Prezentul document este doar un model, textulse

va adapta după fiecare test în parte !!!!!

RAPORT DE VALIDARE A METODEI DE

DETERMINARE A xxxxx PRIN HPLC

NUME STUDENT.................................................,

AN............, GRUPA..................

DATA......................................................................

2

CUPRINS

1.Introducere .................................................................................................................... 3

2.Metoda .......................................................................................................................... 3

3.Procedeu experimental şi rezultate............................................................................... 4

3.1.Liniaritatea ................................................................................................................ 4

3.1.1. Procedeu ........................................................................................................................... 4

3.1.2. Soluţii măsurate ................................................................................................................ 4

3.2. Limita de detecţie şi limita de cuantificare ......................................................................... 7

3.3. Precizia şi exactitatea ......................................................................................................... 7

3.3.1. Precizia sistemului............................................................................................................ 7

3.3.2. Precizia metodei ............................................................................................................... 8

3.3.3. Exactitatea metodei .......................................................................................................... 9

4. Concluzii generale ................................................................................................................ 9

3

1. INTRODUCERE

Prezentul raport descrie dezvoltarea şi validarea metodei analitice de determinarea a ***

prin HPLC..

2. METODA

2.1. Aparatură

- cromatograf de lichide echipat cu detector spectrofotometru UV - VIS;

- coloană cromatografică Stable BondSB C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm).

2.2. Condiţii cromatografice

- faza mobilă este formată din amestecul CH3CN : H2O : CH3COOH în raportul 99 : 99 :

1 cu un debit de 0,7 mL/minut;

- detecţia se realizează în fluorescenţă cu lungimea de undă de excitaţie (λex) de 228 nm

şi lungimea de undă de emisie (λem) de 423 nm ;

- volumul de probă analizat este de 20 µL.

2.3. Soluţii

1) Metanol HPLC;

2) Acetonitril HPLC;

3) Acid acetic glacial;

4) Apă dublu distilată;

5) Soluţii etalon

Soluţie etalon stoc (Soluţie A): o cantitate de 5 mg *** dizolvată în 10 mL

metanol HPLC (1 mg/mL).

Soluţie etalon: 1 mL soluţie etalon stoc în 20 mL (cu metanol).

4

Din soluţia etalon au fost preparate prin diluţie cu metanol HPLC soluţii de lucru cu

concentraţii cuprinse în domeniul 10 ng/mL – 1,25 µg/mL. Soluţiile astfel rezultate au fost filtrate

prin filtru de celuloză cu mărimea porilor de 0,2 µm.

Limită: Testul nu este valid dacă deviaţia standard a unui număr de trei analize replicate

din soluţie etalon este mai mare de 10%.

3. PROCEDEU EXPERIMENTAL ŞI REZULTATE

3.1. Linearitatea

3.1.1. Procedeu

Se prepară şi analizează soluţii etalon de *** cu valorile concentraţiilor cuprinse între

9,765625 ng/mL şi 1,250 µg/mL. Pentru fiecare valoare a concentraţiei au fost analizate un

număr de 6 soluţii. Valorile medii ale ariilor picurilor obţinute se reprezintă grafic în funcţie de

concentraţie.

Valorile experimentale obţinute sunt redate în tabelul nr. 1 iar curba de calibrare în figura

nr.1.

3.1.2. Soluţii măsurate

Soluţiile măsurate sunt preparate din Soluţia etalon prin diluare cu metanol HPLC.

1) 0,1 mL soluţie etalon / 2,0 mL => 2,500 µg/mL

2) 1,0 mL soluţie (1) / 2,0 mL => 1,250 µg/mL

3) 1,0 mL soluţie (2) / 2,0 mL => 0,625 µg/mL

4) 1,0 mL soluţie (3) / 2,0 mL => 0,3125 µg/mL

5) 1,0 mL soluţie (4) / 2,0 mL => 0,15625 µg/mL

6) 1,0 mL soluţie (5) / 2,0 mL => 0,078125 µg/mL

7) 1,0 mL soluţie (6) / 2,0 mL => 0,0390625 µg/mL

8) 1,0 mL soluţie (7) / 2,0 mL => 0,01953125 µg/mL

5

9) 1,0 mL soluţie (7) / 2,0 mL => 0,009765625 µg/mL

Tabelul nr.1. Valorile ariilor picurilor corespunzătoare *** pentru un număr de 6 determinări în

funcţie de concentraţia analizată.

Ochratoxina A

(µg/mL)

Arie pic Arie

medie I II III IV V VI

0,009765625 20 17,1 15,9 13,8 18,1 17,8 17,1

0,01953125 33,8 26,7 30,9 25,4 26,2 33,3 29,4

0,0390625 56,1 53,4 45,1 47,9 42,6 48,7 49,0

0,078125 95,0 86,7 93,3 89,3 85,8 80,6 88,5

0,15625 177,3 172,8 165,8 165,7 164,5 158,3 167,4

0,3125 337,8 328,5 331,9 302,5 306,8 321,5 321,5

0,625 628,4 614,5 619,7 602,1 559,9 611,5 606,0

1,25 1232,1 1194,8 1166,5 1192,6 1041,4 1202,2 1171,6

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 0.5 1 1.5

Concentratie (ug/mL)

Ari

e M

edie

Figura nr.1. Linearitatea metodei de determinare cantitativă a *** prin HPLC

Coeficient de corelaţie (R) = 0,99979

6

Interceptul (a) = 16,80341

Panta (b) = 930,0621

Arie pic = a + b x Concentraţia

Arie pic = 930,0621 x Concentraţia + 16,80341

Date statistice

În urma prelucrării statistice a valorilor ariilor picurilor corespunzătoare ***, s-au obţinut

următoarele rezultate:

A) Coeficienţi statistici

Regresie

Coeficient de corelaţie (R) 0,99979

Coeficient de regresie R2 0,999581

Eroare Standard (ES) 8,89368

Intercept 16,80341

Panta 930,0621

Conform acestor valori se obţin:

a) ecuaţia dreptei de calibrare: Arie pic = 930,0621 x Concentraţia + 16,80341

b) coeficientul de corelaţie (R) = 0,99979

c) eroarea standard a dreptei de regresie: ES = 8,89368

Concluzie: Metoda de analiză a *** prin metoda descrisă este linară pe domeniul de

concentraţie cuprins în intervalul 9,765625 ng/mL - 1,250 µµµµg/mL, coeficientul de

regresie (R) având valoarea de 0,99979 (limita pentru coeficientul de regresie este:

R > 0,997.

7

3.2. Limita de detecţie şi limita de cuantificare

Pentru determinarea limitei de detecţie şi a limitei de cuantificare se utilizează următoarele

formule:

LD se calculează utilizând formula:

LD = (ES x 3,3) / a

LC se se calculează utilizând formula:

LC = (ES x 10) / a

unde “ES” reprezintă deviaţia standard a pantei dreptei de regresie iar “a” reprezintă panta

dreptei de regresie.

Având în vedere faptul că valoarea concentraţiei de interes este foarte scăzută, s-a calculat

ecuaţia dreptei de regresie doar pentru valori mici ale concentraţiei, cuprinse în intervalul

9,765625 ng/mL - 0,0390625 µg/mL. În acest interval, deviaţia standard a dreptei de regresie are

valoarea 1,534983 iar panta dreptei de regresie are valoarea 1045,961.

Utilizând aceste valori se obţine că LD = 4,403 ng/mL, iar LC = 0,014675 µg/mL.

3.3. Precizia şi exactitatea

3.3.1. Precizia sistemului

Pentru a examina precizia sistemului, aceeaşi soluţie conţinând *** în concentraţia de

interes (19,5 ng/mL) a fost analizată de 5 ori şi s-au înregistrat ariile picurilor obţinute. Pentru

aceste valori s-a calculat valoarea medie, deviaţia standard şi deviaţia standard relativă.

Nr.

crt. Arie pic

1 26,7

2 30,4

3 30,7

4 26,2

5 31,8

8

Arie medie 29,16

SD 2,5344

RSD (%) 8,6912

Concluzie: având în vedere valoarea deviaţiei standard relative obţinute (RSD =

8.69127%), se poate afirma că la determinarea prin spectrofotometrie în vizibil a nimesulidului,

sistemul este precis.

Valoarea deviaţiei standard relative (RSD) este mai mică de 10% (valoare ce reprezintă

limita pentru precizia sistemului pentru determinarea *** în condiţiile de lucru).

3.3.2. Precizia metodei

Pentru determinarea preciziei metodei de determinare a *** s-a ales varianta de lucru cu

un minim de 9 determinări acoperind domeniul specific de concentraţie: 3 determinări la 3 valori

ale concentraţiei

Prepararea soluţiei test: se prepară soluţii de *** în aceeaşi manieră ca şi în cazul curbei

de calibrare obţinându-se în final soluţii cu următoarele concentraţii:

1,0 mL soluţie (6) / 2,0 mL => 0,0390625 µg/mL (50%)

1,0 mL soluţie (7) / 2,0 mL => 0,01953125 µg/mL (100%)

1,0 mL soluţie (7) / 2,0 mL => 0,009765625 µg/mL (200%)

Utilizând ecuaţia dreptei de calibrare şi valorile ariilor picurilor corespunzătoare

nimesulidului se calculează concentraţia (în µg/mL) pentru fiecare probă în parte. Se determină

concentraţia calculată ca procent din valoarea concentraţiei teoretice. Valorile obţinute sunt

prelucrate statistic. Astfel, sunt calculate: valoarea medie, deviaţia standard, deviaţia standard

relativă şi intervalul de încredere pentru fiecare valoare individuală ca şi pentru valoarea medie.

Deviaţia standard relativă trebuie să aibă o valoare cât mai mică.

Ecuaţia dreptei de calibrare este:

4285711075,20731

33333228333333,7−=

ArieC

Soluţiile test:

9

Nr.

crt.

Concentraţie

teoretică (µg/mL)

Arie pic Concentraţie

calculată (µg/mL)

Regăsirea

(%)

1

0,009765625

20,0 0,011790439 120,7

2 18,1 0,010023338 102,6

3 17,8 0,009744322 99,8

4

0,01953125

33,8 0,024625174 126,1

5 26,2 0,017556769 89,9

6 33,3 0,024160147 123,7

7

0,0390625

56,1 0,045365360 116,1

8 42,6 0,032809642 84,0

9 48,7 0,038482966 98,5

Date statistice

Media 106,8

Deviaţia standard (SD) 15,3

Deviaţia standard relativă = 14,3%.

3.3.3. Exactitatea metodei

Acurateţea (exactitatea) este o caracteristică ce reflectă apropierea rezultatelor analitice de

valoarea adevărată. Exactitatea este deci o măsură a deviaţiei valorii medii găsită prin analiză,

faţă de valoarea adevărată.

Pentru fiecare nivel de concentraţie se prepară şi se analizează un număr de trei probe,

măsurându-se experimental aria picului.

10

Soluţiile test:

Nr.

crt.

Concentraţie

teoretică (µg/mL)

Arie pic Concentraţie

calculată (µg/mL)

Regăsirea

(%)

1

0,009765625

17,1 0,009093285 93,1

2 13,8 0,006024110 61,7

3 15,9 0,007977221 81,7

4

0,01953125

26,7 0,018021796 92,3

5 25,4 0,016812727 86,1

6 30,9 0,021928019 112,3

7

0,0390625

53,4 0,042854216 109,7

8 47,9 0,037738924 96,6

9 45,1 0,035134775 89,9

Regăsirea medie = 91,5% (valoare minimă = 61,7%; valoare maximă 112,3%)

Concluzie: regăsirea medie în studiul exactităţii metodei de determinare a nimesulidului

prin spectrofotometrie în vizibil are valoarea de 91,5 % pe intervalul 61,7 – 112,3 %.

Concluzii generale

� S-a studiat liniaritatea funcţiei de răspuns (s-a urmărit modificarea ariei picurilor în

funcţie de concentraţia analizată). Funcţia de răspuns este liniară pe domeniul studiat (0,009 –

1,25 µg/mL). Ecuaţia dreptei de regresie obţinute s-a calculat prin metoda celor mai mici pătrate

(coeficient de corelaţie r = 0,9997):

Absorbanţă = 930,06 x Concentraţia (µµµµg/mL) + 16,803

� S-a calculat limita de detecţie (LD = 4,4 ng/ mL) şi limita de cuantificare (LQ = 0,014

µg / mL) folosind estimarea acestor limite pe baza deviaţiei standard şi a pantei dreptei de

regresie.

� Pentru estimarea preciziei s-au determinat:

11

� repetabilitatea detecţiei (precizia sistemului) pentru un număr de 5 determinări, valoarea

deviaţiei standard relative (RSD) fiind de 8,6912%;

� repetabilitatea analizei (precizia metodei) pentru trei soluţii independente la trei nivele

de concentraţie diferite pentru care valoarea deviaţiei standard relative (RSD) este de 14,3%;

� În vederea estimării exactităţii s-a determinat regăsirea pentru un număr de trei probe la trei

nivele de concentraţie diferite obţinându-se o regăsire medie de 91,5% (valoare minimă = 61,7%;

valoare maximă 112,3%)