ML06 Coliformes NMP.rev002

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LABORATORIO DE SALUD AMBIENTAL

PROCEDIMIENTO DE ANALISIS PARA LA NUMERACIN DE COLIFORMES

LSA P5.4-ML06

INDICE 1. OBJETIVO.................................................................................................................. 2 2. ALCANCE .............................................................................................................. 2 3. DOCUMENTOS RELACIONADOS ... .. 2

4. DEFINICIONES...... 2 5. RESUMEN .. 2

6. DESARROLLO..... 2 7. FORMULARIOS Y REGISTROS..... 4

8 REFERENCIAS... 4 9. ANEXOS ...... .. 4

FECHA DE APROBACION: 25 de agosto de 2008

FECHA DE REVISION: 25 de agosto de 2008

REVISION: 02

NOMBRE CARGO FIRMA

APROBO Blga. Soledad Osorio Alva.

Directora del Laboratorio de Salud Ambiental - DIGESA

REVISO

Blga. Edith Villanueva Huamn

Aseguramiento de calidad. Laboratorio de Salud Ambiental DIGESA.

Blga. Aydee Valenzuela Warthon.

Jefa del rea de Microbiologa de Alimentos. Laboratorio de Salud Ambiental DIGESA.

ELABORO Blga. Patricia Nez Ramos. Analista del rea de Microbiologa de Alimentos. Laboratorio de Salud Ambiental DIGESA.



Cdigo: LSA P5.4-ML06 Pgina : 2 de 9 Fecha : 25/08/2008 Revisin: 02


I OBJETIVO

Describir el mtodo de ensayo para la numeracin de Coliformes de acuerdo con el mtodo horizontal ISO 4831:2006 tcnica del nmero ms probable.

II ALCANCE

Este mtodo se aplica a muestras de alimentos destinados para consumo humano.

III DOCUMENTOS RELACIONADOS

Instructivo de preparacin y dilucin de muestras de alimentos para anlisis microbiolgico. Instructivo de preparacin y esterilizacin de medios de cultivo Procedimiento de aseguramiento de la calidad de los resultados.

IV DEFINICIONES 4.1 Coliformes: grupo de bacterias que a temperatura especfica (por ejemplo 30C o 37C) causan

fermentacin de la lactosa con la produccin de gas. 4.2 Deteccin de Coliformes: determinacin de la presencia o ausencia de ests bacterias, en una

cantidad particular de muestra de producto. 4.3 Numeracin de Coliformes: nmero ms probable de coliformes encontrados, por mililitro o por

gramo de muestra. V RESUMEN

Se emplea el caldo lauril sulfato triptosa como medio de enriquecimiento selectivo, e incuba a 30 C 37 C seguido, de la confirmacin de los tubos positivos con gas y turbidez en caldo lactosado verde brillante bilis.

VI DESARROLLO 6.1 Medios de cultivo reactivos y/o suplementos.

Adicionalmente a lo requerido en el Instructivo de preparacin y dilucin de muestras de alimentos para anlisis microbiolgico, se necesita lo siguiente:

6.1.1 Medio selectivo enriquecido: Caldo lauril sulfato triptosa 6.1.2 Medio para la confirmacin: Caldo lactosado verde brillante bilis.

6.2 Equipos y materiales.

Adicionalmente a lo requerido en el Instructivo de preparacin y dilucin de muestras de alimentos para anlisis microbiolgico e Instructivo de preparacin y esterilizacin de medios de cultivo, se necesita lo siguiente:

6.2.1 Incubadora de 30C 1 C o 37C 1 C. 6.2.2 Pipetas graduadas terminales de vaciado total, capacidad nominal de 1 mL, 2 mL, graduada en

divisiones de 0,1 mL y 0,5 mL, respectivamente. 6.2.3 Tubos de prueba, de dimensiones aproximadamente 16 mm x 160 mm y 20mm x 200 mm 6.2.4 Tubos Durham, 7 x 70 mm 10 x 75 mm, para el uso en los tubos de prueba de dimensiones de 16

mm x 160 mm. 6.2.5 pH-metro, preciso para + 1 unidad de pH a 25 C. 6.2.6 Asas de siembra de nquel-cromo o platino de 3,0 a 3,5 mm de dimetro.





66..33 Preparacin de la muestra, suspensin inicial y diluciones.

6.3.1 Ver Instructivo de preparacin y dilucin de muestras de alimentos para anlisis microbiolgico.

6.4 Inoculacin e incubacin

6.4.1 Tomar 3 tubos de medio selectivo enriquecido de doble concentracin. Usando una pipeta estril transferir a cada uno de estos tubos 10 mL de la muestra problema si es lquida, o 10 mL de la suspensin inicial en el caso de otros productos.

6.4.2 Luego, tomar 3 tubos de medio selectivo enriquecido de simple concentracin. Usando una pipeta

estril nueva, transferir a cada uno de estos tubos 1 mL de la muestra problema si es lquida, o 1 mL de la suspensin inicial en el caso de otros productos.

6.4.3 Para cada uno de las siguientes diluciones, realizar la inoculacin como se realiz con la primera

dilucin. Usar una pipeta estril nueva para cada dilucin. Mezclar cuidadosamente el inculo y el medio.

6.4.4 Incubar todos los tubos a 30 C + 1 C o 37 C por 24 h + 2 h. Si no hay formacin de gas o turbidez,

continuar la incubacin otras 24 h + 2 h. 6.5 Confirmacin 6.5.1 De cada uno de los tubos incubados con medio de doble concentracin, inocular con un asa a un

tubo de medio de confirmacin. Incubar a 30 C + 1 C o 37 C por 24 h + 2 h., si en esta etapa no se observa la formacin de gas, continuar incubando otras 24 h + 2 h.

6.5.2 Realizar el mismo procedimiento para los tubos incubados con medio de simple concentracin que

estn mostrando formacin de gas o turbidez a las 24 h + 2 h o a las 48 h + 2 horas. 6.6 Interpretacin 6.6.1 Por cada dilucin, contar el nmero total de tubos en la cual se observa la formacin de gas (tubos

positivos) despus de las 24 h + 2 h o a las 48 h + 2 h. 6.7 Clculos y expresin de resultados: 6.7.1 Calcular el nmero ms probable del nmero de tubos positivos de cada dilucin, ver anexo 5.

Ejemplos de la seleccin de resultados positivos para el clculo de los valores del NMP. 6.7.2 Para el caso de muestras liquidas, cuando la menor dilucin seleccionada corresponde a los tubos de

doble concentracin de medio (10 mL de inoculo), dividir el valor NMP entre 10.

6.73 Cuando la lectura de la serie de tubos de todas las diluciones, sean negativas, expresar de la siguiente forma:

Para productos lquidos: < 0,030 NMP/ mL

Para productos slidos: < 0,30 NMP/ g

6.8 Reporte 6.8.1 Los resultados obtenidos, se expresaran NMP de coliformes / gramo o mililitro. 6.8.2 Los resultados para cada muestra se transcriben al Registro interno de resultados que luego se

archiva.





6.9 Control de calidad

6.9.1 Para verificar la capacidad del laboratorio para la numeracin de coliformes, con el mtodo y medios descritos en este procedimiento, sembrar el medio de cultivo (caldo) con una cepa apropiada de un Coliforme y proceder a travs de todo el protocolo analtico usado para la muestra prueba. Un medio de control positivo asegura que el medio de cultivo no contiene ninguna sustancia inhibidora para los Coliformes.

6.9.2 Incluir adems un control de medio. El control es preparado colocando un tubo con el medio de cultivo sin inocular a travs de todo el procedimiento realizado para las muestras. Un medio de control negativo asegura que el medio preparado no esta contaminado con Coliformes.

VII FORMULARIOS Y REGISTROS 7.1 Registro de numeracin de Coliformes.

VIII REFERENCIAS 8.1 ISO 4831:2006. Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the detection

and enumeration of Coliforms Most probable number technique. 8.2 ISO 7218: 1996. Microbiology of food and animal feeding stuffs General rules for microbiological

examinations. IX ANEXOS

N ANEXO TITULO

1 Diagrama de flujo del procedimiento (muestra slida)

2 Diagrama de flujo del procedimiento (muestra lquida)

3 Tabla NMP

4 Composicin y preparacin de los medios de cultivos y reactivos.

5 Ejemplos de la seleccin de resultados positivos para el clculo de los valores del NMP.





ANEXO 1: Diagrama de flujo del procedimiento (muestra slida)

Incubar a 30C o 37C por 24 - 48 hs.

Leer los tubos

Positivos: Presencia de gas y turbidez

Negativos: Ausencia de gas y turbidez

Ver Tabla NMP

Considerar tubos para control (+) y (-)

Prueba Confirmativa

90 mL APS

9 mL APS

10-1 10-2 10-3

1 mL

1 mL 1 mL

Incubar a 30C o 37C por 24 48hs.

horas

Los tubos positivos con gas y turbidez, se pasan a:

....

1 mL 1 mL

1 2 X X

Incubar a 30C o 37C por 24 horas

Pasar a:

-1

10 mL

-3 -2 Considerar tubos para control (+) y (-)

Prueba Presuntiva

COLIFORMES

Caldo lactosado verde brillante bilis 10 mL por tubo

Caldo lauryl sulfato tryptosa 10 mL por tubo

10 g de muestra





ANEXO 2: Diagrama de flujo del procedimiento (muestra lquida)

Incubar a 30C o 37C por 24 - 48 horas

Leer los tubos

Positivos: Presencia de gas y turbidez

Negativos: Ausencia de gas y turbidez

Ver Tabla NMP


Caldo lactosado verde brillante bilis 10 mL por tubo

Prueba Confirmativa

90 mL APS

9 mL APS

10-1 10-2 10-3

1 mL

1 mL 1 mL

Incubar a 30C o 37C por 24 - 48 hs.

Los tubos positivos con gas y turbidez, se pasan a:

....

1 mL 1 mL

10 2 X X

Incubar a 30C o 37C por 24 hs.

Pasar a:

-1

10 mL

-3 -2

....

Muestra Original (lquido)

1

1 mL

10 mL de muestra

Caldo lauryl sulfato tryptosa 10 mL por tubo


Prueba Presuntiva

COLIFORMES





ANEXO 3: Tabla NMP por 3 x 1 g (mL), 3 x 0,1 g (mL) y 3 x 0,01 g (mL)

Resultados de Nmero de Tubos Positivos

NMP

Resultados de Tubos Positivos

NMP

0 0 0 110 Fuente: ISO 7218: 1996, pg. 40





ANEXO 4: Composicin y preparacin de los medios de cultivos y reactivos.

4.1 Medio selectivo enriquecido: Caldo lauril sulfato triptosa Composicin a) Medio de doble

concentracin b) Medio de simple

concentracin Enzima digestiva de protena animal o de leche

40 g 20 g

Lactosa (C12H22O11.H2O) 10 g 5g Fosfato hidrgeno dipotsico (K2HPO4)

5,5 g 2,75 g

Fosfato di hidrgeno potsico (KH2PO4)

5,5 g 2,75 g

Cloruro sdico 10 g 5 g Lauril sulfato de sodio 0,2 g 0,1 g Agua 1000 mL 1000 mL

Preparacin Disolver los diferentes componentes o del medio completo deshidratado en el agua, si es necesario, calentar. Ajustar el pH, si es necesario, para que luego de la esterilizacin este sea 6,8 + 0,2 a 25C. Dispensar el medio en cantidades de 10 mL en tubos de dimensiones de aproximadamente de 16 mm x 160 mm, conteniendo tubos Durham en el caso de medio de simple concentracin, y en los tubos de dimensiones de aproximadamente 20 mm x 200 mm (no contienen tubos Durham) en el caso del medio de doble concentracin. Esterilizar en la autoclave a 121C por 15 minutos. Los tubos Durham no deben contener burbujas despus de la esterilizacin.

4.2 Medio para la confirmacin: Caldo bilis lactosa verde brillante Composicin Enzima digestiva de casena 10 g Lactosa (C12H22O11.H2O) 10 g Bilis de buey desecado 20 g Verde brillante 0,0133 g Preparacin Disolver los componentes o del medio completo deshidratado en el agua, calentar si es necesario. Ajustar el pH, si es necesario, para que luego de la esterilizacin este sea 7,2 + 0,2 a 25C. Dispensar el medio en cantidades de 10 mL en tubos de prueba de aproximadamente 16 mm x 160 mm conteniendo tubos Durham. Esterilizar en una autoclave a 121C por 15 minutos. Los tubos Durham no deben contener burbujas despus de la esterilizacin.





ANEXO 5: Tabla: Ejemplos de la seleccin de resultados positivos para el clculo de los valores del NMP.

Ejemplo

Nmero de tubos positivos obtenidos de tres tubos incubados para las Resultados

siguientes cantidades inoculadas de la muestra por tubo1)

Productos lquidos 10 mL 1 mL 10-1 mL

10-2 mL 10-3 mL Serie NMP Lquidos mL

-1 Slidos g-1

Otros productos 1 g 10-1 g 10-2 g 10-3 g 10-4 g (M)

1 3 3 2 1 0 3,2,1 15 1,5 x 101 1,5 x 102

2 3 3 3 0 - 3,3,0 24 2,4 x 101 2,4 x 102

3 2 2 1 1 0 1,1,0 0,74 7,4 7,4 x 101

4 3 3 0 0 0 3,3,0 24 2,4 2,4 x 101

5 2 2 0 1 0 2,2,0 2,1 2,1 x 10-1 2,1

6 3 1 0 0 0 3,1,0 4,3 4,3 x 10-1 4,3

1) Negrita: combinacin seleccionada

Expresin de resultados Del ndice o serie obtenido, leer en la tabla, para determinar el NMP de los microorganismos en el volumen de la referencia, usando la siguiente ecuacin:

Cs= M F Vs Cs= M V0 d

Donde:

Cs = es el NMP de los microorganismos en el volumen de referencia Vs;

M = es el NMP del ndice o serie, ledo de la Tabla 3 para la dilucin bsica Vo;

F = es la reciproca del factor de dilucin correspondiente de la dilucin, en todo caso, de la muestra tomada de la dilucin bsica usada en la tabla (generalmente F= 10, 100, etc.);

Vs= es el volumen de referencia elegido para expresar la concentracin del

microorganismo;

V0 = es la dilucin bsica.

d = dilucin de la primera serie.

Fuente: ISO 7218:1996, pgina 30

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