Universidad Complutense de MadridFacultad de Ciencias Biológicas
~3jV
5 Cl 0 $) 5 4 9 8 7 9tiNIVVfl~Ir1Afl COMPÍ tITr~NAE
Modulación de la respuesta inmuneparlas neuropéptidos:
bombesina, GRP y neuromedina o
Tesis Doctoral
Mónica del Rio Zaldúa
Madrid, 1994
Dña. MONICA DE LA FUENTE DEL REY, Catedrútica de Biología Animal II(Ñsielogla Animal> do a Facultad do Ciencias Biológicas de la UniversidadComplutense do Madrid,
CFflTIFiCA: Que Dña. MONICA DEL RIO ZALDUA, ha realizado bajo sudirección, en al Departamento do Biología AnImal 11< FIsiología Animal)do la Facultad de Ciencias BIológicas cia la Universidad Complutensedo Madrid, al trabajo titulado: “Modulación do la respuestaInmune por los nauropéptidos: bombosina, GRP yti ou rornod 1 rin C’’, que presenta a superIor juicio del Tribunal quedesigno la UnIversidad Complutense de Madrid, para optar al Grado deDoctor en Ciencias (3iológícas.
Madrid, 1 cte Junio do 1004,
-~
V”00 del DirectorMtnioa do la Fuente del Rey
El interesadoMónica dcl Rio Zaldús
A Vfcior
ji
Quisio¡a expresar mi agradecimiento a todas las personasque mo han ayudado de una u otra forma a realizar esteproyecto.
En primer lugar a la Dra. Mónica de la Fuente que me habrindado la oportunidad de dedicarme a la investigación yrealizar mis aspiraciones, por su gran dedicación en ladirección de este trabajo.
A mis compañeros y compañeras de laboratorio por formarun grupo estupendo con el que he pasado muy buenos ratosdentro y fuera del mismo. A Dolores, con quien he compartidotrabajo e Inquietudes desde que entramos Juntas en estemundo de la ciencia. A Manuel, a Montse, a Paco, a Nacho, alos que se fueron, y a los reden llegados: ldoia, Amparo,Marina, Sonia, Gemma y .Jake.
A todas y cada una de las personas que forman el Deptode Fisiología Animal, por su colaboración y apoyo constante.
A Rosa M. 2. Gomarlz, a Elvira Garrido, a Javier Leceta, aMario Delgado y a Carmen Martínez del Depto. de BiologíaCelular, que tanto me han ayudado.
A Lisardo Boscá, por su Inestimable colaboración y susvaliosas sugerencias.
A Angel Hernanz, por dedicarme su tiempo frente alordenador y por sus criticas constructivas.
Y muy especialmente a mi familia y a Victor, que tambiénes ya mi familia, sin ellos nada hubiera sido posible.
Gracias a todos.
Este trabajo ha sido parcialmentefInancIado con ayudas del Fondo deinvestigaciones Sanitarias de laSeguridad SocIal (0045/89 y 0697/92) ydel Plan Regional de Investigación de laConsejería de Educación de laComunidad de Madrid (0239/01).
ABREVIATURAS
ACTH Hormona adrenocorticotropo
AOCC Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo
AMPc Adenosín monoloslato cíclIco
APO Célula presentadora de antígeno
SN Bombesína
COK Coleclstoqulnlna
CORP Póptído relacionado con el gen de la cakllonlna
Con A Concanavaline A
CAP Factor liberador de cortícotropina
DAD Diamínobenoldina
DMDA Dinietilbenzantraceno
EGF Factor de crecimIento epIdérmico
ELAM’1 Molécula de adhesión de leucocitos a endotello
FFM Factor de fusión de macrólagos
PMLP Pormll•Met•LeuPhe o pépildo fomillado
FSM Mormona estimuladora del fatulo
GI Hormona de crecimiento
CiAP Factor liberador de hormona. del crecImIento
10AM Molécula de adhesión intercelular
im lnterfewn
lg Inmunoglobulina
IL Interteucína
¡Pa Inositol 1 .4.5-tritostato
Lii hormona luleinizante
LHRH Hormona líbradora de hormona lutehílzante
LPS Lípopolísacérldo
LT134 Leucotrleno 84
MGC Células gigantes multinucleadas
MF Factor Inhibidor de la mIgración
MLfl Cultivos mixtos do lintocitos
NI< Cilotoxicidad natural “Natural killer”
NPV Neuropéptido Y
PAF Factor de activación plaquetar
PAP Complejo poroxidasa antíperoxidasa
PHA Fitohemaglutínina
PKC Proteina quinasa C
PMA Farbol mhlatato acetato
PMN Leucocito polímortonucleado
PR 1 Prolactina
PTII Hormona paratiroldea
SOLO Carcinoma puhncnar “emalí cotí lung cancor”
S.E. SIstema EndocrIno
S.l. Sistema Inmune
8.N. Sistema Nervioso
8.N.C. SIstema nervioso central
SP Sustancla PTNF Factor de necrosis turnan
TRF Factor flbemdoa do ‘FSM
TSH Mormona estImulante del tiroIdeo
VI P Péptldo IntestInal vasoact ¡va
INDICE Pág.
RESUMEN 11.INTRODUCCiON 2
1 1. VI ojo neuroendocrlno-lnmuno 2
1.2. Agentes inmunes que afacían al sistema neuroendocríno 31.3, Inmunomoduiacien por el sistema nervioso y endocrino 5
1.3.1. Agentos nerviosos y endocrinos que regulan la actividad
do las cÉdulas inmtjnos 6
1.3.1.1. Neurotransmísoras y hormonas 71.3.1.1.1. Eje hípotálarno-hipól Isis 71.3.1.1.2. Hormonas adrenornodulares 81.31.1.3. Hormonas adrenocorticales 91.3. 1,1.4. Hormonas sexuales O
1,3.1.1.5. Otras hormonas y naurotransmisoros 10
1.3.1.2. Neuropóptidos y hormonas gastrointestinales 111.3.1.3. Bombosína (UN) y póptídos relacionadas 17
2. OBJETIVOS 233. MATERIALES Y METODOS 26
3 1. Materiales 263.1.1.Materlal Biológico 263.1.2. Mecí íes de cultivo 26
3.1.3. Sueros y antIcuerpos 27314. Mitógonos 273.1.5. Neuropóptldos 27
3.1.6. Otros póptidos 27
3.1.7. Reactivos qulmícos 273,1.8. Productos marcados con Isótopos radIactivos 28
3.1.9. ><its comercIales 263.1.10. Material de laboratorio da espacial Interés 29
3.1.11. Aparataje 29
3.2. Mótod os so3.2.1. DilucIón de los neuropóptídos 30
3.22. Obtención de muestras celuiaras 30
3.2.2,1. Obtención da macrófagos peritoneales mnurines SO
3.2.2.2.Obtención da leucocitos da órganos linfoides 31
3.2.3. Viabilidad celular 32
3.2.4. Estudio del proceso fagocitico 32
3.2.4.1. Adherancla a sustrato 33
3.2.4.2. Movilidad inducida ( Quimiotaxis ) 33
3.2.4.3. Capacidad qulrnioatrayenta 34
3.2.4.4. FagocitosIs de CAndida albicans 34
3.2.4.4.1. En tubo 34
3.2.4.4.2. En placa MW 35
3.2.4.5. Fagocitosis de partículas Inertes (bolas de latox) 35
3.2.4.6. Digestion del material fagocItado 36
3.2.4.6.1. Test cte roducoción del Nitroazul de tatrazelio
(NBT) 36
3.2.4.6.2. Estudio de la formacIón de metabolitos dcl
oxigeno por citornotria do flujo 37
3.2.5. Estudio de la función linfoide 37
3.2.5.1. Qulrniotaxis y capacidad qulmloatrayonto 36
3.2.5.2. Respuesta proliferatíva 38
3.2.6. Estudio do la actividad cítotóxica 39
3.2.6.1. Ensayo do citotoxicídad por IncorporacIón de 510r ‘10
3.2.6.2. Ensayo de cítotoxicidad por valoración onzímética 41
3.2.7. Estudio de la colaboración Intercelular ‘II
3.2.7.1. Efocte de los neuropéptidos sobre la producción de
lUí por macrófagos 41
3.2.7.1.1. Obtención de sobrenadantos cori IL-I 41
3.2.7.1.2. Valoración dolos niveles do Liii 42
3.2,7.2. Efecto de los neuropéptidos sobre la producción de
IL-2 por linfocitos 42
3.2.7.2.1. Obtención de sobrenadantos con IL-2 42
3.2.7.2.2. ValoracIón de los niveles de IL-2 42
3.2.7.3. Valoración do la producción do FFM 43
3.2.6. Preincubaclones con los neuropéptídos 43
3.2.9. Estudio de la especificidad de los efectos 44
3.2.9.1. Estudios de competencia con un antagonista del
receptor para la BN 44
3.2.9.2. Presencia de receptores para SN y CAP en células
inmunocompetentes 44
3.2.9.2.1. DeterminacIón de receptores para UN en
macrófagos y linfocitos 44
3.2.9.2.2. Determinación <le receptores para CAP en
macrófagos y linfocitos 45
3.2.10. Ensaye do quimiotaxis modificado para
la determinación de la presenciado un factor secretado
por macrófago~ 45
3.2.l1.Estudio del mecanismo de acción deles neuropóptidos.... 46
3.2.11.1. ValoracIón de AMPe 46
3.2.11.1.1. Procesamiento de las muestras
celulares 46
3.2.11.1.2. CuantifIcación de AMPo 46
3.2.11.2. ValoracIón do Inositol trifosfato (IP3) 47
3.2.11.2.1. Procosamlento do las muestras
celulares 47
3.2.11.2.2. CuantificacIón do IP3 47
3.2.11.3. Ensayo da la actividad proteina kinasa O 48
3.2.11.3.1. ActivacIón y purificación del enzima 48
3.2.11.3.2. Ensayo enzimátice 48
3.2.7. Estudio estadístico 49
4. RESULTADOS 504.1. Efecto comparado de bombesina, GRP y neuromodina O sobreel proceso fagocitico de macrófagos peritoneales murinos 51
41.1. Adherencia a sustrato 51
4.1.2. Quimiotaxís 544.1.3. Capacidad qulniioatrayonte 54
4.1.4. Capacidad de Ingestión 564.1.5. Podar de digestión 58
42. Efecto de bobesina, (3flP y neuroniedina O sobre la
fu neinrial íd ud de liii locitos ¡mi rl nos 62
4.2.1. Quimietaxis 62
4.2.2. Capacidad químioatrayonte 64
4.2.3. Proliferaclón 66
4.3. Efecto de bombosina, GRP y neuromedina O sobro la
luncienalided de las células citotóxicas 71
4.3.1. ActivIdad ‘natural killer (NK) 71
4.3.2. Citetoxlcidad celular dependiente de anticuerpo 74
4.4. Estudios de colaboración intercelular 76
4.4.1. Producción de IbiD 76
4.4.2.Producción de 1b2 77
4,4,3. Producción de FFM 79
4.5. Electo de los tres póptidos en incubaciones previas al ensayo 80
4.6. Estudio de la especificidad de los electos dolos neuropéptidos 81
4.6.1. Utilización del antagonista del receptor para la bombosína 81
4.6.1.1. Electo del antagonista en la capacidad
qulmloatrayente de los neuropéptidos 81
4.8.1.2. Electo del antagonista en la actividad NK 83
4.6.2. Ensayos de unión al neuropéptido marcado 84
4.6.2.1. unión a macrófagos peritoneales 84
4.6.2.2. UnIón a Iinlocitos de ganglios axilares 86
4.7. Efecto de los póptidos en poblaciones celulares purificadas 67
4.7.1, Efecto comparado dolos neuropéptídos sobre la función
de macrófagos purificados del peritoneo y la suspensIón
peritoneal completa 87
4.7.1.1. En fagocitosis de latex 87
4.7.1.2. En la actividad citotóxíco 86
4.7.2. Efecto comparado sobre muestras completas y
purificadas de linfocitos 90
4.7.2.1. Quimiotaxís 90
4.7.2.2. Proliferación 93
4.7.2.3. Capacidad cítotóxica 93
4.8. Producción de un factor por las cólulas adherentes, responsable de
íes efectos de los neuropéptidos en a función linfoide 102
4.9. Mecanismos de acción intracelular do los tres neuropéptidos: UN,
GRP y neuromedina C 104
4.9.1. Niveles de AMPc intracelular 104
4.9.1.1. En macrófagos 104
4.9.1.2. En linfocitos 105
4.9.2. Niveles de PS 106
4.9.2.1. En macrófagos 106
4.9.2.2. En linfocitos 107
4.9.3. Actividad proteína quinasa O 108
4.0.3,1. Actividad PICO en leucocitos 108
4.0.3.2. Actividad PICO en macrófagos y en linfocitos
purificados 109
5.DISCUSiON 111
5.1. (Efecto de los neuropóptidos de la familia de la bombosina sobre el proceso
fagocitico de los macrófages peritoneales murinos 114
51.1. Adherencia 115
5.1.2. Quimiotaxis 116
5.1.3. Fagocitosis 118
5.1.4. Digestión 120
5.2. Efecto sobre las funciones de linfocitos 1 21
5.2.1. Quimiotaxis 122
5.2.2. Proliferación 123
5.3. Efecto sobre la actividad NK y ADOO 125
5.4. Efecto sobre la secreción de factores de colaboración Intercelular 127
5.5. Efecto de la preincubaclón con los neuropóptidos 129
5.6. EspecificIdad de los efectos observados 130
5.6.1. UtilizacIón de un antagonista de la UN 130
5.6.2. DetermInación de la presencia de receptores
específicos en las células inmunes 131
5.7. Efecto de los neuropéptidos sobre poblaciones celulares purificadas 132
5.7.1. Efecto sobre poblaciones purificadas de macrófagos 132
5.7.2. Efecto sobre poblaciones purilicadas de linfocitos 133
5.8. Existencia de un factor mediador en el efecto
de los neuropóptidos sobre los linfocitos 134
5.9. Mecanismos de acción a nivel intracelular 135
5.9.1. Mecanismos intracelulares en macrófagos 136
5.9.2. Mecanismos intracelulares en linfocitos 137
6. CONCLUSIONES 140
7. BIBLIOGnAFIA. 142
RESUM EN
Rusunwn
RESUMEN
En el presente trabajo hemos demostrado que la bombesina y sus dos
neuropóptidos relacionados en mamíferos, el péptido liberador de gastrina (GRP> y la
neuromedina O, modulan positivamente la respuesta inmune in vitre en ratones de la
cepa BALB/c. Los efectos son dosis dependientes, siendo la concentración do
neuropéptido más efectiva la de 10.10 M. En concreto estimulan todas y cada una de
las etapas del proceso lagocítico de macrófagos peritoneales: adherencia a sustrato,
quimiotaxis, ingestión y digestión de partículas. Estimulan la quimiotaxis y la
proliferación de linfocitos obtenidos de peritoneo y <le ganglios axilares, bazo y timo,
así como inhiben la proliferaclón en respuesta a mitógenos <Concanavalina A y LPS).
Exhiben efectos estimuladores tambión sobre la capacidad citotóxica natural <NK> y la
citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (CODA) en células linfoides y en
macrófagos peritoneales. Producen un aumento en los niveles de secreción de lUí 13 y
una disminución en los niveles de producción de dicha lnterlaukina en respuesta a Con
A, mientras que no se observa modificación en los niveles do iL-2. Estos efectos son
específicos como lo demuestra el que se vean revertidos en presencio do un
antagonista cíe la UN y la existencia de receptores de alta afinidad en macrófagos. La
regulación de la funcionalidad del linlocito por estos neuropéptidos está mediada por
células adherentes accesorias, en concreto macrófagos, corno lo demuestra el hecho
de que se requIera la presencia de algún o algunos factores solubles secretados por
estas células en respuesta a la incubación con los neuropéptidos para observar sus
electos. En cuanto a los mecanismos de acción a nivel intracelular, estos
neuropóptidos producen una disminución de los niveles de AMPc así corno un
incremento en los niveles de lP3y en la actividad de la proteína quinasa C, en linfocitos
y en niacrófagos peritoneales murinos
1
1. INTRODUCCION
1,, traducciÓn
1. INTRODUCCION.
1.1. El eje neuroendocrino-inmuno.
La neuroinmunoendocrinologla es un área interdisciplinaria de investigación que
ha surgido en los últimos años y que estudia las interacciones entre el sistema inmune
(S.l.), el sistema nervioso (SN.> y el endocrino (SE.>.
Los primeros descubrimientos que apuntaban la existencia de esta interconexián
so remontan a los estudios de Sir Thomas Lewis <1927>, ales trabajos do Selye (1936)
sobre la involución timica y el estrás, y en años posteriores, a los de Meyer y Haggerty
(1962> enes cuales se demuestra una clara relación entre el estrás y la susceptibilidad
a oniermedades inlecciosas,
Existen evidencias de la inmunorreguiación, in vivo, por el sistema
neuroendocrino. Jankovic o Isakovlc (1973) observaron que la estimulación eléctrica
del hipotálamo, o la lesión del mismo, variaba la respuesta inmune. floszrnan y cola.
(1985) comprobaron que las lesiones en el hipocampo, amígdalas y cuerpos mamilares
producían activación de esplenocitos y tirnocitos en respuesta al mitógeno Con A.
Estos autores observaron que trás la ostírpación de la hipófisis se perdían estos
efectos, deduciendo que las alteraciones inmunológicas debidas a lesiones en el
sistema nervioso central son mediadas por la hipólisis u otras glándulas endoclinas.
Por otra parle, se ha comprobado también que las células del sistema inmune
secretan sustancias que afectan al SN. o sen constituyentes del mismo, y además son
capaces de producir, baje estimules específicos, hormonas propias del 8.E (Blalock y
cola., 1985>.
El SN. puede regular al S.l. a través de dos vías principales: la secreccián
neuroendocrina de hormonas que pueden via]ar por el sistema circulatorio hasta los
órganos inmunes y la inervación de los órganos linfoides. El S.N. autónomo facilita esta
comunicación entre los sistemas nervioso e inmune a través de su extensiva inervación
de los órganos linfoides primarios y secundarios Las fibras del sistema noradronérgico
se distribuyen a lo largo cíe la vasculalura hasta el interior del timo, la médula ósea, el
2
tnUoduccidn
bazo, ganglos axilares y tejido Linfoide asociado al tracto digestivo (GALT) <Felten y
cois., 1985; EJellinger y cols., 1989>.
Por otra parte, las células inmunes gracias a un elaborado sistema de recircuiación.
pueden viajar por todo el organismo, por el sistema circulatorio a lo tejidos y de éstos al
sistema linfático, cerrando el circuito, de forma que tienen la oportunidad constante de
entrar en contacto con posibles partículas invasoras y al mismo tiempo con productos
del SN. y del 8. E, (Picker, 1992>.
En el contexto de esta bidirecclonalidad entre el SN. y el S.l., surge la idea de
que una importante función del S.l. puede ser actuar corno órgano sensorial. El sistema
inmune puede percibir estímulos no reconocidos por el sistema nervioso central y
periférico, estímulos denominados ~io cognoscitivos~ como pueden ser: bacterias,
tumores, virus, etc. Ese reconocimiento, además de generar una respuesta Inmune, se
convierte en información, en forma de hormonas y citocinas que pueden modular la
función del sistema neuroendecrino. De igual manera, el reconocimiento de los
estímulos cognoscitIvos por parte dei SN. da lugar a una información que es
transmitida mediante neurotransmisores y hormonas a receptores específicos en
células inmunocempotentos, sucediéndose tina serlo de cambios en la respuesta
inmune (Bialock, 1984>. La existencia de esta comunicación bidíreccional solo es
posible gracias a que los sistemas inmune y neuroendocrino comparten hormonas y
receptores (Biaiock y cole., 1985a>.
De esta forma, el sistema inmune a través de toda la serie de mecanismos que
constituyen la respuesta inmune, va a regular junte con el SN. y el 8.E. la homeostasis
general del organismo (i3esedevsky y cola., 1985>.
1.2. Agentes Inmunes que afectan al sistema neuroendocrino
Las citocinas, sustancias características de secreción inmune, tienen un efecto
modulador sobre el sistema nervioso regulando, también la acción do diversas
hormonas y neuretransniisores. El sistema neuroendocrino tiene receptores para estas
sustancias de secreción inmune, corno: interferones, diversas Interleucinas, o
fragmentos del complemento (Weigent y Blaiock 1987>.
Los intorferones (lEN>, citecinas de acción fundamentalmente antivíral, fueron
los primeros productos de macrófagos y linfocitos en los que se observó una funcIón
3
IflttOdL¡CCiÓ1)
hormonal. Les FN W 13 tienen un efecto esteroidegénico parecido al de la AOTH en
células adronales en cultivo (F3lalock y liarp, 1981> y causan elevación en los niveles de
cortisol circulante (Roosth y cols., 1986>. El IFt¾humano se une a receptores epioldes
de cerebro de ratón In vitre y causa tina respuesta analgésica similar a las endorfinas
(I3lalock y Smith, 1981>, lo que explica los efectos, a nivel neuropsiqulaírlco, de esta
citocina in vivo (Adama y cols., 1684>.
La Interleucina 1 (IL-1) es secretada por muacrófagos, astrocitos y otras células
de la gUa (Fontana y cois., 1982). Junto al TNFu ha sido asociada a desórdenes del
SNC como la astrogliosis, proliferacián de células de la micreglía y desmielinización
(Glulian y cols., 1988; Merrilí, 1991). Tiene un efecto pirógemio debido a su acción
sobre el hipotálamo a través de receptores opieldos (Norman y cols., 1986>. Esta
citocina estimnula en hipocampo la liberación do ORF y prostaglandinas (Guaza y Borrelí,
1993>, la biosíntesis de somatostatina (Scarborough y cois., 1989> e incromenta la
liberación de AOTII (Uehar y cote., 1987> a nivel pituitario (Oambronero y cels., 1092>,
así corno la de LII, OH y TSH (Bernien y cois.. 1987>. También actúa sobre la glándula
adrenal activando la producción de glucocorticoides <Roth y cols., 1987; Andrels y
cote., 1991>, así corno sobre el sistema nervioso simpático estimulando la produccIón
de catecolaminas (Haefelí y cols., 1993>.
La Interleucína 2 (IL-2>, factor de crecimiento de linfocitos L causa elevación
en los niveles de AOTIl y corilsol (Loize y cois., 1985> y en la liberación de ORF y
prostaglandinas (Oambronero y cois., 1992b; Guaza y Sorrell, 1993), siendo ademásun Importante factor de crecimiento tisuiar (Groen y cole., 1984>.
El factor do necrosis tumoral <TNF), es producido, en el sistema ncrvioso,
por astrocitos actIvados y células cte la microglia (Lleberman y cole., 1989>. Inhibe la
secreción de hormonas hípof leerlas corno la GH, LH y PRL <Walton y Oronin, 1989;
Galllard y cole., 1990>. Ademnás parece Intervenir en la modulación de la secreción
folicular de progesterona y estradiol (Punnonen y cole., 1992>. y también está
implicado en el desarrollo neuronal (Merril, 1992>.
La interleucína 6 (11.-O), esté relacionada con las patologías del SNC
producidas por virus (Frel y cole., 1988; Van Damme y cole., 1989> y estímula la
‘4
In (reducción
secreción do las hormonas hipofisadas PAL, OH y LII (Spangeio y cois., 1980).
En la siguiente tabla se recogen una serie de hormonas y neuropóptidos que son
modulados por citocinas.
Efectos Neuroendecrinos de Citocinas
Oitocina 1-lormona afectada
IL-1 OAF,somatostalina,AOTH,TSH,LH,FSH,PRL,GH,
corticoesteroides
iL-2 ACTH,ji-endorfina,corticoesteroides
1 L.—6 GIl—RH,TRH,ACTI-l, L¡l,PAL, Gi’l
TNF GR FTBH,PRL,TS,T4
NF GR F,AOTH,corticeesteroidos
1-lormonas Tímicas Gn-RH,AOTH, Pendortina,LH,PRL,GH,corticoosteroidos
FSH, hormnona folículo estimulante; PRL,prolactina; OH-AH, hormona liberadora dehormona del crecimiento. <Homo-Delarche F.y M. Dardenno, 1903>.
El S.l. se comporta, además, corno un órgano neuroendocrino ya que ras propias
células inmunocompetentes secretan sustancias típicamente endocrinas como
serotonina, endorfinas, sematostatína, ORF, PAL, AOTH, TSH, OH, VIP o sustancla P
(Weigent y cole, 1990>. Sin embargo los niveles de estos factores secretados por la
células inmunes nunca alcanzan las cantidades de producción de hipotálamo o
hipofisis. Lo que si parece claro es su papel en una regulación paracrina (Horno-
Qelarche y Dardenne, 1993>.
Desde un punto de vista fisiológico, la producción de hormonas y neuropóptidos
por células inmunes favorece la respuesta del 8.NE. frente a agresiones que no podría
detectar de otra mnanera, y además, propicia la regulación aulocrina del S.l., dado que
corno veremos en el apartado siguiente, estas sustancias son inmunomoduiadoras.
1.3. inmunoniodulaclon por el sistema nervioso y endocrino.
El control que sobre el S.l. ejercen los otros sIstemas reguladores, el SN. y el
SE., es llevado a cabo a través de la acción que los mediadores moleculares de los
5
In tro dL/calón
mismos tienen sobro la actividad de las células iflifluilOcOmpOteiiIeS. La amplia
Inervación noradrenérgica y peptidérgica de los tejidos linfoides sugiere una realidad
física en la que basar esta regulación <Stead y cois., 1987).
Para que tenga lugar una acción de los mediadores producidos por el SN. y el
SE. sobre el Si. in vivo, es necesario que estas sustancias estén presentes
localmente en concentración suficiente para provocar una respuesta. Por eso es tan
importante la relación microanatómica de los nervios periféricos con las células
inmunes.
Se ha encontrado inervación en óganos linfáticos primarios y secundarios, como
la médula ósea, timo, bazo, amígdalas y nódulos linláticos (í’ellen y cels.,1985). Los
trabajos de Feiten y su grupo demuestran que son las zonas T dependientes de estos
árganos las que están inervadas predeminantomenle.
La modulación do la respuesta inmune por el SN. y el S.E. puede ser, le que
podríamos llamar, una regulación a larga distancia, en el caso de mediadores
hormonales o tina regulación local, en el caso de neurotransmiseres y notiropóptidos
que son producidos en cantidades relativamente pequeñas y tienen una vida corta
debido a su mayor sensibilidad a las enzimas hidrolíticas.
En este intrincado contexto, se puede sugerir un control paracrino y autocrino de
las células inmunocompetentes, ya que les neuromoduladores no llegan a estas
células solamente gracias a la inervación de los órganos inmnunes sino que ellas son
capaces de sintetizarlos corno liemos apuntado en el apartado anterior <Horno-
Delarcho y Dardenne 1993).
1.3.1. Agentes nerviosos y endocrinos que regulan la actividad de
las células Inmunes.
De las numerosas hormomias y neurotransmisores conocidos, algunos de ellos
han sido investigados en cuanto a su posible acción sobre la función inmune. Estos
mediadores modifican la actividad y el metabolismo de las células inmunocompotentes
actuando ales más diversos niveles. Debido a su gran número es muy difícil citar todos
íes efectos de estos agentes sobre la respuesta inmune, por lo que centraremos
nuestra atención en los que resultan más relevantes, y describiremos do forma
abreviada lo que se conoce de ellos en el aspecto que nos ocupa.
6
In ¡reducción
1.3.1.1. Neuretransmísores y hormonas.
1.3.1.1.1. Eje hipotálamo-hipófisis.
La existencia de inmunoreactividad para el factor liberador de
corticotropina <CRF) en linfocitos de sangre periférica humana (Ritohio y cois.,
1986) sugiere una posible fuente de CRE en bazo por secreción paracrina, además de
su liberación por neurosecreción Estos hechos, así como la presencia de receptores
en las células inmunes <Audhya y cols., 1991: Webster y cola,, 1990>, apoyan el
posible papel inmunomoduiador del ORE. De hecho se ha observado que promueve la
secreción de freridorfina por células 13 (Kavelaars y cols..1989> y reduce la actividad NK
espiónica en ratas (lrwin y cole., 1992>.
La hormona adronocorticotropa (ACTH) hipofisaria inhibe la síntesis do
anticuerpos (Johnson y cols., 1982> a la vez que promueve la proliferación de linfocitos
U (Alvarez-Mon y cole., 1985>. Inhibo la producción de IFNy por linfocitos T (Johnson y
cole., 1984> y medula la expresión de receptores en estas células yen macrólagos
(Ador y cole., 1990; Zwiling y cole., 1992). Ha sido ldentif loado el receptor para ACTH
en células inmunes (60sf y cole., 1985, 1987; Smith y cole., 1967>, mostrando
características bioquímicas y estructurales semejantes a su receptor en células
adrenales.
La tirotropína (TSH> es producida por células inmunes <Smith y cols., 1983;
ICruger y Blalock, 1989), las cuales poseen receptores específicos para ellas (Kruger y
Ulalock, 1989>, y junto a su factor liberador hipotatámíco, TAH, estimulan la producción
de Inmunoglobulinas (Blalock y cole., 1985b>.
La hormona del crecimiento (OH>, secretada por la adenohipófisis, tiene
receptores en células inmunocompetentes (Weigent y cola., 1990; Ader y cola., 1990>
que son también capaces de secretaría (Weigent y cole., 1990>. Sus efectos son
restauradores sobre una serie de parámetros inmunciógicos, corno la actividad de
células NI< y la respuesta de linfocitos a mitógenos (Berczi 1., 1986; Davila y cola.. 1987;
Hadded y Mashaiy, 1991>, así mismo setirnula la producción de iL-1 e IL-2 (Schimpff y
Rapellin, 1990>. ActIva los macrófagos facilitando la formación de radicales libres
oxídativos (Edwards y cole., 1992> y también lo hace en neutrófilos <Spadonl y cole.,
7
Introducción
1991). Aunque los linfocitos produzcan OH, parece esencial la secreción de esta
hormona por la hipófisis para que pueda desarrollar sus efectos sobre la respuesta
inmune, de ahí que se ¡mpllque también indirectamente en éstos a su factor liberador
hipotalámico ORE (Nagy y cole., 1983; ICrueger y cole., 1989).
Se identificaron receptores para la prolactina <PRL> en leucocitos
mononucleares y linfocitos T y El esplénicos y de sangre periférica (Ruseelí y cole.,
1985; Gurckiey y ces., 1985>. Dei papel inmunorreguiador de esta hormona destaca su
capacidad estimuladora en la producción de IL-2 y en la respuesta celular a mitógenos,
concretamente a Con A, y así mismo la disminución en las funciones supresoras
celulares (Vidolier, 1986).
El factor hípotalárnico liberador de LH (LHRH) induce la regeneración del
timo en ratas viejas (Greenstein y cole,, 1987>. So han descrito receptores específicos
en timo de rata y la estimulación de la blastogenesis de timocitos en respuesta a Con A
(Marchetil y cole., 1989>. Así mismo su encuentran efectos similares para las hormonas
LH y ESH (Costa y cole., 1990>.
La acción de la melatonina sobre el sistema inmune ha sido recientemente
respaldado por el descubrimiento do receptores específicos en linfocitos humanos
(Lopéz-Gonzalez y cole,, 1992a> y esplanocitos de poilo (Pang y Pang, 1992>. Los
efectos, hasta ahora encontrados, incluyen la estimulación de la producción de
anticuerpos en ratones <Maestroní y cole., 1986: 1987 y 1988>, la activación de la
citotoxicidad natural (Del Gobbo y cole., 1980> y la dependiente de antIcuerpo
(Giordane y Palermo, 1991).
También se ha estudiado el efecto inmunoreguiador de la somatostatina que
cementaremos en el apartado de neuropéptidos y hormonas gastrointestInales, por
encontrarse también en esta localización.
1.3.1.1.2. Hormonas adrenomedularos.
A primeros de los ochenta se describe, corno un aumento en los niveles de
catecolamínas, en concreto adrenalina, provoca un Incremento en el número de
linfocitos y neutrófilos circulantes (flexor 1980; Roberison 1981). Estos autores
8
introducción
demuestran que la adrenalina actúa sobre las células endotelialos produciendo un
aumento en la liberación de AMPc, disminuyendo la adherencia de los neutrófilos al
endotelio. Las células inmunes poseen receptores 0-adremiórgicos de alta alinidad,
que han sido identificados en linfocitos (Khan y cole., 1986) y en macrófagos <Nowefl y
cole., 1981; Abrase y cole., 1985>. Estudios Pi vitre han mostrado que el tratamiento
de linfocitos humanos con el agonista 0-adrenérgico isoproteremiol reduce la
producción de IL-2 e iFNy, la presenciado receptores de IL-2, la capacidad citotóxica, la
producción de anticuerpos, así como la producción de IL-1 por monocitos (Beurne y
cole., 1974; Feldman y cols., 1987; Kammer, 1988>. Este último autor explica el efecto
inhibidor de las catecolaminas sobre la respuesta inmune, en base al aumento de los
niveles de AMPc que éstas producen en linfocitos.
1.3.1.1.3. Hormonas adronecorticales,
En 1978, Mooíthy y Zinnerman señalan los efectos supresores que sobro el
sistema inmune son producidos por una liberación de glucocortícoides corno las
que tienen lugar irás una actividad estresante. Estos efectos supresoras están en
parte mediados por la Inhibición de la producción de intorleucinas, como la IL-2 (Gillís y
cols., 1979> o la Li (Lew y cole., 1988; Hurme y cole., 1991> a nivel de células
Inmunocompetentes. A nivel de hipocampo la expresión de receptores para iL-1 no se
encuentra regulada por estas hormonas (Betancur y cole., 1994>. Se ha observado que
los giucocorticoides Interfieren en la secreción de leucotrienos, tromboexanos y
prostaglandinas, lo que provoca un descenso de las reacciones inflamatorias y además,
disminuye las reacciones de injerto contra huesped y la inmunidad antitumoral
producida vía mnenocito-macrófago y células NK ( Nair y Schwartz, 1984; Guyre y Munk
1989; Caliewaerty y cols., 1991; Manso y cols.,1992>. Estos últimos autores proponen
corno vía de disminución de la actividad Inmune en monocitos y macrófagos, la
inhibición del metabolismo del ácido araquidónico en estas células. En leucocitos, en
general, y en otros tipos de células, estas hormonas promueven la síntesis de
lipocortina 1, la cual regula negativamente la actividad de linfocitos poifrnorfonucleares
(PMNs) y monocito-macrófagos (Goulding y Guyre 1993>.
1.3.1.1.4. Hormonas sexuales.
La interacción de las hormonas sexuales con el sistema inmune se pone de
9
Introducción
relieve en el hecho de que en general se observa en hembras una respuesta inmune
mayor que en machos a todos los niveles (Grossman y cois. 1984>. Diversos
investigadores estudiaron la respuesta inmune en animales gonadectomizados y los
resultados obtenidos incluyen la estimulación de la transformación biastogénica de
linfocitos T (Grossrnan y cole., 1982>.y la disminución del tiempo de rechazo de injertos
(Gral f y cole., 1983). Se comprobó que la progesterona provocaba un adisminución del
rechazo a injertos (Munree, 1971>, hecho que se confirmé posteriormente (Szekeres-
l3artho y cole,, 1983).Por otra parte, estudios in vitre han demostrado la actividad
inmunosupresora del piasma seminal (Canh y cols., 1990>.
1.3,1.1.5. Otras hormonas y neurotransmisores.
La acetilcolina, neurotransmisor parasimpático, parece tener efectos positivos
sobre la respuesta inmune (Strem y cole., 1974; Malinsky y cols.,1988) y se han
encontrado receptores nicotinicos y muscarinicos en linfocitos (fierczi, 1989>. A través
do receptores específicos estimulan la función de las células T citotóxicas (Strem y
cole., 1981) así como su preliferación (Strom y cele., 1981; Morgan y cole., 1984>. El
antagonista muscarinico, atropina, disminuye la producción de igA a través de
receptores de baja afinidad en células 13 (Wllson y cole., 1982; Atweh y cole., 1984;
Ado y cola., 1966>.
La serotonina ha sido relacionada con enfermedades autoinmunes corno la
encefalornielitis <Scott y cole., 1983>. InhIbe la proliferaclón en respuesta a PHA
<Uonnet y cole., 1984; Khan y cols., 1986>, eslimula la citotoxicidad NK (Holistrand y
Hormodson, 1987> y medula la fagocitosis (Sternberg y cole., 1986> Estos efectos
parecen ser específicos puesto que se han encontrada receptores en linfocitos (Fillion
y cols., 1989>.
La calcítonína y el cORP parecen tener también receptores en las células
inmunes (flody y cole., 1990>. La caicitonina es quimieatrayente para monocitos,
mientras que no lo es el cORP (Sacerdote y cole., 1990), este último inhibe la
proliferación de linfocitos Ten respuesta a mitógeno <Urneda y cole., 1986).
Se han detectado receptores para la hormona paratiraidea (PTH> en
linfocitos (Ferry y cole., 1984>. Esta hormona inhibe la linfoproiiferación Inducida por
10
¡¡It rOdLICCiótI
loctinas y oste efecto parece mediado por una proteina relacionada que actuaría como
factor inhibidor del crecimiento <Adachi y cois., 1990).
La vitamina O, además de su papel en la hemeostasis del calcio, está tanbIón
implicada en la respuesta inmune <Tsoukas y cele., 1984). Así, estirnula la
diferenciación y maduración de células mieloides (Abe y cols., 1981>. Existen
receptores para 1,25-dihídrocolecalciferol o vitamina OSen linfocitos T y 6 activados
(l3lialla y cols., 1983; Prevediní y cois., 1983; Manolagas y cole., 1990). La
administración de dosis farmacológicas de vitamina O in vitre suprime la producción de
iL-2 e IFNy, la proliferación linfoide y la producción de anticuerpos (Lemire y cole.,
1085>. Este último efecto podría ser debido a la inhibición producida sobre el receptor
de IL-2 en células 13 (Chen y cdc., 1987).
1.3.1.2. Neuropeptides y hormonas gastrol ntostinalesMerecen una especial atención un grupo de péptidos que actuan como
neurotransmisores emi el sistema norioso Central, S.N.C., y que también son
producidos en terminaciones nerviosas periféricas que Inervan el tracto digestivo,
siendo además algunos de ellos producidos por células de tipo endocrino.
Algunas de estas sustancias han sido encontradas en altas concentraciones en
les focos inflamatorios, como es el caso de la su8tancIa P (SP>, perteneciente a la
familia de las taquininas y uno de los neuropéptidos en los que primero se descubrió su
acción reguladora sobre el sistema inmune, en concreto, su papel en la respuesta
inflamatoria. La SP estimula la liberación de histamina por mastocitos, aumenta la
proliferación de fibroblastos, y la secreción de prostaglandinas y de colagenasa en
sinoviocitos. AsI mismo produce un aumento de la permeabilidad vascular,
favoreciendo el tráfico celular hacia el foco Inflamatorio (Marasco 1981, Pernow 1983).
Existen receptores para SP en la población linfoide de bazo y ganglios <Payan y
cois., 1984a: Stanisz y cols., 1987). También los macrófagos peritoneales poseen
receptores para SP (Hartung y cols.,1986). Este péptido es además sintetizado por
cesinófilos (Aliakbar y cols.,1987) y macrófagos (Pascual y Doct, 1990). Sus efectos
sobre el sistema inmune son en general estimuladores. Activa la proliferación linfoide,
aumentando la síntesis de ADN inducida por Con A en linfocitos de bazo, placas de
11
Introducción
Poyar y ganglios linfáticos (Payan y cole., 1983 y 1984a; Stanisz y cols., 1986 y 1987;
Stead y cols., 1987>, estimula la síntesis de inmunoglobulinas (Stanisz y cole., 1986;
Stead y cole., 1987; Pascual y cols., 1991> y la producción de iL-2 (Calvo y cois., 1992;
Rameshwar y cois.,1992) y de IFNy <Wagner y cole., 1987>. También estirnula la
actividad citotóxica NK (Ulennenstock y cols., 1989; Croiteru y cole., 1990>. Aumenta la
fagocitosis <Bar-Shavit y Goldman, 1980>, adherencia a endotelio (Payan y cole.,
19840> y la quimiotaxis <Hartung y Toyka, 1983; Rufí y cets.,1985>, nsj como el
metabolismo oxidativo en neutrófilos, medido como emisión de quirnioluminíscencia
(Hafstrom y cele., 1 989>y en estos mismos fagocitos estimulo la citotoxicidad celular
dependiente de anticuerpo (Wozniak y cole., 1989>. Es un factor quimiotáctico para
monocitos <Ruff y cole., 1905) y en macrófagos estimula la liberación de mediadores
derivados del ácido araquidónico, de radicales libres del oxigeno y la producción de
enzimas lisesómicas (Hartung y cole., 1983y 1986; Marasco y cola., 1981>. Además
ostimula la fagocitosis y quimiotaxis en estas células (McGiilis y cole., 1987; Ruff y cole,,
1985> y facilita la secreción de citocinas como TNF, IL-1 e IL-6 (Letra y cola., 1088).
En cuanto a los mecanismos de acción parece ser que actúa elevando los niveles
de calcio citosólíco y favoreciendo la formación de inositoles fosfato (Sarro y cola..,
1988) actuando presumiblemente vía proteínas de unión al GTP (Shumann y Gardner
1989). Otras taquininas, como la bradiquinina, neuroquinina A o neuromedína M
producemi efectos similares.
El efecto sobre la función inmune de otro neuropéptído, también producido en el
tracto digestivo, la neurotensína, fue investigado por el grupo de Goidman y Bar-
Shavit a primeros de los 80, en concreto comprobaron su unión especifian a
macrófagos murinos le que se traducía en una estimulación de su actividad fagocitica
(Uar-Shavlt y cols.,1982>. Así mismo, demostraron que la neurotensina es capaz de
orientar ¡a migración de leucocitos poilmorfonucleados neutrófilos e incrementar la
fagocitosis de partículas inertes activando a nivel Intracelular la liberación do calcio
(Goidman y cols.,1983).
La neurotensina y el otro neuropéptido estructuraimente relacionado con el que
comparte los cuatro aminoácidos C”termninales, la neuromedino N, estimulan la
adherencia y quinilotaxis de linfocitos peritoneales murinos (Garrido y cols.,1992>, así
como todas las etapas del proceso fagocitico en macrófagos (De la Fuente y cola,,
iSOSo>. Estimula también la proliferación linfoide (Soder y Helstrom, 1987>, la
12
Iri 1ro ducción
producción de Li por macrófagos alveolares activados (Lemaire, iseo> y la formación
de colonias progenitoras de células mononucleadas dependientes do CSF-l (Meore y
cole,, 1989).
Otros neuropéptidos gastrointestinales como la somatostina o el péptido
intestinal vasoactivo <VIP>, parecen ejercer un efecto modulador inh¡bidor sobre las
células inmunocompetentes.
En 1981 Balhena y cole. Identifican receptores para sometostetlna en linfocitos
y en mnonocitos circulantes. Posteriormente, se encontraron receptores para
somatostatina en linfocitos espiénicos y en placas de Poyer (Scicchitano y cole., 1987;
Sínad y cole., 1987> así como en células de la línea mieloide (Welgent y cole., 1990>.Poro no sólo existen receptores para este péptido en células inmunes sino que,
posiblemente, éstas lo sintetizan. Así, se comprobó la presencia de sematostatinatanto en PMNs y linfocitos de sangre periférica (Lygren y cole., 1984 Wolnstock y cole.,
1986), como en el timo de rata (Gomariz y cole., 1990>. Pronto se descubrió su efecto
inhibidor sobre la proliferación linfoide (Payan 1984b; Mascards 1984>. Sl bien los
estudios posteriores muestran resultados contrarios, Johanseon y Sandberg (1989>
obtienen un aumento de la proliferación espontánea de timocitos, así como de la
proliferaclón en respuesta a FHA. En experimentos in vivo Stanlsz y coJa. (1987)
también observan una estimulación do la proliferación linfoide.
Por su parte ha sido encontrada Inmunoreactividad para VIP en linfocitos de la
corteza timica y en áreas T-dependlentee de bazo y ganglios axilares de rata y ratón
(Gomariz y cola., 1990 y 1992>. También se ha encontrado V?P en leucocitos
polimorfonucleares <O’Dorisio y cole., 1980; Lygren y cole., 1964> Se han detectado
receptores para VIP en linfocitos T y 8, así como en macrófagos y monocitos (Guerrero
y cois., 1981: Danek y cole., 1983; Ottaway y Greenberg, 1984; O’Dorisio y cole., 1987
y 1989; Wood y O’Dorleio, 1985; Calvo y cola., 1086; Flnch y cole., 1980; Roberta y
cole., 1991; Segura y cole,, 1991). Se ha comnprobado la expresión gónica de VIP en
liniocitos de bazo y timo de rata <Gomariz y cola., 1993 y 1994)
La actividad de linfocitos T y 6 se ve afectada por el ViP. Este inhibe la
proliferación linfoide en respuesta a Con A y FHA, así como la secreción de IL-2 en
linfocitos T estimulados (Ottaway y Greenberg, 1984; Ottaway, 1987; Boudard y
Bastide, 1991; Ganea y Sun, 1993>, estos últimos autores sugieren que este efecto
13
Introducción
puede estar mediado por AMPc ya que observan un rápido incremento de su
concentración a nivel intracelular, El VIP también ejerce su acción sobre la secreción
de Inmunoglobulinas, estimulando la producción de IgA (Stanisz y cols.,1986; lshloka y
cols., 1992>. Afecta a la migración, inhibiendo el tráfico de linfocitos (Ottaway, 1984 y
1985; Moere, 1984; Meore y cole., 1988> y reduce la actividad NK (Rola-pfasczynski y
cols., 1985; Sirianní y cols., 1992>.
Sobre las células fagociticas el VIR ejerce un papal estimulador de la fagocitosis y
la digestión, incrementando intracelularmente la actividad de la proteína quinasa O (De
la Fuente y cole., 1993b). Por otra parte, también estimula la producción de AMPo en
macrófagos peritoneales de rata (Segura y cole., 1992>. Aumenta la adherencia a
sustrato in vitre de macrófagos y linfocitos peritoneales, estimulando ademnás la
capacidad quimiotáctica de los primeros y reduciéndola en los linfocitos (De la Fuente y
cole., 1994. en prensa).
Recientemente neuropóptidos de la familia del polipéptido pancreático, el
neuropéptido Y (NPY) y el péptido VV, han sido relacionado con el sistemainmune. Estos péptidos, que comparten un 70% de homología en su estructura, son
liberados por fibras simpáticas en óraganos linfoides: timo, ganglios mesentéricos y
bazo en el caso del NPY, y por células endocrinas en el caso del PYY. La acción del
NPY en los órganos inmunocompetentes Indicados podría ser directa o potenciando
íes efectos de la noradrenalina (Remano y cole., 1991>. El NFY disminuye la
estimulación de la proliferación de linfocitos de rata en respuesta a FHA (Soder y
Flelistrom, lOO?> y no estimula por si mismo la proliferaclón espontánea (Johansson y
Sandberg, 1989>. En cuanto ala actividad citotóxica lrwln ycois. (1091>observaron una
correlación negativa entre la concentración plasmática de NPY y dicha actividad en
células inmunes de enfermos con Alzheimer. Recientemente, Nair y cole. (1993> han
observado una reducción de la citotoxicidad naturat (NK> de linfocitos normales, a
concentraciones fisiológicas del NPY.
Nuestro grupo ha demostrado que tanto el NEW como el péptido VS’ se unen
específicamente a macrófagos murinos provocando un incremento de los niveles de
Inositol trlfosf ato y activación de la proteína quinasa O, lo que so traduce en una
modulación positiva de todas las atapas del proceso fagocitico (adherencia,
quimiotaxis, ingestión y digestión) de estas células (De la Fuente y cols.,1993a>.
14
Introducción
Varios estudios apuntan hacia un posible papel imimunomuoduiador de la
coleclatequinina (COK). Ferrara y cols. (1989> y Mc Millen y cole. <1990)
comprobaron que la CCK-8 actua como inhibidor de la proliferación de células
mononucleares de sangre periférica humana cuando las cantidades de FHA utilizadas
eran óptimas para la mitogénesis. Nuestro grupo ha observado también la disminución
por COK-Ss de la proliferación de linfocitos humanos en respuesta a FHA y el aumento,
que, sin embargo, produce en la proliferación espontánea (en ausencia de mitógeno)
(Carrasco y cole., 1990>. Por su parte, Milias y cols. (1991> aunque coinciden en que la
COK inhibe la transformación linfoblástica inducida por FHA en linfocitos humanos no
obtienen diferencias en los cultivos incubados con CCK en ausencia del mitógeno con
respecto a los controles. Los autores postulan un posible mecanismo de acción a
través del aumento del contenido de AMPc Intracelular.
En neutrófilos humanos se ha observado un aumento de la capacidad de
adherencia y una disminución de la fagocitosis (Carrasco y cols.,1991>. También en
macrófagos se produce una Inhibición del proceso fagocítico <De la Fuente y
cois., 1993b>. Según Numae y Agrawal (1992> la COK-8 sulfatada podría tener un papal
importante en los procesos de infiltración celular en la inflamación de origen alérgico.
Estos autores han detectado una potenciación de la qulmiotaxis de eosinófilos
humanos Inducida por PAF (factor de activación plaquetar> y por LT134 en enfermos
alérgicos pero no en sujetos normales, De hecho, nosotros hemos observado una
inhibición de la quimiotaxis de linfocitos y fagocitos tente en ratón corno en humanos
(De la Fuente y cois.,1993b>.
La gastrina pertenece a la misma familia que la COK compartiendo con ella los
cinco aminoácidos 0-terminales. Esta hormona ha sido relacionada con varios tIpos de
tumores, así la transformación maligna del colon podría suponer una respuesta
exagerada a la gastrina circulante o estar asociada con la producción de un péptido muy
similar <Hoosein y cois., 1990>. La gastrina -17 humana y porcina no tienen efecto sobre
la transformación linfoblástica inducida por FHA de linfocitos humanos, incluso a
concentraciones elevadas de la hormona (Míhas, 1991). En cuanto a la adherencia y
fagocitosis de neutrofilos humanos se comporta corno la COK aumentando la
capacidad de adherencia y disminuyendo la fagocitosis (Carrasco y cola., 1991>.
15
IflttOdUCCiófl
En 1981, Heldermann observa que otra hormona, la Insulina, actúa potenciando
el ciclo celular de los linfocitos T y ~umotabolismo. Un año antes se hablan descrito
receptores para la insulina en células fagociticas. en concreto en macrófagos
(Pederson 1980>.
Por otra parte, no caben dudas en cuanto al efecto Inmunorregulador de ciertos
péptidos opiáceos y de la producción de algunos de ellos por células inmunes,
como es el caso de la [3-endorfínaencontrada en macrófagos esplónicos de ratón
(Lolait y cois., 1984). El electo de estos póptídos endógenos sobre la respuesta
prolíferativa varia según las dosIs de los mismos y las condiciones de experimentaciónempleadas. Así se observa una potenciación de la blastogénesis in vitre, mientrás In
vivo las dosis altas son supresoras y las bajas activadoras (Plotnikofi y cots.,1983>. La
met-oncefalina parece actuar aumentando la linfoprolileración en respuesta al
antígeno (Roscetti y cols., 1988> así como estimula la producción de iL•1 (SI-Xun y
Xiao-Yu, 1989>. La I3-endorfina y la met-oncefallna aumentan la actividad NK e inhiben
el crecimiento tumoral in vivo (Proelich y cols,1984; Kay y cols.,1084; Mandíer y
cols.,1986>. Favorecen la qulmiotaxis de monocitos (Van Epps y Salad, 1984> y
estimulan la liberación de radicales libros en fagocitos (Morley y cols., 1987; Wiiloms y
cois., 1988). ExIsten receptores opioldes en todas las lineas celulares inmunes (Carr y
cole., 1988> y también, estos péptídos pueden ser producidos por todas eBas (Welgent
y (3iaiock 1987; Ador y cois.. 1990>.
Otros péptidos ya comentados como el TRH, GRF o CRE también han sido
encontrados en el tracto digestivo pero se han descrito antes por ser más típicos del
hipotálamo.
Umi comentarlo especial y en mayor extensión merecen los péptidos
pertenecientes a la familia de la bombesina, que han Gide el objeto del presente
trabajo, por lo que se les dedicará el siguiente apartado.
18
introducción
1.3.1.3. Bombesina <UN> y peptidos relacionados
La bombesina <UN> es un tetradecapóptido que fue aislado de la piel de la rana
europea Bonibina bombina <Anastasí y cols..1971>. Fosteriormente, otros péptidos
similares en estructura fueron aislados de la piel de otros anfibios (Ersparner y
ceis., 1988). En 1978 es aislado el llamado péptido liberador de gastrina (GRP) del
tracto digestivo porcino (Mc Donaid y coIs., 1979>. El nombre lo recibió por el bioensayo
utilizado en su delermínaclón y se ha mantenido aunque hace mención a uno sólo de
sus numerosos efectos fisiológicos. Este péptido consta de veintisiete aminoácidos y
su fragmento decapóptido O-terminal os idéntico al de la UN y es el requerido por ésta
para su unión al receptor (Moody y cols.,1978>. Posteriormente lun aislado, de médula
espinal porcina, el péptido que constituye el fragmento de diez aminoácidos O-
teríTiinales del CAP, el cual fue denominado neuromedina O (Minarnino y cOls.,1984>.
Los estudios sobre los efectos fisiológicos de la UN pueden ser considerados
descriptivos de los producidos por el CAP, ya que multipies resultados han
demostrado que ambos péptidos actuan de forma semejante <Mc Donaid y cois.,
1983>.
A continuación, se muestran las secuencias aminoacidicas de tos tres
neuropéptidos UN, CAP y neuromedina O, apareciendo subrayada la secuencia que
comparten.
CAP Ala- Pro- Val- Ser- Val- Giy- Gly- Giy- Thr- Val- Lot- Ala- Lys- Mal- Tyr- Pro- Arg-
Clv- Asn- 1-lis- Tro- Ala- Val- Clv- His- Loii- Met.NH0
Net,nrnec~a O
UN
Se encontró CAP en
gastrointestinal y en el pulmón.
cerebro de anfibios para la EN
Clv- Asn- 1-lis- Tro- Ala- Val- Civ- lib- Leu- Met.Nt-lo
Glu- Ciii- Arg- Leu- ~1yA~nSin- Tro- Ala- Val- Clv- His- Leu- Mel. NH2
el sistema nervioso central (aNO>, en el tracto
En el SNO, se hallé Inmunoreactívidad positiva en
(Pollak y cola,, 1976> y posteriormente en extractos de
1?
Inlroducción
cerebro do cobayas y ratas (Roth y cols., 1983; Shew y cois., 1987; i-lernanz, 1990>.
Ha sido comprobado que el GRP ejerce un papel en los mecanismos
homeostáticos centrales, así está implicado en termorregulación, ejerciendo un efecto
hipotórmico (Taché y cois., 1980>. Westendorf y cols., (1982> sugirieron una acción
directa de estos neuropéptides sobre la glándula pituitaria, estimnulando la secreción de
PAL y CH. Así mismo, el CAP estimula la secreción de muchas hormonas, como la
adrenalina y regula la secreción de ácido gástrico y la glucemia (Urown y cela., 1978).
Dentro del tracto gastrointestinal, el OSP se localiza, en la rata, en fibras del plexo
mientérico que se encuentra entre las capas musculares, yen el plexo submucoso que
contacta con la mucosa del estómago y del intestino (Dockray y cole., 1970; Hernanz,
1990>. Estos descubrimientos indicaban el probable papel como neurotransmisores de
esta familia de péptidos en el tracto digestivo de mamíferos, Efectivamente se
descubrió que el CAP estimula la secreción de gastrína, insulina, glucagon, polipéptido
pancreático y somatostatina <Mc Donsíd y cela., 1983>. Así mismo medula la actividad
motora, estimulando la contracción del músculo liso gastrointestinal (Taché y cole.,
1980>.
También se localiza el CAP en el pulmón. En 1981 se caracteriza un tipo de tumor
pulmonar, el SOLO (amaN celí lung cancer), en base a sus elevados niveles de SN
(Moody y cels.,l981>. Basado en los estudios realizados por Moody y colaboradores, el
grupo de Weber (1985> descubre que el CAP es un mitógeno para las células que
constituyen el tumor pulmonar SOLO. La mítogenícidad del CAP reside en su
fragmento tetradecapéptido carboxitermlnai, es decir el que comparto homología con la
bombesina y la más recientemente descubierta neuromedina O. Wiiley y cole. (1984>
observan que la bembesina y el fragmento tetradecapéptido 0-terminal dei CAP
estimulan la proliferación de células humanas normales del epitelio bronquial.
Oon posterioridad a estos descubrimientos y en base a ellos, se clenó el ruRNA
codificador para el CAP de un tumor pulmonar humano que lo contenía (Spindol y
cole., 1984> y de células del SOLO <Sausvilie y cola., 1986>. Estos estudios
establecieron que el CAP es lormado a partir de un precursor polipeptidice que
contiene una sola copia del péptido. La secuencie del CAP sigue inmediatamente al
póptido señal y a continuación se extiende una larga secuencia pelipeptidica
carboxiterminal, El genoma humane muestra un gen codificador para el CAP que por
analisis cítogenéticos ha sido situado en el cromosoma IB.
18
Introducción
Analisis por HPLC de nroleinas aisladas muestran la formación del GRP-10 (o
Ilcuromedina O> in vivo. Este decapéptido es probablemente sintetizado por
procesos proteoliticos alternos a partir del mismo precursor que el GRF-27 (Spindel,
1986; Spindel y ICrane, 1988).
Muchas células tumorales secretan factores de crecimiento autocrinos que
estimulan su proliferación. En el caso de las células del SCLC, el CAP so une a
receptores en la superficie de estas células, eleva los niveles de 0a2+ intracelular y
ostimula el crecimiento del tumor (Moody y Cuttita, 1993>. También hay receptores para
UN/ GRP en lineas tuniorales humanas, en concreto de glioblastoma humano <U-liB> y
de un carcinoma pulmonar <NCI-l-1720> de las cuales han sido solubilizados y purificados
estos receptores (Staiey y cols., 1993>.
También la línea celular murina de fibroblastes Swiss 313 presentti receptores de
alta alinidad para UN/ CRP (Zachary y Rozengurt, 1985), los cuales han sido
solubilizados y purificados de estas células <Naldiní y cole., 1990; Battey y cols., 1991).
El receptor para BN/ CRP de las células Swiss 3T3 ha sido además donado
molecularmente <Uattey y cols., 1991>, y de su analisis estructural, los autores deducen
que dicho receptor es miembro de la superfamilia de receptores dependientes de
proteína O, que une nucleotidos de guanina <GTP>, estando constituido por sus
característicos siete dominios transmembranales hidrofóbicos. Esta posibilidad había
sido también apuntada por Sinnett-Smith y cola., en 1990, al observar una pérdida de
afinidad dei CAP por los receptores al añadir nucieotidos de guanina. En las células
Swiss OTO estos péptidos estimulan la síntesis de DNA a concentraciones
nanomolares y en ausencia de ningún otro factor de crecimiento o mitógeno
(Rozengurí & Sinnett-Smith, 1983>. Se conocen bien los mecanismos de acción de
estos neuropéptidos en las células Swiss 313. Tras la unión de la BNI CAP al receptor,
este interacciona con la subunidad de unión Ql OIP < Flscher y Schonbrun, 1988> y se
elevan los niveles de inesitol 1,4,$trislosfato y de calcio intracelular (Heslop y cola.,
1986; Mendoza y cois., 1986>, se activa la proteína quinasa O (Zachary y cola., 1986) y
se inducen los oncogenes o-los y c-myc (Letterio y cols., 1986>.
En esta misma línea, Fatal y Screy (1990> demuestran la implicación de la
bombesina en el cáncer de mama, ya que la incubación con el neuropéptido produce
una activación de la ruta del inositol trlfosf ato y elevación del flujo de calcio, ambas
señales mitogénicas. Coincidentes con estos resultados en cuanto a los mecanismos
de acción a nivel intracelular, Swope y Schonbrun (1988> determinaron la ruta seguida
19
Introducción
por la bombosina en la estimulación de la secreción de insulina, que implica una
elevación de los niveles de calcio y activación de la preteina quinasa O.
Una vez probada la acción del CAP corno potente factor de crecimiento en
diferentes tumores, creció el interés en encontrar antagonistas que compitieran por el
receptor para CAP en estas células. Coy y cois. (1900>, llevaron a cabo un estudio
sobre análogos de UN! CAP con actividad corno antagonistas y describieron
estrategias para obtener pseudopóptidos que mantuviesen su capacidad antagonista
pura, sin expresar ninguna actividad como agonistas, como había ocurrido hasta
entonces. En este sentido, Szepeshazi y cols. (1992> proponen la posible aplicación
terapeútica de un antagonista de la bombesina obtenido sinteticamente, el RO-SUOS,
el cual actúa Inhibiendo el crecimiento de un tipo de cáncer de mama en ratones. Al
parecer la inhibición se relaciona con una disminución, en presencia del antagonista de
la bomubesina. en la capacidad de unión, a sus receptores, del factor de crecimiento
epidérmico (ESE>, más que con una competición por el propio receptor.
Recientemente Liebow y colaboradores (1993> han observado que el antagonista de la
UN, RC-3095, es capaz de retrasar significativamente el desarrollo do un tipo de cáncer
provocado experimentalmente trás la administración del carcinógeno
dimetilbenzantraceno (DMUA).
Aunque se han encontrado receptores de alta afinidad para un número
considerable de hormonas y neuropéptidos en leucocitos, no han sido aún descritos
para la familia de la bombesina. Sin embargo, si parece probado que estos péptidos
tengan efectos inmunomoduladores, si bien los resultados a este respecto son todavía
escasos y puntuales.
fluí f y cole. (1005>, observan que la bombesina es un potente quimioatrayente
para monocitos humanos y células del SOLO, pudiendo consistir su papel en mantener
localizado el tumor. Sugieren que una alteración en la producción o regulación de la
migración celular por éste y otros neuropéptidos, podría ser responsable de la
dispersión del tumor, En los años siguientes, el grupo de Wiedermann demuestra que
macrófagos alveolares de rata secretan bombesina y también lo hacen, en mayor
medida, los obtenidos de ratas que desarrollan procesos fibróticos (Wiodermann y
cole., 1986 y 1988). Los autores postulan que la UN, quimioatrayente para monocitos
según Ruf 1 y cole., actuarla reclutando macrófagos hacia los alveolos. Esto podría
favorecer el aclaramiento de partículas indeseables <carbón, sílice, etc) no obstante, un
exceso de secreción de UN también podría desembocar en una transformnaclón
20
In 1ro ÚL¡cciÓt)
neoplásica en el pulmón, teniendo por lo tanto consecuencias patológicas.
En estudios con pacientes de bronquitis crónica, Meloní y cols. (1992>
demuestran la presencia de bombesina en células de la línea monocito-macrófago de
sujetos normales, llegando a niveles altos en pacientes con bronquitis crónica. Estos
hechos parecen apoyar la idea de que estos péptidos desempeñan un papel
importante en la respuesta inmunológica a enfermedades pulmonares.
Un estudio con diversos neuropóptídos, entre elfos la bombesina, sobre la
proiif oración de células obtenidas de nódulos linfáticos de ratón en cultivos mixtos(MLII>, revela que ésta es capaz de estimular ligeramente dicho crecimiento, si bien
solamente se observa el efecto con concentraciones muy pequeñas del péptido
(10-~~ a 1018 M> (Krco y cols..1986>.
Fink y cols., (1988> encuentran que la bombesina mute la proliferación de células
OTLL-2 inducida por IL-2. Estos autores proponen la existencia de receptores
específicos para UN cii estas células y rechazan que se de una competición por el sitio
do unión a la IL-2, a la vista de las curvas dosis-respuesta obtenidas.
Según observan Ji11 y cois. (1980>, la bombesina taníbión regula la actividad de los
linfocitos U incrementando la secreción de anticuerpos de tipo IgA e IgO en el intestino
de rata crí experimentos realizados Pi vivo trás inyección intravenosa de SN.
Los mismos autores (Jin y cois. 1990> estudian también, el posible efecto de
estos póptidos sobre la funden fagocitica, en concreto analizaron la emisión de
quimioluminíscencia por fagocitos murinos en respuesta a CAP y péptidos
relacionados y observaron un incremento de la misma. Este hecho es interpretado
como tiria estimnuiación de la función fagocitica por estos péptidos, dado que los
fagocitos activados emiten luz debido al incremento de su metabolismo oxidativo.
Además observan que la adición de un quelante de calcio, como el ECTA, reduce la
capacidad de respuesta de esas células fagociticas al CAP, lo cuat viene a confirmar la
importancia del calcio como mensajero en la transducción de la señal producida por
estos péptidos, hecho que ya había sido demostrado en otros sistemas biológicos.
En 1991, Van Tel y colaboradores investigaron, los efectos de la administración
intravenosa de UN en voluntarios humanos, en concreto, sobre la actividad citotóxica
frente a las células turnorales 1<562, y observaron un incremento de dicha actividad NK.
Previamente hablan obtenido resultados similares en experimentos in vitre (Van Tel y
cols., 1990) aunque los niveles de estimulación obtenidos cori SN en este caso fueron
21
Introducción
inferIores a los obtenidos k, vivo.Como so puede deducir por lo expuesto los trabajos que estudian el erecto de la
SN. o péptidos relacionados con ella, en el S.l. son escasos y puntuales.
22
Objetivos
2. OBJETIVOS.
En base a los antecedentes existentes, expuestos en la introducción, parece
evidemite que el sistema inmune es regulado por los sistemas nervioso y endocrino, sibien no son del todo conocidos los efectos que los mediadores de aritos sistemas
producen en las células inmunocompetentes nl los mecanismos de dicha actuación.
En este sentido los datos existentes sobre el grupo de hormonas y neuropéptidos son
aún más escasos> y dentro de elles destacan, por la falta de información existente, los
péptidos relacionados con la bornbesiria que se han detectado en mamíferos: el
póptido liberador de gastrina (GRP) y la neuromodina O
El objetivo general que ha guiado el presente trabajo de Investigación ha sido
estudiar el efecto que esta familia de neuropéptidos (bornbeslna, CAP, y neuromedinaO) ejerce sobre la respuesta inmune, lo cual aportaría una prueba más de le
interconexión existente entre los sistemas nervioso e Inmune. Además, puesto que
los trabajos existentes en el campo de la neuroinmunomodulación son puntuales en su
abordaje, nos propusimos conocer el efecto de esta famnílla de póptídos sobre la
funcionalidad de los des tipos principales de células Inmunes: linfocitos y fagocitos.
Para alcanzar dicho objetivo se eligió un modelo animal de experimentación
ampliamente utilizado en inmunologia, el ratón, y se estableció un diseño Pi vitre para
poder estudiar la acción directa de los neuropéptidos objeto de estudio sin lasInterferencias que logicamnente tienen lugar Pi vivo.
Esto objetivo general se ha parcelado en objetivos más concretos que se
enumeran a continuación:1.- Efecto de los neuropéptidos sobre la función de las células fagociticas. Se
eligieron para llevar a cabo este estudio, los macrófagos peritoneales, por ser
representativos de este tipo celular, facilmente obtenibíes en las cantidades
necesarias, y por ser una población en la que nuestro grupo tiene una gran
experiencia, habiéndose desarrollado incluso técnicas originales para la Investigación
de la misma. El estudio se contra en la función más significatíva de estas células, el
23
Objetivos
proceso 1 agocítico, considerando todas y cada una de sus diferentes etepas:
adherencia a sustrato, quimiotaxis (posible efecto como quimiotáctice y corro
qulmioatrayente>, fagocitosis de partículas nortes y de células, y destrucción del
material ingerido, esta última etapa del proceso se caracteriza por una serie de
actividades de las cuales, una de las iniciales y más Implicadas en la propia destrucción
os la producción de radicales de oxigeno como el anión superóxido y el peróxido de
ti i clróge no.
2.- Efecto sobre la funcionalidad de los linfocitos. Se obtienen éstos de tres
órganos inmumiocompetentes: timo (órgano linfoide central o primario, lugar de
diferenciación y producción do linfocitos T>, bazo (órgano hematopoyético en el ratón)
y ganglios axilares (representativo de los órganos linfoides periféricos o secundarios)
Además se incluyen los linfocitos peritoneales por ser una población que comparte
localización con los fagocitos que nos proponernos estudiar. En estas células se
estudian dos do sus funciones más representativas: la quimiotaxis y la proliferación
(bien espontánea o cmi respuesta a muitógenos>3.- Efecto sobre la actividad citotóxica. Se estudia por una parte, la actividad
citotóxica natural, na(urai killor (NK) en leucocitos obtenidas de peritoneo y de los tres
órganos linfoides reseñados en el punto anterior, y por otra parte, la citotoxicidad
celular dependiente de anticuerpo (ADCO> en las mnlsmas poblaciones de leucocitos
4.-Modulación por los neuropéptidos de la secreción por células
imímnunocomnpetentes de factores de colaboración intercelular: Valorarnos los niveles de
iríterleucina 1, factor producido por macrófagos que interviene decisivamente en la
estimulación do la proliforación linfoide, y de interleucina 2, producida por los linfocitos
y directamente Implicada también cmi linfoproliferación y en la estimulación de la
actividad citotóxica. Además medimos los niveles del factor de fusión de macrófagos,ITM, producido por linfocitos y responsable de la formación de las células gigantes
muitinucleadas <MCC).5.- Necesidad de la presencia de los péptídos para la obtención de les efectos. Se
pretende averiguar si la incubación con los neuropéptidos previa al ensayo essuficiente para que éstos mantengan su efecto o si por el contrario, es necesaria su
presencia alo largo del tiempo que dura el desarrollo de las pruebas.
6.- Especificidad de los efectos observados. Utilizando un péptido que actúa
como potente antagonista uniéndose al receptor para la bombesina en otros sistemas,
pretendemos comprobar si los efectos obtenidos por nosotros son específicos.
24
Objetivos
Además, se ostudia la posible presencia do receptores en las células inmunes para
estos neuropóptidos.
7.- Efecto de los neuropóptidos según el tipo celular. Se pretende estudiar sus
efectos en las diferentes poblaciones de leucocitos purificadas en base a su diferente
capacidad de adherencia: células adherentes (principalmente macrófagos y linfocitos
U> y células no adherentes (población enriquecida en linfocitos 1>.
8.- Necesidad de la presencia de las célula adherentes para obtener el efecto
modulador de los neuropéptidos sobre la función linfoide o posible producción de
algún factor por dichas células adherentes que sea el responsable de los efectos
observados en linfocitos cuando se analizan en la población leucocitaria.
9.- MocarMemos de acción seguidos por los neuropóptidos a nivel intracelular.
Pretendemos determinar la ruta de tranisducción de la señal de los péptidos estudiados
valoramido los niveles de segundos mensajeros: AMPc e IFa, y su posible efecto sobre
la actividad enzimnática proteína kinasa O <PKC>.
y
y
125
3. MATERIALES Y METODOS
Matorinies y Métodos
34. MATERIALES.
3.14 .Material Bioláglco
La experimentación se ha realizado en ratones Mus ¡nuscuIus de las cepas Swiss y
UALU/c procedentes de IFEA CREDO (Centre de recherche et delevage des Onais de
Saint Cermaini Sur LArbrese en Francia>. Fueron mantenidos en el animalario de
nuestro departamento en condiciones estandar do alimentación con pienso (FANLAB)
y agua oeS iibitu,n, a una temperatura de 22±2~C y fotoperiodo invertido. Los animales
utilizados fueron machos con una edad de 15±5semanas.
Las levaduras Cándida albioans fueron cedidas por el Dr. Prieto del Depto. de
Microbiología de la Universidad Complutense de Madrid (UCM>.
Las células tumorales de la línea K562 fueron cedidas por el Dr. Alvarez De Mon de
la Universidad de Alcalá de Henares,
Las células YAC-1 fueron una cesión del Dr, Subiza del Servicio de Inimunologla del
Hospital Cifnico de Madrid,
34.2. ModIos de cultivo,Sabeuraud Gélose/Agar (UioMérieux) se utiliza como medio de cultivo para las
levadurasCándida albitana
Medio de cultivo RFMI 1640 con HEFES 2SmnM, y enriquezido con L-giutarnina
2OmM (01600). En cultivos celulares se emplea suplementado con 10% de suero fetal
de ternera. srr (01600> descompiemrentarizado en baño a 5600 durante 30 mm, y
como antibiótico se emplea 0.1 mg/mrd de gentamicina <CIUCO).
Medio 199 con 1-IEFES 2SmM y L-glutamina 2OmM (01600>.
Medios salines preparados en el laboratorio con agua tridestilada : solución salina
tamponíada de fosfatos,PBS, <OLNa 720g; FO4HNa2 l,54g; PO4H2K 0,44g por 1 de
disolución> y Hanks (glucosa Ig: cloruro magnésico O,lg; cloruro sódico Sg; cloruro
potásico 0,4g; cloruro cálcico 0,14g; fosfato magnésico dibásico O,lg; fosfato
momiopotásico 0,06g; fosfato disódico 0,35g por 1 de disolución>. La esterilización de
{
26
Materiales y Máfodos
todos los med¡os de cultivo se llevo acabo mediante filtración a través de membrana de
0.22pm do poro (Millipore>. Los rredlos tina vez esterilizados se almacenaron a 400.
3.t3. Sueros y anticuerpos.
Suero humano de treinta individuos sanos cedido por el Dr. Hernanz del Servicio
de flioquirrica del Hospital de La Paz.
Antí-CDiS (DAKO> utilizado en ensayos de citotoxicidad, se conservé alicuotado a
-200C.
Anli-Thy-I amablemenle cedido por el Depto. de Biología Celular de la UCM,
3.1.4. Mítógenios.
Corrcanavalina A <Con A, FLOW>; lipopolisacarido de E Cotí (LPS, SIGMA> y
f itohomnagí utinina (PIlA, New>.
315. Neuropéptidos.
Los neuropéptidos objeto del presente estudio: Bombesina <UN), póptido
liberador de gastrina (GRP>, y Neuromedina 0, se obtuvieren de SIGMA. Los tres
neuropéptidos fueron reconstituidos en medio salino PUS, alicuotados y conservados
a -20~C en congelador. Así mismo se obtuvieron de SIGMA otros neuropéptidos:
colecistoquinina <COK), neuropéptido Y (NEW) y péptido intestinal vasoactivo (VIP>.
3.1.6. Otros péptidos.So obtuvieron tambien do SIGMA los siguientes péptidos: (Leu13-i¡’--CH
2NH-
Leu14>-í3N, antagonista del receptor de la bombesina; forbol rniristato acetato <FMA>;
péptido formilado (F-Met-Letm-Phe, FMLP>, Fueron reconstituidos en medio salino
PBS, alícuotados y conservados a .2000
3.1.?. Reactivos químicosAcetato de diclorodihidroflueresceina: <Molecular Probes Inc.>.
gQjfj~~: al 25% (Merck>.
Acido trifluoracétíco: preparado al iN <Pierce>.
Adenosina trifosf ato: <Boehringer Mannhelm>.
27
Materiales y Métodos
tntotini np: ( Uoeh ringer iví anínhelni>.
llAitT(SiGMA>
PJUQIrnIIQI: <l3oehringer Mannheim>.
EPIA <ácido etiiendiarnintetracetlco):(SIGMA>
liGIA (ácido etilenglicolíetracetíco>: (Uoehrimmger Mannheini>.
ExtrflQIQAQ~QtQkLQ: (SIGMA>, como fuente de fosfatidilserina.
LIEPE&: (Panreac>.
UQun~fl~pllj: <SIGMA>.
IiQkUtiLtfl~IiE~m11inLIJflM~ (Bierredical Technologies).
kQL~2Qpfffl.fl: (Uoehrlnger Mannheim>.
Uatít«qsIQ~nn~1QQ: (Packard>.
Nwn~xULTotra~MMm: (SIGMA).
¡Mí?: <SIGMA>
£Qf~Zi®&Hidróoeno: <Carlo Esta>.
EntliQu1~i9Jk1nz: de 1.091+0.0082 mm de diámetro (SIGMA) diluidas al 1% con
PUS estéril, se conservan en nevera hasta su utilización.
flgjjn~j: (SIGMA>. Se conservé ami alícuotas a ~200C.
Th¡~Iun : (Merck> se reconstituyó al 0,5% en Ff35 y se conservó a 4cQ~
QlinwlxQff&Q: Metanol y etanol (Merck>; DiFF-QUICK <DADE Grifois>; Azuitrípan(SERVA>; Azul de metileno (PANREAC>; dioxano(Merck), ácido cloridrico <Carlo Erba>.
34.8. Productos marcados con isótopos radiactivos.Adenosin trifosfato (32F-ATP> (New Engiand Nuclear); timidina (3H-T) (DuPont>;
610r (DuPont> ; bombesina (1251-UN> (Amersham>; GRF (1251-GRP> <Península).
34.9. Klts comercinies.
Radioinmunoensayos (RíA) de AMPc (AMERSHAM) e IL-1 13 (Advanced Magnetice,
MA); ELISA para determinación de iL-2 <Coilaborative Res. Inc., Bedford, MA): ELISA
para la valoración de citotoxicidad (FROMEGA>, Ensayo de radioreceptor para IP3
(AMERSHAM).
28
Materiales y Métodos
3.140. Material de laboratorio de especIal interés.Cámaras de Uoyden utilizadas en las pmnebas de quimiotaxis. El diámetro interno de
las cámaras es de 9 mm, el externo de 13 mm y la altura de 5 mnrn en cada
compartímente.
Filtros (MILI PORE> de nitrocelulosa transparentabies de 13 mm de diámetro y de 3
mm de tamaño de poro utilizados en las pruebas de quimiotaxis.
Filtros (MILIPORE> de la mm de diámetro y de 0.22 mm de poro para la
esterilización de medios.
Frascos de cultivo de 25 ml (Falcon, Coilaborative>.
Mallas para el macerado de órganos (Sigma).
Hemocitónnetro de Neubauer.
Lana de nylon (Du Pont).
Papel de filtración <Whatnnan GF/C).
Papel do filtración (MILLIPORE AF-40>.
Placas do M.l.F.(Steriln>.
Placas de cultivo de 96 pocillos de fondo piano y de fondo en ‘U <Costar).
Resma cromateoráfica de dietillaminoetil celulosa (DE 52, Whatman>.
3.1.11. Aparatajo.
Agitadores <Bunsen>
Autoclave (SELECTA).
Balanzas do precisión (Sauter y Sartorius>.
i3onnbas do filiración (MILLIPORE>.
Baño termostatizado con agitación <Precision Scientific Inc.>
Biofuga (13 Heraeus>.
Cámara de flujo laminar (Teistar>.
Centrífuga omnnlfuga refrigerada (2.0 RS l-feraeus).
Centrífuga de alta velocidad (ROSO Sorvalí Ints., Du Pont).
Citómetro de flujo FACscan (Becton Oickinson>.
Citocentrffuga (Shandon>.
Congelador de ~700C<Heraeus).
Contador de centelleo beta (LKB>.
29
Materiales y Métodos
Contador de centelleo gamma (LKE).
Destilador de agua ultrapura <ELGA).
Espectrofetómetro (1201 Milton Rey Spectronics>.
Homogeiniizador manual (Pobeil>
Incubador termostatizado (Kowell y Heraeus).
incubadores termostatizado y con atmósfera de 002 controlada (FACISA y
SELECTA>.
Lector de placas de ELISA <SLT Labinstruments>.
Medidor de pH (D-501 Crison Inc. >.
Microscopios ópticos (Nikon>.
Microscopio óptico invertido (Pleuger>
Pipetas automáticas y multidispensadoras <Gilsen y Menariní)
Recolector do células (Taller de Ayuda a la Investigación, UCM>
Sonicader (Vibra Celí Sonice Maleríais>
8.2. METODOS
32.1. Dilución de los neuropéptidos.Las dilerentes diluciones de los neuropéptidos (Bombesina, GRP y Neuromedina
0) se realizaron en solución PUS o en medio Hanks, cada día de experimentación de
modo que se obtubieran las concentraciones deseadas en cada ensayo.
8.2.2. ObtencIón de muestras celulares,
3.2.24. Obtención de macrófagos perItoneales murinos.
Los macrófagos fueron obtenidos del peritoneo de ratones sacrificados por
dislocación cervical, que fueron manipulados en todo momento en condiciones de
esterilidad. La piel sobre el abdomen se retira, quedando al descubierto, pero sin abrir,
la cavidad peritoneal en la que se inyectan a continuación Ami de medio de cultivo
l-lank’s a 3600 y tras suave masaje abdominal, se recupera el 90% de la suspensión
Inyectada. Esta suspensión peritoneal se encuentra fundamentalmente constituida por
linfocitos y macrófagos, (en proporción de 2:3>, células que son contabilizadas por ml
30
Materiales y Métodos
do suspensión, utilizando una cámara de Neubauer y microscopio de contraste de
lase. Los nuacrófages se diferencian por su morfología y por tinción esterasa no
esjieclfica.
Purificación de macrófagos peritoneales niurínos. Alícuotas de 500 pl de
la suspensión peritoneal se mantienen en tubos eppendorf, o bien 200 pl en placas
MW. dependiendo del ensayo a realizar posteriornnente con estas células, durante 45
mini a 37%) para permitir la adhesión de las células a las paredes del tubo o a la superficie
do la placa, se decanta el sobrenadante (que incluye células no adherentes, linfocitos T
principalmente> y se añade tripslna al 0,6% incubándose durante 1 hora para eliminar
los linfocitos adheridos (fundamentalmente células U>. Se lava con PUS y se incuban
las células adheridas con mnedio de cultive RFMi dtmrante 24 h para facilitar la
recuperación de los receptores en los macréfagos.
3.2.2,2. ObtencIón de leucocitos de órganos linfoides.Los órganos inmuniocompetenles que van a ser utilizados en los ensayos: bazo,
timo y ganglios axilares, fueron extraídos, en condiciones de esterilidad, del ratón,
previamente sacrificado por dislocación cervical. Los órganos así obtenidos fueron
cuidadosamente macerados en medio de cultivo RPMI completo <suplementado con
10% de SFr descomplementarizado) y filtrados por una malla. Los leucocitos de bazo
fueron separados siguiendo la técnica de L3oyOmn <1968> que consiste en la
centrifugación de la suspensión celular en un gradiente de Ficolí de densidad 1070 a
2500 rpm durante 25 mm. Los hematíes quedan depositados en el fondo del trabo, el
piasrna, en la parte superior y en la interfase ficoll-plasnna se localiza el halo de
leucocitos, que os extraído y lavado tres veces con PUS por centrifugación a 1200
rpm. Los leucocitos de timo y ganglios se lavaron con Fas a 1200 rpm irás ser filtrados
por la maila. Las células así obtenidas se contabilizan en cámara de Neubsuer.
PurIfIcación de linfocitos T.
La suspensión de leucocitos que se desea purificar se hace pasar através de
columnas empaquetadas con ana de nylon. Se utilizan jeringuillas de 6 mi que se
rellenan con 0,6 gr de ana de nylon y que son lavadas con medie RFMI y a
continuación con el mismo medio RFMI pero complete y son mantenidas a 370C y 6%
31
Materiales y Métodos
do 002 hasta su utilización. La suspensión celular resuspendida en medio completo se
deposita en la columna y se Incuba a 37%) durante 30 mm, transcurrido ose tiempo se
extraen les linfocitos con 5-10 ml de medio completo. La pureza en linfocitos T así
obtenida es del 97%, según fue comprobado por inmunodetección utilizando un
anticuerpo anti-Thyl. Para ello se citocentrifugaron 200 pl de la suspensión celular
purificada y se dejaron secar a temperatura ambiente durante 2 h. Transcurrido este
tiempo las preparaciones se fijaron con acetona durante lO mm y se dejaron secar 20
mini. Se bloqueé la perexidasa endógena cori motanol y peróxido de hidrógeno en
proporción 99:1 durante 30 ruin. A continuación se añadió suero de conejo <dilución
1:30 en PUS/USA>, animal en el que estaba obtenida la segunda capa y se esperé 20
mini para añadir el anticuerpo antiThyl” (sobrenadante concentrado>. Se dejaron
algunas prol)araciones sin esta primera capa corro controles positivos. Se lavé tres
veccs cori POS y se añadió la segunda capa, inmunogiobulina antí ratón obtenida en
conejo <dilución 1:20 en PUS/USA +1%suere de ratón>. Se volvió a lavar y se adicioné
el complejo (‘AP (dilución 1:30 en Tris + 1% suero de ratón>. Se reveló con DAR, se
realizó tina tinciómí de contraste con azul de metileno, se desengrasé y se montaron las
preparaciones para observarlas el microscopio.
3.2,3. Viabilidad celular.La viabilidad de las células extraídas y utilizadas en las distintas técnicas fue
analizada mediante el método de exclusión del colorante vital tripan azul. Este
colorante al 0,5% en solución salina se añade a la suspensión celular <al 5O0/o en
voluníen> y se contabilizan inmediatamente en cámara de Neubaucr las células que
aparecen teñidas de azul <muertas> y las que no lo están (vivas>, expresándoee corno
porcentaje de mortalidad o viabilidad. Solamente se utilizaron para eloctuar los
correspondientes experimentos aquellas suspensiones celulares que presentaban
tiria viabilidad mayor dei 95%.
3.2,4. EstudIo del proceso fagocítico.
La función fagocitica en el macrófago conlieva una serie de acciones que se
desarrollan con anterioridad al proceso de Ingesta del material extraño y que se
continuan tras el mismo. En primer lugar el macrófago peritoneal se adhiere al sustrato
32
Maten ajos y Matados
tisular, posterlormoníto so mueve tinola el foco de infección dirigido par un gradiente cts
productos atrayentes <qulmnlotaxis>. Va en contado con el materIal extraflo se une a élespontáneamente o a través de factores séricos, y lo ingIere. Por último el materialIngerido os destruido y digerido mediante un proceso que requiere actividadmetabólica oxlclatlva. Pasamos a analizar la metodología utilizada para el estudio de
cada tirio de estos procesos en el macrófago peritoneal muríno.Los macrólagos en la suspensión celular cttenIda del peritoneo se ajustan a 5x106
mnacrófagos/ ml de metilo 1-lanka para llevar a cabo el estudio de las diferentes etapas
del proceso 1 agoaltico.Las concentraciones de los neuropéptidos utilizadas van desde 10-14 hasta 1 0~ M
en intervalos do una decena molar.
3.2.4.1. AdherencIa a suatratoLa capacidad de adherencia al suetrato del macrófago se analizó siguiendo la
técnica previamente descrita por nuestro grupo <De la Fuente y cois, 1990>.Brevemente consiste en dispensar alícuotas de 200 PI de la suspensión peritoneal
ajustada en tubos eppendorf, a los que se añadió 20 pl de cada uno de los
neuropéptidos para obtener las duterontes concentraciones indicadas anteriormente.Los controles recibieron 20 pl de medio Hanlc’s. A los 5,10, 20, 30 o 60 mm deincubación en estufa a 3~C, u tomaron alícuotas dolO pl y se cuantíiIcó en cámara deNoubauer el número de maciófagos no adheridos, calculéndose el Indice de
adherencia <lA) como sigue:<lA> u 100. ( < macrótagos/ mi del sobrenadaSte) 1< macrótagos/ mide la suspensión
origIneiHxlOO
3.2.4.2. MovilIdad inducida < Quimiotaxía )La movilIdad inducida o quimiotaxis, se evalué según una modificación de la técnica
original descrita por Boyden <1982), que consiste bauícamente en la utilización decámaras con dos compartimentos separados por un filtro de nitrocelulosa (MILLIPORE>de 3 pm de poro. 8. depositan alicuotas de 300 pI de la suspensión de macrófagos yaajustada en el compartimento superior de la cámara junto con 30 ji de la dilución delneuropéptido, pus obtener las diferentes concentraciones, o 30 ¿Ji de medio Hank’s
33
Materiales y Métodos
en las muestras controles. Ení la parto inferior se depositan alícuotas de 400 pi de F-
Mot-Leu-Piíe a la concentración de l08 M utilizado corno agente quimiotáctico.
Las cámaras se incuban durante 3 horas a 37~0 en tina atmósf era al 5% en 002 y
cotí liuniíedad a saturación. Trás la incubación los filtros son recuperados, fijados y
teñidos siguienído las siguientes pautas:
Alcohol metilico 50% Smin
Alcohol etílico 75% Srnin
Agua destilada 2nnln
L~osinía-azul de metileno 1 Smin
Agua destilada 2min
Posteriorniente se procede al recuento al microscopio del número de macrófagos
que aparecen en la cara Inferior del filtro, mediante cuatro barridos de 5 mm cada uno,
con lo que se cubre aproximadamente un tercio de la superficie total del filtro. El valor
obtenido crí dicho recuento lo denominamos indice quinílotáctico <IQ).
3,2.4.3. Capacidad quimioatrayenteAsí mismo, también se valoró la capacidad qimioatrayente de los péptidos utilizando
las mismas cáníaras pero modificando la técnica, de forma que los neuropóptidos se
dIspensan, a las dilerenítes concentraciones, en el compartimento inferior de la cámara
de í3oydení y las células crí el superior. El control lleva péptido formhlado: F-Met-Leu-
Plie a la concentración de 10~ M corno quinnioatrayente, en el compartimento Inferior.
3.2.4.4. Fagocitosis de Cindlda aIb~cana,Las placas con el medio de cultivo do Calbicana descrito en materiales, se
siembran en condiciones de esterilidad y se mantienen en estufa a 3700 durante un
máxinio de 4-5 días.
3.2.4.4.1. En tubo. Se llevo a cabo siguiendo la técnica descrita por Grune y
cola. (I~73> ligeramente modificada por Nuñez y cols.<l989). Alícuotas de 500 pl de la
solución de macrófagos se dispensan en tubos de plástico junto con 500 pi de
C.atblcans ajustadas a 5x100 céiuias/ ml de medio (relación macrófagos/ cándidas
1/10> y 40111 de un pool de suero humano, como fuente de opsoninas, o en su lugar
34
Ma ¡eriales y Métodos
40 pi de modio para evaluar la fagocitosis espontánea. Se añade seguidamente el
neurepéptido a las diferentes concentraciones o bien medio de cultivo en igual
canítidad,10¡A, en las muestras controles.
Tras incubación durante 60 mm a 37«C, se centrífuga a 800g durante lO mm. Se
eliminan 2/3 del sobrenadante y se agita vigorosamente el resto, efectuándose
seguidamente el recuento en cáníara de Neubauer y expresando los resultados corno
número de cándidas ingeridas por 100 muacrófagos.
3.2.4,4.2. En placa MW. Se suigió una técnica diseñada por nosotros
tomando corno base otra previamente descrita (De la Fuente, 1985>. Alícuotas de
200pl de la suspensión original de muacrólagos se Incuban en cada pocillo de placas
MiF durante 30 minutos a 3700. Al mismo tiempo son incubadas C.albicans,ajustadas a
iOxlO6 células/ ml de nuedio (relaclén:macrófagos/ cándidas 1/20>, con suero <la
relación cándidas/ suero en volumen fue de 200 pl1 40 pi>. La monocapa de
niacrófagos adherida a la placa, se aya con medio salino PBS a 37~C. Seguidamente se
añade a cada pocillo alícuotas de 200 pl do cándidas y suero, e inmedIatamente 20 ¡Idel neuropéptide para conseguir las diferentes concentraciones o 20 pl de medio
i~lanks en los controles. Transcurridos 60 minutos de Incubación en estufa a 370Q, las
placas se lavan con abundante POS a esa misma temperatura, para eliminar las cándidas
no fagocitadas. Las placas se fijan en metanol durante 5 mm. y se tiñen con un Wright-
Gienisa modificado (DIFF-QUICK> procediéndose al recuento del número de cándidas
ingeridas í>or 100 níacrólagos, lo que se indica cornoindice de fagocitosis <IF>.
3.2.4.6. Fagocitosis de partículas Inertes <bolas de iatex>
So siguió la técnica descrita por De la Fuente <1985>. Se añaden alicuotas de 200
pi de la suspensión peritoneal ajustada a placas de MIS y se obtienen la monocapa
corno se indicó en el apartado anterior de fagocitosis de cándidas en placas MIF. En
este caso una vez lavada la monocapa de macrófagos, se añade a cada pocillo 200 pl
de medio Hanks , 20 pi de iatex ( al 1% en POS> y 20 pi de los neuropéptidos para
conseguir las diferentes concentraciones o unicamente de medio en los controles. Se
incuban las placas 30 mm, se lavan, fijan y tiñen. Se cuentan el número de partículas de
latax ingeridas por lOO macrófagos <15>.
35
Materiales y Métodos
Para averiguar el efecto de los neuropéptidos sobre poblaciones purificadas se
ensayé esta misma prueba con nnácrófagos peritoneales que fueron purificados
siguiendo el protocolo expticado en el apartado 3.2.2.1. realizado en placas MíE.
Procediendo a continuación corno en el caso de níuestras peritoneales completas que
ncabaniios do describir.
3.2.4.0. Dígostien del material fagocitadoA la hora do estudiar el efecto de los péptidos sobre la capacidad de destrucción
del material ingerido de los macrófagos, se valoré la producción de des metabolitos
oxidativos: Q~ y li2~.
Li aniómí suporéxido (Os> se midió gracias a la gran capacidad de éste para reducir
compuestos, utilizando nitroazul cíe tetrazollo (NET) que es convertido en proporción
equiníelar en un lormazan delectable por espectrofotometría (Bagasra y cols, 1988 ).(2n cuanto al peróxido de hidrógeno lo hemos valorado por citornetría de flujo
valiéndonos de uní compuesto fluorescente, el diacetato de 2,7-diclorodihidro
fuoroscinia (ODltDA). Este es un compuesto no fluorescente y estable que atraviesa la
menubrania celular por su caracter apolar y es desacetilado en el interior de la célula,
quedando atrapado y siendo rapldaníiente oxidado en presencia de H202 a un
cemiípuesto altanííeníte fluorescente 2’7’-diclorofuoresceina.
3.2.4.6.1. Tost de reducoclón del Nitroarul de tetrazollo (NBT)Se realizó siguiendo el método descrito por De la Fuente (1985> ligeramente
modificado por Nuñez y cols.(1989).A Alícuotas de 250 pl de la suspensión original de
muacrófagos, se les añaden 250 pl do NET <1 mg/ mvii Hanks). SeguIdamente se
imicorperan LO pi de la suspensión de latex (vil % en PBS> para estudiar la reducción
en condiciones de estimulación <muestras estimuladas) o 50 pl de medio en las
muestras sin estinííuiar. Los neuropéptidos se añaden en alicuotas de so pi para
obtener las dilerentes concentraciones y en los controles se dispenso igual volumen
de medio.
Transcurridos 60 minutos de incubación en baño a 37~C y con agitación suave, se
para la reacción añadiéndo a cada tubo 2,5 mi de CIH 0,5 N, se centrífuga so mm a
1.600 g. se desprecia el sobrenadante y el NI3T reducido es extraído con 1 ml de
36
Materiales y Métodos
dioxane, se centrífuga de nuevo y se determinan las absorbancias del sobrenadante
cmi espectrofotómetro a 525 nrn,
Para realizar la curva patrón, se procedió como sigue: se Incubaron alícuotas de
500 pl. de NBT a diferentes concentraciones (desde 105M a 10’3M> con ditiotreitol
como agente reductor en proporción 1:1 molar, y se siguieron los nnismos pasos
explicados anteriormente en este mismno apartado.
Una vez dibujada la curva patrón con concentraciones de NBT frente a las
absorbancias obtenidas, se interpolaron los valores encontrados en los experimentos
con el fin de expresar los resultados en concentración de NBT.
3.2.4.6.2. Estudio de la formaclóni de metabolitos del oxi’geno porcitomotría de flujo.
Se recogen las células peritoneales, se lavan en medio F-íanks y se ajustan a 8x106
mracrófagos/ ml. Se vuelven a lavar y el precipitado se resuspende en imí de bu? fer A
(Hanks sin Ca2’, sin Mg2’ y con 1 nnM EGTA). Se añade diacetato de
diclorodiliidrofluoresceina (ODECA> de una solución stock de 5 mM en etanol, para dar
una concentración final de 5pM. Se incuba 15 nrin a SPC y se centrífuga a 1000 rpm, 5
mini, para eliminar el exceso del producto, y se resuspende de nuevo en 1 ml de buffer
A. Se dispensan alícuotas de 100 pl/tubo en tantos tubos como muestras se vayan a
ensayar y se completa a 1 miii con buffer A. Se añaden los estimnulos en lO pl (PMA 50
ng/ mí, FMLP 10.8 M y GRP j~.10 M>. Como control positivo se utiliza 300pM de I~f2Q2
y conno control negativo 5 mM de azida sódíca. Se incuban los tubos en baño con
agitación durante 15 mm a 3700. Se nnantienon en hielo y se analizan en el citometre de
fiujo.
3.2.5. EstudIo de la función linfoide,Pasarnos a descniblr la metodología empleada para analizar la quimiotaxis en los
linifocilos, así conio la capacidad qulnnioatrayente de los neuropéptidos, y la capacidad
proliferativa de células linfoides incubadas con los rieuropéptidos. Se ensayaron EN,
GRP y neuronnedina Catres conícentraciones: l0-~, 1010 y 10-12 M.
37
Materiales y Métodos
3.2.5.1. Qulrniotaxia y capacidad qulmioatrayente.
La quimniotaxis de los limifocitos se valoré siguiendo el mismo método descrito para
macrófagos en el apartado 3.2.4.2. con alguna salvedad y es que se utilizó péptido
formilado como quimioatrayente.
La capacidad quimioatrayeníte de los neuropéptidos para los linfocitos se estudio
añadienído en el conipartimento inferior de la cámara de Boyden las distintas
conconítracionos de UN, GRP y neuroniedina C, como se describe en el apartado
32. ‘¡.3.
Se realizaron annbas pruebas con linfocitos peritoneales y de órganos linfoides:
timo, bazo y ganglios axilares.
Así nnismo, se estudio la quimiotaxis en muestras enriquezidas en linfocitos T do
peritoneo y de los tres órganos linfoides. Para ello se procedió a la purificación de las
poblaciones do leucocitos, según la metodología descrita en el apartado 3.2.2.2., y acontinuación se procedió al ensayo de quimiotaxis de la mima manera que con las
naucatras completas.
3.2.5.2, fleapuesta proilferativaLa respuesta proilferativa de linfocitos fue estudiada mediante un test de
transformnaclón linifoblástica (TTL>. Su fundamento reside en la capacidad de los
linfocitos maduros de transiormarse, en condiciones adecuadas, en células con
capacidad de división o linfoblastos. Estos linfoblastos sintetizan ADN por lo que
añadiendo un precursor de la síntesis, como la timidina, puede cuantificarse el
crecinniento.
La suspensión leucocitaria obtenida de ganglios axilares, bazo y timo fue ajustada a
1 x106 linfocitos/ ml de medio RPMI completo. Para estudiar el efecto de los
neuropéptidos sobre la linfoproliforación espontánea, se sombraron alícuotas de 200
pi en placas de 98 pocillos con fondo plano, en presencia de bombesina, GRP o
neuromedina O <ío-~, io-iO, 1012M>, que fueron incorporados en volurnenes de 20
pl, o en ausoiícia de neuropóptidos, en cuyo caso se añadieron 20 pl de mnedio
unicamente.
Para estudiar la respuesta proliferativa en respuesta a mitógenos se incorporan en
38
Materia/es y Métodos
otros pocillos 20 pl de Con A como estimulador del crecimiento de linfocitos 1 o LPS
(20 ¡¡1/ pocillo> como mitógeno de linfocitos 8. La Con A se utilizó a dos
concemitracienos 1 pg/ml y 5 pg/nnl; el LPS a 10 pg/mnl. Así mismo se incubaron otros
pocillos con los tres neuropóptidos a las concentraciones indicadas y en presencia de
los mitógenos. Las placas se imicubaron durante 48 h a 370Q y 5% CO2. Transcurrido
oste tiempo so añadIó 0,5 mCi de timidina-3H por pocillo y se prolongó la incubación
durante 24 Ii más. Al ternnino de la misma se recolectaron las células, con un recolector
semiautomático, en papeles (MILLIPORE AP-40) que se introducen en viales con 5 ml
de liquido do centelleo, La timidina incorporada, se midió en un contador de centelleo-
it obtemiiemidose las cuentas por minuto (cpm) de cada pocillo.Los resultados se expresan como porcentajes de estimulación, dando el 100% a
las cpni obtenidas en las muestras controles incubadas sin neuropéptido ni mitógenos.
Estas mismas pruebas se realizaron con muestras de poblaciones enriquecidas en
linfocitos T. Para ello se purificaron poblaciones de leucocitos obtenidas de timo, bazo
y ganglios axilares, según la metodología descrita en el apartado 3.2.2.2., y a
continuación se procesaron de la nnima nnanera que las nruestras completas.
3.2.6. Estudio do Ja actividad oltotóxica.
La capacidad citotóxica de las células inmunocompetentes, principalmente la
citetoxicidad celular dependiente de anticuerpo o ADOO y la llamada citotoxicidad
natural o NK, fueron estudiadas en respuesta a la Incubación con los neuropéptidos de
la familia de la bombosina.
Para ello, se utilizó como célula diana, la línea turnoral humana K562 para los
ensayos de ADCC y las células YAC-1, procedentes de un linfoma rnurino, como dianas
de la actividad NK. También se utilizaron en algunos experinientos las células K562
como dianas de citotoxicictad NK. Las dianas fueron almacenadas a -YO0C y crecidas en
cultivo antes de su utilización. El cultivo se realizó en frascos estériles mantenidos a
StO y 5% de 002. El medio de cultivo consistía en RPMI completo al que se añadieron
0,1 mg/mi de gentamícina, y era renovado cada dos días. La evolución del cultivo se
controlaba periodicamente con el nnicroscopio invertido, comprobando su crecimiento
y detectando posibles contaminaciones.
Se siguieron dos técnicas diferentes para valorar estas actividades. Una basada en
39
Materiales y Métodos
cl marcaje do las células tumorales con 5tCr y la otra mediante la utilización de un
ensayo comnercializado (PROMEGA> que se basa en una valoración enzimática.
3.2.6.1. Ensayo de citotoxicidad por incorporación de 51Cr.
Esta técnica se basa en el marcaje de las células tumorales usadas como dianas con
uni isótopo radiactivo: 51Cr, que se incorpora al interior de las células. Las células K562
y YAC-l se lavan con medio de cultivo RPMI completo, se resuspende el precipitado
en 100 pi de suero fetal de ternera y 100 pide 510r (0.1 mcl> y se incuba durante 1 h a
37~C agitando varias veces. Después, se lavan tres veces con medio de cultivo y se
ajustan a 2.SxiO4células/ ml.
En los ensayos de ADCC las células K562 se incuban durante 15 mm con el
anticuerpo monoclonal, antí-OD 15 (VIM-D5), que reconoce espedficamente el
liaptono X (iacto-N pentosil fucosa III) que se expresa en las células tunnorales K562
(Madjicycols., 1981>. Se utilizaron varias diluciones del mismo: 1:200; 1:500; 1:1000.
Las células electoras (leucocitos de bazo, ganglio y timo> se ajustan para obtener
tinas relaciones efectora:diamia de 25:1; 50:1:100:1 para la prueba de NK o 100:1 para
el ensayo de ADOC.
Se siembran en placas de 96 pocillos con fondo en “U’ los componentes del
ensayo (dianas, efectoras y anticuerpo, en los ensayes de ADCC o solamemite los dos
primores en los de NK>, y se añaden bombesina, GRP y neuromedina O a diferentes
concentraciones (10-8, 10-10, 10’12M>. Se centrifugan las placas a 250 g 5 mm, para
favorecer los contactos Intercelulares y se Incuban a 2700 y 5% 002 durante 4 fi.
Transcurrido ese tiempo, se centrifugan de nuevo las placas y se recogen 100
pl/pocillo del sobrenadante y se determinan sus cpm en un contador de centelleo
(LKB, Upsala, Suecia>. El porcentaje de lisis se calcula como sigue:
% lisis -~ (($5) x 100/ M
E: media de las cpnn obtenidas en los pocillos Incubados en presencia de las
células efectoras.
5: medía de las cprn obtenidas en los pocillos controles de lisis espontánea,
sembrados solo con dianas.
M: inedia de las cpm obtenidas en los pocillos controles de liberación total
conteniendo células diana y una dilución 1:100 de detergente Triton-XIOO.
40
Materiales y Métodos
2.2.6.2, Ensayo de citotoxícidad por valoración enzimática.
En cuanto al otro método utilizado en la valoración de la citotoxicidad se trata de un
ELISA comercializado por Promega y cuyas lineas generales exponemos aquí.
Se basa en la valoración de la actividad enzinnática de la LDH (lactato
desliidrogenasa) liberada al sobrenadante por las células usadas. Esta valoración se
lleva a cabo concluidas las 4h de incubación de las diarias con las electoras que se
realiza de igual manera que en la técnica explicada anteriormente, utilizando también
placas de 96 pocillos y fondo en “U’. El método consiste en ensayar la actividad LDHen los sobrenadantes de los diferentes pocillos, para lo cual se toman 50 pV pocillo a
los que se añaden 50 pl de una nnezcla del sustrato de la enzima (Diaf orase, lactato y
NAD’>, se incube 30 mm a tennperatura ambioníte y se leen las absorbanclas a 490 nm.
Utilizando este nnétodo se valoré el efecto de los neuropéptidos sobre la actividad
citotóxica NK y ADCC eni muestras de tinno, bazo y ganglios axilares en las que se
purificó la población) de linfocitos no adherentes <siguiendo la metodología expuesta
en el apartado 3.2.2.2.>. Así mismo se valoré la actividad “NK-like” en muestras de
macrófagos purificados del peritoneo en respuesta a los neuropéptidos.
3.2.7. Estudio do le colaboración Intercelular.
Se valore la producción de citocinas por las células inmunes estudiadas Incubadas
en presencia de UN, GRP y neuromedina C. Se eligieron citocínas claramente
implicadas en las funciones estudiadas: la IL-1 y la IL-2, activadores de la respuesta
linfoproliferativa, la óltima tannbión implicada en citotoxicidad; el factor de fusión de
niacrófagos (FFM> responsable de la formación de células gigantes muitinucleadas
(MGC>.
3.2.7,1. Efecto de los neuropépticios sobre le producción de IL-1
por mocrófages.3.2.7.1.1. ObtencIón de sobrenadantee con IL-1.La suspensión peritoneal fue ajustada a io~ macrófagos/ ¡ni, sembrados en placas
de cultivo de 96 pocillos en alícuotas de 200 pl/pocillo, e incubados a 370C durante 45
mm para favorecer la formación de una monocapa y permitirnos eliminar medianteY
41
Materiales y Métodos
lavados com~ PUS las células no adherentes. A continuación se añadieron a los pocillos
los neuropóptidos cmx alícuotas do 20 pl,’ pocillo para conseguir una concentración delo-lo M. También se incorporé Concanavalina A (lpg/ miii> como control de la
producción de IL-1, y así mismo, a otros pocillos se añadieron la Con A y EN, GRP o
neuromodina 0. Por último se añadió medio RPMI completo en alícuotas de 200 pU
pocillo y se incubaron las placas durante 24 h a 3700 en una atmósfera al 5% de 002 y
humedad a saturación. Finalizada la incubación, las placas se centrifugan y los
sobrenadantes, libres de células, se almacenan a -20~C hasta su ensayo.
3.2.7.1,2. ValoracIón do los niveles de IL-1l3.
La determinación de los niveles de iL-1 ~en los sobrenadantes se realizó mediante
radioinmunoensayo, que se basa en la connpetición emítre el ligando marcado ((1251>-iL-
111) y el ligando nativo que contengan las niucatras, por un número limitado de sitios en
un anticuerpo especifico. La IL-1 l~ unida al anticuerpo fue separada de la libre con un
anticuerpo un)ido a bolas magnéticas por centrifugación. La fracción marcada unida al
anticuerpo fue medida en un contador gamma y se correlacionaron las cuentas
obtenidas con concentraciones de iL-1 13, interpolando los valores en una curva
estandar. La cantidad mínima de iL-I 13 detectable es de 4 pg/ 0,1 ml. El coeficiente de
variación interemisayo es del 7,4 ~/o y el de variación intraensayo es del 6,4 %.
3,2.7.2. Efecto de los neuropéptidos sobre la producción de IL-2
por linfocitos,
3.2.7.2.1. Obtención de sobrenaclantes con iL-2.
Suspensiones de leucocitos de ganglios axilares, bazo y timo fueron ajustados a
io~ células/ ml y sembradas en placas de cultivo de 96 pocillos a los que se
incorporaron UN, GRP, o neuromedina 0. A otros pocillos se añadió Con A (1 pgl mí)
como control positivo. Las placas se incubaron durante 48 fi con 200 pU pocillo de
RPMI completo a 3700 en una atnnósfere al 5% de 002 y humedad a saturación. Irás el
periodo de incubación las suspemísiones fueron centrifugadas y los sobrenadantes,
libres df O células, se almacenan a .2000 liaste su ensayo.
3.2.7.t2. Valoración de los niveles de IL-2,
La deternninación de los niveles de IL-2 en los sobrenadantes se realizó usando un
42
Materiales y Métodos
(lISA comnorcial para ratón. Las muestras y los estandares de iL-2 se incorporan a una
placa de ensayo adsorbida con un anticuerpo gO específico contra la IL-2 de ratón.
Despues de lavar se añade el anticuerpo especifico contra la IL-2 conjugado con
peroxidasa. Se aya de nuevo y se añade el sustrato del enzima, fenilendiamina,
midióndose la absorvamicia a 490 nm, Esta técnica presenta una ventaja frente a los
tradicionales bioensayos con lineas célulares IL-2-dependientes, y es que al utilizar un
anticuerpo específico contra IL-2 no esta sujeta a interferencias por otras citocinas que
pueda haber presentes en les sobrenadantes. La cantidad mínima de IL-2 detectable
es de 1 U/ mí, el coeficiente de variación de prectsión intraensayo es de 5,1 %, y el de
precisión interensayo es de 7,3 %.
3.2.7.3. Valoración de la producción de FFM.
La producción del factor de fusión de macrófagos <FFM> fue valorada en presencia
del GRP. Para ello, se utilizaron placas MíFen las que se depositaron alícuotas de lOO
pl/pocillo de la suspensión peritoneal ajustada a 5x105 macrófagos! ml de medio
ilank’s. Se incubaron 45 mm a 370C y una vez formada la monocapa, se leyó con PBS a3700 y se añadieron 200 ph pocillo de medio RPMi completo. Se incorporaron 20 pu
pocillo de PHA como control positivo, o de GRP para obtener una concentración de y
lO’~ M, respectivamente. Trás 24 h de incubaclon, las cóluias se lavan, se fijan en
mnetanol durante 5 mm, so tiñen con un Wright-Glemsa, y se procede al recuento de
células gigantes con dos o más núcleos por cada cien macrófagos.
3.2.8. PreIncubaciones con los neuropéptidos.
Se relizaron pruebas de valoración de la citotoxicidad natural (NK> incubando los
leucocitos previannente al ensayo con GRP. Para ello se obtuvieron los leucocitos de
timo, bazo y ganglios axilares, se ajustaron a 106 cólulas/ ml y se sembraron (100 pl/
pocillo> en placas de 96 pocillos y fondo en U”, añadiéndose 10 pl de GRP para
obtener las siguientes concentraciones: 10.8, 1rn10 y 10.12 M. Se incubé la placa a
37~C y 5 % CO2 durante 1 h, transcurrida la cual, se centrifugó la placa a 250g durante
5 mm y se lavaron los pocillos dos veces con PUS en iguales condiciones de
centrifugación. Seguidamente so añadieron lOO pl1 pocillo de las células YAC-1
ajustadas a i05 células/ ml y 100 pl/ pocillo de RPMI y so procedió siguiendo el
43
Ma ter/ales y Métodos
protocoio expuesto en el apartado 3.2.6.2.
3.2.9, Estudio de la especificidad de los efectos.
La especificidad de los efectos de los neuropéptidos en células inmunes fue
estudiada mediante dos aproximaciones. En primner lugar utilizando un antagonista del
receptor para la bombesina y por otra parte, realizando ensayos de bbid¡ng con
bomubesina y GRP marcados isotópicarnente.
3.2.9.1. Estudios de competencia con un antagonista del receptor
para la EN.
Li péptido (Leu13~y 0112N1-l.Leu
14)-EN, es un antagonista del receptor para la
bombosina, que se une específica y competitivamente al receptor para la bombesina
antagoixizando sus efectos en células Swiss 3T3 (Coy y coIs., 1988>. Fue incluido en
varias pruebas representativas: la capacidad quimiotrayente de los neuropéptidos
sobre macrófagos y linfocitos peritoneales y la actividad citotoxica NK de leucocitos de
tinxIo.
3.2.9.2. PresencIa de receptores para SN y GAP en célulasti ni uno cern potentes.
El fundamento dei ensayo utilizado para valorar la presencia de receptores
específicos para bombesina y GRP en células inmunes radica en la competencia por los
sitios de unión que se establece entre neuropéptido marcado con un isótopo
radiactivo y neuropóptido sin marcar. El procedimiento, que se detalia a continuación,
sigue la técnica de Segura y cole. <1991>.
3,2.9.2.1. Determinación de receptores para EN en macrófagos y
linfocitos.
La suspensión celular, linfocitos o macrófagos previamente purificados (apartado
3.2.2.>, se ajusta a 1.5 x106 células/ml en buffer Tris-CIH 35 mM, conteniendo NaCí 50
mM y 1.4% de USA (albumina de suero bovino> y se dispensan en alícuotas de 500 pl/
tubo. A cada tubo se añaden lOO pl de 1~l-8N (2000 mCi/ mmol> para obtener una
concentración 45 pM y 10 pl de diferentes concentraciones de bombesina sin marcar:
I0-~, fl3-9, 10.10, 10.11 y 10-12 M. A otros tubos se atiaden las mismas
‘14
Ma ter/ales y Métodos
concentraciones de CAP o Neuromedina 0, o un péptido no relacionado comno control
negativo, el neuropóptido Y (NPY). Aquellos tubos a los que se añade una
concentración saturante del póptido sin marcar <io~ M) nos dan el valor de unión no
específica (NSE3>. La unión total nos la dan los tubos que solamente llevan
neuropéptido marcado (TU>.
Los tubos se incuban a l&C durante 90 nnin, tras los cuales se centrifugan, para
quedarnos con el péptido marcado unido a las células, y se lavan tres veces. Se mide la
radiactividad de los precipitados y se calcule la cantidad de neuropéptido que se une
específicamente a las células para cada concentración del mismo. De la representación
de Scatchard de los datos así obtenidos, se caicula la afinidad de la unión al receptor,
que viene dacia por la constante de disociación, Kd y la concentración de sitios do
unión.
3.2t2.2. Determinación do receptores para GRP en macréfagos y
linfocitos,Se procedió siguiendo el nnismo protocolo explicado anterlornnento para el caso de
la UN. En este caso se incuban las células con una concentración 45 pM de ~ 1-CAP
(2000 nnCi/ nimol> añadiendo 10 pl de diferentes concentraciones de GRP sin marcar, o
de UN o Neuromedina O, o del NPY como control negativo. Se representan
gralicamente los datos obtenidos y se caicula la afinidad y la concentración de sitios de
unión.
3,2.10. Ensayo de qulmiotaxis modificado para lo determinación de
la presencia de un factor secretado por macrófagos.
Se ensayó el efecto del CAP a la concentración más efectiva, 10-lo M, en la
quimiotaxis de linfocitos mantenidos en la suspensión peritoneal completa (P.Total> y
de linfocitos T purificados del peritoneo <L. purificados> y se ensayé un tercer grupo
consistente en linfocitos aislados del peritoneo alas que se añadió el sobrenadante de
una suspensión de células adherentes del peritoneo (macrófagos y linfocitos ~>o de
tina suspensión de nnacrófagos purificados, que fue previamente Incubada con CAP
(10-10 M>.
Para ello se separé la suspensión obtenida del peritoneal en dos alícuotas. Se
45
Materiales y Métodos
incubaron dbmin a 3t0 para oblemier la población adherente, se lavó y a una de las
alícuotas se añadió lripsina al 0,5% durante 45 ruin, para purificar los macrófagos, a
continuación) se lavó y se recuperaron los receptores de los fagocitos durante 24 fi a
37’C y 5% de CO2. Postoriormemite ambas alícuotas lueron incubadas con CAP <10.10
M> durante 3 Ii, lavándose a 1500 rpm 10 mm y obteniendo los sobrenadantes.
Transcurrido oste tiempo se procedió al ensayo de quinniotaxis con tina población
purificada (como se describe ami el apartado 3.2.2.2.) de linfocitos T, a la que se
añadieron los sobrenadantes obtenidos de las nnuestras purificadas de macrófagos, o
de las muestras de células adherentes (macrófages y linfocitos U>.
3.2.11. Estudio del mecanismo de acción de los neuropóptidos.
Para estudiar los mecanisnuos intracelulares implicados en la transmisión de la señal
de estos neuropéptidos valoramnos los niveles intracelulares de segundos menasajeros
implicados en las principales rutas de transducción de señales: AMPo, 1P3 y proteína
klnasa O (PKC>
32.11.1. Valoración de AMPo.
3.2.11,1.1, Procesamiento de las muestras celulares,
Sobre alícuotas cíe 500 pl/tubo eppendorf da macrófagos peritoneales puní loados
(protocolo de purificación descrito en el apartado 3.2.2.1.) o de linfocitos purificados de
ganglios axilares <apartado 3.2.2.2.> se añaden alícuotas de 5 pi deles neuropéptidos a
tas diferentes concentraciones utilizadas (10.0, 10-10 y 10-11 M>, junto con un inhibidor
de 10sfatase, isobutil-metil-xantina (IUMX> 0,2 mM, y a distintos tiempos (30, 80 y 120
segundos) se para la reacción con 500 pl/ tubo de ácido tnifluoracético IN. Los tubos
so agitan enérgicamente y se congelan hasta la realización del radiolnrnunoensayo.
3.2.11.1.2. Cuantificación de AMPo
El ensayo para la cuantificación do AMPc se basa en la competencia entre una
cantidad fija de AMPo marcado radiactivamente con 1125 y el AMPo contenido en la
suspensión celular que se analiza, por un número limnitado de sitios de unión en un
anticuerpo especifico. Comí cantidades fijas de anticuerpo y ligando radiactivo, la
cantidad de este ligado al anticuerpo será inversamente proporcional a la concentración
del ligando no radiactivo añadido. El AMPo ligado al anticuerpo es entonces precipitado
46
Materiales y Métodos
con un segundo anticuerpo unido a partículas polimóricas separables
nflaqn)ótican)oIlte,
La curva patrón se realiza con siete concentraciones de AMPc, 2, 4, 8,16, 32, 64 y
120 fmol. Para conseguir una mayor sensibilidad se procedió a la acetilación previa de la
curva patrón y de las muestras problema. La sensibilidad del ensayo es de 1 Imol, y la
reproducibilidad inlerensayo es dei 5,0 ~ y el coeficiente intraensayo dei 4%.
Heprusontando graficamente los valores obtenidos con las concentraciones de
AMi’c estandar construimos la curva patrón. Sobre ella se interpolan los valores
oblenidos para las muestras y se leen las concentraciones de AMPc 1 tubo. Los
resultados se expresan como pmoles de AMPo /10.8 células.
3.2.11.2. ValoracIón de ino8itol trifosfato <IP3).
3.2.1t2.1. Procesamiento de las muestras celulares.
Se procedió igual que para la valoración de los niveles intracelulares de AMPo. Con
la diferencia de que mio se añadió el inhibidor de fosfatasas <iBMX) y las muestras
celulares se imicubaron en medio 199, en lugar de en APMi, porque este medio
presenta los niveles de inositol más bajos entre los nnedios comerciales, siendo el másutilizado para la valoración de este segundo nnensa¡ero.
3,2.11.2.2. Ouantlflcaclón de IP3.
El método utiliza IP3 marcado con tritio y una proteína bovina adrenal que se une
específicamente al IP3. El ensayo se basa en la competición entre el IP3 marcado y el
IP3 presente en la muestra por un número limitado de sitios en la proteína de unión.
Con concentraciones conocidas de la proteína de unión y el ligando radiactivo, la
cantidad de ésteúltlrno que se una a la proteína es inversamente proporcional a la
cantidad de IP3 de la muestra añadida. El IP3 unido se separa del libre por
centrifugación, y se mide la radiactividad en los precipitados, determinando las
concentraciones de IP3 en las muestras por Interpolación en una curva de estandares.
La curva patrón se realiza con ocho concentraciones de IP3, 0.19, 0.38, 0.76,1.5,3.1,
6.2, 12.5 y 25 pmoi/ tubo que constituyen las muestras estandares.
Los resultados se expresan corno pnnoles de IP3 por 10-8 células. La cantidad de
IP3 detectable se encuentra entre 0,19-25 pmol/ tubo, el coeficiente de variación
47
Matedales y Métodos
in)traensayo es del 12,5 ~/oy el do interensayo es del 8,2 a/o.
3.2.11.3. Ensayo de le actividad proteína kinasa C.La actividad de la proteína quinasa O en células inrnunoconnpetentes <macrófagos y
linfocitos) se valera cuantificando la fosforilación de histona con 32P-ATP que lleva a
cabo la PKC aislada previamente de dichas células.
3,2.11.3.1. Activación y purificación del enzima.
Alícuotas de 500 pl de las células inmuunes, linfocitos o nnacrófagos, ajustados,
respoctivrnuente. a io~ y a 5x108 células/ miii, fueron incubadas durante 5 mitin a 3700
con diferentes concentraciones deles neuropóptidos (1O’~, 10-10 y 10’~~ M>, y vatios
comitroles, como el forbol muiristato acetato (PMA> potente activador de la PKC, a una
conconitración de 50 ng/ml. retinal, un inhibidor del anterior, a una concentración 20
n)M y Con A lpg/ml. La imicubación se para con solución de PBS muy tría e
in)nlediatan)ente se centrifugan las muestras dos veces. En este punto las muestras se
pueden almucomuxr a •70C o proseguir con el ensayo.Las células se resuspenden en mml de buffer <A> de homogeinización (20 mM
Hopes,pHi.5: 2 mM EDTA: 2 mM ECTA; 10 nnM 2-meroaptoetanol; 1mM aprotinina
(trasilol>; lmM PMSF; lOrng/ml leupeptina > y se centrifugan a 20.000 rpnn durante soruin a 400. Los precipitados se resuspenden en 2 mIde bulfer A con 0.1% de triton X-
100 y se sonican en) tres pulsos de 5 seg. Las dos fracciones correspondientes a
citosol <sobrenadantes> y menubranas (precipitados> se purifican en columnas de
intercambio lónico, preparadas previamente con 0.5 ml de resma DE-52 equilibrada con
bufler U <lO mM Hepes,pHl.5; 0,2 mM EOTA; 0.2 mM ECTA; 2-mercaptoetanol lo
mM; NaCí 20 mM>, y se eluye la PKC, usando un gradiente de O a 0.25 mM de NaCí.
Este paso se realiza a 400 en cámara fría.
3.2.1t3.2. Ensayo enzlmAtioo,
Siguiendo el método de Gopalakrishna y cols. (1988), alícuotas de 100 pl de
muestra de cada fración fueron incubadas a 3000 durante 5 mm con 20 mM 1-lepes
(pHl.4>; 2-mercaptoetanol 5 muM; i)istona 35 mg/mI; 0.2 mM ATP y 0.1 mCI/tubo de 32P
ATP en presencia o en ausencia de extracto de cerebro 2 mg/ml <conno fuente de
fosfatidilserina) y 2 nuM CaCI2. La reacción separé con Imí! tubo de ácido tricloroacético
48
4,
Matedales y Métodos
al 25%. 121 precipitado se recogió por filtración en papel Whatman GF/C y se midió laradiactividad <LKI3 I3”counter>. La actIvidad PKC se calcula como la cantidad de 32P
incorporado a la liletomia, en presencia de foelatidilserina y cedo, menos la canUdadincorporada on su ausencia. Estos vaioms se expresan en el apartado de resultados
como fósforo incorporado en histona por i$ células y por minuto,
3.2.7. EstudIo estadístIco.Los resultados se expresan mediante la media aritmética y desviación estender de
los datos obtenidos en cada una de las dtfenntee pruebas.
La normalidad de la distribución de las variables se analizó mediante el test deKoi,nagorov-Smlrnov. Los datos se evaluaron mediante un test ANOVA de mediadas
ropotidas. La comparación da las muestras aparead. entre síu analizó mediante unado Bludoní,
Se considoró que no había signIficación cuando el valor de la probabidad <p> fuennayor de 0,05. Una diferencia de pcO,05 ha mido consIderada como signIfIcatIva, de
pcO,01 como mnuy significativa y de pcO,001 como altamente slgnifloatlva.
49
4. RESULTADOS
Resultados
4, RESULTADOs
En primer lugar se exponem los resultados obtenidos en cuanto al efecto de cada
uno de los tres neuropéptidos estudiados: bonnbesina, CRP y neurornedina C, sobre
el proceso fagocítico de nuacrófagos peritoneales murinos, en) todas y cada una de sus
diferentes etapas. En segundo lugar, se presentan los resultados correspondientes al
efecto do los mieuropéptidos sobre la funclonalidad del linfocito, representada por la
l)reliferación y quimniotaxis. En tercer lugar, se muestran los resultados obtenidos encuanto al efecto sobre i.a actividad citotóxica natural y la cítotoxicídad celular
dependiente de anticuerpo. En cuarto lugar, los resultados en relación al efecto de
estos neuropéptidos sobre la secreción de factores de colaboración intercelular. A
contim)uación, se muestran los resultados obtenidos cuando se procedió a una
incubación, previa a los ensayos, con los neuropéptidos, para averiguar si era
m)ecesaria su presencia a lo largo de la prueba, En sexto lugar, se presentan los
resultados en cuanto a la especificidad de los efectos observados que Incluyen la
determinación de la existencia de receptores específicos en las células inmunes. En
sól)timTlo lugar, se muestran los resultados obtenidos Irás purificar las diferentes
subpoblaciones celulares y estudiar el efecto de los neuropéptidos sobre su
funcionalidad. A continuación, se muestran los resultados correspondientes al estudio
de la nnediación por las células adherentes del efecto de los neuropéptidos sobre los
linfocitos, y la determinación de la secreción de uno o varios factores que median esta
respuesta. Por último se procede a la exposiciómi de los resultados obtenidos en la
valoración del mecanismo de acción Intracelular de estos neuropéptidos en las células
inmunes estudiadas.
50
Resultados
4.1. Efecto con)parado de bembesína, anp y neuromedína O sobre
el procoso fngocftico do macrófagos peritoneales murinos.
Soguldiannente se expon)en los resultados correspondientes al estudio del efecto
que los neuropóptidos: UN, CRP y m)euromnedina O, tienen) en cada una de las etapas
del proceso fagocitico, las cuales se Irán exponiendo en el mismo orden en el que
tienen lugar ¡n vivo: adherencia a sustrato, n)oviiidad dirigida o quimiotaxis, así como
capacidad quimioatrayente, im)gestlón de partículas inertes o de células y mecanismo
dIo destrucción de las nnismnas.
4.1.1. Adherencia a sustroto,
En la fig 1 so representan los indices de adherencia correspondientes a los
resultados obtenidos con macrófagos peritom)oales incubados durante 5 mm, con cada
uno de los tres péptidos estudiados a las concentraciones indicadas <10.12 a io’~ M>,
siendo el O el valor control. Del mismo modo se exponen los resultados obtenidos con
los otros tiempos de incubación): 10, 20, 30 y 60 nnin en la tabla 1.
Como se observa en los resultados expuestos, los neuropéptidos estimulan
significativamente la capacidad de adherencia de los macrófagos a sustrato
prácticamente con todas las concentraciones estudiadas, con excepción de la de 10.6
M y a todos los tiempos do incubación analizados.
Se observa un incremento de la adherencia en los macrófagos incubados con
neuropéptidos a concentraciones de io~ y 10-lo M a todos los tiempos. La
concem)tración do io<3 M no tiene efecto y los encontrados con 10~ y 10.12 M son
escasos. Los incrementos mayores se dan a los lO mm de Incubación y los menores a
los 60 mm.
De los resultados que se muestran, se deduce que no existen diferencias
significativas entre los tres neuropéptidos en cuanto a su capacidad de estimulación de
esta propiedad, salvo a los 5 mm de incubación (fig 1>, tiempo al que el CAP y la
neuromnedina O producen un indice de adherencia significativamente mayor (pc0,00l>
con la concentración de l0~ M con respecto a la BN.
51
Resulta dos
no
70
Go.
40’
80
60
40~
50
tic
70
50
40
50
Hg 1. índices de adherencia (lA> de macrófagos peritoneales murinos incubadosdurante 5 mm con SN, GRP o neuromedina C en el rango de concentraciones que seindica de 1012 a 10.8 M.EI Oes el valor control.Se representa la media t DE. de los l.A.de 8 experimentos por duplicado. pcO.05. “p~O.O1. “‘p<0.OOl.
0 12 II lO 0 0 7 6
omw
0 12 II ID 0 9 7 0
~edI,ia0
2 II 0 0 8 7 6
52
Resultados
TABLA 1. índices de adherencia a sustrato decon bombosin)a, GflP o neuromedina C.
m))acrófagos peritoneales incubados
‘1 imicubación
10
20
30
60
1 incubación
<mh)
10
20
30
60
BN
o ío-12 ío-l 1 10-10
52±2 63±70
62±4 66±5
08±2 71±2
73±5 74±5
67±ya
68 ±
y~ ~
77±6
O lo-12 10-11
tj4.j4 62±5071~4a
61±5 64±4 y4~yb
66±6 72±3
75±5 75±5 78±5
76 ~
78
~
86±ab
GRP
lo-lo
80 ~
83 ±
83
CcnxnÚt~ckn (M>
ío~
72 ±5a
76 ±
79 -±~a
04 ±
67 ±
73 ±40
78 ~
85 ±4
Cono3rVmXn (M)
ío9 ío~
78 ±
82±3a
~ ~
67 ±74)
71 ±80
76 ±
81 ±7
T imn¡bad&’i NC
o ío12 10-11 ío-10
Cc*nflraión <M>
ío-9 iO~
54±7 63±6v
61±7 65±5
68±7 72±4
78±6 78±8
69 ±-¡a
71 ±
~ ~
81 ±5
78 ~
01 ±
90 ~ gb
71 ±
76 ±
80 ~
89 ~
67 ~
71 ~
78 ±50
84 ±8
83 ±5
68 ±7
74 ±5
82 ±6
59 ±6
64 ±4
70 ±6
79 ±6
Cada valor es la media ±DE. de 8 experimentos realizados por duplicado. 0p <0.05,b ~<0.01, a p <o.ooí con respecto a controles.
53
io6
63 ±3
74 ±4
79 ±4
84 ±5
58±2
71 ±3
78 ±4
83 ±3
1 rn
63 ±7
68±8
72 ±6
80 ±4
60±7
66 ±8
69 ±7
79 ±4
lo
20
30
60
Rastillados
4.1.2. Qulnilotaxis
lin la fi9 2 so represem)tan los indices de quimiotaxis (1.0.>, es decir el núnnero de
nuacrófagos peritoneales murinos contados por filtro, en muestras que fueron
incubados durante tres horas con las concentraciones de neuropéptidos que se
indican) (10.14 a 10-6 M). El O corresponde a las nnuestras control incubadas en
ausencia de neuropóptidos.
Esta capacidad de los macrófagos se encuentra significativannente estimulada por
casi todas las concentraciones empleadas de los neuropéptidos, salvo la de 10-14 M.
Como puede observarse los valores son significativamnente mayores con CAP y
con mrnuromodima O que con bombesina. Existen diferencias significativas entre los
valoros obtenidos cor) bombosina y con SUP a las concentraciones de 10-14 a 10-11 M,
y lo niiismo ocurre con la neuromedina O a concentraciones de 10.13 a i0.11 M, A las
concentraciones do 10.12 y 10.11 se dan las mayores diferencias con la bombesina
(pc0,00 1>.
4.1 .3.Cnpncldad quimloatrnyente.
En la fi9 3 se representan) los resultados obtenidos en el estudio de la capacidad
quimioatrayente de les neuropéptides a concentraciones de 10.12. io~~ y ío~ M. El
o es el valor correspondiente al control sin neuropéptido.
Los tres neuropéptidos produjeron un incremento del número de células que
migraron a través del filtro. Como se puede observar, el CAP se mostró como el más
c~uimioatrayente de los tres péptidos, siendo la concentración de lo-10 M la más
efectiva (pcO,Ol).
Una vez demostrado la capacidad quimioatrayente del GRP sobre todo a la
concem)tración) de 1010 M. Se relizaron unos experimentos añadiendo como control
positivo, el péptido formnilado FMLP, probado quimloatrayente para macrófagos(Shiffnnann y Gailin 1979> a la concentración de 10-6 M, en los mismos ensayos se
añadió CAP 1010M en otras cámaras o amitos en la misma cámara.
Con) FMLP (10-8 M> el número de macrófagos que migraron por filtro, en 7
experimentos realizados por duplicado, fue 1021 ±150,Inferior al obtenido con CAP
(10-10 M), que fue de 1526 ±221.Y cuando se añadieron ambos péptidos el resultado
f tic de 1095 ±167macrófagos.
54
Resultados
8(X)
1(X)
400
300
/00
500
.100
1) 14 13 12 II lO 9 0 7 6
0 14 a 12 II lO 9 0 7 6
Hg 2. índices de quimiotaxis (IQ> de macrófagos peritoneales murinos incubados conUN, GRP o neuromedina C en el rango de concentraciones que se indica de 10-14 a10~ M.EI O es el valor control,SO representa la media ±DE. de los IQ. de Oexperimentos por duplicado. p~O.OS. “pcO.Ol. “p<0.OOI.
0 14 13 2 II lO 0 0 7 0
Qn’,
55
ResUltados
3000
2500-
2000-
1500-
1000-
500-
o
Fig 3. Capacidad quimioatrayente de las concentraciones indicadas (10-12 a ío~ M)de bombosina, GRP y neurornedina O para macrófagos peritoneales murinos.Serepresentan) las medias ±DE. del número de macrófagos por filtro contados en 5
experimentos por duplicado, frente a concentración de neuropéptidosYp<0.0l
respecto al control.%cO.01 respecto a EN. bpco.oi respecto a NC.
4.1.4. Capacidad de Ingestión.
Se muestran en primer lugar los resultados correspondientes a la ingesta de
partículas inertes. Los valores que se representan en la fig 4 corresponden al númerode bolas de latex fagocitadas por lOO macrófagos <l.F.>, incubados con las
concentraciones que se indican de cada uno de los péptidos ensayados.
No se observan diferencias signilicativas en ningún caso entre los valores
obtenidos con los tres péptidos, estimulando todos ellos la capacidad fagocítica de los
macrófagos en concentraciones desde l0~ hasta 10-13 M, con valor máximo a la
concentración) de 10-li M.
66
—ci—-- Bombesina
—4— GRP—1-— Neuromedlna O
0 -12 -10 -6
RescnItadas
(loo -
4(X)
700 ~§~m~InsC
000
5(X)
400
lA 13 12 II lO 0 0 7 0
Hg 4. Número de bolas de Iatex fagocitadas por cíen) macrófagos (IF) incubados conUN, GRP o neuromedina O a las concentraciones que se indican de 1O~ a ir6 MEI Oes el valor controlSe representa la medía ±D.E. de los 1$. de 8 experimentos porduplicado. pc0.OB. “pcO.Ol. “‘p<O.OOI.
200O
(lix)
1i00
0 14 13 2 II lO 0 0 7 0
Qn’,
0 4 13 12 II lO 0 0 7 0
57
Resultados
Los restiltados obtenidos en cuanto a la ingestión de C.albicans, siguiendo la
muotodologia do fagocitosis en tubo (no mostrados>, indican una disminución del
número de cándidas ingeridas cuando os macrófagos se incuban con los
n)etiropóptidos. Sil) embargo, y como se comentará en la discusión, la técnica no
resultaba adecuada para este estudio, por lo que pasamnos a analizar la propiedad de
Ingestión en placas de MW en lugar de hacerlo en tubo.
1.os resultados obtenidos utilizando placas de MW se muestran en la fig 5.
Podemos observar un aumento de la fagocitosis de C. albicans con los tres
n)ouroéptidos a concentraciones que van desde 10.13 a 1O8 M, siendo la mnás efectiva
la concen)lraciónI de 1O’10M.
Se observa tina estimulación significativamente mayor del GRP y la neuromedina
o en comparaciól) con la bombesina en dosis que van desde lo-12 a lO~~ M. Estas
diferencias son altamen)te significativas (pcO.OOl> a las concel)traciones de i012 y
1011M.
4.1.5. Poder de digestión.
Una do las dos nnetodoleglas utilizadas para comprobar el efecto de los
neuroóptidos sobre el poder de digestión im)tracelular fue la reducción dei nitroazul de
tetrazolio <NUT>, que como se ha comentado en el capítulo de Métodos, nos da una
medida de la cantidad de anión) superóxido producido por el macrófago.
Los datos expresados como ¡,moles de NBT reducido por io~ células se indican
gráficamente en la fig 6. La tran)siorrnación de las absorvancias a pmoies de producto se
efectuó por interpelación en una curva estandar realizada con las D.O. obtenidas en la
reducción do diferentes concentraciones de NBT en la forma que se indicó en la
metodología. Los resultados (hg 6> corresponden) a los experimentos realizados en
ausencia de estimnulo fagocitico. muestras no estimuladas, (representados por
símbolos abiertos> y en presencia do estimulo fagocítico, partículas de latex, muestras
estimuladas (representados por símbolos cerrados>.
Se observa una estimulación significativa de la produción de anión superóxido
por los macrófagos incubados con los neuropéptidos a concentraciones que van
desde iOíS a iu~ M. siendo las concentraciones de 10.10 y 10.11 M, con las que se
consiguió mayar estimulación. No se observan diferencias relevantes entre los efectos
producidos por los diferentes póptides en ningún caso.
58
Resultados
700
600 -
600 -
400-
200
50<»
400’
300
200
700
600
600
400-
200 -
Hg 5. Número de cám)didas fagocitadas por cien macrófagos (IF> incubados con EN,GRP o neuromedina O a Las concentraciones que se Indican de 10í4 a 1O~ M. El Oesel valor control. Se representa la media ± DE. de los lE. de 8 experimentos porduplicado. ‘p’cO.05. “p4i.0l. ~*p~cO.OO1.
59
Dom botI,~.
0 ‘4 13 2 II ID 0 8 7 6
Qn”,
0 4 13 12 II O & 8 7 6
~m~In.0
0 14 13 12 II 10 0 8 7 6
Resultados
30 -
25 -
20 -
15
lo -
35
no
25
20
l5
lo
5
as
30
25 -
20
‘5
lo
0 14 13 12 11 10 0 8 7 6
Hg 6. CantIdad de NBT reducido <pmoles/108 células> en macrófagos peritonealesIncubados con EN, GRP o neuromedinia O a las concentraciones que se indican de10-14 a lO~ M. El 0 es el valor control. Se representa la media ± DE. de 8experimentos realizados por duplicado. ‘p~O.O5. ~pc0.0l. •5~p~0.O0l.
60
5•• ••5
5, ,0 14 13 12 11 lO 0 8 7 0
O Id 13 12 II lO O 8 7 8
Neuromedin O
•5• 5*44**
9—5,,
5,,5•
Resultados
también se valoré la producción de otro radical de oxigeno, el peróxido de
hidrógeno mediante citonnetría de flujo. El) la fig 7 se representan íes picos de
fluorescencia, obtenidos a diferentes tien)pos, en muestras de macrófagos
peritoneales incubados con diacetato de 2.7-diciorofucrescina <DCFH-DA>.
600
550 -
Li-500-
‘150•
-leo -
350o aoo
Hg 7. intensidades de fluorescencia en función del tiempo, de macráfagos
peritoneales ir)cubados con GAR 10’le M y con los controles que se indican Serepresenta la media de tres experimentos.
Se realizaron varios controles: uno positivo adicionando H202 a la suspensión
celular sin) estimular para comprobar que las células hablan Incorporado suficiente
marcador fluorescente: otro negativo con azida sádica que inhibe la glucosa oxidasa y
xantina oxidasa que producen nnetabolitos do oxigeno. Así mismo, se incubaron
muestras con PMA y con FMLP además de con el GRP.
Conno podemos observar aparece un aumento de fluorescencia con GRP no solo
en relación al control negativo sino también en relación a la intensidad producida por el
FMLP y a determnlnados tiempos, a la producida por el PMA.
61
A
—o---- Control -
tr Control +
—-4---- PMA—&--- FMLP—O— GRP
aoo ioo 600
Tiempo (segundos>
Resultados
4.2. Efecto de bombesina, on~ y neuromedina O sobre la
funcionalidad de linfocitos murinos.
A contin)uac¡óm) se muestran los resultados obtenidos al estudiar el efecto de la BN,
GRP y neuromedina C sobre la funcionalidad linfoide: la quimiotaxis, así como la
capacidad quinnioatrayente de los neuropéptidos, y la capacidad proliferativa de células
linfoides.
4.2.1. Quimiotaxls.
Un primer lugar se muestran los resultados en cuanto al efecto de los péptidos
estudiados sobre la capacidad quimniotáctica de linfocitos obtenidos del peritoneo.
En la fig 0, se represem)tan los indices de quiniiotaxis (1.0,> de linfocitos, de
muestras peritoneales que fueron incubados durante tres horas con las
conIcen)tracionos de neuropéptidos que se indican <10í2 ,ío~W y ío’8 M>. El O
correspon)de a las ¡nuestras control incubadas en ausencia de neuropéptidos.
1800 ____________________
1 400
I000~
600’
200
Hg 8. índices de quimniotaxis <lO> de linfocitos peritoneales murinos incubados conUN, GRP y neuromedina O con las concentraciones que se indican (1 0-~-10>~ 2 M). El Oes el valor controiSe representa la media ±DE. de los lO. de 6 experimentos porduplicado. pc0.05. ~p<O.Ol.“p<O.0Ol.
La quinniotaxis en linfocitos peritoneales se encuentra estimulada por los
neuropéptidos a la concentración de i010 M. Como puede observarse los valores son
significativamente mayores que en controles con CAP y con bombesina <p-cO,O1>.
62
~—O-—- I3ornbeslna—a— en’,—~á--- Nouroouodkm O
0 -12 -10 -8
Resultados
I800
1400’
1000
000
200
1800
400”
1000’
(loo.
2000
000
IPflO
000’
400
0 ‘12 .10 ‘8
0 -12 ‘lO ‘8
Hg 9. Indices de quimiotaxis (l.Q.> de linfocitos de ganglios axilares, bazo y timo,
Incubados con EN, GRP o neuremedína O a las concentraciones que se indican (lOa-10.12 M>. Se representan la media ±D.E. de los 1.0. de O experimentos por duplicado.pc0.05.
Ganglio‘—4—orn,’
—o-- Uornbooin.—e— OFW—‘*— Ntwení4n~ O
—o— Bomb*.irt~—.--— GAL,—&-- Núrom,<In* O
0 ‘12 ‘lO .8
63
Resultados
En la fig 9 se exponen tos indices de quimniotaxis de linfocitos obtenidos de bazo,
tinro y ganglios axilares, in)ctJbados con los neuropéptidos durante tres horas. Como se
puede observar, existe una ligera estimulación de la quimiotaxis de linfocitos de bazo y
gan)glios axilares con la concentración de io10 M, que tiene una sIgnificacIón de
pco,05 en el caso del ganglio, y sin embargo no es estadisticamente significativa en el
caso del bazo. En el caso de los linfocitos de timo se observa una ligera inhibición que
es sigm)ificativa (p<0.05> para el GRP a la concentración de 10.10 M.
4.2,2. Capacidad quimioatrayente.
En la fig lOse representan íes resultados obtenidos en el estudio de la capacidad
qliimioatrayen)te, fror)te a linfocitos peritoneales, de los neuropéptidos a
concentraciones de io’2 íO”10y ío-8 M. El Oes el valor correspondiente al control.
Como se puede ver, el GRP se mostró corno el más quimioatrayente de los tres
péptidos, siendo la conceI)tración de 10.10 M la más efectiva. Cuando se añadió
póptido formilado <FMLP) come control se obtuvo un valor de 681 ±79, menor al valor
alcanzado con GAP (938±159>.
1800
1400
*1000-
600’
200
Hg 10. Capacidad quimioatrayento de las concentraciones indicadas (10-12 a 10-8 M>
de UN, GRP y neuromedina O para lInfocitos peritoneales. Se representa la media ±
DE. de los valores obtenidos en 6 experimentos por duplicado. p<0.05; “p.cO.Ol,
respecto al control. ap~0,oj respecto a BN. bp<ooí respecto a neuromedína O.
64
—a— Bombosina—4— onr’
—*,—-- Nouronnodlta0
ab**
0 -12 -10 -8
Rosulta dos
Los resultados correspondientes a la capacidad quimioatrayente que presenta el
GRP a la concem)tración do lo-lo M, la más efectiva para esta actividad en linfocitos
peritom)eales, se muestra para el caso deles linfocitos de ganglios axilares, bazo y tinno
en la fig 11. En este caso también se realizaron en paralelo controles con FMLP como
quin)ioatrayente.
Como cabía esperar el péptido formilado (FMLP> provocó un incremento
significativo (p<0,001> del n)ún)ero de linfocitos que atravesaron los filtros. Esta
estimtliación) de la migración se produjo en linfocitos procedentes de los tres órganos
linfoides estudiados: ganglios axilares, bazo y timo.
2000
1500
loco
500
o
Hg 11.CapacidadquimioatrayentedeiGflPa la concentración de 1O~ My del FMLP
(l0~ M> para linfocitos de ganglio, bazo y timo. Se representan la media ± DE. de 7
experimentos realizados por duplicado. En las muestras incubadas con FMLP y con
(3flP los valores fueron superiores al control (p=0,OOl>en los tres órganos. “p<O,O0I
con respecto al valor obtenido con FMLP.
En cuanto al efecto del GRP (10-10 M), éste aotuó, también, como
quimioatrayente, produciendo Incrementos en la nnigración de los linfocitos
significativamente superiores a los del FMLP, en el caso de las muestras obtenidas de
bazo y ganglios. Sobre los linfocitos del timo, ambos péptidos, GRP y FMLP mostraron
la mnisma capacidad qulmioatrayente, con diferencias no significativas estadisticamente.
65
Ganglio Bazo Timo
Resultados
4.2.3. Proilforación.
En cuam)Ie al efecto de los tres neuropóptidos sobre la respuesta proliferativa de
linfocitos de ganglios axilares, tinno y bazo, estudiarnos, en primer lugar, dichos efectos
en auser)cia de cualquier otro posible estimulo mitógenico, lo que denominarnos
proliferación espontánea. En la tabla 2 se muestran les resultados obtenidos
expresados en porcentajes de estimulación respecto a controles, que representan las
cpm obtenidas en presencia de los neuropéptidos respecto al valor lOO dado a las cpm
en muestras im)cubadas en ausencia dolos mismos. A la concentración de lo-lo M los
tres póptidos estimulan la proliferación. Destaca el mayor efecto estimulador de BN,
GRP y neuromnedina C sobre los linfocitos de timo que sobre ganglios y bazo. Así
mismo, el GflP produce un efecto estimulador mayor que la UN y la neuromnedina O en
timo.
TABLA 2. Porcentajes de proliferacion espontánea de linfocitos de ganglios axilares
bazo y timo do ratones BALDío 61) respuesta a bombesina, GRP y neuromedina C
Ganglios Bazo Timo
10.8 M 120 ±lO 120 ±la 135 ±200
Uomnbesina 1010M ~ ~ 2W 145 ±12a 174 ±
1012M 127 ± 18 125 ±16 126 ± 17
l0~’8M 116±16 118±15
GRP 1010M 142 ±12a 148 ±15a 241
lo~12M 126 ±19 127 ±17 132 ±
M 118 ±10 110 ‘±15 133±180Neuromedina IOdOM 134 ±
15b 139 ±ma 173 ~±27S#
l0’12M 126 ±16 121 ±17 126 ±18
Cada valores la media ±DE. deS experimentos realizados por triplicado, dando el valor100 a las c.p.rn. obtenidas en controles (N=8> sin neuropéptidos (816±211, 61 5±120
and 192±60cpm para ganglios axilares, bazo y timo, respectivamente). 5<pco.00í>,b<p.co,oí>, 0<p<0.0S) respecto a controles sin neuropéptido. *(p~o,ool> con respecto
a bombesina o neuronnedina O. #<p43~1> con respecto a los valores obtenidos en
ganglio y bazo.
66
Resultados
Como com)troI positivo de la proliforación se utilizó Concanavalina A (lpg/rnl>. Las
medias de los porcentajes de preliloración en respuesta a Con A de 8 experimentos
fueron) las siguientes: 2654±343(ganglios axilares>, 2803±263(bazo> y 3080±310
(timo>. Estos valores son mayores que los obtenidos con los neuropéptidos con
diferencias altamente significativas (p~0,00l>.
Lo siguiente que estudiamos fue el efecto de los péptidos sobre la proliferación
en) respuesta a mitógenos. Se presen)tan los resultados obtenidos con Con A, a dos
concentraciones una submitógenlca (5 pglml> y una mltógenica (1 pg/mi>, y los
obtenidos con lipopellsacárido, LPS (10 pg/mnl>.
En la tabla 3 se muestran los resultados con la concentración submitogénica de
Con A y en la fig 12 los obtenidos a la concentración óptima del mitógeno. Los tres
neuropóptidos, a la concentración) de 10>10M, inl)iben la proliferación Inducida por Con
A independientemente de la concentración de mitógeno y del órgano de procedencia
de los linfocitos. Estos neuropéptidos a la concentración de i08 M también inl)lben la
proliferación inducida por la dosis initogénica de Con A en linfocitos de bazo y timo.
TABLA 3. Porcentajes de proilferación de linfocitos de ratones BALE/o en respuesta
a Con A (6 vg / nni> y en presencia de bombesina, GRP y neuromedina 0(10-10 M>
Con A Bonubesina GRP Neuromedina C
Ganglio 236±32135~18a2 150±188 121±2082
Uazo 230±42 169±278 157±288 l65±2O~
Timo 225±25 166±228 168~1ga 169±128
Cada valores la nnedia ±D.E. de O experimentos realizados por triplicado, dando el valor
100 a las c.p.n’i. obtenidas en controles sin neuropéptído ni mitógeno (816±211,
615±120y 192±60en ganglio, bazo y timo respectivamente).8p<O.O01 con respecto
a las muestras con Con A. 2pc0.01 %4Y05 con respecto a los valores obtenidos con
GflP.
67
Resultados
10-61lO -101
AEN Qn’?
1tititititiJ/
Nc-1
mlo-eli~.1ol[5~J,fl
0
1fi
t/4
o
.11aVE¡titititi-A
T
1
- - - . - -
¡3M CAP HO
Plg 12. Porcentajes de proliferaclón de linfocitos de ganglio, bazo y time en respuestaa Con A <1 ¡igl mi> e incubados con las concentraciones Indicadas de UN, GRP yneuromedina O. Se representan la media ±DEde los resultados de 8 experimentos
por triplicado. 0p43,05. bp<o,ot. apco,ool respecto al valor control sin neuropéptido
68
~IosaxImn’rog
1’
Co,, A
5000
4000-
3000-
2000
1000’
o
5000
4000
3000
2000
bao
0
5000
4000
~000
2000
¶000 -
o
Con A EN CAP Nc
Con A
Resultados
(~n la hg 13 se presentan los resultados obtenidos tras la incubación de los
limilocitos con LPS (10 ¡ig/ mnl) y con los neuropéptidos. También se observa una
disminución de la respuesta al mitógeno en presen)cia de bornbesina, GRP y
m)etlron)odlna O. La concentración de l0~ M es, al igual que se ha indicado para el
caso de la Col) A, la que presenta mayor capacidad lnl)ibidora en los tres órganos y con
los tres mieuropóptidos.
(Sn el bazo la concentración de 10-8 M de bombesina y de GRP también producen
Im)illbición) do la respuesta proliferativa a LPS, y en el caso del timo es la neuromedina O
la que lo lince a todas las concen)traciofles estudiadas.
69
o
~IosoxIInros
.1
fi
titititi/
1
1
a
-1 /
lo-el10101[~J3j
1r
-~.-1~~~.~~ -LPB [3M CIII’, NC
00 co
a00
00
0 — — — — —LPB ¡SN CIAP NO
fin
400
300
200
loo
o
10-8110.101[,~J,fl
LPS
a
ti
/yyyyyyyyyyyyy
a3-
¡3M Qn’,
0
fi
tititititiNO
o
r
Hg 13. PorcentaJes de proliferación de linfocitos de ganglio, bazo y timo en respuesta
a LPS (lO ¡igl mí) e incubados con las concentraciones Indicadas de EN, GRPy
neuronriedina O. Se representan la media ±DEde los resultados de 8 experimentos
por triplicado. 0p<O,05. b~<o,oí. ap<o,ool respecto al valor control sin neuropéptido
70
Resultados
600
500
400
300
200
loo
2500
2000
fi
Resultados
4.3. Efecto de bombesína, GRP y neuronnedina C sobre la
funclonalidad de las células citotóxícas.
So exponen a contim)uación los resultados obtenidos en el estudio del efecto de
la UN, GRP y nauromedimia C sobre la actividad citotóxica natural (NK> y la dependiente
de anticuerpo (ACCO> de leucocitos obtenidos del peritoneo y de timo, bazo y ganglios
axilares.
4.3.1. ActivIdad natural kIIler (NK>.
Con respecto al efecto de bombesina, GRP y neuromedina C sobre la
citotoxicidad natural (NK>, en primer lugar se muestran los resultados obtenidos al
realizar los ensayos de citotoxicidad con células procedentes del peritoneo como
efectoras, los datos se expresan en porcem)tajes de lisis de células YAC-I.
%NK
(30
50
40
30
20
lo
ocontrol bombesina GRP neuromedina O
Flg 14. PorcentaJes de citotoxicidad natural (NK> de leucocitos peritoneales en
preser)cia de las concentraciones que se indican de UN, GRPy neuromedina C,
usando células YAC-l como diana a una relación efectora:diana de 50:1. Se
representan la media ±DE. de los valores obtenidos en 6 experimentos realizados por
triplicado. Cp~o.ool con respecto al control.
Tanto bombesina como GRP y neuromedina O, a la concentración de 10í0 M,
produjeron un incremento muy significativo de la citotoxicídad natural sin diferencias
estadísticas significativas entre los tres neuropéptidos.
71
Resultados
A con)tinuación pasamos a estudiar estos efectos en nnuestras de leucocitos
obtenidas de órganos linfoides
En la tabla 4 de la págln)a siguiente, se exponen los resultados obtenidos al utilizar
leucocitos de: bazo, tinno y ganglios axilares, como efectoras. También en este caso se
observa un incremem)to en los porcenta]es de lisis en respuesta a la incubación con los
neuropéptidos a la concentración más fisiológica (lO-10M ). Los mayores porcentajes
de lisis so obtuvieron en bazo y los menores en timo. La relación efectora:diana más
efectivti fue la de 50:1 y el CAPel péptido que produjo una mayor estimulación en los
tres órganos. i73ombesina y neuromedina O produjeron los máximos incrementos en los
porcentajes de lisis cuando las células electoras procedían de bazo y de timo.
Los tres neuropéptidos a la concentración de lO~~ M, también estimularon la
citotoxicidad en~ leucocitos procedentes de los tres órganos cuando se utilizaron
células K562 humanas como dianas, aunque los porcentajes de estimulación fueron
menores que al utilizar YAC-1 (hg 15>.
% NK
150
40
so
20
‘o
o
Hg 15. PorcentaJes de citotoxicidad natural (NK> de leucocitos peritoneales en
presen)cia de las concentraciones que se Indican de EN, GRP y neuromedina O,
usando células K562 como diana a una relación efectora:diana de 50:1. Se
representan la media ±DE. de los valores obtenidos en 6 experimentos realizados por
triplicadoTodos los valores de las muestras Incubadas con los neuropéptidos fueron
mayores que en controles, con diferencias estadisticamente significativas <pcO,0l>.
72
control bombesina GRF’ neuromedina C
Resultados
TABLA 4. Efecto de bombesina, GRP y neuromedina o <in-lO M) en el porcentaje de
citotoxicidad natural (NK> de leucocitos de ratones UALB/c usando células YAC-1 adiferentes relaciones efectora/ diana.
Ganglios axilares
100:1 50:1 25:1
Control 20±4 26±7 20±4Uombesina 2’~~6c g5~-1b
GRP 31~5a 40~gaNeuronnedina O 23±sc 30±7
Bazo
1001 50:1 25:1
Control 35±7 40±10 30±8
Gombesina 62±is~’ y2~13a 62±118GRP 6o±io~ 80~13a 75±168Neuromedina O 62±l0~~ ea±isa ¿35±128
Timo
100:1 50:1 25.1
Control 14±2 13±2 12±2Uombesina 21~3a 28~4a 25±48
CAP 1g~ga 29±4v 21±38Neuromedina O 22±sa 25~5a 28±48
Los valores son la media±D.E. de seis experimentos realizados por triplicado.
a p<o.ooí, b~<o,o1. c p.co.os.
7:3
Resultados
4.3.2. Citotoxicldad celular dependiente de anticuerpo (ADCC>.
A continuación se nnuestran íes resultados obtenidos en el estudio de la
citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo <ADCC) o actividad kl/la <K). En la fig
15 se observa que los tres péptidos a la concentración 1010 M estimularon esta
actividad citotóxica de células peritoneales.
¿30~
50
40 -
30-
20
lo -
o,control bombesina CAP neuromedina O
Hg 16. PorcentaJes de citotoxicidad (ADOC> de leucocitos peritoneales incubados
con las concentraciones que se indican de SN, GRP y neuromedina O, usando células
K562 como diana a una relación efectora:diana de 50:1. Se representan la media ±
DE. de los valores obtenidos en 6 experimentos realizados por triplicado. ap<O,oOI
con respecto al control.
En cuanto a los resultados obtenidos con células procedentes de bazo, timo y
ganglios axilares <tabla 5>, los tres péptidos incrementaron los porcentajes de lisis de
células K562 utilizando diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal antí-COIS
(1:200; 1:500; 1:1000> y una relación efectora:dianade 100:1, la cual demostró ser la
más efectiva en ensayos previos. Los valores más altos se obtuvieron con la dilución
1:500 del anticuerpo, y el GRP mostró la mayor capacidad estimuladora de la CODA en
leucocitos.
74
00a 0-8
U-ío~ -12
a a
ti
-r —
Resultados
TABLA 5. Efecto de bombesina, GRP y neuromedina O (101o M> en el porcentaje decitotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC> de leucocitos de ratones
UALU/c usando células K562 a una relación electora/ diana de 100:1 y a diferentesdiluciones de anticuerpo.
Ganglios axilares
1ZY) 1:500 1.1000
Control 20±4 21±4 15±3
Bonibesina 27±4 31±5 28±5ClIP 28±4 40±8 32±7Neuromedina 0 26±5 31±5 24±5
Bazo
1.1000
Control 15±6 19±4 18±4Uombesina 20±3 28±4 22±5
ClIP 20±5 28±6 27±5Neuromedina 0 19±5 27±5 22±6
Timo
1:500 1:1000
Control 15±4 19±6 15±4
F3ombesina 23±6 25±5 23±7
CAP 26±5 32±5 24±5Neuromedina 0 26±5 25±5 23±5
Los valores son la media ±0.2. de seis experimentos realizados por triplicado, rodoslos resultados de las muestras incubadas con los neuropéptidos fueronestadfstlcamente superiores a controles (v0.0l>.
75
Resultados
4.4. Estudios do colaboración intercelular.
Para im)tontar comprender mejor la forma de actuación de estos neuropéptidos en
la m))oduiaclón de la respuesta inn)un)e, nos propusimos estudiar los posibles cambios
en la secreción de citocinas por tas células inmunes incubadas en presencia de los
m)etiropóptidos. Se eligieron citocinas implicadas en la respuesta proliferativa ya
estudiada, la iL-l y la iL-2 también implicada en citotoxicidad, así como el factor de
fusión de muacrófagos (FFM> responsable de la formación de células gigantes
mullimiucloadas (MCC>, con gran actividad fagocitica.
4.4.1.Producclón do IL-líl.
En la hg 17 se represemita la cantidad de IL-l 3 valorada en los sobrenadantes de
cultivos de macrófagos incubados en presencia de EN, GRP y neuromedina O, en
presencia o ausencia de un estinnulante de la secreción de IL-1, la Con A (ya utilizadacomo control y como mítógeno en otras pruebas>.
Fig 17. Cantidad de IL-l 13 obtenida de sobrenadantes de cultivos de rnacrófagos
peritoneales incubados con una concentración 10~ M de EN, ClIP o neuromedina O.
En presencia o no de Con A (1 ¡igl mí). Se representa la media ±DE. de 3
experinnentos realizados por tripficado.tpcfl,05 **p.co,o1; ***p~o,00l respecto al
control sin neuropéptido y sin Con A. pcO,05 respecto al valor con Con A.
76
o-CenA +ConA
Resultados
Como se puede observar en la Hg 17, en presencia de Con A se produce una
mayor liberación de iL-113 por parte de los macrófagos que en controles, con
diferencias altamnente significativas. Los tres neuropéptidos también aumentan
significativamnente la liberación de iL-l 13, princIpalmente el CAP. Sin embargo, estos
neuropóptidos en presencia de Con A provocan una disminución en los niveles de la
in)terieucina, en relación a la producida por la Con A.
4.4.2. Producción de IL-2.
En la fig 18 se muestran los resultados de la valoración de IL-2 en sobrenadantes
do cultivos do linfocitos incubados en presencia de los neuropéptidos. No se observa
en este caso un incremento significativo en los niveles de IL-2 en respuesta a los
n)etiropéptidos aunque si en respuesta a Con A utilizada como control positivo.
77
Resultados
nt~2 <u¡rnÉ>60
40
20
40
20
o
¡1.2 <U/nil>‘O
40
20
o
o OontrotO OonAa Gn~ti N.i,ro,w.dln. OO Bomh..In.
m5T
Fig 18. Cantidad de IL-2 obtenida de sobrenadantes de cultivos de linfocitos
peritoneales incubados con una concentración 1O~10 M de BN, CAP o neuromedina O.
Se relizaron controles con Con A <1 ¡igl mi>. Se representa la media ±D.E. de 3
experinnentos realizados por tripilcado.*p<0,05; **p~o,ol; respecto al control sin
neuropéptido y sin Con A.
78
1
.1
In..2 <U/mi>60
Resultados
4.4.3. Producción de FFM.
Asi mismo se valoró la producción de una tercera cítocim)a • el factor de fusión de
macrófagos (íTM> mediante el recuento de la población de células gigantes
multinucleadas (MCC> encontradas en muestras de peritoneo incubadas con ClIP
(10.10 M>. con) PIlA (a una dilución 1:1280) como conocido estimulador de la
producción) de FFM y con ambos.
50
.1
30
20
10
Flg 19. Número de células multinucleadas gigantes (MCC> por cien macrófagos en
muestras peritoneales incubadas con ClIP (10-10 M), con PHA o con ambos. Se
representa la media ±D.E. de 6 experimentos por tripiicado.* pcO,O5 respecto al
control.• pcO.05 respecto al valor con FHA.
Como se observa de los resultados expuestos en la fig 19, aparece un aumnento
<pcO,001> del númnero de MCC en presencia del control positivo, FHA, respecto al
control. También en presencia de ClIP se obtiene un numero de MCC
significativamente superior al detectado en controles <p~O,01 >• El efecto de FHA se ve
significativamente reducido cuando se añade ClIP.
79
ts
r
Resultados
4.5. Efecto de los tres péptidos en incubaciones previas al ensayo.Para comprobar si era necesaria la presencia de los neurepéptidos a lo largo de
todo el ensayo para poder ejercer su acción o no, eleginnos una de las pruebas
funcionales que por su protocolo permitiese la preincubación. Descarlamos los cultivos
por ser demasiado larga pudiendo enmascarar el resultado y escogimos la citotoxicidad.
Er) la tabla O se nnuestram) los resultados obtenidos en leucocitos de ganglios axilares,
bazo y tin)o que fueren incubados con concentraciones 10’~, lO~o 1012 M de CAP
durante 1 h y posteriormente, tras eliminar la presencia del neuropéptido, son
utilizados para am)aiizar su actividad NK.
TABLA 6. Efecto sobre el porcentaje de citotoxicidad (NK> de leucocitos de ganglios
axilares, bazo y timo de ratones BALB/C jovenes machos, de la incubación <ib) previaal ensayo con tres concentraciones molares de CAP, usando YAC-1 como células
diana a una relación E:D 10:1.
Concentracion <M> ganglios
P NP
bazo timo
P NP P NP
0 22±1 21±1 20±1 21±3 17±3 17±2
10.8 23±3 25±2 31±1 32±8 22±3 22±2
l0~ 39±4 37±3 37±1 42±11 31±7 30±3
10-12 :31±5 27±3 26±3 30±7 21±1 22±6
Los resultados son la media ±DE de cinco experimentos realizados por duplicado.
Como se puede observar no existen diferencias significativas entre los valoresobtenidos con nnuestras Incubadas con CAP previamente al ensayo (P: preincubación>
y los encontrados en muestras incubadas en presencia del péptido durante las 4h que
dura la prueba <NP: no preincubaclón>. Esto sucede a las tres concentración de CRP
utilizadas y en los leucocitos de los tres órganos empleados.
80
Resultados
4.6. EstudIo de la especificidad de los efectos de losn e tiro p é p ti dos.
Una vez probados los electos de los péptidos de la familia de la bombesina sobre
la funcionalidad de las células Inmunocompetentes, se procedió a analizar la
especificidad de tales efectos. Para ello se incluyó en una serle de experimentos un
am)tagonista del receptor para la bombesina, (LeulS-y CH2NH-Leul4>-BN, y se
precedió también a estudiar la presencia de receptores en las células estudiadas.
4.6.1 - Utilización dei antagonista del receptor para la
bombosína.
Este estudio se efectué en dos pruebas: la capacidad quimioatrayente que
presentan estos neuropéptídos frente a macrófagos y linfocitos peritoneales y la
actividad NI< de leucocitos de órganos inmunocomnpetentes como el timo.
4.6.1.1. Efecto del antagonista en la capacidad quimloatrayente de
los neuropéptidos.
Se incubaron las células del peritoneo con el antagonista de la BN y los
n)européptidos (a la concentración que había demostrado ser la más efectiva, 10’0M>,
y se obtuvieron los resultados que se muestran en la fig 20 para macrófagos (parte
superior> y para linfocitos (parte inferior). Se observa corno la capacidad
quinlioatrayen)te de la bombesina y del ClIP se revierte en presencia del antagonista.
Se utilizó otro péptido que es un probado quimioatrayente para macrófagos y linfocitos,
el péptido formilado (FMLP>, corno control y al igual que el control sin péptidos, no
suf rió una reducción de su efecto quimioatrayente en presencia del antagonista de la
bomnbesina.
81
Resultados
2CCO
500’
1000-
500
o
2000
¶500
l000•
500
u
‘/
Control Doinbosina GflP FMLP
[5’tRT¡¡agonmsnW9
L2~só2maoOmlIGta
a
a
b o
ffi~iControl tlomboelmrn orn FMLP
Hg 20. Capacidad quimioatrayente de la concentración de 10-10 M de EN y CAP para
macrófagos (arriba> y para linfocitos (abajo> peritoneales en presencia <barras
sonnbreadas> y en ausencia <barras blancas> del antagonista de la EN. Se representa lamedia ±DE. de los valores obtenidos en 5 experimentos por duplicado. 8p<0,O1
respecto al control; b~<o,oi respecto a EN sin antagonista; cp<o,ol respecto a CAP
sin antagom)ista.
~fngou
-1o
-Hb
82
Resultados
4.6.1,2. Efecto del antagonista en la actividad NK.
llor otra parte, se probó el antagonista en ensayos de citotoxicidad de
leucoecitos de timo que fuero!) incubados con tres concentraciones de GRP <i08~
10.10 y 10.12 M> en presencia y en ausencia del antagonista.
% NK50
40
30
20
10
O
Hg 21. Porcentajes de lisis de la citotoxicidad natural, NK, de linfocitos de timo en
presencia de las tres concentraciones que se indican de GRPe incubados con o sin el
an)tagonista, Los valores son la media ±ELE. de 5 experImentos por duplicado.
8pc0,Ol con respecto al control; bpcqoi respecto a la concentración 10-lo M
de GF3P sin antagonista.
Como se aprecia por los resulatdos obtenidos <fig 21), tamnbién en este caso, el
efecto estimulador de la concentración de10wW M del GRP fue revertido en presencia
del antagonista.
83
o -8 -10 -12
GFlP <~o X M)
Resultados
4.6.2. Ensayos de unión al neuropéptido marcado.
Para determinar la presencia de receptores paralos neuropóptidos estudiados en
las células i!1I1)um¶ocompeterites, sobre las que se habla demostrado su acción, se trealizaron ensayos de unión al neuropéptido nuarcado <EN y ClIP>.
4.6.2.1. Unión a macréfagos peritoneales.
En la 1 ig 22 se muestran) los resultados obtenidos al incubar macrófagos
periton)oaios con) diversas concentraciones de EN, CAP y neurornedina C , así como
con un póptido ajeno a dicha famnilia, el neuropéptido ‘y’ <NPY) , en presencia de una
concentración) constante de UN marcada con 1261
,/
e-,
Bombesinae CAP
Neuromedina ONPY
1‘a.
0 12 it lO 9 8 7- log conoantraci6n rieuropéptldo (M)
Fig 22. Porcentajes de unión de 1251-EN a nnacrófagos peritoneales Incubados conlas concentraciones que se indican de EN, CAP, neuromnedina C y NP’?. Serepresentan) la nnedla respecto a la unión máxima (obtenida en ausencia deneuropéptido frío> de tres experimentos por triplicado.
Conno se puede observar, la bombesina se une a la membrana plasmática de los
macrófagos de forma específica ya que añadiendo un péptido sin similitud en su
secuencia amninoacidica a la bombesina no fue capaz de desplazar a este neuropéptido
marcado. En cambio si se observa desplazamiento de la unión en presencia de CAP y
en menor medida en presencia de neuromedina C.
84
Resultados
En la fi9 23 so n)uestran los resultados obtenidos al valorar en este caso el
desplazanniento de la unión de ClIP marcado, a n)acrófagos peritoneales.
rs ~ GAR~5. —6-— Neuromedina O
—O--— Bombesina—a— NPY
0 12 Ii 10 0 8 7•Iog concontraclón neuropáptído (M)
Flg 23. Porcentajes de unión de1251-GRF a macrófagos peritoneales incubados
con) las coI)centraciones que se indican de UN, GRP, neuromedina C y NPY. Serepresentan la nuedia respecte a la unión máxima (obtenida en ausencia de
neuropéptido frío> de tres experimentos por triplicado.
Do nuevo en este caso se observa el desplazamiento en la unión del CAP
marcado producido por la unión de este mismo neuropéptido sin marcar y también tras
la adición) de bombesina y neuromedina C. Tampoco en este caso el neuropéptido Y
fue capaz de desplazar la unión del CAP a los macréfagos.
De la representación de Scatchard de los datos obtenidos se identil loaron dos
tipos de receptores en macrófagos peritoneales uno de alta y otro de baja afinidad y se
calcularon) las constantes de afinidad. En el caso de la bombesina fueron: Kd=2,7±0,4
m)M y Kd=64,2±7,lnM.Para el ClIP fueron Kd=1,1±0,07nM y Kd=79,0±8,6nM. Así
mismo so calculé la concentración de sitios de unión que fueron 38,0±3,51 moi/106
células y 420,5±65,0 fmoi/106 células para la EN, y 6,0±1,0 fmol/106 células y
703,3±32,2fmol/106 células para el CAP.
65
:1
Resultados
4.6.2.2. Unión a linfocitos de ganglios axilares.
Al contrario que lo observado en macrófagos, les linfocitos no expresan
receptores para la bombesina ni para el CRP, a un nivel que puedan ser detectados por
la técnica de um)ión llevada a cabo. Los datos obtenidos en los experimentos de unión
que se llevare?) a cabo con linfocitos purificados de ganglios axilares se presentan en la
tabla 11.
TABLA 7. Porcentajes de unión) de neuropéptido marcado a linfocitos purificados adiferentes concentraciones do neuropéptido sin marcar
%unión
8
- log concentración
9 10
UN <M>
Ii 12
84±15 95±1 71±3 84±8 76±11
- leg concentración ClIP (M>
% unión
8 9 lO 11 12
80±5 89±4 71±4 70±5 78±1
Cada valor es la nnedia ±DE. de tres exporímentos realizados por triplicado.
Como se observa los porcentajes de unión del neuropéptido marcado:
bombesina o CAP, son siempre elevados e independientes de la concentración de
neuropéptido no marcado añadido al ensayo.
86
1r
u
/
1s
/
vi
Resultados
4.7. Efecto de los péptidos en poblaciones celulares purificadas.
Una voz comprobado que los tres n)européptidos objeto del presente estudio1presentaban) ti?) efecto estimulador sobre la funcionalidad de los macrófagos, de los ½
linfocitos y sobre la actividad citotóxica, y visto el carácter específico de esta acción, así
conro la carencia de m)iveies de receptores detectables, por las técnicas de unión, en
lim)fOOitOS, pasamnos a estudiar el efecto que estos neuropéptidos tienen en las
poblaciones celulares purificadas.
No olvidemos que los estudios realizados hasta el nnonnento sobre los efectos en
la lunción celular se han efectuado con la población leucocitaria total presente, tanto
fagocitos como linfocitos, aunque según el caso observamos los efectos en uno u otro
tipo celular.
La base cíe la separación leucocitaria ha sido la capacidad o no de adherencia a
sustrato. Puesto que los linfocitos U presentan esta capacidad al igual que los
macrólagos, utilizamos tripsina, como se describe en métodos, para purificar los
n)acrófagos.
4,7.1. Efecto comparado de los neuropéptidos sobre la función demacrófagos purificados del peritoneo y la suspensión peritonealcomplot a.
Se escogieron las des pruebas que por su metodología permitían este estudio: la
fagocitosis, que se realiza previa formación de una monocapa adherente sobre lasnnismas placas en las que se desarrolla posteriormente el ensayo y la citotoxicidad, que kde la misma forma se nealiza en placas de cultivo. 1 0
4.7.1.1. En fagocitosIs de iatex.Para estudiar el posible efecto diferencial de los neuropéptidos sobre los
macrólagos peritoneales en relación al total de la población adherente peritoneal se
escogió la prueba de ingestión de partículas inertes (bolas de latex) y se ensayé en
an)bas poblaciones. La metodología emnpleada en esta prueba permite purificar lavi
población de macrófagos peritoneales sobre las mismas placas MW donde se realizaposteriormente el ensayo fagocitico. t
En los resultados obtenidos, expuestos en la 1 ig 24 de la página siguiente, no se
observan diferencias significativas entre la estimulación de la fagocitosis producida por
el GRP en macrófagos purificados con respecto a la producida sobre la población
peritoneal adherente total.
87
Resultados
l.F.
800
700
600
500
400’
300-
200-
100-
OcoI)trol -8 —11
A
4’
1
-13
Fig 24. Número de bolas de latex fagocitadas por cien macrófagos (IF> incubados en
presencia de las concentraciones que se indican en abscisas, de ClIP, en la población
adherente peritoneal total (colunnnas blancas> y en macrófagos purificados <columna
rayada>. Los valores son la media ±O.E. de 5 experimentos por duplicado. ~cO,OO1
con respecto al control de células adherentes; 1p<0001. con respecto al control de
nuacrófagos.
41.1.2. En la actividad citotóxíca.En los siguientes experimentos, se estudió el posible efecto diferencial de los
péptidos sobre nuacrófagos purificados del peritoneo y la suspensión peritoneal total
en ensayos de citotoxicidad. Les resultados se presentan en la tabla 7.
Como se puede observar no se aprecian diferencias entre los efectos producidos
por los tres péptidos sobre la capacidad citotóxica de macrófagos purificados o de
muestras del peritoneo total.
88
O adherentesEJ macréfagos
a
a1 a
aLt nL
¡ ..
Resultados
TABLA 8. Efecto de tres concentraciones ¡notares de bonnbesina, ClIP yneuromodina C en el porcentaje de citotoxicídad natural de peritoneo completo y demuacrófagos l)Oritor¡eales purificados de ratones BALB/c usando células YAC-1 como
diaria.
Control Bombesina
io’~ lo-lo 10-12
P.Compioto 13±4 21±7 33~8a 18±5
Macrófagos 12±3 15±2 26±81 18±2
Control GRP
io’~ 10.10 10-12
P.Completo 13±4 21±4 30~11a 20±6
Macrófagos 12±3 16±4 ao±sl 19±3
Control Neuromedína O
lo-lO 10-12
P.Cempleto 13±4 19±5 3~8a 18±4
Macrólagos 12±3 16±6 24±71 15±4
Los valores son la media ±DE. de seis experimentos realizados por triplicado.a p~0.00l respecto a su correspondiente control; 1 p<0.00l respecto a su
correspondiente control.
1”It
/
o4
Y
‘‘rl
Ii89
RasuRados
4.7.2. Efecto comparado sobre muestras completas y purificadas de
linfocitos.
Se pretem)dia com)ocer si la acción moduladora de estos péptidos sobre la
funcionalidad del linfocito se ejercía directannente sobre él o a través de las células
accesorias adherentes, corno nnacrófagos. Para ello se estudiaron) los electos de estos
póptidos sobre la funcionalidad del linfocito en muestras completas y en muestras
doplecionadas de células accesorias y enriquezidas en linfocitos T. Las poblaciones
purificadas contenían) un 97% de células T según se connprobó por innnunodetecclón
con anti—lhy 1
41.2.1. Quimlotaxís.
En primer lugar se presentan los resultados obtenidos en cuanto al efecto del
GRP sobre la quimiotaxis en linfocitos peritoneales.
1500
1000
500
o
Hg 25. Indices de quimiotaxis de linfocitos obtenidos del peritoneo incubados con
GlIP (10’0M> nnantenidos en la suspensión peritoneal completa o purificados a partir
de la misma. Se representa la media ±D.E. de 7 experimentos realizados por
duplicado. *A~ycO,01 respecto al control sin neuropéptido.
90
1
/
3
.4
,/
.1
Y 4itLi
control GRP
Resultados t
En la hg 25 se muestran) íes indices de quimiotaxis de linfocitos obtenidos delw
peritoneo en respuesta a la incubación con GRP a la concentración que resulté ser la
más electiva, <10l0 M). Para estudiar la forma de actuación del neuropéptido, se
on)sayó su efecto en linfocitos mantenidos en la suspensión peritoneal completa(P.Totai> y en iin)focitos aislados del peritoneo (L. purificados).
Se observa la desaparición) del efecto estimulador de la quimiotaxis producido por
el GPP a la concentración de 10-10 M, cuando los linfocitos están purificados.
Por otra parte, en la 1 ig 26 se exponen comparadarnente, los resultados
obtenidos al incubar con GRP, a tres concentraciones, muestras de leucocitos‘¾
obtenidos de bazo, timo y ganglios axilares o linfocitos purificados de dichos órganos.
No se observa ningún efecto del neuropéptido sobre la quimiotaxis de linfocitos1
purificados no adherentes, mayoritariamente linfocitos T, de órganos linfoides. El ligeroefecto estimulador que se observa a la concentración de 10.10 M de GRP sobre
lim)focitos en suspensiones no purificadas de ganglios axilares desaparece al estar los
lin)focilos purificados y también, el efecto inhibidor encontrado en timo con esa misma
concem)tracióm) de GRP, se pierde cuando la quinniotaxis se analiza en linfocitos
purificados de dicho órgano.
,1
>1Nvi
91
Resultados
1000
¶300
600”
40<»
20<»
o ‘ —, “, — ‘.,‘ — —‘r — —
0 ‘8 -10 ‘12
1200
800’
.100’
1800
200’
¡300
400’
o
L
0 ‘8 ‘lO ‘¶2
Hg 26. índices de qulmiotaxis de linfocitos obtenidos de ganglios axilares, bazo ytimo incubados con las concentraciones que se indican de GlIP mantenidos en lasusponsión celular completa o purificados a partir de la misma. Se representa la media±DE. de 5 experimentos realizados por dupllcadO.* p<0.05 respecto a su control.
92
Qanollo
It 5’-
A
.1
r
luxo
121
r.
2
0 .8 ‘¶0 ‘12
í’~’rtwi
1j~I21
Resultados
4.7.2.2. Linfoproliferación. 1/
Una vez probados los efectos nvtogénicos de los neuropéptidos de la familia de la
bombesina sobre la linfoprolileración, procedimos a estudiar los efectos de los
n)europóptidos sobro dicha capacidad linfoide en muestras enriquecidas en linfocitos
1. Así se puede determinar si esta acción moduladora de los neuropéptidos se lleva a
cabo directamente sobre el lim)focito o a través de las células adherentes, como
macréfagos. Para ello, lim)focitos no adherentes aislados de suspensiones celulares
obtenidas do órganos limifoides: bazo, timo y ganglios axilares, fueron Incubados con
bonnbesina, GflP y neuronnedina O a la concentraciónlo10 M que resulté ser la más
efectiva en los ensayos previos de preliferación. De este nnodo, se puede conocer el
efecto en la proliferaclón espontánea, en ausencia de mitógeno, sobre los lin)focitos T.
Para determinar el electo de los neuropéptidos sobre la proliferación de los linfocitos T
purificados emj presencia de mitógeno se incorporó Con A a concentración de lpg 1 ml.
Los resultados comparados entre muestras completas de leucocitos y las
¡nuestras de limílecitos purilicados se presentan en las fig 27 y 26 en ausencia y en
presencia de Con A, respectivamente. Los valores se expresan conno porcentajes de
prolil oración respecto a controles sin) neuropéptído ni mitógeno y cuyos valores en
c.p.m. fueromí 816 ±211, 615 ±120y 192 ±60 en ganglio, bazo y timo,
resl)ectivamento, CI) la población leucocitica total, y 212 ±49, 187 ±56y 200 ±31 en
muestras de lim)fecitos 1 purificados.
No se obsenvó efecto do los neuropéptidos en la proliferación espontánea (Vg 27>1
ni en la inducida por Con A (hg 28) cuando los linfocilos se encontraban purificados, lot
que se representa en la figua como linfocitos no adherentes” frente a “leucocitos’
que representa la población total de leucocitos obtenida de los órganos.
4.7.2.3. Capacidad citotóxica.4
El sIguiente paso fue el estudio de los posibles efectos de los péptidos sobre la.4
actividad citotóxica mrntural y sobre la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos
(AOCO) de linfocitos Y purificados por adherencia comparado con lo que ocurría en 1muestras completas obtenidas de órganos linfoides. Como puede observarse en las fig
29, 30 y ~1y en las tablas 0,10 y 11, ninguno de los tres péptidos mantuvieron sus
efectos estimnuiadores cuando las muestras consistían en linfocitos T purificados, tanto
en la citotoxicidad Ni< corno en la ADCC.
¡ i~t
93
Resultados
¶00
200
1 00
o
500
200
loo’
o
5
¶00
m¶ohlbo.Int Qn’, H~urorn.dIns O
[~J~s~.dhor!n.
fi ~~~~1flon~booina QI1P Hrngom,dlna O
Hg 27. PorcentaJes de prolil oración de linfocitos de ganglio, bazo y timoincubados con EN, GRP o neuromedina 0 <10.10 M> en la suspensión leucociticatotal y en los linfocitos T purificados (no adherentes). Se representan la media ±
D.E.de los resultados de 8 experimentos por triplicado. b~<o,o1.5p<o,ooí
respecto al valor control en la población total de ieucocitos.*pco,05; **p<0,01~***p<o,001 respecto al valor en leucocitos con los respectivos neuropéptidos.
94
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Hg 28. Porcentajes do proliferación de linfocitos de ganglio, bazo y timo enrespuesta a Con A <lj,g/ml> e incubados con EN, GRP o neuromedina C (lOlO M> en lasuspensiómí leucocitíca total y en los linfocitos T purificados <no adherentes). Serepresentan la media ±D. E.de los resultados de 8 experimentos por triplicado.bp.co,oí: apco 001 respecto al valor control en la población total de leucocitos.*p<o 05 ***p<o,ool respecto al valor en leucocitos con los neuropéptidos
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Fig 29.Porcentajes de citotoxicidad natural de la suspensión leucocitica total y delos linfocitos T purificados <no adherentes> de ganglio, bazo y timo incubados con EN alas concentraciones que se Indican. Se representan la media ±DEde los resultadosde a experimentos por triplicado. ap<oooí ;cp<0,05, respecto al valor control en lapoblación de leucocitos.*p<O,
0s **pcO 01. ***pco,001 respecto al valor enleucocitos con los respectivos neuropéptidos.
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FIg 30.Porcentajes de citotoxicidad natural de la suspensión leucoeltica total y delos linfocitos T purificados (no adherentes> de ganglio, bazo y timo incubados con GRPa las concentracIones que se indican. Se representan la media * D.E.de los resultadosde O experimentos por triplicado. apco,001 ;
0p<O,05, respecto al valor control en lapoblación de leucocitos.**pcO,0U ***p~O,OOl respecto al valor en leucocitos conlos respectivos neuropéptidos.
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Flg 31. Porcentajes de citotoxicidad natural de la suspensión leucocítica tOtal y delos linfocitos 1 purificados (no adherentes) de ganglio, bazo y timo incubados conneuromodino O a las concentraciones que se indican. Se representan la media ±DEdo los resultados de 8 experimentos por triplicado. 8pcO,0OI; bpco,oí; 0pcO,05,respecto al valor control en la población de leucocitos.*p<0,05; **p<0 01**‘kpco,ool respecto al valer en leucoclios con los respectivos neuropéptidos.
98
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1.
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1
‘YL
Resultados
TABLA 9. Efecto de tres concentraciones molares de bombesina, GlIP ynetiremodina C en el porcentaje de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo(ADCC> (le leucocitos totales y de linfocitos T purificados de ganglios axilares deratones E3ALU/c usando células 1<862 como diana y una dilución 1:500 de anticuerpo.
Control Bombesina
loe 10-10 10l2
Leucocitos 19±1 21±3 29±la 20±2
lInfocitos 1’ 16±3 15±1 15±1 16±2
Control GFIP
íoe 10-10 10M2
LeucocItos 19±1 23±1 32~4a 23±5
Linfocitos T 1 6±3 1 4±4 1 7±2 1 7±1
Control Neuromedina O
íoe 10-10 1012
Leucocitos 19±1 19±1 29~1a 21±5
Linfocitos T 16±3 16±3 13±4 14±2
Los valores son la media ±D.E. de cinco experimentos realizados por duplicado.a pco.00l respecto a su control.
99
4>~
1
1
0
1
jirL
1~
2
1.
Resultados
TABLA 10. Efecto do tras concentraciones molares de bombesina, GRP yneuromodina G en ni porcontajo do citotoxlcidad celular dependiente de anticuerpo<ADCC) de leucocitos totales y do linfocitos T purificados do bazo de ratones RALB/cLisLindo células K562 corno diana y una dilucIón 1:500 de anticuerpo.
Control Bombesína
108 10-lO 10-12
Leucocitos 19±1 23±2 26~5a 23±4
Linfociles T 17±1 19±5 18±5 21±5
Control GAP
10-10 10-12
teucoeltos 19±1 25±8 3í±e~ 23±4
Linfocitos T 17±1 17±2 20±3 20±1
Control Neuromedina O
loa 10-10 10-12
Leucocitos 19±1 23±7 29±40 25±7
Linfocitos T 17±1 16±3 18±4 16±3
Los valores son la rnodla±D.E. de cinco experimentos realizados por duplicado.
~ p<0.O01 respecto a su control.
100
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4
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j~~2
1
J
2
Ef
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Resultados
TABLA 11. Elocto de tres concentraciones molares de bornbesina, GRP y:iauromad¡na O en el porcentaje de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo(ADCC) <le leucocitos totales y de linfocitos T purilicados de timo de ratones BALRIctisando células K562 como diaria y una dilución 1:500 de anticuerpo.
Control Bombesina
1O~ 10.10
Leucociton 1 7±2 23±2 2G±2~ 21±1
LInlocitos 1 15±1 18±3 14±4 17±2
Control GRP
10-8 10-10 10-12
LeucocItos 17±2 23±2 20±3~ 20±2
linfocitos 1 1 8±1 13±2 1 5±2 1 4±4
Control Neuromedina O
l0-~ 10-12
leucocitos 17±2 17±1 25±28 20±1
Linfocitos T 15±1 14±2 15±4 14±2
Los valores son la rnedia±DE. de cinco experimentos realizados por duplicado.~ pcO.001 respecto a su control.
101
4
Resultados
4 .5. Producción de un factor par las células adherentes,
responsable do los efectos de los neuropéptídos en la función
linfoIde.
Para profundizar en la forma de actuación de los neuropéptidos sobre la
funclonalíciad de los lInfocitos, realIzamos unos ensayos para determinar si era
noccanrin una interacción de las células: linfocito y adherente, o si la información se
transmitía a través do algún mediador soluble producido por estas últimas, que podrían
ser linlocitos adherentes, prIoritariamente linfocitos B, o macrófagos.
Para ello se ensayé el efecto dei GRP a la concentración más efectiva, 10~ M, en
la qulmiotaxís do linlocitos mantenidos en la suspensión peritoneal completa (P.Total) y
cíe linfocitos T purilicados del peritoneo <L. purificados) y se ensayé un tercer grupo
consistente en linlocitos aislados del peritoneo a los que se añadió el sobrenadante de
una suspon’dón de cólulas adherentes del peritoneo (¡nacrófagos y linfocitos B) o de
una suspensión de macrólagos purificados, que fue previamente incubada con GRP
(10.10 M).
1500
1000
500
o
Hg 32. Indicen de quimiotaxís de linfocitos obtenidos dei peritoneo purificados y sin
purificar (P.Totai> Incubados con GRP (10.10 M>, o con el sobrenadante de células
adherentes e de macráfagos, peritoneales incubados cori el neuropépetído. Se
representa la medía ± [YE,de 7 experImentos realizados por duplicado. *p<o,O5;**pcO.0I respecto al control sin neuropéptido.
1’. Total L. PurIfIcados
102
Resultados
Los resultados muestran que el efecto del GRP se conserva en muestras
purificadas de linfocitos a las que se añadieron los sobrenadantes de la suspensIón
porítoneal completa del peritoneo incubada en presencia de GRP. Este hecho apunta
la posibilidad de que la señal del neuropéptido, en este caso de estimulacIón, pase a
tos linfocitos a través de un factor soluble que seria secretado por las células
adherentes, probablemente macrófagos, dado que los resultados no varian
significativamente si so añado el sobrenadente de macrófagos purificados o de la
población adherente total.
103
3
Resultados
4.9, MecanIsmos da acción Intracelular de los tres neuropéptidos:
Bombesina, GRP y Neuromedina C.
Para descubrir que tipo de señales intracelulares estaban implicadas en la
activación do las células inmunes por los neuropóptidos de la familia de la bombesina,
decidimos estudiar los principales segundos mensa]eros de las dos v!as clásicas de
transducción de señales: la ruta de la adenilato ciclasa y la de los Inositoles fosfato, para
ollo valoramos los niveles de AMPc intracelular y los de 1,4,5-Inositol trifosfato <IP3>, así
como la subsecuente activacIón de la proteína quinasa O.
4.9.1. NIveles do AMPo intracelular.
La valoración (le los niveles de AMPo intracelutarse efectuó en macrófagos
porilonoalos y en linlocitos (le ganglios axilares.
4,9.1,1. En mocrófagos.
En la tabla 12 se muestran los niveles Intracelulares de AMPo obtenidos de
mucrófagos incubados con bombesina, GRP y neuromedina O a las concentraciones
que se indican <lo”9, 1010y 10-li M> ya tres tiempos 30, COy 120 segundos.
Tabla 12. Niveles da AMPo (prnoil 108 células)Incubados con bombesina, GRP y neuromedina O.
en macrófagos peritoneales
Pompo Concentración Control EN GRP Neuromedina O
30 010.0 M10.10 M10.11 M
00 0i0~ MI0’10M10.11 M
120 0o-9 M
10.10 M10.11 M
Se representa la inedia ±respecto a los valores control.
32 ±4
21 ±8
30 ±5
28 ±325 ±4~29 ±3
29 ±426 ±330 ±4
29 ±320 ±430 § 4
22±5’22±4”25±6
26 ±528 ±630 ±8
28 ‘± 429±528±4
24 ±3’24 ~426 ±5
26±528 ±427±4
30±‘129 ±527 ±5
D.E. de 4 experimentos por dupiicade.’p<0,Ob ~p-c0,0.l‘4)
104
3
Resultados
So obsorva una reducción significativa de los niveles intracelulares de AMPc con
los tres péptidos a los 30s de incubación y con la concentración de lo-lo M. Con CAP
y neuromodina O también aparece esa reduccIón a ío9 M.
4.9.1.2. En linfocitos
En la tabla 13 se exponen los datos obtenidos al valorar los niveles de AMPc en
linfocitos de ganglios axilares incubados con bombesína, GRP y neuromedina O.
Tabla 13. Nivelas de AMPo (pmotl 108 células) en linfocitos de ganglios axilaresincubados cori bornbosina, GRP y neurornedina O.
Tiempo Concentración control (3M GRP Neurornedina O
80 0 03±12 — —
io~ M 61 ±10’,, 55±10... 67±12”’1CY10M 87±11”’ 55±9”’ 67±12”’10-11 M 70±9”’ 54±7”’ 60±8”’
60 0 79±11 —
10-9M .~. 77±12 79±13 75±1110”10M 79±10 79±14 74±11lodlM 79±9 80±14 77±12
120 0 79±9l0~M 76±12 80±12 76±111010M -. 78±9 78±12 77±111011M .~ 77±12 78±12 77±10
So representa la medía ±
al valor control.
[YE.de 4 experimentos por duplicado. “‘p~0,OOl respecto
Los tres neuropéptidos producen una rápida disminución muy significativa en los
niveles Intracelulares de AMPc. Para comprobar que la medida era realizada
correctamente añadirnos el páptido intestinal vasoactivo (VIP> para el que está
demostrada la elevación de los niveles de AMPo. Los valores obtenidos al añadir VIP
<108M> fueron: 234 ±37prnol/ 108 células a SOs (p~0,C0l>; 129 ±25a GOs <p~,0l> y
07±18a 120s-
105
Resultados
4.9.2. Niveles de IP3.La valoración de los niveles de IP3 se llevó a cabo en macrófagos peritoneales así
como en linfocitos de ganglios axilares.
4.9.21. En macrétúgos.
En la tabla 14 se muestran Los resultados obtenidos en cuanto a los niveles
intracelulares de IP3 expresados en prnollíO8 macrófagos incubados con bombesína,
(3RP y neuromedina Calas concentraciones que se indican <íO~, 1010y lo-li> ya
tres tiempos 30, COy 120 e.
Tabla 14. Niveles do IP3 (pmol/ lo
8 células> en macrófagos peritoneales incubadoscon bombesina, CiAP y neuroniedina O.
Tiempo Concentración Ocnlro4 SN GRP Neuromedina O
30 0 16±5 — —
109M 23±5 22±5 23±5
10”~0M 23±5 23±6 23±5
1&1M 20±6 22±6 21±5
60 0 13±4 —
10”9M 17±5 18±5’ 16±5’
1010M 24±6” 23±5~ 24±6”
1011M 22±6’ 19±0’ 20±6’
120 0 10±3 —
109M 13±3 12±4 11±3
I0-10M 13±4 12±3 12±2
10”11M 9±2 9±2 10±3
Se representa la media ±respecto a los valores control.
D.E. dc 4 experimentos por duptícado.p<0.05; “p<0,Ol
Al contrario de lo que ocurrfa con los niveles de AMPc, se observó un incremento
sIgnIficativo de los niveles intracelulares de IP3 en macrófagos peritoneales, con los
tres póptidos a los 60 s de incubación y a la concentración de 10.10 M, y con
bombesina también a la do ío-9 M.
106
Rastillados
4.9.2.2. En linfocitos.
En la tabla 15 se recogen los resultados obtenidos al valorar los niveles de IP3 en
leucocitos de ganglios axilares.
Tabla 15. NIveles de IP3 (pmol/ io8 células> en
incubados con bombesina, GRP y neuromedina O.linfocitos de ganglios axilares
Tiempo Concentración Control EN GRP Neurornedina O
30 0 29±6 — —
109M 35±4 32±5 32±6
10-10M 85±5’ 37±6’ 37±5’
10”11M 35±5’ 36±6’ 38±6”
60 0 28±5 —
109M 38±6” 37±6 37±5”
10-10M 41 ±5”’ 40±5”’ 40±5”’
10>~1M 35±5’ 34±5’ 30±4
120 0 29±7 —
10~M 30±7 30±5 31±7
1010M 29±4 31±6 30±6
1011M . 31±6 31±7 30±5
Se representa la media ±
respecto a los valores control.
DE. de 5 experimentos por duplioado.’p<O,05; “p<0,0l
También en la población linfocitica do ganglios axilares, los tres neuropéptidos
Incrementaron los niveles do IP3 a los 30 y 60 s. Dándose el mayor incremento a los
Gas y con la concentraciónlo10 M de los tres péptidos.
107
Resultados
4.9.3. Actividad Proteína quinasa O.
Además de 1P3, la hidrólisis de fosfolipidos de membrana genera diacilgílcerol,
que a su vez activa la proteina quinasa O favoreciendo su traslocación del citosol a la
membrana, lo que pasamos a valorar a continuación.
4.9,3.1. Actividad PKC en leucocitos.
La implicación de la PKC en la transducción de la señal de los neuropóptidos fue
confirmada valorando la actividad de la enzima en las células inmunocompetentes
estudiadas: población de leucocitos de ganglios axilares, y macrófagos y linfocitos
ítj rificados.
Tabla 16. Actividad proteína kinasa O (pmollmin/106 células) en membranas ycitosol de leucocitos obtenidos de ganglIos axilares.
Sustancio Concentración Actividad PKO
Membranas Oltosol
Control ... S.l ±1,2 10,3 ±1,0PMA 50 ng! mi 15,3±3,70 10,0 ±1,1
Con A 1 pglml 14,1 ±usa 9,7±2,4
Bombesina ío-9 M 8,7±2,288,6~o,8a
1010M 15,5 ±140 10,5 ±1,7
10”~ 1M 12,6±2.O~’ 9,7±1,7
CLIP 109M 7,3±1,10 78±168
1010M150113a 9,6±1,7
1011M 11,6±1,90 8,5±1.6
Neuromedina 0 10-9 M 8,5 ±1,08
8
8,6±1,3
10-bM 12,6±2,38 10,4±1,810-blM 98±148 77±1,28
Los resultados son»pc0 001 respecto a
la inedia ±
sus controles.
IlE. de 5 experImentos realizados por duplicado~
108
Resultados
En la tabla 16 se muestran los resuiatados obtenidos al valorar la actividad PKC en
leucocitos obtenidos de ganglios axilares, como órgano representativo. Corno se
observa, los tres neuropóptidos estimulan por igual la actividad PKC alcanzando
valores próximos a los obtenidos con PMA, conocido activador de ésta enzima.
Se realizaron algunas pruebas añadiendo retinal como probado inhibidor de la
activación de la PKC producida por PMA. Las muestras incubadas con PMA + retinal
dieron una actividad de 6,8 ±1,9 significativamente menor que la obtenida con PMA
(pcO,001). Así mismo se incubaron muestras con GRP + retinal y también la
estimulación de la actividad PKO por GRP fue reducida significativamente (p~0,0I) en
presencia do retinal dando tina actividad 9,0±1,1 pmol/ mini 1~ células.
4.9.3.2. ActIvidad PKO en maorc5fagos y lInfocitos purificados.
En la siguiente tabla se exponen los resultados obtenidos en ensayos de
actividad PKC en poblaciones celulares purificadas: macrófagos del peritoneo y
linfocitos de ganglios axilares.
Tabla 17. Actividad proteína kinasa O <pmol/niin/106 células) en membranas y
citosol de macrófagos purilicados de peritoneo y linfocitos purificados obtenidos de
ganglios axilares.
Tratamiento Macrófagos Linfocitos
Membranas Citosol Membranas Citosol
Control 5,5±0,7 11,3±1,3 4,7±0,4 9,3±1,8
PMA <SOng/rnl) 21,5 ~15b 7,2± 13,6
PMA + retinal <2OpM) 8,1 ±2,3* 8,8±2,1 5,1 ±1,0* 9,2±1.4*
anr’ (ío-~O M) 13,5 ±2,3b 5,2~2,1b 1130±1,9 6,2
GflP + retinal 7,9 ±2,4* 8,4±2,3* 7,2±1,7* 9,2 ±1,7*
Los resultados son la media ±DE. de 5 experimentos realizadosrespecto a sus controles. * pcO,oí respecto a los valores sin
por duplicado.
retinal.
109
Resultados
En las poblaciones purificadas se sigue observando la activación de la PKC por el
<3flP a niveles similares. Tanto el efecto del PMA corno el del CAP se encuentra
rovortido hasta casi alcanzar los valores controles, en presencia de retinal.
En la fig 32 se exponen de forma comparada los resultados en cuanto a la
activación de la proteína kinasa O por PMA y CAP (10-lo M> en macréfagos purificados
de perifoneo, linfocitos T y leucocitos totales de ganglios axilares.
30
.4’o
? 20
‘o
o
Hg 33. Actividad PKO en pmol/ mini 106 células en muestras de macrófagos
peritoneales, linfocitos T y leucocitos totales de ganglios axilares en respuesta a PMA
(50 ng/mi) y a CAP (10<~0 M>. Los valores son la inedia ±D.E. deS experimentos porduplicado. ‘pco,OOI respecto al valor con PMA. ap~O,Oo1; cp~O~05 respecto al valoren macrófagos
En las tres poblaciones celulares se produjo un significativo aumento (pcOOOI)
de la actividad proteína kinasa O tras la incubación con el CAP. En los leucocitos y
linfocitos 1 purifIcados de ganglios axilares esta mayor actividad enzimática llega a ser
del mismo nivel que el alcanzado con el PMA.
control PMA 0FF’
110
5. DISCUSION
Discusión
5.0 ¡SC US ION
La existencia de tina estrecha interrelación entre los sistemas nervioso e inmune sesustonta a nivel anatómIco con la presencia de fibras nerviosas en órganos linfoIdesprimarios y secundarios. Muchas de estas fibras que acompañan a los vasossanguíneos y están intímamonte asociadas con varios tipos celulares como linfocitos,macrótagos y mastocitos, son peptidérgicas habiéndose encontrado en ellasimmunoreactividad para diversos neuropéptidos como la sustancia P, VIP o el NPY(Falten y cols., 1985 y 1988>. Además de estos hechos, en las células inmunes se handetectado receptores para toda una serie de neuropéptidos y se han comprobado losefectos moduladores do algunos de ellos sobre la respuesta Inmune. Otro dato queapoya la compleja inlerrelación entre los sistemas reguladores es la presencia deneuropóplidos en órganos y células inmunes (Blalook y cola., 1988). Hechos todosellos que ya han sido comentados más ampliamente en la introducción de estamemoria.
Por otra parte, en las terminaciones nerviosas que inervan el tracto digestivo, seliberan muchos de esos neuropéptídos, y si tenemos presente el Importantecomponente inmune en esta localización (Bienenstock y cols., 1988: Dockray y cola.,1979) parece evidente la modulación que podrían ejercer sobre esas células inmunesdichos neuropéptidos.
Como ya se ha comentado en la introducción, los efectos moduladores que, sobrela función inmune, tiene uno do los grupos de neuropéptidos asociados al tractodigestivo, el de la larnilia de la bombesína, han sido muy poco estudiados y de forma
puntual. Entre estos estudios y dentro del marco de la relación neuroendocrina-inmune, el hecho de que la BN se comporto como mitógeno para determinadas lineascelulares, especialmente en células transformadas (Rozengurt y Sinnett-Smith, 1983>,y como agenle quimioatrayente para linfocitos (Moere y cola., 1984> y monocitos (Ruff ycols., 1985>, aumentó nuestro interés por relizar un estudio más completo sobre estafamilia de péptídos.
Se eligió como animal de experimentación el ratón <mus musculus), por ser en elque mejor estandarizados se encuentran los estudios inmunológicos Además, se tratade una especie en la cual se dispone de cepas singénicas perfectamente “Upadas” encuanto a su genética y expresión de antígenos implicados en la respuesta Inmune.
Las pruebas fueron realizadas in vitre, lo que permitió conocer los efectos de losneuropéptidos sobre células aisladas y por tanto, sin Interferencias de otros sustancias
lii
Discusión
como hormonas o metabolitos producidos por otros elementos sisternicos quepudieran enmascarar o alterar los resultados.
Los neurepóptidos han sido ensayados utilizando un rango de concentracIonesque van desde la mayor de 10~ M a la menor de í0í4 M en graduación de 10-1 M-tEsto rango permite estudiar por una parte los efectos que las mayores cantidades deles póptidos, a un nivel farmacológico, o bien conseguidas fisiológicamente en lasproximidades de la terminación nerviosa secretora puedan tener sobre las célulasInniunocompetentes que nos ocupan. De hecho, otros neuropéptídos se hanencentrado a niveles nanomolares en las terminaciones nerviosas como sucede con elVIP <Fahronkrug.1980>. Las concentraciones intermedias son aquellas a las que losneuropóplidos pueden encontrarse en lugares algo más alejados de la termInación enla que so liberan y a la que pueden llegar a los fagocitos tisulares. En este rangopueden detectarso en plasme o en otros líquidos corporales <Hernanz y cois., 1989>.Las concentraciones en el rango de pmolar se han encontrado para el caso de lasomatostatina en liquido cerebroespinal (Reichlin, 1983)- Las concentracionesmenores utilizadas (10-14 - 10.13 M> suponen un rango de extrema dilucIón a la quenormalmente no se van a encontrar esos péptidos Pi vivo. Así, en a mayoría de lostrabajos existentes que estudien el efecto de neuropéptidos sobre alguna función dela respuesta inmune, se utIlizan concentraciones que se encuentran entre lasescogidas por nosotros. Payan y cols.(1984) utilizan concentraciones de somatostatinade 10~ a 10”13My Mascarda ycols.(1984>cie 10-88 1014M. Goldman ycolt<1983)estudian el efecto de la neurotensina en el proceso fagocitico con concentraciones deío”5 a ío~~ M. Rozongurt y cols.<1983) utilizan bombesina a concentraciones de itT
a 10.8 M para estudiar su efecto mitogénícoLI estudio del efecto inmunomodulador de esta familia de neuropéptidos se llevó a
cabo en los dos principales tipos de células inmunocompetentes, por una parte, losmacrófagos, como representantes por excelencia de las células fagocíticas, y por otrolado, los linfocitos, pieza clave en la respuesta inmune específica. Ambas son lascélulas esencIales del sistema Inmunológico y de gran importancia en el mantenimientocíe la homeostasla general del organismo (Paul, 1989>. También se incluyó el estudiode otras células básicas en la defensa antitumoral, las NK (Trtnchierí, 1989).
Los macrófagos desempeñan funciones inespecificas, como lo es su papel en larespuesta inflamatoria. No obstante, también desarrollan acciones especfflcas decolaboración con otras células inmunes, secretando factores moduladores, y así mismoactúan corno células presentadoras de antígenos (APO), exponiendo en susmembranas el resultado del procesamiento del antígeno que han relizado, en unióncon moléculas de histocompatibilidad, permitiendo así que tenga lugar la respuestaespecífica de la célula T <Delovich y cols., 1988>. La mayor parte de estas funciones decolaboración o como célula electora se basan en última instancia en la gran capacidadfagocilica de estas células <Unanue y Alíen, 1987). Entre tas diferentes poblaciones en
112
Discusión
las que puede encontrarse este tipo celular, se eligió la población peritoneal en base asu (noii disponibilidad y por ser buenos representantes de otras poblaciones tisularesde macrófagos (Unanue y cola., 1909). Además, es esta una población muy estudiada
por nosotros y de la que se tiene tina metodolog(a perfectamente estandarizada ydisoñada por nuestro grupo <De la fuente y cols., 1985; Nuñez y cois., 1989; De laFuente y cola., 1990)
Entre los linfocitos, los linfocitos T pueden actuar como células que al reconocer eldeterminante antigénico de origen exógeno presentado por la APO, proliferan ysecretan citocinas que permiten la respuesta de otras células inmunes, así come sercilelóxicas frente a las células en las que recococen un determinante antigénicoextraño de origen endógeno <Hodes, 1989). Los linfocitos, objeto de estudio, fueronobtenidos do diversas fuentes, Del timo, como órgano linfoide central (Andersen,1990>. del bazo, órgano linfoide periférico pero hematopoyético en el ratón <Andersen.1990> y de los ganglios axilares, como representativos de los órganos linfoides
periféricos <Andersen, 1990).Nuestro primer planteamiento fue estudiar los posibles efectos de los
neuropóptidos elegidos sobre las funciones más representativas de cada uno de rostipos celulares comentados: macrófagos, linfocitos y células NK. En los macrófagos elproceso fagocitico, en los linfocitos su capacidad de migración y respuesta proliferativay en las células NK su capacidad cítotóxica natural.
lEn relación a los niacrófagos se estudian todas y cada una de las diferentes etapasdel proceso fagocitíco que tienen lugar in vivo : la adherencia a sustrato como pasoprevio a la migración de la célula hacia el foco de infección, donde se produce laingestIón y por último la destrucción del material feocitado. La modulación de todasestas funciones por los neuropéptídos de la familia de la EN no es conocida, aunque sellenen datos sobre la capacidad quimioatrayente de la EN en monocitos humanos (Ruffy cola., 198É3> y sobre la emisión de quimioluminiscencia, como medida de la mayorcapacidad de destrucción en macrólagos murinos.(Jln y cola, 1990>.
En cuanto a los linfocitos, el efecto de estos neuropéptidos en su capacidadmigratoria es desconocida y de forma muy puntual se ha indicado su papel estimuladorde la proliferación (Krco y cola., 1986>.
En cuanlo al efecto de estos neuropéptidos en la función NK, según un estudioreciento en experimenlos Pi vitre e it, vivo en humanos, la EN y péptidos relacionadosestimulan la actividad cítotóxica natural <NK> frente a células tumorales <Van Tol y cola.,1990 y 1991>. Otra actividad citotóxica, la ADOO, que se ha planteado en el presenteestudio, no ha sido abordada en cuanto a su modulación por estos neurepéptidos.
Una vez comprobados los efectos de la EN, CAP y neuromedina O en las diversasfunciones indicadas y el hacho de que no era necesaria la presencia de los mismos a lolargo de todo el proceso sino unícamente una incubación previa, pare intentar explicaralgunos de los resultados obtenidos pasamos a valorar si posible efecto de estosneuropéplidos sobre la secreción de interleucínas, en concreto de IL-1 por parte de los
113
Discusión
macrólagos y do iL-2 por linfocitos. De hecho existía un trabajo en el que se muestra unefecto inhibidor do la ON sobre la proliferación de células CTLL-2 inducida por IL-2 (Finl=y cois., 1988>.
Una vez detectados los efectos, era necesario probar la especificidad de losmismos para lo cual nos servimos de un antagonista del receptor para la BN, <Leu13-ip-CII
2NH-Leu14)-BN, de demostrada acción como tal (Coy y cois., 1988>. Además no se
habla estudiado aún la posible existencia de receptores para estos neuropéptidos encélulas inunes. Si bien se hablan encontrado en otros sistemas (Zachary y Rozengurt,1985; Naldiní y cols., 1990; Gattey y cels, 1991; Staley y cols., 1993). Por esorealizamos ensayos de unión específica con EN y CRP en macrófages y linfocitos.
A la luz de los resultados obtenidos hasta este momento, se nos planteaba laposibilidad de que estos neuropóptidos actuaran sobre los linfocitos indirectamente, através de las cólulas adherentes, principalmente macrófagos. Así, realizamos ensayosen poblaciones purificadas por adherencia, que corroboraron nuestra hipótesis. Dandoun paso más quisimos averiguar si esta mediación se llevaba a cabo por la interaccióncelular directa entre linfocito y macrófago o bien por algun factor secretado por esteúltimo.
Por úllimo analizamos los mecanismos de acción a nivel intracelular seguidos porestos neuropéptidos y responsables de los electos observadosen las células inmunesestuchadas.
5.1. Efecto do los neuropéptídos de la famIlIa de la bombesínasobre el proceso fagocitico do macrófagos peritoneales murinos.
Cada una de las etapas indicadas del proceso fagocitico en las que ha sidoestudiado el elote de los tres neuropéptidos de la familia de la bombesina, representaun aspecto concreto de la activación de la célula fagocitica, y pasaremos a discutir losresultados separadamente, siguiendo dichas etapas.
Como ya ha sido indicado, los neuropóptidos se han utilizando en concentraciones
que van desde 100 M a 10.14 M. Este amplio rango de concentraciones incluye las
utilizadas por otros autores, corno fluff y cola. <1985) que estudiaron los efectos sobre
la quimiotaxis en monocitos de concentraciones de 10.8 a 10.14 M de EN.
De los resultados obtenidos podemos deducir, que los tres neuropéptidos estiulan
In vitro el proceso facjocitico del macrófago sin apenas diferencias significativas entre
ellos. idénticas capacidades para la EN y el GRP ya hablan sido observadas con
anterioridad en la consecución de otros efectos biológicos como la secreción hormonal
(Mc Donaid y cois., 1983: Spindel, 1986>. Este hecho sugiere que los receptores en
fagocitos para GRP deben tener afinidad muy semejante para SN o neuromedina 0,10
cual era esperabie si tenemos en cuenta que la secuencia aminoacidica por la cual se
114
Discusión
unen al receptor en otros sistemas es la parte común de la molécula para los tresneuropéptidos (Sinnett-Smith y cols., 1990>. En algunos cases encontramos un mayor
efecto para la molécula del GRP en relación a la BN y la neuromedina O, lo cual pareceindicar que los diecisiete aminoácidos del extremo amino-terminal de la molécula de
GRP (ausentes en los otros dos péptidos) juegan un papel importante en la activación
celular. Hecho este que también ha sido corroborado por otros autores (Hetcher y
cola., 1983; Que y cola., 1987).
5.1.1 Adherencia.
Es la primera etapa fisiológica dentro del proceso fagocitico, siendo necesaria para
que se produzca la extravasación o la diapedesis de las células fagociticas desde losvasos a los tejidos inflamados (McGregor y cola., 1978; Doheriy y cols., 1987).
La capacidad de adhesión de la célula fagocítica es una característica de la célula
viva en la que no solo intervienen factores de tipo físico sino que se requiere la
presencia de cationes divalentes <Ca2+ y Mg2+ principalmente>, componentes séricos,
glicoproteinas y receptores, así como el citoesqueleto (Rinetiarí y Boulware, Igl?;
Springer, 1990>.
Es importante la participación del propio endotelio o del sustrato tisuiar en la
adherencia de los fagocites. Las células endoteliales sintetizan moléculas de ad~’esión
como ELAM-1 (molécula de adhesión de leucocitos a endotelio) e ICAM-1, ICAM-2
(molécula de adhesión intercelular> (Stauton y cois., 1989; Springer, 1990>, que
estando muy extendidas entre los diferentes tipos celulares permiten la unión a las
mismas de las moléculas complementarias presentes en los fagocitos.
Especialmente importantes, en los fenómenos de adhesión que nos ocupan, son
dos familias de glicoproteinas: las L-selectinas, y las 13-integrinas que comprenden la
LFA-1 o CD11a/00I8 que une ICAM-1 e ICAM-2, y el Mac-1 o CDllb/CDI8 y el
pl 50,95 o CDIIc/0D18 que unen ambos iCAM-1. Estas moléculas son sintetizadas
por las células fagocíticas activadas por contacto con el sustrato y se depositan sobre la
membrana favoreciendo la adherencia. <Zlmmerman y Mclntyre, 1988; Sanchez-Madrid
y cois., 1989; Stauton y cola., 1989: Zimmerman y cois., 1992>.El proceso analizado por nosotros de adhesión a sustrato plástico es semejante al
fenómeno fisiológico de adhesión del macrófago al sustrato tisular que ocurre In vivo
(Noga y cois.,1974; Haskill y cols., 1988).
Por los resultados encontrados, se deduce que los Ires neuropéptidos estimulan
significativamente la capacidad de adherencia de los macrófagos a sustrato, en un
amplio rango de concentraciones desde 108 a 10-12 M. Siendo con las
115
Discusión
concentraciones más fisiológicas (1O~ a ~ lvi) con las que se consigue la
estimulación más significativa de la adherencia a todos los tiempos ensayados. Las
estimulaciones mayores con los neuropéptidos se dan ales 10 minutos de incubación
y las menores a los 60 minutos.
Las concentraciones más altas de los péptidos (10~ a 10~ Nl> no producen efecto
probablemente debido a fenómenos de internalización de los complejos ligando-
receptor con la consecuente reducción en la capacidad de unión o down-regulation,
como sedescribe para la EN en monocitos (Ruff y cola., 1985>, y para otros
neuropéptidos, como el VIP (Ottaway, 1992).
En general los procesos inflamatorios y aquello que los promueve provocan un
aumento de la capacidad de adherencia de las células fagociticas, así los productos
quimiotácticos que se encuentran en las lugares de inflamación incrementan esta
capacidad <Doherty y cols., 1987>.Otros neuropéptidos biologicamente activos también estimulan la adherencia en
fagocitos. Es el caso del NPY y el PYY (De la Fuente y cois., 1993a), del VIP (De la
Fuente y cois., 1994>, de la neurotensina y neuromedina N (De la Fuente y cois.,
1993d), así como de la COK-as y la gastrina <Carrasco y cola., 1991>. En cuanto a la
forma de actuación, estos péptidos podrían comportarse de forma parecida a otros
mediadores inflamatorios como el IFNy, la lUí o el TNF, o como le endotoxina
bacteriana, LPS, que inducen la formación de ICAM-l en variedad de tejidos y
estimulan la adhesión en linfocitos y monocitos a través de LFA-l y Mac-1 <Bevilacqua y
cois., 1987: Erevario y cois., 1988; Springer, 1990).
Este primer resultado obtenido supone que los macrófagos peritoneales están
siendo activados por los neuropéptidos de la familia de la EN, hecho que por si mismo
no resultaría beneficioso para el organismo a menos que se diese acompañado de una
estimulación de las otras etapas que componen el proceso fagocítico.
5.1.2. Quimiotaxis
El movimiento de la célula fagocitica a favor de un gradiente de factores químicos
atrayentes es lo que se conoce por quimiotaxis, y tiene una importancia primordial en el
reclutamiento de leucocitos en el foco inflamatorio. Han sido descritos gran cantidad de
factores capaces de inducir esta capacidad migratoria en fagocitos.Estas células presentan receptores específicos para algunos de estos factores que
se conocen corno agentes quimioatrayentes: la fracción OSa del complemento
(Fernandez y cola., 1978>, leucotrienos (Ford-Hutchinson, 1980) o el péptido
formilado, FMLP <Shawell y cols., 1976>.
116
Discusión
Otros muchos factores inducen la quimiotaxis de forma indirecta, favoreciendo la
respuesta migratoria en favor de otro quimioatrayente, es el caso del LPS (Hugli, 1989>.
Por otra parte los niveles de 0a2+ citosólico, provinlentes tanto del exterior como de
los compartimentos internos de la célula, participan en el fenómeno qulmiotácticodecisivamente <Gallin y cois., 1974).
También en esta segunda etapa del proceso fagocítico siguen teniendo un papel
importante las glicoproteinas de adhesión que se expresan en la membrana plasmática
en mayor medida en leucocitos activados quimiotacticamente (Springer y Andersen,
1986>.
Por último para permitir el movimiento del fagocito debe estimularse el
citoesqueleto, la maquinaria contractil de la célula que hará que los macrófagos
estimulados migren más vigorosamente (Schiffmann,1982>.
1-lomos estudiado en primer lugar, la modulación de la capacidad de quimiotaxis de
los macrófagos peritoneales por nuestros neuropéptido, utilizando como factor
quimioatrayente el FMLP, por ser uno de los mejor estudiados en cuanto a su forma de
actuación y a la presencia de receptores en macrófagos. (Schifmann y Gallin, 1979;
Snyderrnan y Pike, 1984). Después hemos probado que los péptidos de la familia de laON son además potentes quimioatrayerites para estas células.
La quimiotaxis en respuesta al FMLP se encuentra estimulada significativamenle
por los tres neuropéptidos. siendo GRP y neuromedina O los que alcanzan mayores
valores de estimulación a las concentraciones más bajas, lo cual podrfa ser reflejo de las
diferencias en cuanto a la secuencia aminoacidica con respecto a la BN.
A su vez, otros neuropéptidos estimulan la capacidad de quimiotaxis del
macrófago: NP’? y PV’? (De la Fuente y cois., 1993a); VIP (De la Fuente y cols., 1994); la
sustancla P (Ruff y cols., 1985).
Para estimar la capacidad corno quimioatrayentes de estos neuropéptidos se
escogieron tres concentraciones próximas a las fisiológicas y se observó un
incremento del número de células que migraron por filtro, que fue muy signif¡cativo para
el caso del CiAP a la concentración de 10-10 Nl. La potencia como quimioatrayentes de
estos neuropéptidos queda patente dado que el valor máximo conseguido con el GRP
fue significativamente superior al obtenido con FMLP a 10-8 Nl, la concentración óptima
en su actuación como quimioatrayente (Snyderman y Pike, 1984).
Una vez más sepone de manifiesto que sí bien los 17 aminoácidos diferentes quepresenta el CiAP con respecto a BN y neuromedina O, no parecen claves para la unión
al receptor, si juegan un papel importante que se traduce en los efectos observados,
En cuanto a la forma de actuación a nivel intracelular, que veremos más tarde al
II?
Discusión
discutir los mecanismos de acción, podemos adelantar que ésta podría ser similar a la
forma de actuación del FMLP. Este trás su interacción con el receptor en el leucocito,
estimula La fosfolipasa Ovia proteina Ci <Shetly y cols., 1959). Corno resultado de lo cual
se genera diacilglicerol (DAG> e inositoll,4,b trisfosfato (1P3). El DAG puedemetabolizarse y producir ácido araquidónico, que a su vez incrementa los niveles de
leucotrienos y ácidos elcosatetraenoicos (HETES>, que son a su vez potentes
mediadores d la quimiotaxis (Shelly y cols., 1989>. Además el PS potencia la salida deCt=del retículo endoplasmático, el cual es directamente responsable de la capacidad
migratori.a de la célula (Bareis y cols., 1982) y por otra parte, la proteína kinasa O,
activada por el DAG, está implicada en la regulación de la polimerización de actina (NiggIi
y Kelter, 1991>.
Nuestros resultados están de acuerdo con los obtenidos por Ruff y colaboradores
(1985>. Estos autores demostraron que tanto el GRP como la BN eran
quimioatrayentes para monocitos y células tumorales. Además es frecuente el hecho
de que agentes qulmioatrayentes sean fuertes estimuladores de la quimiotaxis como
se ha demostrado con ciertos antibióticos (Rodríguez y cois., 1989>. Si bien no siempre
ocurre así, nuestro grupo ha encontrado que tanto la neurotensina como la
neurornedina N estimulan la quimiotaxis de macrófagos peritoneales murinos pero no
actuan como quimioatrayentes (De la Fuente y cois., 1993d>.
De esta forma los neuropéptidos de la familia de La BN podrían actuar como
mediadores en focos inflamatorios contribuyendo a la acumulación de lagocítos en los
tejidos inflamados, de igual modo que el VIP o la sustancia P (Wiedermann y cois.,
1991).
5.t3. Fagocitosis.
El siguiente paso en el proceso fagocitico, una vez que los macrófagos han llegado
al lugar donde se encuentra el agente patógeno, es la Ingestión del mismo.
Nosotros analizamos la capacidad de ingestión de células vivas (Cándida albicans)
y de partículas inertes <bolas de latex> ya que en cada caso los mecanismos implicados
son diferentes.En un primer momento se utilizó una metodología descrita en el apartado de
materiales y métodos corno fagocitosis en tubo que, si bien es una de las más
utilizadas tras su publicación por Brune y cola., (1973) y que ha sido estandarizada
para macrófagos por Nuñez y cols.<1989), resulté ser inadecuada. Los resultados
obtenidos indicaban una disminución del número de cándidas ingeridas cuando losmacrófagos eran incubados con concentraciones fisiológicas de bombesína. Sin
118
Discusión
embargo estos resultados nos hicieron sospechar que podríamos estar analizando la
respuesta fagocitica de una población de células no activadas por la bombesina, ya
que con esta técnica los macrófagos más estimulados por el péptido quedan tan
fuertemente adheridos al tubo que no es posible extraerlos del mismo para llevar a
cabo el análisis fagocitico.Por esta razón se utilizó, para estudiar la capacidad de ingestión, otra
metodología alternativa y estandarizada por nosotros consistente en el empleo de
placas de MíE en las que las células adheridas a las mismas podían ser vislualizadas
directamente al microscopio, Empleando esta nueva técnica se han realizado tambiénestudios con otros neuropéptidos, como el ViP, observando que éste estimula la
fagocitosis a concentraciones de 108 a 10~ Nl (De la Fuente y cois., 1993b), hecho
que contradecía los resultados de Litwin y cols., (1992> en macrófagos alveolares de
rata, los cuales obtenían una disminución de la fagocitosis llevada a cabo por la
metodología de Brurie y cols. (1973).
Nuestros resultados en cuanto a la fagocitosis de partículas de latex, no muestran
diferencias significativas entre los tres neuropéptides, estimulando todos ellos esta
función a concentraciones desde 108 hasta lO~ M, obteniéndose de nuevo los
valores estadisticamente más significativos con las concentraciones fisiológicas <ícr9hasta ío-12 Nl).
La incorporación de partículas Inertes no parece estar mediada por receptores
específicos sino a través de características lónícas y estructuras inespecificas de
membrana <Gallin,1982>, si bien algunos autores postulan la existencia en este tipo deingestión no mediada por epaenínas, de receptores específicos aún no Identificados
<Silveretein y cols.,1989>.La fagocitosis de partículas inertes puede ser de gran interés a nivel fisiológico. Tal
es el caso del importante papel de los macrófagos alveolares en la eliminación de
partículas contaminantes que pueden introducírse por el tracto respiratorio <Golde y
Hocking, 1982>. De hecho curiosamente el grupo de Wiedermann (1988) que
describen por primera vez la secreción de BN por células inmunes , encuentran un
incremento de la secreción de este neuropéptido por macrófagos alveolares cuando
estos se encuentran expuestos a sílice y carbón.
En cuanto a la fagocitosis de Cándida albtoans, los resultados que obtuvimos
fueron también de estimulación por parte de los tres neuropéptidos, y de nuevo lasconcentraciones fisiológicas fueron las más efectivas.
Esta estimulación de la ingestión en presencia de suero como fuente de opsonlnas
como es el caso de la fagocitosis de cándidas, supone la activación por parte de los tres
119
Discusión
neuropéptidos, de los receptores para la fracción Fc de la lgG, así corno de losreceptores CRí y CRS para el complemento, que el macrófago expresa en membrana
(Unanue y Alíen, 1987; Silverstein y cois., 1989>. Una mayor actividad y/o número de
estos receptores supone una estimulación funcional de la célula fagocitica (Gandeur y
Walker, 1983>.
Otros neuropéptidos que también estimulan la adherencia yquimiotaxis, aumentan
la fagocitosis de la misma manera, como es le caso deles impflcados en la regulación de
los procesos inflamatorios: sustancia P (McGillis y cols., 1987> y VIP (De la Fuente y
cois., 1993c) y de otros como el NP? y PYY <De la Fuente y cole., 1993a), y la
neurotensina (De la Fuente y cois., 1993d>.
5.1.4. Digestión.
La activación de los fagocitos y la ingestión de partículas extrañas desencadena en
la célula lo que se conoce como ‘burst” o estallido respiratorio que se caracteriza por un
aumento del consumo de oxigeno y por la generación de derivados tóxicos del
oxigeno que van a constituir el principal mecanismo microbicida del macrófago. La
destrucción del material fagocitado se realiza en gran medida, a través de la producción
de sustancias oxidantes generadas en una primera etapa por la activación del sistema
enzirnático NAD PH-oxidasa que forma una cadena de transporte electrónico (Mollinedo
y Schneider, 1987; Klebanoff, 1980>. Este complejo enzimático se situa en la
membrana citoplasmática que pasa a formar parte de los endosomas producidos en la
fagocItosis, donde se destruyen las partículas Ingeridas. El anión superóxído es el
primer producto que se origina en la reacción de la NADPH.oxidasa, que tiene por
sustrato NADPH2 y ~ Por tanto, los niveles de este anión sirven como medida de laactuación de todo el complejo enzimático (Beiyakovich 1983>. El anión superóxido y
otros radicales libres que del mismo se derivan como el peróxido de hidrógeno, el
oxigeno singiete y el hidroxilo entre otros, degradan el material ingerido por los
macrófagos (Mollinedo y Schneider, 1987: Commins, 1990>.
Los niveles de anión superóxido se pueden cuantificar por la capacidad de éste
para reducir el nitroazul de tetrazolio <NBT> convirtiéndolo, en proporción equimolar, en
un formazan detectable por espectrofotometría (Bagasra y cois., 1988 >.Los valores de reducción del NBT que detectamos en presencia de estimulo
fagocitico <latex) son mayores que los obtenidos en ausencia del mismo, lo cual era
esperable puesto que los niveles de anión superóxido se incrementan cuando el
fagocito está estimulado (Mollinedo y 8chneider, 1967>.
En relación al efecto de los neuropéptidos estudiados, éstos estimulan tanto el
120
Discusión
metabolismo oxidativo basal, que se analiza en las muestras incubadas en ausencia de
estí mulo fagocítico, como la capacidad de digestión en presencia de partículas de
latex.A partir de su formación, el anión superóxido es transformado en otros compuestos
como el peróxido de hidrógeno, en reacción catalizada por la superóxido dismutasa.
Este es el primer producto del metabolismo oxidativo con potente actividad
microbicida, que al combinarse con míeloperoxidasas y haluros actúa eficazmente
destruyendo bacterias, virus y micoplasmas, así como células de organismos
superiores <Klebanoff, 1980). Hemos valorado la producción de peróxido de
hidrógeno por citometria de flujo valiendenos de un compuesto fluorescente, la 2,7-
diclorofuorescina, Los resultados obtenidos son similares a los encontrados en la
valoración del anión superóxido por reducción del NBT, es decir, una estimulación de
los mecanismos responsables de la capacidad de digestión del macrófago en
presencia de concentraciones fisiológicas de los neuropéptidos. Con el GRP se
consigue una intensidad de fluorescencia intermedia entre las producidas por el PMA
y el FMLP, activadores del estallido respiratorio en macrófagos <Paimbiad y cois., 1984).
Asilos péptidos de la familia de la EN no solo estimulan la ingestión de particulas
sino que favorecen su destrucción, imprescindible para su posterior eliminación del
organismo y presentación de los determinantes antígénicos a los linfocitos (Unanue y
Alíen, 1987).La producción de radicales libres ante eslimulos fagociticos, también se encuentra
estimulada en presencia do otros neuropéptidos como el NPY y PYV (De la Fuente y
cois., iSOSa>, la neurotensina (De la Fuente y cois., 1993d), el VIP <De la Fuente y
cois., 1993c) y la sustancia P (Wozniak y cois., 1989).
De los resultados hasta aquí comentados podemos concluir, que los tres
neuropéptidos: EN, GRP y neuromedina O estimulan a concentraciones fisiológicastodas y cada una de las etapas del proceso fagocitico de macrófagos peritoneales
murinos.
5.2. Efecto sobre las funciones de linfocitos.
Los linfocitos son, sin duda importantes células efectoras y reguladoras en la
respuesta inmune, por eso la posible modulación de su funcionalidad por los
neuropéptidos de la familia de la EN constituía otro de los objetivos en el estudio delefecto de estos péptidos sobre el sistema Inmune.
Los linfocitos desarrollan gran variedad de funciones de ellas podemos destacar
121
Discusión
dos muy representativas: la capacidad de movimienlo y la respuesta proliferativa. Asídecidimos analizar ambas funciones en células linfoides incubadas con los
neuropóptidos.
La movilidad de los linfocitos es esencial para la vigilancia inmunológica y selección
clonal. Dentro de esta, la migración dirigida a favor de un gradiente químico o
qulmiotaxis permite la recuperación de células linfoides recirculantes o no desde el
torrente circulatorio, así como la acumulación de las mismas en los focos de infección e
inflamación. Los linfocitos E y T migran al bazo, a las mucosas y a los lugares de
infección donde proliferan y se diferencian en células plasmáticas y T efectoras.Nuestros resultados, que pasamos a comentar a continuación, prueban la
existencia de una modulación positiva, como ocurría con los macrófagos, si bien a
diferencia de ellos, en este caso el efecto parece ser indirecto, aunque esto lo
discutiremos más adelante.
5.2,1. Quimiotaxis.
Para valorar la respuesta quimiotáctica de los linfocitos, utilizamos el mismo
quimioatrayente empleado en el estudio de macrófagos, el péptido formilado (FMLP) a
la concentración de io~ Nl. El FMLP ha sido probado como quimioatrayente para
linfocitos por nuestro grupo (De la Fuente y cois., 1993b y 1993c>, y otros autores
sugieren la existencia de receptores para él en estas células inmunes <Shubert y
MOllar., 1989).
Los resultados obtenidos en cuanto al efecto de los neuropéptidos difieren sagún
la procedencia de las células linfoides. Mieniras en linfocitos peritoneales observamos
un incremento significativo de la quimiotaxis en respuesta a la concentración más
fisiológica (10.10 Nl ), no ocurre lo mismo cuando los linfocitos proceden de órganoslinfoides. Así los linfocitos obtenidos de timo ven reducida su capacidad migratoria en
presencia de la concentración de 101v Nl de GRP; en bazo no se observan diferencias
significativas con ninguna de las concentraciones empleadas: mientras que en
ganglios axilares se aprecia una estimulación significativa de esta actividad con la
concentración de 10-lo Nl.
Estas diferencias podrían ser debidas a las distintas poblaciones que conforman
cada una de estas localizaciones linfoides in vivo. Los linfocitos T y E que componen
los órganos linfoides primarios (timo y médula ósea) son continuamente exportados a la
periferia localizándose principalmente en órganos linfoides secundarios, donde ven
reducida su capacidad migratoria. Además esta capacidad viene también determinada
ontogenéticamente de forma que los linfocitos T migran más que los E, y entre los
122
Discusión
primeros los CD4~ más que los CD8~ (Butcher, 1988; Picker y Butcher, 1992). Estos
hechos se correlacionan con nuestros resultados en controles que muestran una
capacidad de migración superior de los linfocitos obtenidos del timo frente a los de
otras procedencias.
En cuanto a los efectos discriminativos concretos observados con los
neuropéptidos estudiados, podrían tener un significado fisiológico si consideramos a
éstos corno mediadores inflamatorios, ya que los linfocitos procedentes de órganos
secundarios convertidos en células de memoria o efectoras por exposición al antígeno,
interesa que migren de forma efectiva a los lugares de inflamación (Nlackay, isgí:
Pltzalis y cols., 1991>.
La forma de actuación de íes neuropéptidos podría ser directamente sobre las
moléculas expresadas en la superficie del linfocito o favoreciendo la secreción de
mediadores inflamatorios en los propios linfocitos o en las células accesorias
adherentes acompañantes, como macrófagos. Esta última posibilidad se vió avalada
por experimentos posteriores que apuntan la necesidad de la presencia de estascélulas adherentes para que tenga lugar la respuesta de los linfocitos a estos
neuropéptidos. Entre los posibles mediadores inflamatorios implicados, las clioquinas
iFNy y TNFa no solo incrementan la adherencia de los linfocitos a endotelio sino que
favorecen la quimiotaxis in vivo tras inyección hipodérmica (lssekutz y cois., 1988 y
1989). Por otra parte otros experimentos ponen de manifiesto la implicación de las
glicoproteinas de adhesión en estos procesos, así utilizando anticuerpos contra L-
selectina se consigue inhibir la migración de neutrófilos a la cavidad peritoneal
inflamada en ratón (Watson y cols., 1991>, y de igual modo, anticuerpos anti-LFA-1 y
anti-iCAM-1 Inhiben el tráfico linfocitico (Isobe y cois., 1992>.Otros autores han encontrado a la EN capaz de estimular el tráfico linfocitario
<Meore y cols., 1964), y otros neuropéptidos gastrointestinales como la neurotensina y
la neuromedina N también lo hacen (De la Fuente y cois., 1993d>. En cambio el ViP que
estimula la quimiotaxis en macrófagos peritoneales la inhibe en linfocitos (De la Fuente
y cols., 1994>.
5.2.2. Proilferación.
Los factores de crecimiento son polipéptidos que regulan la proliferación y el
crecimiento de las células, y que además pueden intervenir en procesos de
diferenciación de las mismas. La capacidad mitogénica de los péptidos de la familia de la
BN es bien conocida para lineas seleccionadas neopiásicas como fibroblastos Swlss
3T3 (Rizengurt y Sinnett-smith, 1983) y células del tumor SOLO (Weber y cois, 1985>.
123
Discusión
De nuestros resultados podemos deducir que actúan a su vez estimulando la
proliferación in vitro de linfocitos no tumorales obtenidos de timo, bazo y ganglios
axilares murinos.Los tres neuropéptidos ejercen este efecto estimulador a la concentración más
fisiológica (10.10 M>, siendo la respuesta mayor en linfocitos obtenidos del timo frente a
los obtenidos de bazo y ganglios axilares, lo cual puede deberse, como
comentabamos en el case de la qulmiotaxis a las diferentes poblaciones celulares que
componen uno u otros órganos. Precisamente en timo, un órgano linfoide primario, la
población de células de la línea linfoide es, en su mayor parte, indiferenciada y con
capacidad proliferativa (Ritter y Crispe, 1992) y en cualquier caso, la sensibilidad a las
citocinas particulares o a combinaciones de ellas, varia en los diferentes estados de
diferenciación de los linfocitos que se encuentran en esta localización (Cardigan y
cois., 1991).
En 1960, la fitohemagiutinína (PHA> fue utilizada en estudios in vitre como inductor
de la mitosis, correlacionandose con los fenómenos proliferativos in vivo (Noweli,
¶360>. En 1972, los linfocitos E incubados con lipopolisacáridos obtenidos de paredes
bacterianas (LPS> sufrían transformación biástica, proliferaban y se diferenciaban en
células secretoras de inmunogiobulinas (Andersson y cols,, 1972>.
Desde entonces, diversas sustancias que incluyen el grupo de las botinas
vegetales y antígenos policionales se constituyen en potentes inductores de la
proliferación para la investgación ¡ti vitro. La señal producida por estos mitógenos
equivale a la estimulación del receptor de la célula T producida fisiologicamente por su
unión al antígeno en asociación con las moléculas del complejo mayor dehistocompatibilidad (NlHO> (Weiss, 1989>, estimulación que también se puede
conseguir utilizando anticuerpos específicos contra dicho receptor (Van Waume y
cols., 1980>-En nuestros experimentos hemos utilizado des mitógenos, uno de ellos selectivo
para linfocitos E, el LPS, y el otro selectivo para células T, la cencanavalina A (Con A)(Liener y cois., 1986>.
Los resultados obtenidos muestran que EN, GRP y neuromedina O inhiben muy
significativamente la proliferación de linfocitos, procedentes de los tres órganos
estudiados, en respuesta ales mitógenos. Resultados similares han sido encontrados
por otros autores para el caso de la sustancia P que inhIbe, también a concentraciones
fisiológicas <io9 Nl), entre un soy un 40% la proliferaclón inducida en espienocitos por
LPS <Pascual y cois., 1991). El ViP inhibe la respuesta línfoproliferativa a Con A y a
Pekeweed <PWM> (Ottaway, 1987; Peuriere y cois., 1989>. También la somatostatina
124
Discusión
inhibe la respuesta a mitógenos (Mascarda y cols,, 1984; Payan y cola., 1984b; Stanisz
y cola,, 1986), y hechos similares han sido puestos de manifiesto por nuestro grupo
para el NP’? y la COK (De la Fuente y Del Rio, 1994).
El hecho de que los neuropéptidos de la familia de la EN actuen estimulando la
proliferación e inhibiendo la respuesta a otros mitógenos es un fenómeno repetido no
solo para otros neuropéptidos, como acabamos de comentar, sino para otros diversos
compuestos con la peculiaridad de ser factores de crecimiento, si bien los mecanismos
responsables de esta dualidad no se conocen bien, Así por ejemplo, la interleucina 4
puede estimular o inhibir el crecimiento de progenitores hematopoyéticos
dependiendo de los otros factores de crecimiento que se encuentren presentes. Esto
se podría explicar en base a que la unión de un péptido con su receptor especifico
puede alterar la distribución celular o la afinidad de unión del receptor para un segundo
factor de crecimiento, independientemente de reactividades cruzadas entre ellos, lo
que se conoce como transmeduiacién (Sporn y Roberts, 1988).
Como conclusión podemos decir que los tres neuropéptidos estimulan la
funcionalidad del linfocito, si bien dependiendo de la procedencia de éste: estimulan la
quimiotaxis de linfocitos obtenidos de peritoneo y ganglios axilares y la reducen en
linfocitos del timo. Por otra parte estimulan la línfoproilferación espontánea e inhiben la
proliferación en respuesta a mitógeno: Con A y LPS.
5.3. Efecto sobre la actividad NK y ADCC.La citotoxicídad celular, como mecanismo de lisis mediado por leucocitos, incluye
varios tipos: citotoxicidad restringida por el complejo mayor de histocompatibilidad(MHO>, llevada a cabo por linfocitos T citotóxicos, cítotoxicidad natural no restringida(NK> y cítotoxicidad celular dependiente de anticuerpos o ADCC. El mecanismo de lisistiene puntos en común en todos los cases, y basicamente consiste en elreconocimiento de la diana, su unión y posterior lisis (Eieackley y ceis., 1988; Eerke,1989>,
Recientemente se ha centrado la atención en la actividad NK y su activación pordiversos compuestos incluyendo citocínas y productos bacterianos (Contí y cols.,1991; Moretta y cols., 1994>. Las células capaces de esta lisis constituyen unasubpoblación derivada de la médula ósea, que comparte antígenos de superficiecomunes a linfocitos, monocitos y granulocitos, como el 0016 y el 0056 <NKH-1) perono expresan otros antígenos de superficie característicos de la célula T como el 0030TOR, salvo la cadena t del 003 (Andersen y cols., 1989; Phiilips y cois., 1992). Por otraparte, se encuentran morfologicamente asociadas a los llamados large granulariymphocytes (LGL> (Petersen,1988>.
125
Discusión
A parte de la actividad tumoricida que caracteriza a las células NK y que proporcionaun marcador funcional para su análisis, cada vez se hacen más patentes otras funcionesdesempeñadas por estas células, como su papel en la resistencia natural a Infeccionesvirales y a las producidas por otros microorganismos patógenos (Levitz y cois., 1993;Murphy y cols.,1ssa), o su función reguladora del sistema hematopoyético e inmune através de la secreción de citoquinas como: interferon (lENy>, factor de necrosis tumorai(TNFa>, interieucina-t ji, factor estimulador de colonias granulo-macrofágicas (GM-CSF)y factor de crecimiento transformante (TGFjVI) <Perussia 1991).
Las bases del reconocimiento y activación de las células NI< por sus células dianacontinuan siendo objeto de estudio, La lisis de las células tumorales dianas por lasefectoras NK constituye la fase final de un proceso que comienza con elreconocimiento y formación de un conjugado entre la célula NR y la diana (Roozemundy cola., 1987) en el que intervienen moléculas de adhesión como la LFA-I, querecientemente se ha demostrado que activa además la producción de TNFa por las NK(Melero y cols., 1993>.
Aunque la actividad NK no está restringida por el MHO, se sugirió que el nivel deexpresión de dichas moléculas en la superficie de las células tumorales puede influir ensu susceptibilidad o resistencia a la lisis por células NK (Harel-Belian y cols,, 1986), deforma que cuanto menor es la expresión de estos antígenos mayor es sususceptibilidad a la lisis por células NI< <Karre y ceis., 1986). Sin embargoposteriormente se ha demostrado que otros factores, independientemente de losantígenos de histocompatibilídad, pueden conferir resistencia a la lisis por células NK(Serrano y cois., 1989; Serrano y cola., 1990>.
Los interferones son probablemente las sustancias reguladoras más importantesde la citotoxicidad natural. Con ellos otras citocinas, secretadas principalmente pormacrófagos y linfocitos 1 son responsables de la modulación de la actividad de lascélulas NK, como son la IL-2 y la IL-4, y el factor de crecimiento transformante (TGF><Perussia,1991>.
En cuanto a la ADCO se caracteriza por la necesaria presencia de anticuerpos en lasuperficie de la célula diana que serán reconocidos por receptores específicos en lacélula efectora, tal es el caso del receptor Fc para la gO (Sissons y Oldatone, 1980).Las células natural kilier, responsables de la citotoxicidad natural, pueden ser tambiénelectores de la ADCC (Curnow y cola., 1993>, y ésta se ve regulada por los mismosfactores que la NK: IL-2 y FN (Vuist y cois., 1993>.
En cuanto a nuestros resultados, se observa una estimulación por los
neuropéptidos de la familia de la EN de la actividad NK y ADCO tanto en muestras
obtenidas del peritoneo como en leucocitos obtenidos de ganglios axilares, bazo y
timo. Estos resultados están de acuerdo con los obtenidos por Van tol y colaboradores
(1990) que demuestran la estimulación de la actividad NK por EN. Así mismo otros
126
II
Discusión
neuropéptidos gastrointestinales estimulan la citotoxicidad como el NP’? (Nair y cola.,
1993> y la sustancia P (Eiennenstock y cois., 1989; Croitoru y cois, 1990>.
Podernos concluir que los neuropéptidos de la familia de la BN estimulan también la
actividad citotóxíca natural y la citotoxicidad dependiente de anticuerpo a
concentraciones fisiológicas.
5.4. Efecto sobre la secreción de factores de colaboración
intercelular.
Las citocinas son factores solubles secretados por varios tipos de células inmunes,
que exhiben potentes efectos reguladores sobre la respuesta inmune. La
Inmunorregulación desarrollada por les neuropéptidos de la familia de la EN pudiera
estar mediada a través de la expresión y secreción de algunos de estos factores.
La secreción de citocinas ha sido descrita en respuesta a la incubación con otros
neuropéptidos gastrointestinales, como ha sido detallado en la introducción, por
recordar algún ejemplo se puede indicar que la neurotensina estimula la producción de
IL-1 (Lemaire, 1988) y la sustancia P favorece la liberación de IL-1, iL-2, IL-8 y TNFcz
LoIz y cois., 1988; Laurenzí y cols., 1990; Calvo y cols., 1992; Rameshwar y
cois.,1992>,
Para profundizar en el conocimiento de los efectos que la EN, GRP y neuromedína
O producían en las células Inmunes, nos propusimos estudiar como afectaban
nuestros neuropéptidos a la secreción de dos de estas citocinas directamenteimplicadas en fa regulación de las funciones observadas: la IL-1, producida
mayoritariamente por macrófagos y que tiene su papel más relevante en la inducción de
la proliferación linfoide, y la IL-2 factor autocrino secretado por el linfocito activado para
estimular su proliferaclón. La iL-2 es además un modulador positivo de la citotoxicidad
natural de linfocitos <Hoyer y cois., 1986) y también de macrófagos (Nlaikovsky y cois.,
1987).Los resultados observados Indican un aumento en los niveles de iL-f 13 en los
sobrenadantes de cultivos de macrófagos que habían sido incubados con los
neuropéptidos a una concentración fisiológica (10-10 Nl> que era la que habla
demostrado ser más eficaz en la estimulación de la respuesta proliferativa.
Este incremento en los niveles de IL-I 13, significativamente superior a controles, es
comparable al obtenido en muestras de macréfagos incubadas con el mitógeno Con A,
si bien el incremento en proliferación observado no se corresponde con estos
resultados, ya que la estimulación de dicha función en presencia de los neuropéptídos
it127
Discusión
es significativamente menor a la que ocurre en presencia de Con A. Esto indica que
además de Li hay otros factores implicados en la modulación de la respuesta
proliferativa que producen los neuropéptidos, como discutiremos más adelante,Por otra parte, en muestras incubadas con los neuropéptidos además de con Con
A , se observa una disminución en la produción de Li, con respecto a los niveles
obtenidos por ambos factores por separado, neuropéptido y lectina, lo cual se
corresponde con los efectos observados en proliferación de disminución de la
respuesta al mitógeno en presencia de los neuropéptidos, y podría explicarse por un
fenómeno de transmoduiación ya previamente comentado. Así, la unión de la Con A al
macrófago estaría siendo alterada por los neuropéptidos lo que provocaría una
disminución en la producción de iL-1 y en la concecución de la respuesta proliferativa.
En cuanto a la liberación de iL-2 por parte de los linfocitos, ésta se vió
incrementada, como cabía esperar, en presencia de Con A, pero no se modificó
respecto a controles en presencia de los neuropéptidos. Este hecho puede explicar
los resultados obtenidos en cuanto al efecto de los neuropéptidos sobre la respuesta
proliferativa de los linfocitos en ausencia de otro estimulo mitogénico, que se
comentaban anteriormente. Ya que si bien los neuropéptidos incrementan los niveles
de iL-t produciada por los macrófagos, en valores similares a la Con A, éstos no se
traducen sin embargo en una elevación de los niveles de IL-2 producidos por loslinfocitos, lo cual seria una posible causa de que observemos un discreto incremento
en la proliferación no tan elevado como en el caso de la prolife ración en respuesta a
Con A.
También el VIP que tiene un comportamiento semejante a EN 1 GRP en cuanto a la
linfoproliferación, es decir, que reduce la respuesta a mitégenos, se ha visto que
medula negativamente la síntesis de IL-2 ( Boudard y Bastide, 1991; Ganea y Sun,
1993).El hecho de que EN, GRP y neuromedina O no modifiquen los niveles de
producción de iL-2 indica también que el efecto estimulador que ejercen sobre la
citotoxicidad no se encuentra mediado por esta citocina. Recientemente ha sido
descubierto un nuevo factor estimulador de células NK producido, al menos, por
linfocitos E, que se ha denominado IL-12 y que actúa promoviendo la síntesis de IFNy,
directamente o de forma sinérgica con IL-2 y TNFa <Tripps y cola., 1993; Naume y cols.,
1993>. Esta interleucina o el propio TN5x productdo por macrófagos, o ambos factores,
podrían ser los mediadores de la acción de estos neuropéptidos sobre la citotoxicidad
y el comprobarlo es uno de los objetivos de nuestras futuras investigaciones.
En este sentido otro de los neuropéptidos más estudiados en cuanto a sus efectos
II128
Discusión
sobre el sistema inmune, la sustancia P se vió que incrementaba la actividad NK de
leucocitos murinos intestinales sin observarse un incremento significativo en los
niveles de iL-2 e IL-4 (Croitoru y cols., 1990).
Como conclusión podemos decir que los neuropéptidos estudiados producen un
aumento de los niveles de secreción de IL-1 13 por los macréfagos peritoneales pero no
de la IL-2 liberada por los linfocitos.
5.6 Efecto de la preincubacién con los neuropéptidos.
Los resultados obtenidos hasta este momento nos mostraban un papel modulador
para los neuropéptidos de la familia de la EN sobre las células inmunes. Todos los
experimentos realizado, lo habían sido manteniendo los neuropóptidos en contacto
con las células durante todo el tiempo que duraba cada ensayo. Ahora nosproponíamos comprobar si era necesaria la presencia del neuropéptido durante todo el
ensayo o si, por el contrario, era suficiente una incubación previa de las células con el
neuropóptido para que éste ejerciera su efecto sobre las mismas.
Debíamos elegir una prueba que nos permitiera realizar una preincubacién de las
células con los neuropéptidos, y posteriormente lavarlas para realizar el ensayo sin
tener que trasvasarías. Esto descartaba la posibilidad de escoger las pruebas de
adherencia y quimiotaxis. Además la preincubación debía de ser de una duración
mínima razonable para permitir la posible transmisión de se/lates al interior de la célula,
por esta razón, y basados en experimentos previos realizados con ViP por otros
autores (Rola-Pleszczynski y cois., 1985) decidimos realizar un ensayo de
preincubación durante una hora sobre la capacidad citotóxica de muestras de
leucocitos obtenidas de bazo, timo y ganglios axilares. De esta forma, los leucocitos
fueron incubados con tres concentraciones de GRP durante una hora previa al ensayo
y a continuación se lavó la suspensión celular. Tras las cuatro horas que dura la prueba
de citotoxicidad las muestras que hablan sido preincubadas con el GRP mostraban
porcentajes de lisis superiores a los controles y del mismo orden a los obtenidos en
muestras en las que se añadió el CiAP al comienzo de las cuatro horas del ensayo
citotóxico y se mantuvo hasta el final.
Se deduce que no es necesaria la presencia del neuropéptido durante todo el
ensayo para transmitir su efecto, siendo sufieciente una incubación previa de las
células.
129
Discusión
5.6. Especificidad de los efectos observados.
Una vez observados los efectos que los péptidos de la farnii¡a de la EN estudiados,ejercen sobre la respuesta inmune, era necesario comprobar la especificidad de dichosefectos, puesto que aún no había sido descrita la presencia de receptores para estos
neuropéptidos en células inmunes, Para conseguir este objetivo nos planteamos dos
estrategias, cuyos resultados pasamos a discutir a continuación.
5X.l. Utilización de un antagonista de la BN.
Recientemente se ha centrado el interés en el diseño y desarrollo de antagonistas
competitivos para el receptor de la SN, sobre todo por su posible aplicación terapeútica
corno agentes antimitóticos en diversos tumores. Coy y colaboradores consiguieron
obtener un antagonista, <Leul3-iíi-CH2NH-Leul
4>-EN, que exhibe una alta afinidad por
el receptor de la EN comparado con otros antagonistas (100 veces superior según lospropios autores>, y no presenta afinidad por el receptor para la sustancia P como ocurría
con otros anteriormente descritos. Además comprobaron su acción revertiendo el
efecto estimulador de la EN sobre el crecimiento de células Swiss 3T3 <Coy y cois.,
1988>, Por todo lo anterior éste fue el antagonista escogido por nosotros para realizar
los ensayos,
Elegimos las funciones más representativas de los tipos celulares estudiados para
comprobar la especificidad de los efectos encontrados. Así, estudiamos laespecificidad del electo de los neuropéptídos como quimioatrayentes para linfocitos y
macrófagos, usando la concentración que había resultado ser la más efectiva, 1010 Nl.
Observamos una reducción significativa del número de estas células que migraron en
las muestras incubadas con EN, GRP o neuromedina O ¡unto con el antagonista,
respecto a las muestras incubadas solo con el neuropéptido. El control no se vié
afectado por la incubación con el antagonista, como tampoco modificó la capacidad
quimieatrayente del FMLP en muestras incubadas con ambos, FMLP y antagonista,
utilizadas como un segundo control. Estos hechos corroboran por un lado, la acción
específica del antagonista puesto que no afecta a la unión del FMLP con su receptor y
por otro lado demuestra la acción a través de receptores específicos de los
neuropéptidos puesto que se ve revertida por un antagonista del receptor para la EN.
Estos resultados se repitieron al probar la acción del antagonista en ensayos de
citetoxicidad natural <NK). El efecto estimulador del GRP a la concentración de 1010 Nl
se vió revertido en presencia del antagonista.
De estos resultados se deduce que los neuropéptidos actúan sobre la
funcionalidad de estas células inmunes a través de receptores específicos en la
130
Discusión
membrana de dichas células.
5.62. Determinación de la presencia de receptores específicos en
las células inmunes.
Hasta ahora no han sido abordados estudios para determinar la presencia de
receptores específicos para los neuropéptidos de la familia de la EN en células
inmunes. Sin embargo, si se han caracterizado en otros tipos celulares mediante
ensayos de unión de radioligandos. En células pancreáticas acinares de cobaya y en
dos lineas celulares endocrinas: 0H401, de células hipofisarias de rata, y HÉT de islotes
de hamster (Jensen y cois, 1976; Westendorf y Schonbrun, 1983; Swope y
Schonbrun, 1987>. Así como en cerebro de rata (Moody y cols., 1978), y en
fibroblastos de la línea Swiss STa (Zachary y Rozengurt, 1985 y 1987>,
Nuestros resultados muestran, en primer lugar, que la capacidad de unión al
neuropéptido varia según la población celular estudiada, macrófagos o linfocitos no
adherentes.
En los experimentos que se llevaron a cabo con poblaciones enriquecidas en
macrófagos se observó una inhibición competitiva de la unión de los ligandos
marcados, (1251> EN o (1251> GRP por los neuropéptidos no marcados. El analisís de
Scatchard de los resultados de unión muestran la existencia de dos tipos de
receptores en macrófagos, de alta afinidad kd=2,7±0,4nM y Kd=1,1±0,O7nM para EN
y GRP respectivamnte, y de baja afinidad Kd=64,2±7,InM y Kd=79,O±8,6nM para EN
y GRP respectivamnte.
El GFIP y a neuromedina O fueron capaces de inhibir la unión de la (1251> EN a los
macrófagos pero con menor potencia que la EN nativa. Del mismo modo en los
experimentos con (1251) GRP, EN y neuromedinaC fueron capaces de inhibir la unión
del péptido marcado con menor capacidad que el GRP, sobre todo en el caso de la EN.Estos resultados parecen estar de acuerdo con estudios recientes que indican la
existencia de al menos des tipos de receptores para estos neuropéptidos, uno de
mayor afinidad por GRP y neuromedina O, y otro que presentarla mayor afinidad por
otro péptido relacionado, la neuromedina E, un decapéptido que presenta
discrepancias en la secuencia consenso O-terminal, careciendo entre otros, del
residuo His20 de la molécula del GRP, que tampoco contiene la EN. Esta
heterogeneidad de receptores se ha encontrado en varias localizaciones cerebrales
<Von Schreck y cois., 1989:.Ladenhelm y coi&, 1990; Guard y cols., 1993).
Los valores de afinidad encontrados para estos receptores en macrófagos son
similares a los encontrados por otros autores en otras células, como las células de
131
Discusión
gliobiastoma humano <Moody y cols. 1989; Staley y cois., 1998), en las que los autores
encuantran receptores para EN de una únic tipo de alta afinidad con una Kd=2 nM.
En cuanto a los experimentos realizados con poblaciones enriquecidas enlinfocitos no adherentes mayoritariamente T (hasta un 95% de pureza), los resultados
no indican la presencia de receptores ni para EN ni para GRP en estas células, en las
mismas condiciones de experimentación empleadas con los macrófagos. Pudieran
carecer estas células de receptores para estos neuropéptidos si bien no se descarta la
posibilidad de que existan uniones de muy baja afinidad no detectadas con el tipo de
metodología empleada. Por un lado, los resultados obtenidos analizando los efectos
de los neuropéptidos sobre poblaciones purificadas de linfocitos, que se discutirá en el
siguiente apartado, parecen apoyar la inexistencia en estas células inmunes de
receptores para estos neuropéptidos, pero por otro lado y como se comentará más
adelante, se observa una elevación de los niveles intracelulares de segundos
mensajeros en respuesta a la incubación de los linfocitos con los neuropéptidos.
Podemos concluir que existen receptores específicos para estos neuropéptidos al
menos en macrófagos por lo que los efectos observados sobre estas células Inmunes
son específicos.
5.7. Efecto de los neuropéptidos sobre poblaciones celulares
purificadas.
Puesto que en este momento de las investigaciones la presencia de receptores
era clara en macrófagos y no parecían apreciarse en linfocitos, células en las que no
obstante encontrabamos modulación de sus funciones por los neuropéptidos objeto
del presente estudio, pasamos a valorar alguna de las funciones analizadas en
poblaciones purificadas.
5.7.1. Efecto sobre poblaciones purificadas de macrófagos.
La purificación de macrófagos peritoneales, se llevó a cabo en base a la capacidad
de adherencia de estas células, lo cual permitió realizar los ensayos solamente en despruebas: la fagocitosis, que se realiza previa formación de una monocapa adherente
sobre las mismas placas en las que se desarrolla posteriormente el ensayo y la
citotoxicidad, que de la misma forma se realiza en placas de cuttivo.En ambos casos, la fagocitosis de iatex y la citotoxicidad natural (NK> no
encontramos diferencias significativas en cuanto a la estimulación de eslas funcionespor los neuropéptidos, en la población de macrófagos purificada frente a la población
132
Discusión
total del peritoneo.Estos resultados nos demuestran, por una parte, que el efecto de los
neuropéptidos sobre la funcionalidad del macrófago (al menos en las dos funciones
ensayadas> es directo y no mediado por otros tipos celulares, lo cual está de acuerdo
con la presencia de receptores específicos para estos péptidos en estas células
inmunes.
Por otro lado, la actividad NK detectada es en realidad una NK-like’ puesto que la
presentan macrófagos, los cuales no son céluas NK aunque si realicen actividad
citotóxica natural. De hecho se han encontrado en ratón células del linaje mieloide que
presentan actividad NK y se han llamado NC (citotóxicas naturales> (Berke, 1989>.
5.7.2. Efecto sobre poblaciones purificadas de linfocitos.
Para determinar si los efectos moduladores de los neuropéptidos sobre la
funcionalidad de los linfocitos eran directos sobre estas células o por el contrario, eran
mediados a través de células adherentes accesorias como el macrófago, procedimos a
realizar los ensayos funcionales en poblaciones purificadas de linfocitos no
adherentes, mayoritariamente T (Thy 1+).
Estos estudios se realizaron en todas las pruebas de función linfoide: quimiotaxis,
proliferación <espontánea y en respuesta a mitógeno>, y citotoxicidad (natural y
dependiente de anticuerpo>, ya que en este caso no había ninguna dificultad
metodológica que lo impidiera.
En primer lugar, en cuanto a la qulmiotaxis, cuando las muestras purificadasprocedían del peritoneo se perdió el efecto estimulador de los neuropéptidos que se
siguió manteniendo en controles realizados con población peritoneal total.
Lo mismo ocurrió con muestras obtenidas de los tres órganos linfoides: bazo, timo
y ganglios axilares. En este caso también se perdieron los efectos del GRP sobre la
quimiotaxis: la estimulación en linfocitos de ganglios axilares y la inhibición de la
qulmiotaxis en linfocitos de timo. En el bazo se siguió sin observar efectos
sign if calivos.
En el estudio de la proilferaclón obtuvimos resultados semejantes. Al purificar la
población linfoide de timo, bazo y ganglios axilares, perdimos el efecto mitogénico de
los neuropéptidos. De igual manera, desapareció el efecto inhibidor sobre la
proliferación en respuesta al mitógeno Con A. Estos hechos apoyan los resultados
discutidos en el apartado 4, en las que veíamos un aumento en los niveles de IL-1
producida por macrófagos, en presencia de los neuropéptidos, pero no así en los
niveles de IL-2, producida por linfocitos. Todo ello vuelve a apuntar un efecto de los
133
Discusión
neuropóptidos sobre la proliferación linfoide mediada, al menos, a través de la
secreción de iL-1 por los macrófagos.En cuanto a la cítotoxicidad, de nuevo los efectos estimuladores de los tres
neuropóptidos sobre la citotoxidad natural y sobre la ADCC, se perdieron cuando las
muestras se encontraban depiecionadas de células adherentes. Los controles
mantienen los niveles de estas actividades citotóxicas semejantes a lo encontrados
cori la población leucocitaria total, viéndose solamente reducidos significativamente en
la NK de muestras obtenidas de ganglios axilares.
Como conclusión podemos decir que el efecto de los neuropéptidos sobre lafuncionalidad de los linfocitos es indirecta y se realiza a través de las células
adherentes.
5.8. Existencia de un factor mediador en el efecto de los
neuropéptidos sobre los linfocitos.
Para profundizar en el tipo de mediación llevada a cabo por las células adherentes
en la modulación por estos neuropéptidos sobre las funciones de los linfocitos,
realizamos unos ensayos para determinar si era necesaria una Interacción de las
células: linfocito y adherente, o si la información se transmitía a través de algún
mediador soluble producido por estas últimas, bien linfocitos adherentes,
prioritariamente linfocitos E o macrófagos.
Para ello, realizamos unas pruebas de qulmiotaxis con linfocitos purificados a los
que añadimos los sobrenadantes de muestras peritoneales bien de células adherenteso bien de macrófagos purificados. En ambos casos las muestras fueron incubadas
previamente durante Sh con el OSP (10.10 M>.
Los resultados obtenidos, indican que no se precisa la presencia de las células
adherentes durante el ensayo para observar el efecto estimulador de la quimiolaxís delinfocitos ejercida por el OSP. Sino que dicho efecto se consigue por mediación de
uno o varios factores solubles que son secretados al medio por las células adherentes.
Estas parecen ser macrófagos puesto que no se aprecian diferencias en la quimiotaxis
de linfocitos a los que se atiadieron los sobrenadantes de cultivos de la población
adherete total de peritoneo o los obtenidos de macrófagos purificados.
Podemos concluir que estos neuropéptidos ejercen su acción sobre la función
linfoide a través de uno o más factores solubles secretados por los macrófagos. El
aislamiento y caracterización de este factor o factores será objeto de futuras
134
Discusión
investigaciones.
5.9. Mecanismos de acción a nivel intracelular.La regulación de las funciones celulares por los neuropéptidos depende de la
transmisión de la señal efectora al interior de la célula, una vez que éstos se unen a sus
receptores específicos en la membrana citoplasmática.En los sistemas receptores se pueden identificar dos componentes funcionales: el
receptor, al que se une el ligando, y el efector, que induce la respuesta. Ambos
componentes pueden formar una única cadena potipeptídica, o dos entidades
diferentes que necesitan acopiarse previamente para su funcionamiento.
Así se diferencian dos grandes grupos de vias de transducción de información:
uno que depende de proteínas O para el acoplamiento del efector con el receptor, y
otro independiente de proteínas O, en el que receptor y efector constituyen una
actividad enzimática en una sola cadena polipeptidica.
Los efectos fisiológicos de un gran número y variedad de hormonas y
neurotransmisores están ligados a su capacidad de activar la fosfolipasa O (PLO> por
medio de la unión de sus receptores a proteínas O. La PLO es un efector enzimático
que cataliza la hidrolisis de fosfatidilinositol 4,5 bifosfato en inositol 1,4,5 trifosfato (iPS)
y diacliglicerol, que a su vez promueven la salida de 0a2+ de los compartimentos
internos y la activación de la proteina quinasa O (PKC>, respectivamente. Algunas
subespecies de esta familia de proteínas O, son insensibles al bloqueo por toxina
pertussis y se expresan solo en células de origen hematopoyético (Helper y Gilman,1992). La ruta de la PLO es la vía preferentemente utilizada en la transducción de
señales activadoras de la respuesta inmune en general (Michelí y cois., 1992>, mientras
que la ruta de la adenilato ciciasa actúa como inhibidora o regulando negativamente la
respuesta inmune celular (Ooidstein, 1985).
En fibrobiastos murinos de la línea Swiss 3T3, unas de las células mejor estudiadas
en cuanto a los efectos de la EN y sus mecanismos de acción, se demostró la
pertenencia del receptor de la EN al grupo de receptores dependientes de proteínasO (Fischer y Schonbrun, 1988; Sinnett-Smith y cols., 1990; Eattey y cois., 1991>, En
estas células el efector implicado es la PLC, ya que se produce una elevación de los
niveles de 1P3 y de calcio intracelular (Hesiop y cols,, 1986; Mendoza y cols., 1986), así
corno una activación de la PKC <Zacliary y cois., 1986).
Resultados que implicaban a Jos mismos mensajeros fueron observados en la
acción mitogénica de la EN sobre un tumor de mama <Patel y Screy, 1990) y en la
estimulación de la secreción de insulina en células pancreáticas <Swope y Schonbrun,
135
Discusión
1968).
La PLO también puede ser activada por receptores independientes de proteínas O,
con actividad tirosina kinasa. Es el caso de los receptores de algunos factores de
crecimiento como el factor de crecimiento epidérmico (EOF> y el derivado de plaquetas
(PDGF) (Berridge, 1993> y también de un receptor para la EN hallado en las mismas
células Swiss 3T3 (Cirillo y cola., 1986>.
En células inmunes no habían sido investigadas las vias de transmisión de la señal a
nivel intracelular por los neuropéptidos de la familia de la BM. Por esta razón nos
propusimos hacerlo en los dos tipos celulares estudiados: macrófagos y linfocitos.
5,9.1. Mecanismos intracelulares en macrófagos.
Una vez demostrada la presencia de receptores específicos para EN/OSP en la
membrana de los macrófagos, nos propusimos estudiar los mecanismos intracelulares
Implicados en la transmisión de la señal de estos neuropéptidos.
Para ello valoramos los niveles intracelulares de los segundos mensajeros
implicados en las principales rutas de transducclón de señales que medían los
neuropéptidos: AMPc, PS y PKO.
Los niveles de AMPc disminuyen a los 30 a de incubación de los macráfagos con
los neuropéptidos. Esta disminución es transitoria ya que los niveles de AMPc llegan a
los valores controles a los 60s.
Por su parte, los niveles de iPa muestran un aumento en repuesta a la incubación
con los neuropéptidos a los 60s de la incubación.
La existencia de una doble acción de los neuropéptidos y su receptor sobre la
adenilato ciclasa y sobre la PLC, que se traduce en la elevación de los niveles de AMPc
e PS, se explica dada la gran complejidad y versatilidad del mecanismo de transducclón
dependiente de proteínas O, que permite que una vez activada la proteína O por el
receptor trás la unión de éste al neuropéptido, dicha proteína O puede activar a su vez
efectores diferentes (Birnbaumer y cols., 1990; Hepler y Gilman, 1992>.
Por otra parte valoramos la actividad PKC en respuesta a la incubación de los
macrófagos con los neuropéptidos. La PKC se encuentra distribuida entre el citosol y la
fracción particuiada de la célula. Las hormonas y neurotransmisores que utilizan este
mensajero intracelular estimulan la transiocación de la enzima citosólica a membrana, ya
que solamente la fracción unida a ésta es la forma activa, hecho este que está
relacionado con cambios en la estructura secundaria de la proteína (Boscá y Moran,
1993). Esta situación depende también de la actividad metabólica de la célula, ya que
en tejidos muy activos como cerebro o hígado, la enzima se encuentra en un elevado
136
Discusión
porcentaje constantemente unida a membrana (Boscá, 1989; DIaz-Guerra y Boscá,1990). En nuestro caso observamos una estimulación de esa actividad enzimática
unida a membrana.Estos resultados están de acuerdo con numerosos trabajos que apuntan a la ruta
de los PS como la preferentemente utilizada por diversos agentes estimuladores de la
respuesta inflamatoria y del proceso fagocitico. Así, se demuestra que los niveles de
Ps se elevan en macrófagos después de la adherencia a superficies de vidrio
(Zabrenestzky y Gaiiin,1988). También se ha demostrado que el péptido
formilado actúa incrementando la quimiotaxis por esta ruta , elevando los
niveles de Pa y de DAG(Eareis y cols.,1 982; Pike y Arndt, 1988; Sheliy y cola.,1989). La actividad PKC también se encuentra implicada en el desarrollo de la
polaridad celular y de la movilidad inducida por FMLP (Niggii y Keiier, 1993).
Un aspecto importante en la capacidad de movimiento del macrófago es la
activación del citoesqueleto, a este respecto el incremento en el turnover de los
fosfoinositoles parece actuar como modulador dei ensamblaje de actina en
neutrófilos humanos (Bengtsson y cols., 1988).
Faiman y cols.,(1989) demuestran que la fagocitosis mediada por
receptores Fc y C3b en neutrófilos humanos está asociada con un incremento
en los niveles de 1P3 y DAG y propone a la protein kinasa C como efector.
En cuanto al estallido respiratorio se demuestra la necesidad de altos
niveles de calcio para que sea posible, pero no seria este el único factor
necesario segun propone Hartiala y cois.,(1 987).
Por otra parte, la regulación de la expresión del mRNA de Li y TNF y
su sintesis por macrófagos murinos, tiene lugar via protein kinasa C (Kovacs
y cois.,1988).Otros neuropéptidos también actuan estimulando diversos aspectos de la
funcionalidad del macrófago a través de la PLO. Tal es el caso, de la sustancia P que
actúa elevando los niveles de calcio citosólico y favoreciendo la formación de inositoles
fosfato (Serra y cois,, 1988>, vía proteínas O (Shumann y Oardner 1989); del ViP que
actúa estimulando la fagocitosis en macrófagos activando la PKC <De la Fuente y cola.,
1993c>, y del NP’? que de igual forma estimula la FKC (De la Fuente y cois., 1993a>. Por
otra parte, una reducción de la actividad PKO en macrófagos peritoneales incubadoscon OOK-8, se acompaña de una menor funcionalidad de estas células en respuesta al
neuropéptido (De la Fuente y cola., 1993b).
137
Discusión
5.9.2. Mecanismos intracelulares en linfocitos.
Eri los linlocitos pese a no haber conseguido derrostrar la existencia de receptores
y a no haber observado efecto de los neuropéptidos sobre los linfocitos purificados,
también nos parecio importante valorar los posibles cambios en los niveles
intracelulares de segundos mensajeros.
Igual que corno habfa ocurrido en macrófagos, observamos una disminución rápida
y pasajera de los niveles de ANlPc y una elevación de los de IFa, así como un
incremento en la actividad de la PKC.Este hecho parece apoyar la existencia en estas células de receptores, si bien
éstos podrían ser escasos y de baja afinidad, por lo que no habrían sido detectados porlas técnicas de unión utilizadas. Los niveles de segundos mensajeros en presencia de
los neuropéptidos, significativamente superiores a controles, se pueden explicar por la
gran amplificación que se desencadena trás la unión del ligando al receptor en la
transducción de señales mediada por proteínas O. En la mayoría de sistemas esta
amplificación tiene lugar en dos etapas. En la primera se activan de diez a cien proteínas
O por cada ligando unido a su receptor, y en segundo lugar, se ve afectado el recambio
de miles de segundos mensajeros por cada enzima efectora que se regula (Birnbaumer
y cois., 1990; 1-lepier y Gilman, 1992>.
Estos altos niveles de 1P3 y la activación de la PKO, están implicados en la
estimulación de la respuesta inmune de linfocitos, tanto en la estimulación de sucapacidad de quirniotaxis <Shubert y MOller, 1989>, como en la respuesta proliferativa
de linfocitos T y B (Orinstein y Kiip, 1989; Oardner, 1989; Hengel y cols., 1991; Rush y
cois., 1992: Desal ycols., 1990).
Sin embargo en nuestro caso, esta elevación de los niveles de segundosmensajeros no se traduce en una estimulación de las funciones linfoides. Este hecho
habría que explicarlo por la necesidad de una señal de activación adicional o de
coestimuiaclón en la regulación de las funciones linfoides: quimiotaxis, proliferación y
citotoxicidad por estos neuropéptidos, que seria proporcionada, en el caso que nos
ocupa, por los macrófagos. Esto es lo que ocurre por ejemplo, con tos clones de
células T inducidos por antígeno, en los que independientemente de la elevación de
los niveles de calcio intracelular y de la activación de la PKO, es necesaria una señal de
coestimulación producida por las células adherentes accesorias, para permitir su
proliferación (Muelier y cols., 1990).
Corno conclusión, estos neuropéptidos actúan sobre las células inmunes
estudiadas, activando la ruta de la fosfolipasa O e inhibiendo la actividad adenilato
138
Discusión
ciclasa, probablemente a través de proteinas O de mambrana.
Nuestro trabajo confirma el papel inmunomodulador de los neuropéptidos
gastrointestinales de la familia de la bombesina: EN, GRP y neuromedina O.
Estos neuropéptidos estimulan la función fagocitica de los macrófagos
peritoneales murinos, uniéndose a receptores específicos en su membrana, quetransmiten la señal intracelularmente a través de la activación de la PLO. Ejercen
también un papel modulador positivo de la funcionalidad del linfocito en los que
también activan la vía de la PLO aunque no se detectan receptores en los mismos
mediante las técnicas de unión de radioligando. No obstante esa modulación en
linfocitos se efectúa a través de los macrófagos, por medio de la secreción de uno o
varios factores que activarían a estas células.
En la página siguiente se muestra, en esquema, el modelo propuesto para la
modulación de la respuesta inmune por estos neuropéptidos.
139
+ Citotoxicidad+ Citotoxicidad+ Proliferación+ Quimiotaxis
GRPBombesinaNeuromedina O
+ Actividad NK
¿¡Qunita general pFO9flfltO- para la ¿no d¡¡hieJtf a de la rnpnedaln¿iuifl¿ por lo¿ neu¡sopq.itldo¿ .«i~<7), bo¿nhal¿uz u. ,wcro¿ned/na (2
+ Proceso fagocítico
6. CONCLUSIONES
Conclusiones
6. CONCLUSiONES.
De los resultados obtenidos en el presente trabajo podemos deducir que los tresneuropóptidos estudiados: bombesina, ORP y neuromedina O, modulan (ti vitre aconcentraciones fisiológicas la respuesta inmune, encontrándose los mayores efectoscon el ORP a una concentración 100pM, A partir de esta conclusión general podemosconcretar las siguientes conclusiones:
1. Los tres neuropéptidos estimulan todas y cada una de las etapas del procesofagocitico de macrófagos peritoneales murinos, es decir, la adherencia a sustrato, lamovilidad dirigida o quimiotaxis, actuando además como quimioatrayentes, lafagocitosis de partículas inertes y de células, así como la destrucción del materialingerido, por medio de la producción de radicales de oxígeno.
2. Los tres neuropéptídos modulan la funcionalidad de los linfocitos. Actúan comoquimioatrayentes para linfocitos de peritoneo, ganglios axilares, bazo y timo y su efectosobre la quimiotaxis de estas células depende de la procedencia de las mismas. Así, laestimulan en linfocitos obtenidos de peritoneo y ganglios axilares, no la modifican enlinfocitos de bazo y la reducen en linfocitos de timo. Por otra parte, estimulan lalinfoproliferación espontánea y reducen la proliferación en respuesta a mitógenos tantode linfocitos T como de linfocitos E.
3. Los tres neuropéptidos de la familia de la EN estimulan, también, la actividadcitotóxica natural y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo tanto en muestrasperiloneales corno en leucocitos obtenidos de timo, bazo y ganglios axilares.
4. Los neuropóptidos estudiados producen un aumento de los niveles desecreción de Ud 11 por los macrófagos peritoneales pero no de la IL-2 liberada por loslinfocitos.
5. No es necesaria la presencia de los neuropéptidos para producir los efectos
moduladores, siendo suficiente una incubación previa de las células con los mismos.
6. Existen receptores específicos para estos neuropéptidos al menos en
140
Conclusiones
macrófagos, de des tipos, de alta y bala afinidad, por lo que los efectos observados
sobre estas células inmunes son específicos, hecho también corroborado por la
reversión de dichos efectos encontrada en presencia de un antagonista de la EN.
7, El efecto de los neuropéptidos sobre la funcionaildad de los linfocitos esindirecta y se realiza a través de las células adherentes.
8. Estos neuropéptidos ejercen su acción sobre la función linfoide a través de
algún factor soluble secretado por los macrófagos.
9. A nivel intracelular, estos neuropéptidos actúan sobre las células inmunes
estudiadas, activando la ruta de la fosfolipasa O, con elevación de los niveles de IP3 y
activación de la proteína quinasa O, e inhibiendo la actividad adenilato ciclasa,
produciendo una reducción de ANlPc.
Corno conclusión final, podemos afirmar que los neuropéptidos estudiados
estimulan l~, vitro la funcionalidad de los macrófagos murinos, uniéndose a receptores
ospecilicos en su membrana, que transmiten la señal intracelularmente a través de la
activación de la PLO, dando lugar a la secreción de factores que modulan la función de
los linfocitos y células NK, actuando como señal de activación para dichas células
inmunes.
141
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