-K1CHO-K1

• ERE-Luc • Mir-17-5p

• Mir-95

• RE

• AIB1 (wt3’UTR)

• AIB1 (m3’UTR)

• +/- Estrógenos

Resultados…

• Cotransfección:

AIB1 wt3’UTR + ERE-Luc + Mir-17-5p:

transactivación mediada por ER

• Cotransfección:

AIB1 m3’UTR + ERE-Luc + Mir-17-5p:

Potente actividad transcripcional mediada por ER

• Tratamiento con Mir-95 no demostró diferencias significativas

Conclusión…

• La de proteína AIB1 mediada por Mir-17-5p, requiere de su sitio target AIB1 wt3’UTR mRNA indemne.

• Así efectivamente se bloquea la señalización mediada por ER.

Expresión de Expresión de Mir-17-5pMir-17-5p en líneas en líneas celulares de cáncer de mama y celulares de cáncer de mama y

otros tumores (1)otros tumores (1)

Sabemos que…• Evento clave en CA Mama es el up-regulation de

AIB1 por amplificación génica• AIB1 es coactivador y factor limitante en el

crecimiento de las células de CA Mama• Mir-17-5p afecta la señal estrogénica, a través de

AIB1

Hipótesis…

• La pérdida del control postranscripcional de Mir-17-5p sobre AIB1 puede conducir a crecimiento celular disregulado en CA Mama

¿Cómo lo probamos…?

Northern BlotNorthern Blot

Resultado…

• Expresión de Mir-17-5p ó es indetectable en líneas celulares de CA Mama comparadas con otras lineas celulares tumorales

Expresión de Expresión de Mir-17-5pMir-17-5p en líneas en líneas celulares de cáncer de mama y celulares de cáncer de mama y

otros tumores (2)otros tumores (2)

Hipótesis…• Existe correlación entre expresión proteica celular

de Mir-17-5p y AIB1

Western BlotWestern Blot

Resultado…

• AIB1 altamente expresado cuando Mir-17-5p tiene expresión

Conclusión…

• La down regulation de Mir-17-5p, puede ser factor importante en el crecimiento del CA Mama

La traducción del E2F1 La traducción del E2F1 endógeno es regulada por endógeno es regulada por

Mir-17-5pMir-17-5p

Mir-17-5p reprime los genes de Mir-17-5p reprime los genes de RE y E2F1RE y E2F1

Mir-17-5p reprime la proliferación estrógeno-Mir-17-5p reprime la proliferación estrógeno-dependiente de células de cáncer de mamadependiente de células de cáncer de mama

• MCF7 transfección estable con vectores que sobreexpresan Mir-17-5p o Mir 95

W-B

AIB1 marcada reducción en las células con expresión de Mir-17-5p

Normal en células con expresión de Mir 95

MTT

• Tratamiento con 17β-estradiol• Reintroducción de AIB1 con su 3´UTR mutado (escapa a la inhibición por Mir-17-5p)

Transfección transiente con 2´-O-metil Mir-17-5p o 2´-O-metil Mir 95 en células BT-474

En otra línea celular RE positiva que expresa Mir-17-5p(ZR75-1) se introdujo siRNA específico para Mir-17-5p

Mir-17-5p reprime la proliferación estrógeno-Mir-17-5p reprime la proliferación estrógeno-independiente de células de cáncer de mamaindependiente de células de cáncer de mama

• Transfección transiente de células BT-20 (RE negativas) con 2´-O-metil Mir-17-5p o 2´-O-metil Mir 95

• Reintroducción de AIB1 con su 3´UTR mutado (escapa a la inhibición por Mir-17-5p)

La deplecion de AIB1mediada La deplecion de AIB1mediada por Mir-17-5p inhibe el por Mir-17-5p inhibe el

crecimiento anclaje crecimiento anclaje independiente de células MCF-independiente de células MCF-

7 inducido por IGF-17 inducido por IGF-1

• AIB1 juega un importante rol en el crecimiento de cél.MCF-7 mediado por IGF-1 y regulado por el FT E2F1.

• Dado que E2F1 es blanco de Mir-17-5p se utiliza un vector de expresión con Mir17-5p y E2F1 insensitivo Ej. con ausencia de su propio 3 ‘ UTRs.

• 1º chequean la expresión de E2F1 y AIB1 después de una transfección transiente de Mir-17-5p y un control: MIR 95.

• El nivel de expresión de AIB1 y E2F1

se reduce por el tratamiento con Mir-17-5p

y se recupera con el agregado de

Mir -17-5p + formas insensitivas de AIB1

y E2F1.

• 2º )Evaluar efecto de Mir-17-5p sobre el

crecimiento de células MCF-7 anclaje

independientes inducidas por IGF-1

• El IFG-1 induce el aumento del número de colonias mayores de 80 micrones de células MCF-7 control.

• El aumento del número de colonias es eliminado por el agregado de Mir-17-5p

y no se modifica con Mir-95

• Se intenta rescatar la inhibición del

crecimiento celular por Mir-17-5p

usando formas insensitivas de AIB1 y

E2F1 individualmente.

• El rescate de crecimiento celular no es significativo : las colonias que crecen son menores a 80 micrones.

• Por último se chequea la coexpresión de

AIB1 y E2F-1 insensitivos observándose que aumenta significativamente el crecimiento de colonias anclaje independientes.

• El efecto inhibitorio de Mir-17-5p sobre el crecimiento de células de cáncer de mama estrógenodependientesse debe a la regulación en la traducción tanto de

AIB1 como de E2F1.

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

• A partir de diversas evidencias se ha implicado a los miARN en la génesis tumoral.

• Muchos genes de miARN se hallan localizados en regiones asociadas a amplificación,deleción y translocación en cáncer.

• En este estudio se ha identificado al miARN Mir 17-5p como regulador genuino de la traducción del oncogen AIB1.

• AIB1 está sobreexpresado en células de cáncer de mama hormonodependiente e independiente.

• Es un coactivador de receptores nucleares ( RE ) y acelera la proliferación celular

amplificando el efecto mitogénico.

• La expresión de Mir-17-5p está disminuída en líneas celulares de cáncer de mama.

• Mir-17-5p inhibe además el camino mediado por E2F1.

• Mir -17-5p inhibe la proliferación celular independiente de anclaje .

• El crecimiento hormono-independiente

de células BT-20 también es inhibido por

Mir-17-5p.

• AIB1 y E2F1 cooperan en la proliferación de cél. de cáncer de mama BT-20 RE (-)

razón por la cual no se recupera la proliferación al máximo cuando no se introducen juntos.

• El crecimiento celular mediado por IGF-1 dependen de la funcionalidad de AIB1 y E2F1.

• El locus c13orf25 parece ser que contiene una familia de 7 miARN incluyendo al

Mir-17-5p .

• El locus c13orf25 está sobreexpresado en linfomas B.

• La traducción del oncogen E2F1 es regulada negativamente por Mir-17-5p y se sugiere que actuaría como supresor tumoral en ca de mama.

• La región que contiene al policistrón Mir-17-92 está delecionada en el 16,5% de ca de ovario, 21,9% de ca de mama y 20% de melanomas.

• La desregulación de la función de Mir-17-5p podría ser un mecanismo alternativo para controlar la proliferación celular en cáncer de mama.

• Mir-17-5p puede actuar como supresor tumoral o como oncogen dependiendo del ambiente celular en el que se exprese.

¡ Muchas Gracias!¡ Muchas Gracias!