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Microarray Preprocessing - Columbia Universityandrews/pub/microarray-data-080729.pdfMicroarray...

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Microarray Preprocessing by Stuart Andrews with help from Uri-David Akavia & Bo-Juen Chen 1 Tuesday, July 29, 2008
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Microarray Preprocessing

by Stuart Andrews with help from Uri-David Akavia & Bo-Juen Chen

1Tuesday, July 29, 2008

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Gene Expression

• A key function of all living organisms is the expression of genes

2Tuesday, July 29, 2008

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Gene Expression

• mRNA is created from DNA

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Gene Expression

• protein is created from mRNA

4Tuesday, July 29, 2008

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Microarrays

• High-throughput technology used to measure concentration of mRNA in a sample

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Applications

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Text

Measurement Process

sources of uncertainty:addition of noise and artifacts

normalizing, filtering, cleaning:removal of noise and artifacts

7Tuesday, July 29, 2008

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Goal

• Framework for preprocessing raw microarray data

• Produce reliable gene expressions

• Jeff Settleman’s data

8Tuesday, July 29, 2008

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Strategy

• Keep it simple, efficient, easy to modify, and easy to re-run

• Use visualizations to test, communicate, and confirm results

9Tuesday, July 29, 2008

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Overview

• Introduction to microarrays

• Probe normalization & summarization

• Batch effects

• Redundant probe set summarization

• From A to Z

• Summary

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Micro

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Array

12Tuesday, July 29, 2008

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Probes, Probe Pairs, & Probe Sets

• Probes are short oligomers e.g. 25-mers

13Tuesday, July 29, 2008

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Probes, Probe Pairs, & Probe Sets

• Perfect match & mismatch pairs

14Tuesday, July 29, 2008

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Probes, Probe Pairs, & Probe Sets

• 11–20 probe pairs per gene = a probe set

15Tuesday, July 29, 2008

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Probes, Probe Pairs, & Probe Sets

• Many genes have redundant probe sets

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Chip Design

• Sample preparation & hybridization

• Datasheet.pdf

• Probe sequence & gene auxiliary data

• Annotation file.csv

• Probes locations & gene mappings

• Library file.csv

• Intensity values

• Sample.CEL

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Filter Rule #1

• Remove control & garbage probes

• Probes included for quality control

• Probes discovered to encode incorrect sequence, as the Human genome is revised

• Probes discovered to hybridize to antisense strand

• Probes with annotation warnings, etc.

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Probe Normalization & Summarization

19Tuesday, July 29, 2008

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Each color is a different chip (sample)

Inputs: Probe Intensities

X42506_01_YT_RO82.W.1.CEL X42506_04_YT_Sci.1.CEL

05

1015

20

log 2

intensity

4 6 8 10 12 14 16

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

log2 intensity

density

20Tuesday, July 29, 2008

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• Calculate a single expression value for a transcript from a set of probes

• Remove background chip effects

• Normalize intensity values

• Summarize

Outputs: Transcript Exprs

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Algorithms

• MAS5

• local average & PM-MM background correction

• robust Tukey-biweight summarization

• fixed scale

• RMA

• normal-exponential foreground/background model

• linear model of log expression

• Plier, MBEI, FARMS, many others ...

22Tuesday, July 29, 2008

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MAS5

Log2 Probe Set Expressions

X42506_01_YT_RO82.W.1.CEL X42506_04_YT_Sci.1.CEL

05

1015

log 2

expr

0 5 10 15

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

log2 expr

density

X42506_01_YT_RO82.W.1.CEL X42506_04_YT_Sci.1.CEL0

510

15

log 2

expr

0 5 10 15

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

log2 expr

density

X42506_01_YT_RO82.W.1.CEL X42506_04_YT_Sci.1.CEL

05

1015

log 2

expr

0 5 10 15

0.00

0.05

0.10

0.15

log2 expr

density

RMA FARMS

MAS5 RMA FARMS

23Tuesday, July 29, 2008

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Batch Effects

24Tuesday, July 29, 2008

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Batch variations:

Biology, or

artifacts?

Batches

1 3 5 7 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39

34

56

7

log 2

intensity

Technician & Date25Tuesday, July 29, 2008

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1 3 5 7 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39

34

56

7

log 2

intensity

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

34

56

7

log 2

intensity

CEL Intensities

1 3 5 7 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39

−20

24

68

10

log 2

expression

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14 16

−20

24

68

10

log 2

expression

MAS5 Expressions

Technician and date

Tissue

Batches

26Tuesday, July 29, 2008

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Caveat

Problem:

Batch variations are not removed by linear models when computed batch-by-batch

Solution:

Use global linear model with batch factors

1 3 5 7 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39

02

46

8

log 2

expression

RMA expressions computed batch-by-batch

27Tuesday, July 29, 2008

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• Conclusions

• Small variations exist among the technician & date batches

• Likely to be artifactual and not biologically meaningful

• Normalization of batch MEAN AND VARIANCE is recommended

Batch Effects

28Tuesday, July 29, 2008

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Redundant Probe Set Summarization

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Redundant Profiles

5 10 15 20 25 30

6

6.5

7

7.5

8

8.5

9

9.5

10

number=7, ncbi=14

log2 expression

NCBI 143 probe sets

Batch 1 (samples 1–7)

Batch 2 (samples 8–33)

30Tuesday, July 29, 2008

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5 10 15 20 25 30

8.5

9

9.5

10

10.5

11number=15, ncbi=23

log2 expression

5 10 15 20 25 30

7

8

9

10

11

12

13

14

15number=47, ncbi=71

log2 expression

5 10 15 20 25 30

−1

0

1

2

3

4

5

6

7

number=24, ncbi=32

log2 expression

5 10 15 20 25 30

2

4

6

8

10

12

number=11, ncbi=19

log2 expression

31Tuesday, July 29, 2008

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Redundant Profile Summarization

• Previous methods

• Take average profile

• Use most variant

• Use biologically motivated outlier filtering

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• Profiles that are consistently low are indistinguishable from noise and should be removed

• Set inconsistenly low values to NaN

• “Specs of Dust”

Filtering Example

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• Care must be taken to avoid the introduction of additional batch effects

Filtering Example

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corr filt.gene

~low&corr filt.gene

~low&~noisy&sample corr

filt.gene

~low&~noisy&corr filt.gene

~low&~noisy&cluster&corr filt.gene

~low&~noisy&cluster&singleton filt.gene

~low&~noisy&cluster&~noisy&corr filt.gene

~low&~noisy&cluster&~noisy&sample corr

filt.gene

Outlier Detection

[low]

[~low&~noisy&cluster&~noisy&~corr] filt.gene

singleton filt.gene

[~low&noisy] filt.gene

~low&singleton filt.gene

[~low&~noisy&~cluster] filt.gene

[~low&~noisy&cluster&noisy] filt.gene

[low] filt.gene

Occam’s Razor- difficult to choose parameters- not enough data to test all possibilities

Over 10 tunable parameters

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• Summarization by weighted median

• Robust and biologically motivated

• Weights

• Profile mean expression

• Profile variance

• Profile eigen-centrality

• All weights combined

Alternative Solution

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Weighted Median Summarization

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39Tuesday, July 29, 2008

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From A to Z

1. Remove invalid probes

2. Normalize & summarize probes

3. Normalize batch mean & variance

4. Construct probe set profiles

5. Remove consistently noisy profiles

6. Compute weighted median of redundant profiles

... Validate and improve

40Tuesday, July 29, 2008

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Summary

• Presented a framework for processing raw microarray data

• Batch effects identified and documented

• Introduced weighted median probe set summarization

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The End

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Redundant Profiles Correlations Distributions

−1 −0.8 −0.6 −0.4 −0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 10

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

redundant gene profile correlation distribution

[0 3] redundant profiles[4 6] redundant profiles[7 9] redundant profiles

−1 −0.8 −0.6 −0.4 −0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 10

0.05

0.1

0.15

redundant gene profile correlation distribution

[0 3] redundant profiles[4 6] redundant profiles[7 9] redundant profiles

−1 −0.8 −0.6 −0.4 −0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 10

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

redundant gene profile correlation distribution

[0 3] redundant profiles[4 6] redundant profiles[7 9] redundant profiles

−1 −0.8 −0.6 −0.4 −0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 10

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

redundant gene profile correlation distribution

[0 3] redundant profiles[4 6] redundant profiles[7 9] redundant profiles

max corr(i,j)all corr(i,j)min corr(i,j)

For each NCBI gene, compute correlation matrix corr(i,j) for redundant profiles

43Tuesday, July 29, 2008

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0 5 10 15

!4

!2

02

4

batch07 vs batch16

A

M

Points correspond to probesets, M = difference, A = average (of batch median expr)

Caveat 2

small variation moderate variation large variation

MAS5 by tissue MAS5 RMA

44Tuesday, July 29, 2008


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