The First

International Proficiency Testing Conference

Sinaia, România 11th − 13th October, 2007

340

MODEL AND KINETIC PARAMETERS IDENTIFICATION FOR A

MICROBIAL IMMUNOMODULATOR BIOSYNTHESIS

Camelia Ungureanu1, Ovidiu Muntean1, Mihai Caramihai1, Adrian Onu2, Ana Aurelia Chirvase1, Aura Sălăgeanu2, Alina Mihalcea2, Iosif Nagy1

1University Politehnica of Bucharest, Department of Bioengineering and Biotechnology, Splaiul Independentei 313, Bucharest, Romania

2National Institute of Research and Development for Microbiology and Immunology “Cantacuzino”, Splaiul Independentei 103, Bucharest, Romania

1ungureanucamelia@gmail.com, 2alinamihalcea2003@yahoo.com Abstract Because the production of the microbial immunomodulator is associated with biomass growth, the study of the kinetic model for the exponential phase of growth was needed. Thus, biomass growth experiments (batch bioprocess) were done in a Bioengineering AG bioreactor with a total volume of 100L and mechanic stirring. The monitored growth variables were: physical: temperature, overpressure, stirring, air flow and chemical and biological: pH, substrate concentration, biomass concentration. The concentration of dissolved but unconsumed oxygen was also monitored. The aim of the paper is to present (by comparison) different models based on experimental data. The analysis criteria were: modelling error and convergence rate. The estimated values and the modeling analysis were done by using the Matlab, Table Curve 2D/3D, Sygma Plot, etc. The preliminary conclusions indicates an exponential growth model with a maximum specific growth rate of the bacterium in the range of 0,8 h-1. Key words Microbial immunomodulator, kinetic model, maximum specific growth rate 1 INTRODUCERE Una din direcţiile cele mai importante de dezvoltare a biotehnologiilor moderne este orientată către obţinerea de produse terapeutice din microorganisme. Din acest punct de vedere, considerat mult timp ca un germene cu importanţă minoră în patologia umană şi animală, atât Pseudomonas aeruginosa cât şi celelalte specii aparţinând

Camelia Ungureanu, Ovidiu Muntean, Mihai Caramihai, Adrian Onu, Ana Aurelia Chirvase, Aura Sălăgeanu, Alina Mihalcea, Iosif Nagy: Model and kinetic parameters identification for a microbial immunomodulator biosynthesis

341

genului Pseudomonas, au început să intereseze un cerc mai larg de oameni de ştiinţă. Faptul că în ultima vreme infecţiile cauzate de bacilul pioceanic atât la om cât şi la animale s-au dovedit a fi din ce în ce mai frecvente şi severe, a determinat urmărirea serotipurilor şi realizarea de produse biologice (monovaccinuri, polivaccinuri, seruri terapeutice) utilizate în scopuri profilactice şi terapeutice [1]. Astfel vaccinul cu rol imunomodulator prezentat în această lucrare este un extract bacterian din Pseudomonas aeruginosa. Interacţiunea dintre principiul activ al produsului şi celulele imunocompetente, conduce la activarea diferitelor seturi şi subseturi celulare cu rol în sistemul imun al organismului. Acţiunea principală are loc la nivelul celulelor implicate în prima linie de apărare a organismului, respectiv asupra celulelor implicate în imunitatea naturală, de asemenea creşte activitatea bactericidă a macrofagelor, precum şi activitatea limfocitelor T [2]. Un astfel de produs utilizat în terapia umană trebuie să îndeplinească trei cerinţe obligatorii: calitate, siguranţă şi eficacitate. Asigurarea calităţii este un concept larg care cuprinde toate elementele, care individual sau colectiv, influenţează calitatea unui produs. De la materiile prime până la produsul finit, echipamentul şi personalul sunt factori cheie în asigurarea calităţii, factori care sunt supuşi unui control strict. Astfel cultivarea în volum, în bioreactor, a bacilului permite obţinerea în condiţii controlate şi repetabile a masei bacteriene care ulterior este prelucrată pe baza unui flux tehnologic bine stabilit. Scopul acestei lucrări a constat în determinarea modelului şi identificarea parametrilor cinetici pentru biosinteza acestui imunomodulator microbian. 2 PARTEA EXPERIMENTALĂ 2.1 Materiale Dezvoltarea celulară a fost urmărită într-un bioreactor Bioengineering AG-Elveţia de volum 100 L, volumul culturii fiind de cca. 40 L. Amestecarea mediului de cultură se realizează cu un amestecător tip disc cu palete (turbină Rushton) care respectă rapoartele geometrice recomandate; pe axul amestecătorului poate fi montat şi un al doilea disc. Antrenarea amestecătorului se face la partea inferioară a reactorului. Reactorul este prevăzut cu manta pentru agentul termic: abur pentru sterilizare şi apă de răcire. Alimentarea cu aer filtrat (oxigen) a mediului de reacţie se face printr-o conductă verticală care coboară pe lângă perete şi este îndoită la 900 de grade sub amestecător. Porţiunea orizontală este perforată. Porţiunea verticală de conductă acţionează şi ca spărgător de valuri. Reactorul este dotat cu traductoare (şi sisteme de reglare) pentru temperatură, pH, concentraţia oxigenului dizolvat, turaţie, turbiditate, debitul de aer alimentat, nivelul spumei. Turaţia a fost stabilită astfel încât să fie realizată o bună amestecare, o oxigenare corespunzătoare a mediului de reacţie şi un vortex lângă amestecător puţin dezvoltat. Debitul de aer este măsurat cu un rotametru, presiunea poate fi fixată în intervalul 2-7 at. Sterilizarea reactorului se face la 1210 C cu abur de 4 at. Operarea reactorului a fost făcută discontinuu (în şarjă). Durata şarjei a fost stabilită urmărind variaţia concentraţiei oxigenului dizolvat.

Camelia Ungureanu, Ovidiu Muntean, Mihai Caramihai, Adrian Onu, Ana Aurelia Chirvase, Aura Sălăgeanu, Alina Mihalcea, Iosif Nagy: Model and kinetic parameters identification for a microbial immunomodulator biosynthesis

342

Materiile prime utilizate au fost pentru anumite loturi peptone şi extract de carne obţinute după o tehnologie proprie IC preparate în Institutul Cantacuzino, iar pentru celelalte loturi s-a utilizat mediu de cultură preparat din materii prime Organotech (OG), producător de componente ale mediilor de cultură acceptat de reglementările GMP. 2.2 Metode Pentru concentraţia celulară s-au utilizat două metode: - determinarea densităţii optice a probei, prelevate la diverse intervale de timp după însămânţare mediului de cultură, spectrofotometric (Spekord, UV-VIS) prin măsurarea absorbţiei luminii la lungimea de undă 570 nm. - prin determinarea masei de celule uscate la 105±50C; la durate mici de timp, deoarece volumul centrifugat a fost mic, 1 ml. S-a determinat pentru o apreciere rapidă a stării culturii şi masa celulară umedă, cea obţinută după centrifugarea unui anumit volum de cultură. Reactorul este prevăzut cu un traductor de turbiditate rezultatele fiind înregistrate “on line”. În condiţiile de operare prezente rezultatele de turbiditate pot fi considerate cel mult orientative. În cazul mediului utilizat, concentraţia substratului de interes este reprezentată de concentraţia azotului aminic (AAm); aceasta se obţine prin titrarea cu NaOH a unei probe în care s-a adăugat formaldehidă [3]. 3 REZULTATE SI DISCUŢII Au fost realizate experienţe în reactorul de 100 l, cu posibilitatea monitorizării concentraţiei de oxigen dizolvat. Au fost efectuate opt experienţe, numerotate Lot 1 - Lot 8. Cu excepţia lotului 5, efectuat cu materii prime preparate în institutul Cantacuzino, toate celelalte loturi au utilizat mediu de cultură preparat din materii prime Organotech (OG). Volumul util a fost de 42 l, temperatura de 37 oC, debitul de aer de 15 l/min, turaţia agitatorului 250 rpm. Durata experienţelor a fost de 16 ore, cu excepţia ultimelor trei loturi (6-8), care au fost oprite după 4 ore. pH-ul mediului s-a menţinut practic constant, la valori apropiate de 7,3. În paralel au fost efectuate determinări ale concentraţiei de substanţă uscată, în intenţia de a o corela cu densitatea optică. Singura serie de determinări pe mediul Organotech a fost făcută pe lotul 4, reprezentată în figura 1 şi are un indice de corelare r2 = 0.97, de aceea a fost utilizată pentru calculele ulterioare. În figura 1.8 s-a reprezentat concentraţia oxigenului (CO) în grame la litru, calculată cu valoarea de saturaţie la 37 oC şi 1,2 atm de COS=7,9 mg/l. Această valoare s-a determinat cu ajutorul constantei Henry adimensionale (CG = H·CO) [4]:

H = -9281,4·10-3 + 4030,9·10-3T – 1403,5·10-4T2 + 178.8·10-5T3 (1)

unde temperatura T se ia în oC. Efectuând corecţia pentru relaţia:

PO = He·CO (2) rezultă He(37) = 31,8 m3atm/g, valoare concordantă cu concentraţia de saturaţie a oxigenului de 6,5·10-3 kg/m3, la 37 oC şi 1 atm, indicată în sursa citată.

Camelia Ungureanu, Ovidiu Muntean, Mihai Caramihai, Adrian Onu, Ana Aurelia Chirvase, Aura Sălăgeanu, Alina Mihalcea, Iosif Nagy: Model and kinetic parameters identification for a microbial immunomodulator biosynthesis

343

Lot 1-4

-20

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

timp, h

D.O.

NNH2

oxigen diz.

D.O.

NNH2

oxigen diz.

D.O.

NNH2

oxigen diz.

D.O.

NNH2

oxigen diz.

Figura 1 - Lot 1-4 global

Lot 6-8

0

20

40

60

80

100

120

140

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

timp, h

D.O.

NNH2

oxigen diz.D.O.

NNH2oxigen diz.

D.O.

NNH2oxigen diz.

Figura 2 - Lot 6-8 global

Camelia Ungureanu, Ovidiu Muntean, Mihai Caramihai, Adrian Onu, Ana Aurelia Chirvase, Aura Sălăgeanu, Alina Mihalcea, Iosif Nagy: Model and kinetic parameters identification for a microbial immunomodulator biosynthesis

344

lot 4 y = 0.0349x + 0.0004R2 = 0.9718

00.050.1

0.150.2

0.250.3

0.350.4

0.450.5

0 5 10 15

DO

s.u., g/lLinear (s.u., g/l)

Figura 3 - Corelarea DO – substanţă uscată, lot 4 (considerată ca reprezentativă)

În ecuaţiile ce urmează notaţiile folosite exprimă următoarele mărimi: - t timpul; - CO concentraţia oxigenului; - COS concentraţia de saturaţie a oxigenului; - CX concentraţia celulară; - CX0 concentraţia iniţială celulară; - H înălţimea corpului cilindric; - He constanta lui Henry; - T temperatura - V volumul; - μm viteza specifică maximă;

În figura 4 este reprezentată corelaţia CX – CO pentru loturile 6-8. Concentraţia CX s-a calculat pe baza corelaţiei s.u – DO determinate la lotul 4, CX = 0.0349·DO, [g/l], iar concentraţia oxigenului, normalizată la valoarea de 100, a fost calculată din concentraţia de saturaţie, aşa cum s-a arătat mai sus.

O(X) y = -0.0379x + 0.009R2 = 0.9714

00.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.0080.009

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

X, s.u, g/l

O, g

/l

Figura 4 - Corelaţia CO-CX, lot 6-8

Camelia Ungureanu, Ovidiu Muntean, Mihai Caramihai, Adrian Onu, Ana Aurelia Chirvase, Aura Sălăgeanu, Alina Mihalcea, Iosif Nagy: Model and kinetic parameters identification for a microbial immunomodulator biosynthesis

345

Modelul cinetic Aşa cum s-a arătat mai sus, corelaţia lineară între CX şi CO fundamentează modelul de creştere exponenţială: (3)

XmX Cμ

dtdC

= a cărei integrare duce la: (4) ( )tμexpCC mX0X = care se liniarizează sub forma: (5)

tμCCln m

Xo

X = Reprezentarea grafică a relaţiei (5), cu datele cumulate ale loturilor 6-8 este dată în figura 5. Regresia lineară furnizează pentru μm valoarea 0,8 h-1, cu un indice de corelare destul de bun, r2 = 0,92.

ln(Cx/Cx0) y = 0.7971xR2 = 0.9169

0

1

2

3

4

0 1 2 3 4 5

t, h

ln(C

x/C

x0)

Figura 5 - Estimarea vitezei specifice maxime, μm 4 CONCLUZII Analiza efectuată asupra compoziţiei elementare a celor două tipuri de materii prime la debutul bioprocesului şi în final indică o compoziţie elementară mai favorabilă bioprocesării în cazul materiilor prime OG, mai ales în cazul bioprocesării până la concentraţii celulare ridicate. Dependenţa lineară dintre concentraţia de oxigenului şi a masei celulare indică o limitare a vitezei procesului prin transferul de oxigen. Aceasta sugerează luarea în considerare a oxigenului ca un al doilea substrat şi verificarea modelului cinetic corespunzător. Aceeaşi dependenţă lineară fundamentează un model exponenţial de creştere; pentru acest model s-a estimat viteza specifică maximă μm = 0,8 h-1, aflat în plaja de valori uzuale raportate în literatură.

Camelia Ungureanu, Ovidiu Muntean, Mihai Caramihai, Adrian Onu, Ana Aurelia Chirvase, Aura Sălăgeanu, Alina Mihalcea, Iosif Nagy: Model and kinetic parameters identification for a microbial immunomodulator biosynthesis

346

BIBLIOGRAFIE [1] [2] [3] [4]

Olinescu,A.; Hristescu, S.; Salageanu,A.; Manda, G.; Neagu, M.; "In vivo and in vitro Effect of CANTASTIM, an Immunomodulatory Agent Extracted from a Highly Pathogenic Pseudomonas aeruginosa Strain"- Neoplasma 38(1), 119, 1991 Onu, A.; Stefanescu, M.; matache, C., Salageanu, A.; Istrate, N.; Szegli, G.; Experimental studies on bacterial product CANTASTIM derived from Pseudomonas aeruginosa, Rom.Arch.Microbiol.Immunol. T56, 1- 2, 37-45, 1997 Ryu, H.W.; Kim, M.; Kim, J.N.; Zun, J.S.; Appl.Biochem. Biotechnology, 10 (2006), 129-132 Muntean, O., Bales,V., Meszaros,A., Biochemical Technology, Ed. Printech, Bucureşti, 2003