Microscopía óptica

El microscopio

Microscopio óptico

OcularCapta y amplía la

imagen formada en el objetivo

CondensadorConcentra los rayos luminosos sobre la

preparación

Fuente de luzIlumina la muestra

ObjetivoSistema de lentes

delgadas: proyecta una imagen real, aumentada e invertida de la muestra

Aumento total = aumento objetivo  x  aumento ocular

DiafragmaRegula cuanta luz llega al condensador

Microscopio invertido

Objetivos

AumentoCuanto se va a

ampliar la imagen luego de pasar por el objetivo (10x,60x,

100x)

Apertura numéricaMedida de la capacidad del objetivo para recoger la luz y resolver detalles finos de

la muestra

Objetivo de InmersiónLos objetivos pueden ser clasificados en secos o de

inmersión

Espesor del cubreobjetos

Apertura numérica

Índice de refracción del aire

AN (objetivo seco)

< Índice de refracción del aceite

< AN (objetivo de inmersión)

AN = n . sen (α)

n = índice de refracciónEs una medida de cuanto disminuye la velocidad de una onda al atravesar dicho medio

n = 1 Airen = 1.33 Aguan = 1.515 Aceite/vidrio

α = ½ ángulo de apertura

¿Qué ocurre cuando utilizamos aceite de inmersión?

Aire: debido a la refracción, granparte de la luz no llega al objetivo

Con aceite: índice de refracciónuniforme, la luz no cambia de ángulo.Mucha mas luz llega al objetivo

ResoluciónLa resolución (R) de un objetivo es la menor distancia entre dos puntos del espécimen que pueden distinguirse como dos entidades separadas

Longitud de OndaA menor longitud de onda

mejor resoluciónApertura numérica

A mayor apertura numérica mejor

resolución

Muestra

d

Imagen

d < R d > R

Cuanto menor es R, mejor la resolución

Intensidad o brillo

Por ejemplo:10x

AN = 0,2540x

AN = 0,6

Intensidad (Apertura numérica)4

(Magnificación)2=

(0,25)4

(10)2

(0,6)4

(40)2= =3,9 x 10-5 8,1 x 10-5

Tipos de microscopía

Campo claroEl campo claro es la forma más simple de microscopía donde la luz pasa a través de la muestra o es reflejada del espécimen. Las muestras deben ser delgadas. Muchas veces se usan tinciones diferenciales.

Células MDCK (línea células epiteliales)

Tipos de microscopíaContraste de FasesSe basa en el retraso de las ondas de luz al atravesar objetos de distintos índices de refracción (densidades), aprovechando y amplificando dichos retrasos.Las regiones mas densas se ven mas oscuras que el fondo

Células MDCK

Tipos de microscopía

Campo Claro Contraste de Fases

• No hay buen contraste con el fondo• No se observan límites claros• No se distinguen estructuras internas

• Buen contraste de células con el fondo• Límites celulares evidentes (oscuros)• Se distinguen estructuras internas

Tipos de microscopíaDIC (Microscopía de Contraste de Interferencia Diferencial)Utiliza luz polarizada y prismas para exagerar los gradientes de índices de refracción dentro de una muestra.

Las bicapas lipídicas producen un buen contraste en DIC por la diferencia de índice de refracción entre el medio lipídico y el medio acuoso de la célula

Glóbulos rojos Células HeLa

¿Qué objetivo usar?• ¿Queremos ver muchas células en un mismo

campo o detalles en una célula?→ Magnificación: 10x, 40x, 100x

• Para una misma magnificación ¿Qué apertura numérica elegir?→ Cuanto mayor es AN, mejor es la resolución

• ¿Campo claro, contraste de fase, DIC?Depende las posibilidades de cada objetivo/microscopio

Tipos de microscopía

Microscopía de FluorescenciaSe basa en la detección de proteínas o estructuras marcadas o que son intrínsecamente fluorescentes.

¿Qué ventajas introduce la microscopía de fluorescencia?- Especificidad- Contraste- In vivo- Desde microorganismos a mamíferos

En el TP…-Expresión de proteínas de fusión fluorescente (GFP o mCherry)-Anticuerpos o toxinas conjugados a fluorocromos-DAPI (tiñe ADN)

Fuente de IluminaciónPara excitar la fluorescencia de unfluorocromo se necesita una fuente de luzintensa que suministre las longitudes deexcitación del fluorocromo en uso.

-Lámpara de Mercurio

-Diodo emisor de luz (LED)

-Láseres (para microscopia de confocal)

Fuente de iluminación

CUBO DE FILTROS DE FLUORESCENCIA

Filtro de excitación:Determina que rango de longitud de onda va a incidir en la muestra

Espejo dicroico:Refleja luz de λ bajaTransmite luz de λ alta

Filtro de emisión:Determina que rangos de longitudes de onda llegan al detector

Objetivo

Detector

Deja pasar luz entre 450‐490 nm

λ=510 nm

Deja pasar luz entre 520‐560 nm

http://www.microscopyu.com/tutorials/spectralprofiles

Tipos de microscopía de fluorescencia“Campo amplio” vs confocal:

La configuración del microscopio confocal permite iluminar un volumen menor.

Solo llega al detector la luz emitida en el plano que está en foco.

Microscopía de fluorescencia confocal

Al eliminar la fluorescencia proveniente de planos fuera de foco sepueden ver más detalles en la muestra

Microscopía de fluorescencia confocalSe puede realizar una serie de secciones ópticas en el eje z

Se pueden realizar representaciones en 3D

Podemos determinar si la localización de dos proteínas coincide dentro de una sección óptica → COLOCALIZACIÓN

Cámaras: CCD (Charged Coupled Device)

La resolución de una cámara depende del tamaño y número de pixeles del chip

Las cámaras CCD capturan la luz y la convierten en data digital.

¿Cómo pasamos de intensidad de luz a data digital?

Profundidad de bits• Un bit es la unidad mínima de

capacidad de información que utiliza una computadora

• El número de niveles en la escala de gris (profundidad de bits) está determinado por la cantidad de bits

• Ejemplo: si un pixel de una imagen bitmap tiene 8 bits de profundidad de color, entonces podrá tomar hasta 256 colores

28 = 256

Niveles = 2 n bits

MÁS BITS NOS PERMITEN DETECTAR MAS DETALLES

Para consultar:

• http://www.microscopyu.com/• http://www.olympusmicro.com/• http://zeiss‐campus.magnet.fsu.edu/