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METABOLÓMICA NUTRICIONAL Nutritional Metabolomics Monografia Ana Cristina Monteiro da Cruz Orientada por Duarte Torres Porto, 2008
METABOLÓMICA NUTRICIONAL
Nutritional Metabolomics
Monografia
Ana Cristina Monteiro da CruzOrientada por Duarte Torres
Porto, 2008
À minha família,
Aos meus amigos,
Ao meu orientador.
Surprises in science often arise from new tools rather than from new concepts.
Madou, 2002
Índice
Lista de Abreviaturas .......................................................................................... iii�
Resumo e Palavras-chave ................................................................................. iv�
Abstract and Key words ..................................................................................... v�
1.� Introdução ................................................................................................... 1�
2.� A Metabolómica .......................................................................................... 2�
2.1.� A Metabolómica no contexto da Genómica Funcional e da Biologia de
Sistemas ............................................................................................................. 4�
2.2.� A Metabolómica Nutricional ....................................................................... 6�
2.3.� Metaboloma nutricional versus saúde ....................................................... 7�
3.� As metodologias utilizadas na Metabolómica ............................................ 12�
3.1.� Desenho experimental ............................................................................ 13�
3.2.� Medição e identificação de metabolitos ................................................... 14�
3.1.1.� Fingerprinting .................................................................................... 15�
3.1.2.� Caracterização do perfil metabólico - “profiling” ............................... 16�
3.1.3.� Análise orientad - “targeted” ............................................................ 17�
4.� Aplicações da metabolómica nas Ciências da Nutrição ............................ 19�
4.1.� Análise de subconjuntos do metaboloma por abordagens orientadas .... 20�
4.2.� Análises holísticas ................................................................................... 21�
5.� Futuro da metabolómica nas Ciências da Nutrição ................................... 25�
5.1.� Construção de redes biológicas – desenvolvimento de um novo conceito
de biomarcadores ............................................................................................. 25�
5.2.� O papel da metabolómica na nutrição personalizada .............................. 28�
6.� Análise crítica e conclusões ...................................................................... 29�
Referências Bibliográficas ................................................................................ 34�
Índice de Anexos .............................................................................................. 42�
Lista de Abreviaturas
1H RMN - Ressonância Magnética Nuclear de protão
ACP – Análise de componentes principais
ARNm – Ácido ribonucleico mensageiro
CG – Cromatografia Gasosa
CL – Cromatografia Líquida
EM – Espectrometria de massa
MN – Metabolómica Nutricional
RMN – Ressonância Magnética Nuclear
TRP – Técnicas de Reconhecimento de Padrões
Resumo e Palavras-chave
A Metabolómica é uma disciplina emergente da Genómica Funcional que se
caracteriza pela elevada capacidade de identificação, quantificação e
caracterização de pequenas moléculas presentes no metaboloma. O metaboloma
pode ser definido como o conjunto das pequenas moléculas encontradas numa
célula, órgão ou organismo.
Neste trabalho, apresentam-se os conceitos e metodologias subjacentes à análise
global de metabolitos em amostras biológicas. Inicialmente são introduzidas a
metabolómica e suas terminologias, seguidas pela abordagem da metabolómica
nutricional. Depois são abordadas as várias etapas da análise do metaboloma,
começando pelo desenho experimental de um estudo metabolómico, passando
por uma abordagem geral das técnicas analíticas mais comummente utilizadas na
separação, detecção e identificação de metabolitos e terminando na análise de
dados – um dos grandes desafios enfrentados pela ciência e tecnologia
metabolómica.
São reportadas algumas das aplicações da metabolómica na área das Ciências
da Nutrição, consideradas representativas da caracterização orientada e holística
de perfis metabólicos.
Os futuros papéis da metabolómica nutricional são discutidos, do ponto de vista
da descoberta de novos “biomarcadores holísticos” e da caracterização de
fenótipos metabólicos, num contexto da sua possível aplicação na nutrição
personalizada e na manutenção de um óptimo estado de saúde.
Palavras-Chave: metabolómica, metabonómica, nutrição, metabolómica
nutricional, biomarcadores, fenótipo nutricional.
Abstract and Key words
Metabolomics is an emerging field of Funtional Genomics, with high-throughput
identification, quantification and characterization of the small molecules in the
metabolome. The metabolome can be defined as a set of small molecules found in
a cell, organ or organism.
Concepts and methodologies underlying the global analysis of metabolites in
biological samples are presented. Initially, metabolomics and its terminologies are
introduced, followed by the application of metabolomics to Human Nutritional
Sciences. Later on, the various stages of metabolome analysis are approached,
starting with the experimental design of the study, through a general approach of
analytical techniques more commonly used in separation, detection and
identification of metabolites and completing with data analysis – one of the major
challenges facing metabolomics science and technology.
Some applications considered representative of targeted or holistic approach
characterization of metabolic profiles, in nutritional metabolomics field are
reported.
The future roles of metabolomics nutrition, in terms of new “holistic biomarkers”
discovery, and characterization of metabolic phenotypes are discussed in a
context of their possible utilizations for personalized nutrition to provide an optimal
health status.
Key words: metabolomics, metabonomics, nutrition, nutritional metabolomics,
biomarkers, nutritional phenotype.
1
1. Introdução
Ao longo dos milénios, a conexão alimento-saúde tem sido valorizada e as
diferentes civilizações têm incorporado este conceito na abordagem da cura (1).
Com o desenvolvimento das Ciências da Nutrição, entendemos que os nutrientes
e outras substâncias alimentares obtidas aquando da ingestão de uma grande
variedade de alimentos promovem a saúde, mantêm a homeostasia metabólica e
preenchem os requisitos energéticos (1). A nutrição modula os aspectos físicos e
cognitivos do desempenho e tem um efeito importante sobre o risco de doença.
Estima-se que a nutrição pode contribuir em 50% ou mais para o risco de doença
e, dependendo do individuo, pode ser tão importante ou mais do que factores
ambientais, tais como o tabaco (2). A ligação entre a alimentação, a manutenção
da saúde e o desenvolvimento de doenças crónicas tem-se tornado evidente nos
últimos anos, tendo a alimentação assumido o papel decisivo como agente
preventivo de doença e promotor de saúde (3).
Os nutricionistas têm-se debatido para deduzir a base mecanística da relação
entre a alimentação e a saúde, através do entendimento da interacção entre
nutrientes e vias metabólicas. O elevado ritmo a que a informação tem sido
gerada, no últimos 10 anos, traduzir-se-á num aprofundar do conhecimento
acerca das complexas relações entre o metabolismo humano ou animal e os
alimentos. As Ciências da Nutrição poderão então decifrar os mecanismos de
acção de alimentos e dietas promotores de saúde (4).
As novas ferramentas para o estudo do metabolismo incluem a genómica, a
proteómica, a metabolómica e as ferramentas modernas da bioinformática. Serão
estas as forças motrizes capazes de integrar na comunidade científica
conhecimentos sobre ligações entre o que somos e o que comemos. A genómica
2
(estudo dos genomas dos organismos) fornece a matriz e a proteómica (estudo
de todas as proteínas expressas numa célula, tecido ou organismo) fornece as
estruturas e as actividades catalíticas. Todavia, num determinado momento, o
desempenho de um organismo no seu ambiente é reflectido mais nitidamente
pelo seu metabolismo dinâmico, que terá de ser medido por caracterização
fenotípica metabólica quantitativa ou seja, metabolómica (5).
2. A Metabolómica
Com o Projecto do Genoma Humano, a comunidade científica começou a encarar
os organismos de uma forma completamente renovada. Contrariamente ao
paradigma do último século, os genes não são o ponto culminante e a razão de
todas as investigações sobre o funcionamento da vida. A sequenciação é,
portanto, apenas o primeiro passo na compreensão dos organismos a um nível
molecular e a maioria das perguntas permanece sem resposta. Para chegar à real
função dos genes, os sistemas biológicos devem ser analisados em diferentes
níveis de controlo – através de parâmetros externos (ambiente, o estádio de
desenvolvimento, os sinais moleculares, etc) e de parâmetros internos
(transcrição e degradação de ácido ribonucleico mensageiro (ARNm), modificação
pós-tradução, dinâmica proteica e concentrações e fluxos de metabolitos). A
metabolómica, ou seja, a identificação e quantificação de todos os metabolitos de
baixo peso molecular numa amostra biológica (metaboloma), desempenha um
papel fundamental em toda esta análise (6).
Os pioneiros da metabolómica foram um grupo de cientistas, liderado por Jeremy
Nicholson, agora a trabalhar no Imperial College of London. Porém apenas em
3
1999, o termo metabonómica foi definido pelos mesmos como a “medida
quantitativa da resposta metabólica dinâmica e multiparamétrica dos sistemas
vivos a estímulos patofisiológicos ou a modificações genéticas (7)”. Mais tarde, em
2001, o termo “metabolómica” foi introduzido por Oliver Fiehn e definido de forma
ligeiramente diferente como “a análise quantitativa e abrangente de todos os
metabolitos num sistema (8)”. Apesar de permanecerem algumas diferenças de
conceito, há uma grande sobreposição de filosofias e metodologias e os dois
termos são frequentemente usados indiferenciadamente por cientistas e
organizações. No entanto, alguns autores fazem a distinção entre estudos
metabolómicos em sistemas simples (celulares) e estudos metabonómicos em
sistemas complexos (de tecidos, ou organismos) (9). Apesar do termo
“metabolómica” ser agora mais amplamente aceite (10), os leitores são avisados a
conduzir as pesquisas de literatura com ambos os termos (11). Neste trabalho o
termo metabolómica será utilizado englobando as duas ciências.
A metabolómica pretende detectar mudanças na distribuição e concentração de
uma larga gama de metabolitos em matrizes biológicas e tecidos, recorrendo,
principalmente, ao uso de tecnologias baseadas em espectroscopia por
Ressonância Magnética Nuclear (RMN) (12-16) e Espectrometria de Massa (EM) (17-
21). A metabolómica não estuda apenas as concentrações estáticas de metabolitos
celulares ou de metabolitos endógenos nos biofluídos. Estuda a dinâmica das
concentrações de metabolitos ao longo do tempo, incluindo moléculas que
resultam de processos químicos, não enzimáticos, e moléculas que surgem como
consequência de interacções intergenómicas, como as decorrentes da interacção
entre microflora do intestino e o hospedeiro.
4
O Prémio Nobel de 2002, Sidney Brenner, em 1980, declarou que “os progressos
no domínio da ciência dependem de novas técnicas, novas descobertas e novas
ideias, provavelmente por esta ordem”. As plataformas analíticas modernas
permitem uma medição simultânea de vários metabolitos, possibilitando novas
perspectivas na compreensão das funcionalidades das células e de todo o
organismo (4).
A metabolómica é um novo domínio da ciência, encontrando-se em fase de
crescimento exponencial, será central à biologia nas próximas décadas. Vivem-se
tempos emocionantes neste domínio, experiencia-se um estado de crescimento e
agitação sem precedentes. Estão a ser criadas novas sociedades, como a
Metabolomics Society (www.metabolomicssociety.org) (22), fundada em 2004;
estão a surgir novos jornais dedicados a este domínio científico (Metabolomics,
Springer) (23). Para ilustrar o crescente interesse na área da Metabolómica, em
especial no âmbito das Ciências da Nutrição, foi conduzida uma pesquisa restrita
aos termos [metabolomics OR metabonomics AND nutrition], na base de dados
ISI Web of knowledge. Desta pesquisa resultaram 1407 artigos publicados entre
1991 e 2007. Ao dividir as publicações por ano, verifica-se um crescimento
significativo desde 2003 (Anexo 1 - Gráfico 1).
2.1. A Metabolómica no contexto da Genómica Funcional e da Biologia
de Sistemas
Tem sido reconhecida a complexidade da biologia molecular no seu estudo das
interacções entre factores genéticos e ambientais. É agora aceite que a
compreensão destas interacções é impossível ao nível da transcritómica e difícil
com a proteómica. Na realidade, o estudo das pequenas moléculas (metabolitos)
5
envolvidas nos processos bioquímicos fornece informação de inigualável valor
sobre o estado e o funcionamento de um sistema vivo. O sistema biológico
humano é muito extenso e a integridade funcional da fisiologia humana reflectida
no fenótipo depende não só dos polimorfismos no nucleótido, mas também de
vários factores externos tais como os ambientais e comportamentais, e mesmo da
interacção com outros genomas de organismos simbióticos como os da microflora
do intestino (24-26). Os dados da expressão genética e os dados proteómicos
apenas indicam o potencial para mudanças fisiológicas, porque alguns
mecanismos de feedback simplesmente não são reflectidos na concentração de
proteínas ou na expressão genética. Por outro lado, as concentrações de
metabolitos e cinéticas reaccionais nas células, tecidos ou órgãos representam
parâmetros quantificáveis reais de processos fisiológicos de regulação (25, 27).
A genómica, a transcritómica, a proteómica e a metabolómica, em conjunto com a
bioinformática, constituem a disciplina da genómica funcional, que é também
referida como a biologia de sistemas (28). Este conceito relaciona-se com a
integração da informação proveniente dos diferentes níveis de expressão genética
(ARNm, proteína e metabolitos) (4).
A biologia de sistemas fornece informação sobre as vias metabólicas, permitindo
a monitorização de variações subtis resultantes dos efeitos nutricionais e a sua
integração na investigação nutricional conduziu ao desenvolvimento da Genómica
Nutricional, ou Nutrigenómica, que aborda o modo como a alimentação influencia
a transcrição genética, a expressão proteica e o metabolismo (28-30). Por sua vez, a
Genética Nutricional, ou Nutrigenética, tenta compreender como o fundo genético
coordena a resposta à dieta (31-34). A Nutrigenómica e a Nutrigenética são,
portanto, duas disciplinas com abordagens diferentes, mas ambas objectivam a
6
compreensão da interacção entre a alimentação e os genes e da forma como a
alimentação modula os mecanismos moleculares (35).
2.2. A Metabolómica Nutricional
No âmbito das Ciências da Nutrição a transcritómica, a proteómica e a
metabolómica aplicam-se, fundamentalmente, para avaliar as adaptações a nível
molecular em resposta à ingestão de nutrientes, como ilustra a Figura 1 (Anexo
2). A transcritómica pode gerar uma visão holística sobre as alterações da
expressão genética nas intervenções dietéticas. A proteómica é ainda mais
desafiante devido à maior complexidade dos proteomas comparativamente aos
transcritomas e metabolomas. A metabolómica, como ferramenta de estudo do
metaboloma – o conjunto de pequenas moléculas presentes num organismo, que
pode ser considerado como a expressão final do seu genótipo a alterações
ambientais (36, 37) - é complementar à transcritómica e proteómica, mas tem, no
entanto, vantagens importantes (38). Embora se espere que as mudanças nas
quantidades de enzimas individuais tenham um pequeno efeito nos fluxos
metabólicos, elas podem ter efeitos significativos nas concentrações de
numerosos metabolitos individuais. Para além disso, o metaboloma está mais
distante na linha entre o gene e a função e assim reflecte melhor as actividades
da célula a um nível funcional. Assim, como resultado a jusante da expressão
genética, espera-se que as mudanças no metaboloma sejam amplificadas
relativamente às mudanças no transcriptoma e proteoma (39).
A aplicação da metabolómica à área da nutrição encara desafios únicos pois o
conhecimento sobre o impacto que as mudanças no conteúdo de nutrientes da
alimentação têm nos perfis metabólicos ainda é exíguo. No entanto, o conceito de
7
Metabolómica Nutricional (MN) tem emergido rapidamente e esta tem sido
identificada como uma abordagem promissora para avaliar funcionalidades de
alimentos e nutrientes através da medição simultânea de múltiplos parâmetros
metabólicos quantificáveis em organismos complexos (40). A MN é uma
abordagem única para avaliar respostas às deficiências ou excessos de nutrientes
e compostos bioactivos. Além disso, a MN é utilizada para caracterizar o fenótipo
metabólico de indivíduos integrando polimorfismos genéticos, interacções
metabólicas com parceiros comensais ou simbióticos como a microflora intestinal,
bem como factores ambientais e comportamentais, incluindo preferências
alimentares (4).
A MN será capaz de caracterizar modulações metabólicas induzidas por
alimentos ou nutrientes dentro de um sistema metabólico altamente dinâmico
exposto simultaneamente a vários factores ambientais (4, 24). Espera-se que estas
modulações sejam mais subtis do que as associadas a condições toxicológicas ou
patológicas. Além disso, os efeitos biológicos em nutrição não podem ser
reduzidos à acção de uma única molécula, pois resultam da interacção do
metaboloma do consumidor com o metaboloma do alimento que fornece tanto
nutrientes como compostos não nutrientes. A resposta metabólica é multifactorial
e reflecte a modulação de muitas vias metabólicas ao mesmo tempo, o que é, a
priori, muito mais difícil de distinguir, quando comparada com um mecanismo
único (4, 24, 25, 41).
2.3. Metaboloma nutricional versus saúde
Rapidamente se tem tornado possível medir centenas ou milhares de metabolitos
em pequenas amostras de biofluídos ou tecidos. O primeiro desafio da MN será
8
identificar todos os químicos que estão ligados ao metaboloma nutricional
humano, presentes nos diferentes biofluídos. O segundo maior desafio encontra-
se na forma de trabalhar com os grandes conjuntos de dados obtidos, nos quais
muitos compostos permanecem não identificados. Ainda não está publicamente
disponível, uma biblioteca suficientemente abrangente de pequenas moléculas
com espectros RMN e EM (42). Na persecução deste propósito, estão a ser
levadas a cabo algumas importantes iniciativas internacionais.
A Molecular Libraries Screening Center Network, uma iniciativa do National
Institutes of Health (11), aloja numa base de dados a informação de pequenas
moléculas metabólicas (peso molecular inferior a 500 dalton) (43). A PubChem irá
recolher, numa fase inicial, dados de 500000 substâncias químicas (40). O governo
do Canadá, através da organização financiada Genome Canada, apoia, desde
2005, e durante 3 anos, o projecto The Human Metabolome Project (44). Cerca de
7.5 milhões de dólares estão a ser utilizados para identificar, quantificar, catalogar
e armazenar todos os metabolitos que podem ser encontrados em tecidos e
biofluídos humanos em concentrações superiores a 1 milimolar (mM). O projecto
prevê tornar estes dados acessíveis em formato electrónico para todos os
investigadores, através da Human Metabolome Database (www.hmdb.ca). Para
além disso, todos os compostos serão sintetizados e isolados podendo ser
adquiridos na Human Metabolome Library (www.metabolibrary.ca) (45).
O valor de definir uma base de dados quantitativa única, acessível
electronicamente, bem registada, contendo dados metabólicos extensos,
registados por fenótipo, é inegável e representa um recurso chave para o futuro
da saúde humana. A Tabela 1 (Anexo 3) resume os principais tipos de bases de
dados e os esforços internacionais actuais na persecução desse objectivo.
9
O contributo da bioinformática, com a sua capacidade para lidar com grandes
séries de dados e o seu valor na avaliação do risco de doença fará com que a MN
beneficie de uma cada vez maior capacidade analítica quantitativa. Este ponto
pode ser ilustrado usando a medição do colesterol sérico como exemplo. O valor
do prognóstico da doença cardiovascular através de medições de biomarcadores
aumentou à medida que níveis adicionais de análises técnicas foram adicionados:
as medições de colesterol total foram reforçadas quando a avaliação de LDL foi
acrescentada; esta foi melhorada quando as medições de HDL foram
adicionadas, e posteriormente melhoradas, com a adição da homocisteína,
fibrinogénio, lipoproteínas (a), dimensão das partículas de LDL e proteína-C
reactiva (46).
Cada indivíduo é distinto fenotipicamente, quer na aparência física, quer na
fisiologia e na resposta aos estímulos ambientais (47). A fixação das medições
potencialmente relevantes para a nutrição e para a saúde, num conjunto integrado
de informações genéticas, proteómicas, metabolómicas, medições
antropométricas e comportamentais, irão servir para estimar o real estado
nutricional, a que chamamos fenótipo nutricional (48), representado na Figura 2
(Anexo 4).
2.3.1. Tipo de amostras usadas na análise do metaboloma
O sangue, a urina e a saliva são as fontes de biofluídos mais importantes para a
metabolómica humana (40). O tipo de amostras a serem analisadas e a frequência
da sua amostragem dependem da questão científica colocada (36), no entanto na
maioria dos casos, são usadas a urina e o plasma.
10
Os perfis metabólicos da urina fornecem uma representação das alterações
metabólicas de curto a médio prazo e codificam também informações sobre as
actividades metabólicas da flora microbiana (49, 50). O plasma revela
acontecimentos metabólicos mais instantâneos e transporta informações sobre a
dinâmica dos nutrientes e metabolitos no metabolismo inter-órgãos. Este é o tipo
de amostra que mais se adapta ao estudo de redes biológicas de micronutrientes
(4, 51).
A metabolómica é também cada vez mais aplicada no estudo de matéria fecal que
pode transportar informação sobre a saúde do tracto intestinal, sobre a eficiência
digestiva, e sobre a microflora intestinal (52).
2.3.2. O metaboloma e os compostos não-nutrientes
Os compostos não nutrientes com efeitos metabólicos potenciais, como por
exemplo os fitoquímicos, juntamente com as centenas de milhares de compostos
alimentares que não têm efeitos metabólicos, mas que tornam a comida um
prazer gastronómico, devem todos ser tomados em conta na análise do
metaboloma (Anexo 5, Figura 3) (40).
Vale a pena considerar alguns exemplos de não nutrientes. Os ácidos salicilúrico
e salicílico, que estão geralmente presentes em frutos e hortícolas, são
excretados pela urina em concentrações mais elevadas em vegetarianos do que
em omnívoros (53). Certos alimentos são conhecidos por produzir alterações
óbvias na urina de alguns, mas não de todos os indivíduos; a beterraba pode
produzir urina vermelha; os espargos podem dar origem a uma urina com um mau
odor (54). Os metabolitos do café são detectados na urina recolhida 4-5 horas após
a ingestão de café (55). A presença de metabolitos da quercitina no sangue e urina
11
após a ingestão de 270 g de cebola frita foi estudado e 18 dos metabolitos da
quercitina foram recolhidos 0-4 h após a refeição testada (56). Num estudo, foi
descrito que a concentração de aminas heterocíclicas, que são produzidas
quando as carnes são grelhadas, aumentava 14-18 vezes na urina no dia em que
o bife grelhado era ingerido e retomavam os níveis basais após 48-72 h da
cessação da ingestão de carne (57).
Está, portanto, claro que cuidadosas intervenções alimentares crónicas poderiam
ser desfeitas pela ingestão aguda de diferentes alimentos antes das amostras
finais de biofluídos serem recolhidas. Assim, os não nutrientes alimentares, que
podem não ser importantes em farmacologia ou toxicologia, podem ser
extremamente importantes em estudos alimentares no Homem que visam utilizar
a metabolómica. Uma decisão que necessita de maior consenso na área da MN
será abordar os metabolitos humanos endógenos e os componentes exógenos
dos alimentos que coexistem pelo menos transitoriamente nos biofluídos
humanos (40).
2.3.3. O metaboloma e a microflora intestinal
O “metaboloma ingerido” que se mistura no tempo e espaço com nutrientes e
intermediários do metabolismo do hospedeiro e também com a microflora
intestinal metabolicamente activa confere grande complexidade ao metaboloma
mamífero.
Os humanos saudáveis têm 400-500 espécies microbianas no seu intestino
grosso. Estas podem distribuir directamente compostos do seu metaboloma para
o metaboloma humano, que ou são absorvidos e contribuem para o metabolismo
humano (como por exemplo os aminoácidos, vitaminas e substratos energéticos)
12
ou então não são considerados metabolicamente importantes (40). A disparidade
das actividades da microflora intestinal associada com a variabilidade da
alimentação representa o maior determinante da grande variabilidade inter-
individual metabólica observada em humanos (49, 58-60).
3. As Metodologias utilizadas na Metabolómica
O processo de trabalho da MN implica o uso simultâneo de técnicas de química
analítica para gerar perfis metabólicos e de técnicas de exploração de dados para
recuperar informações metabólicas relevantes (61).
Nenhuma plataforma analítica é capaz de medir e identificar todos os metabolitos
simultaneamente. Por conseguinte, técnicas de separação e de análise
quantitativa são acopladas para completar o estudo de amostras (5). A aquisição
de dados metabólicos, como já foi referido, pode ser realizada por estratégias
analíticas baseadas principalmente em EM e espectroscopia por RMN (16). Na
Tabela 2 são referidas as principais características de cada técnica (Anexo 5). A
análise de dados adquiridos termina com a transformação da informação
metabólica numa hipótese biológica que pode ser conseguida através da
observação directa das vias metabólicas estabelecidas ou com a ajuda de
modelação matemática de redes metabólicas (62, 63).
A desvantagem da ampla aceitação da tecnologia metabolómica é que vários
protocolos, métodos e estruturas de comunicação desenvolveram-se dentro das
sub-disciplinas que empregam a tecnologia. Como tal, revela-se também
importante padronizar procedimentos experimentais da metabolómica e métodos
de comunicação de dados entre os grupos que abordam assuntos semelhantes
13
(64). O grupo de trabalho Standard Metabolic Reporting Structures (SMRS)
publicou um sumário de recomendações e padrões para a caracterização do perfil
metabólico no qual é apresentada uma versão abreviada dos requisitos mínimos
propostos para o desenho e registo dos dados de um estudo metabólico (23).
É consensualmente aceite que um estudo metabolómico engloba 3 passos
principais:
� Desenho experimental;
� Medição e identificação de metabolitos;
� Análise da relação entre metabolitos.
3.1. Desenho experimental
A variação bioquímica inter-individual no metabolismo é geralmente maior em
humanos do que em modelos animais devido à sua maior diversidade em factores
genéticos e ambientais. A maior variabilidade inter-individual deve-se também a
maiores diferenças na alimentação, ao ciclo circadiano, ao género e ciclo
menstrual, ao estado de saúde e a uma vasta gama de componentes do estilo de
vida como o tabagismo, o consumo de álcool, ou a actividade física, por exemplo.
Como consequência, a MN requer um cuidadoso desenho experimental. Para
lidar com a variação metabólica inter-individual, devem conduzir-se estudos de
intervenção alimentar cuidadosamente controlados, onde cada indivíduo consome
uma dieta definida e participa nas intervenções de teste e de controlo (4).
A padronização das dietas é reconhecida como uma boa precaução para reduzir
as variações metabólicas que não estão ligadas à intervenção propriamente dita.
Assim, é um pré-requisito, o controlo de fontes e quantidades de macro- e
micronutrientes consumidos (58, 59, 65). Walsh e colegas examinaram o efeito da
14
padronização alimentar nos perfis metabólicos de biofluídos de humanos
saudáveis e observaram uma redução importante na variabilidade inter-individual
no perfil metabólico de amostras de urina (60). Assfalg e colegas demonstraram
que através da recolha de múltiplas amostras de urina ao longo do dia, pode-se
eliminar o efeito da variabilidade diária no metaboloma da urina (66).
É frequentemente usado o desenho de estudo aleatorizado duplamente cruzado.
O número de participantes num estudo deve ser fixado de acordo com os
requerimentos estatísticos, isto é, um número suficiente de indivíduos agrupados
por classe, para originar modelos estatísticos robustos e interpretáveis. Os
critérios de selecção de participantes são também fundamentais. Geralmente,
para esta selecção é levado a cabo um pré-estudo utilizando parâmetros
biológicos (índice de massa corporal, pressão sanguínea) e parâmetros químicos
convencionais (colesterol sanguíneo, perfil lipídico, glicemia, uremia, etc.).
Adicionalmente, são aplicados questionários sobre o estilo de vida e alimentação
destinados a recolher informações que podem ser responsáveis pela variabilidade
bioquímica inesperada. O âmbito desta aplicação é usar a informação para a
interpretação de perfis metabólicos pouco usuais e para a identificação de
alimentos que podem ter influenciado particularmente os perfis metabólicos dos
biofluídos (4). Por exemplo, está claramente estabelecido que a presença de óxido
de trimetilamina (TMAO) na urina, pode estar associado ao consumo de peixe (13).
3.2. Medição e identificação de metabolitos
A escolha de uma estratégia analítica adequada exige uma formulação clara do
problema para o qual queremos obter respostas. Algum conhecimento prévio
pode simplificar bastante ao permitir-nos dividir os problemas em sub-problemas,
15
possibilitando o planeamento de uma estratégia analítica mais sensível ou uma
estratégia orientada. O planeamento eficaz de uma estratégia para a análise do
metaboloma requer que se considerem as seguintes questões: que tipo de
informação é necessária? que tipo de química é esperada? e que tipo de métodos
analíticos estão disponíveis? (67) Em geral, as abordagens para a análise do
metaboloma estão divididas em 3 tipos diferentes, como podemos ver na Tabela 3
(Anexo 7). No entanto há autores que consideram 5 tipos de abordagens
diferentes (68).
3.2.1. “Fingerprinting”
Nesta estratégia obtém-se uma assinatura química através da análise directa da
amostra biológica em bruto. Estas assinaturas são uma ferramenta eficaz para
comparar e classificar amostras, mas não fornecem sempre informação sobre a
presença de metabolitos específicos, sejam eles conhecidos ou não, pois o
fingerprinting envolve a detecção de todos os metabolitos dentro de uma amostra
sem ter em conta a sua identificação (67, 69).
As técnicas de fingerprinting são habitualmente utilizadas para rastrear um
sistema biológico diferenciado e ver se os metabolitos estão presentes no material
de controlo e de teste, proporcionando assim uma primeira abordagem, mais
barata e rápida em relação à caracterização do perfil metabólico (69). Em princípio,
as alterações nas assinaturas químicas devidas à presença/ausência ou
alterações na concentração de metabolitos podem oferecer evidências precoces
de doenças. A maior falha apontada a esta “fotografia instantânea” do
metaboloma é a sua forte variabilidade diária.
16
Assfalg e colegas mostram que uma análise estatística rigorosa realizada ao
espectro de RMN de amostras de urina revela uma parte invariável característica
de cada pessoa, que pode ser extraída das análises de amostras múltiplas de
cada indivíduo. Estas descobertas fornecem evidências de que os fenótipos
metabólicos individuais podem existir e abrem novas perspectivas aos estudos
metabolómicos (66).
3.2.2. Caracterização do perfil metabólico - “profiling”
A caracterização do perfil metabólico envolve a detecção, quantificação e, quando
possível, a identificação de metabolitos dentro de um extracto, empregando
vulgarmente separação por cromatografia (ou seja, CG ou CL) ou electroforese
capilar (EC) acopladas à EM (67, 69). Os metabolitos identificados podem então,
posteriormente, ser quantificados e correlacionados uns com os outros e também
com as suas potenciais vias metabólicas. As vias metabólicas alteradas são
depois relacionadas com os sistemas biológicos correspondentes.
É geralmente aceite que para a caracterização metabólica de um extracto inteiro
sem viés, devem ser empregues várias tecnologias. Os perfis metabólicos mais
ricos serão mais facilmente obtidos pelo emprego de uma sequência de métodos
de extracção e instrumentos analíticos devido ao facto de que nenhum método é
isento de enviesamento para determinado grupo de compostos (38, 69, 70).
O profiling é a principal abordagem da metabolómica que permite a comparação e
estudo detalhado de metabolomas de estados fenotípicos distintos
(saúde/doença, magreza/obesidade, dieta com baixo teor de gordura/ dieta com
elevado teor de gordura) (51).
17
3.2.3. Análise orientada “targeted”
A análise orientada visa detectar e quantificar metabolitos que participam numa
parte específica do metabolismo (67). Podem ser usadas várias técnicas analíticas
de acordo com o(s) metabolito(s) a detectar.
3.3. Análise de dados
A análise dos complexos dados metabolómicos é realizada por programas
informáticos desenvolvidos especificamente para cada plataforma analítica. Está
em curso a introdução de programas informáticos fáceis de utilizar e a custo
acessível para cada ferramenta.
As técnicas de reconhecimento de padrões (TRP) e outras ferramentas de análise
estatística multivariada são usadas para extrair o máximo de informação em
dados de espectroscopia (61). Dependendo do modelo matemático em construção,
as técnicas estatísticas utilizadas na metabolómica podem ser divididas em
técnicas não-supervisionadas e em técnicas supervisionadas.
As técnicas não-supervisionadas como a ACP (análise dos componentes
principais) são geralmente aplicadas para explorar a variância estatística global
com o objectivo de aglomerar perfis metabólicos semelhantes e detectar valores
atípicos. Simples algoritmos de aglomeração não-supervisionados (que não
requerem conhecimento a priori da classe da amostra), como a ACP, permitem a
visualização de dados biológicos baseados nas semelhanças e diferenças
inerentes relativamente à composição bioquímica. Normalmente, é aplicada nos
estádios iniciais de uma investigação a fim de apresentar uma visão geral da
informação contida em cada conjunto de dados. A ACP cria um resumo de dados,
que podem ser analisados graficamente.
18
A análise da variância dos valores atípicos pode fornecer importantes informações
sobre as alterações metabólicas, isto é, fortes respostas a um estímulo específico.
Posteriormente há que decidir a remoção dos valores atípicos da análise
estatística, considerando as possíveis perdas de informação metabólica e a
robustez dos modelos obtidos. Uma análise cuidadosa dos valores atípicos é
essencial se a investigação requer a aplicação de técnicas supervisionadas
(necessitando a priori de conhecer o tipo de amostra) que são frequentemente
empregues em MN.
Dentro das várias técnicas supervisionadas, as mais populares na investigação
em MN, são baseadas no método de regressão multivariada dos mínimos
quadrados parciais (PLS) ou de regressão multivariada dos componentes
principais (RCP). Estas técnicas utilizam o conhecimento obtido durante o
desenho do estudo, o que permite separar as observações em, pelo menos duas
classes diferentes e, desta forma, usar métodos multivariados mais avançados
(71). As técnicas supervisionadas aplicam-se quando se associa a ingestão de
alimentos específicos ou ingredientes individuais a uma resposta metabólica, pois
entende-se que esta seja subtilmente distinta da variabilidade metabólica global.
As TRP já foram usadas na investigação metabolómica para, por exemplo,
separar com sucesso os casos e controlos na doença cardiovascular (72),
esclerose múltipla (73), hipertensão (74), no cancro do epitélio do ovário (75), para a
detecção de erros inatos do metabolismo, para espécies de animais (76), para
estirpes de animais dentro de espécies (77), para animais tratados com fármacos
(78) ou alimentados com diferentes dietas, ou para humanos de diferentes regiões
geográficas (58, 79).
19
4. Aplicações da metabolómica nas Ciências da Nutrição
A metabolómica tem sido identificada como uma abordagem promissora para
avaliar funcionalidades de alimentos e nutrientes através da medição simultânea
de múltiplos parâmetros metabólicos quantificáveis em organismos complexos.
Nos últimos 10 anos, inúmeros cientistas discutiram o elevado potencial da MN
para entender mais a fundo as relações complexas entre o metabolismo humano
e os alimentos (4). A MN tenta, pois, decifrar as alterações metabólicas na
resposta a compostos alimentares específicos, produtos alimentares ou dietas.
Esta informação poderá ser incorporada no desenvolvimento de determinadas
composições alimentares que ajudem a manter a saúde e a prevenir a progressão
da doença (4, 36). Na descoberta de biomarcadores onde a priori os alvos
metabólicos não são sempre evidentes, prefere-se a caracterização do perfil
metabólico holístico porque é mais adequada para explorar variações metabólicas
inesperadas em organismos complexos (36).
De um ponto de vista técnico, podem distinguir-se as abordagens orientadas,
(onde as medições são focadas em metabolitos específicos ou na sub-
caracterização do perfil metabólico de famílias moleculares, isto é, lipídeos (80-82),
aminoácidos (80, 83), ácidos biliares, ácidos orgânicos), de abordagens mais
holísticas onde não é feita nenhuma selecção prévia de metabolitos (4).
O conceito de rastrear uma vasta gama de metabolitos seleccionados, em
sistemas biológicos, também foi aplicado a estudos com isótopos estáveis,
denominando-se assim metabolómica baseada em marcadores (84). Esta última
abordagem é interessante pois complementa o conhecimento gerado pela
metabolómica baseada nas múltiplas concentrações de metabolitos com os
20
cálculos e a análise da distribuição dos fluxos moleculares dentro de uma rede de
reacções bioquímicas.
4.1. Análise de subconjuntos do metaboloma por abordagens orientadas
Não será aqui feita uma revisão completa das diferentes aplicações de análises
orientadas no domínio nutricional, mas alguns exemplos encontram-se resumidos
na Tabela 4, no Anexo 8.
Uma abordagem metabolómica para a determinação de metabolitos responsáveis
pelos efeitos da ingestão excessiva de aminoácidos foi descrita por Noguchi e
colegas (83).
Matsuzaki e colegas investigaram o efeito metabólico do excesso de leucina
alimentar (80, 82). Todos os dados foram consistentes com os efeitos exercidos pelo
excesso de leucina através da sobrecarga do metabolismo do azoto e que a ureia
ou o �-ceto-isocaproato pode ser um marcador precoce para o limite superior da
ingestão de leucina.
Watson reviu as técnicas analíticas que permitem a extracção e a análise de
lipídeos biológicos, isto é, lipidómica.(81) A lipidómica, como um ramo da
metabolómica é uma abordagem que visa um entendimento abrangente da
influência de todos os lipídeos num sistema biológico, no que diz respeito às suas
várias facetas (sinalização celular, arquitectura membranar, modulação da
transcrição e tradução, interacções célula-célula e célula-proteína, etc).
Watkins e colegas usaram a caracterização quantitativa do perfil metabólico em
ratinhos deficientes em fosfatidiletanolamina N-metiltransferase (PEMT)
alimentados com dietas com várias concentrações em colina (82). Estes resultados
21
indicaram que a suplementação em colina tem efeitos benéficos em alguns, mas
não em todos os fenótipos induzidos pelo knockout.
4.2. Análises holísticas
A literatura relata vários estudos com abordagens metabolómicas holísticas para
a avaliação de alterações metabólicas em resposta a alimentos, ingredientes e
suplementos bioactivos, bem como componentes relacionadas com o estilo de
vida. Além disso, há um crescente interesse em entender a contribuição
metabólica e fisiológica do metaboloma da microflora do intestino em organismos
complexos. Não será aqui feita uma revisão completa das diferentes aplicações
de análises holísticas no domínio nutricional, mas serão reportadas algumas das
aplicações consideradas mais representativas (Tabela 5, Anexo 7).
A metabolómica foi destacada como uma abordagem eficiente para entender
alterações metabólicas associadas com a restrição calórica (85, 86), suplementação
com vitamina E (87), para avaliar efeitos de ingredientes activos como os polifenóis
(88-90), estimulação do stress (91) e processo de envelhecimento em modelos
animais (92). A metabolómica foi também aplicada para decifrar os efeitos
metabólicos causados pela ingestão de isoflavonas de soja (89, 93), chá (94) e
camomila (95).
Recentemente, Selman e colegas examinaram as alterações metabólicas
induzidas por restrição calórica (RC) aguda (85). Neste estudo, concluíram que as
alterações e metabólicas dos ratos submetidos a RC aguda rapidamente se
assemelharam àquelas apresentadas numa situação crónica, sugerindo que os
efeitos benéficos da RC podem requerer apenas uma redução de curto prazo na
ingestão calórica.
22
Griffin e colegas aplicaram a metabolómica ao estudo do efeito da suplementação
em vitamina E (87). Esse estudo demonstrou a eficácia da metabolómica na
caracterização de fenótipos metabólicos de uma dada alteração genética.
Solanky e colegas investigaram as alterações metabólicas que se seguiram a
uma intervenção alimentar com isoflavonas de soja (89). Esse estudo sugeriu
alterações do metabolismo energético induzidas pela soja. Dois anos mais tarde,
voltaram a conduzir um estudo semelhante sobre os efeitos das isoflavonas de
soja conjugadas (glicosídeos) e não conjugadas (agliconas) no metabolismo (90).
Desses estudos, concluiu-se que o efeito das isoflavonas conjugadas é
semelhante ao das não conjugadas mas com magnitudes diferentes devido,
provavelmente, a diferenças na biodisponibilidade.
Foram estudados os efeitos bioquímicos da epicatequina, um flavonóide bioactivo
presente em vários produtos alimentares como o chá verde, cacau e chocolate
(88). Este estudo enfatizou o potencial da metabolómica para estudar a
bioactividade dos polifenóis que ocorrem naturalmente em alimentos como o chá.
Wang e colegas aplicaram a metabolómica para avaliar, no plasma, as
consequências metabólicas da exposição ao stress e da separação maternal em
ratos, isoladamente, ou seguida de um segundo agente stressante (carência de
água) (91). Avaliaram os efeitos da suplementação alimentar com ácidos gordos
polinsaturados de cadeia longa (AGPI-CL), que podem supostamente aliviar os
efeitos do stress. No entanto, concluíram que a suplementação era incapaz de
reverter as alterações metabólicas induzidas pelo stress.
Van Dorsten e colegas compararam os efeitos do consumo de chá preto e de chá
verde no metabolismo humano (94). Este estudo demonstrou o forte potencial da
metabolómica baseada em RMN para detectar alterações metabólicas subtis,
23
relativas ao consumo de chá preto e chá verde quando comparadas com o
controlo de cafeína. A partir destes resultados, eles relataram que a ingestão de
chá pode ter efeito no metabolismo oxidativo energético e nas vias de biossíntese.
Stella e colegas aplicaram a metabolómica baseada em RMN para a
caracterização dos efeitos metabólicos, em humanos, de dietas vegetarianas,
dietas com baixa ingestão de carne e dietas com elevada ingestão de carne (59).
Esse estudo ilustra a eficácia da metabolómica para medir a influência de
modulações alimentares num metabolismo humano a curto prazo.
Lenz e colegas sublinharam as diferenças metabólicas significativas entre dietas à
base de peixe e dietas com baixa ingestão de glicídeos, derivadas de populações
suecas e britânicas, respectivamente (58).
Kochhar e colegas têm caracterizado as assinaturas metabólicas relacionadas
com o género, idade e índice de massa corporal para um melhor entendimento do
papel destas variáveis confundidoras em experiências metabolómicas (96).
Está bem estabelecido que as preferências e hábitos alimentares são
predominantemente de origem cultural, socioeconómica, psicológica e
comportamental, embora algumas características biológicas possam também ter
uma influência significativa (97-99). Muito recentemente, o metaboloma associado a
preferências alimentares específicas, exemplificadas pelo consumo de chocolate
em humanos foi avaliado (65). A modelação estatística da análise metabolómica do
plasma e urina revelam que a preferência por chocolate foi associada a uma
assinatura metabólica específica que é marcada no metabolismo mesmo na
ausência do chocolate como estímulo. Os metabolitos que contribuem para esta
preferência por chocolate são provenientes de diferenças no metabolismo
energético basal e interacções metabólicas entre o indivíduo e a sua flora
24
microbiana. Este estudo forneceu evidências para ligações entre preferências
alimentares específicas e fenótipos metabólicos e destaca a importância da
actividade da microflora intestinal que pode ser modulada por escolhas
alimentares mais do que se pensava.
A metabolómica é adequada para revelar as interacções metabólicas entre o
metabolismo do hospedeiro e os seus microrganismos simbióticos e parasitas da
população de microrganismos do cólon. Espera-se que a caracterização
metabólica e a modelação matemática desta interacção com o hospedeiro
conduzam a uma melhor compreensão das consequências na saúde a longo
prazo, associadas a uma actividade da microflora óptima ou deficiente. Num
estudo recente, Martin e colegas descreveram um modelo matemático dos efeitos
metabólicos resultantes da inoculação da população de microrganismos fecal
inadaptada num modelo animal (100). Este estudo evidencia mais uma vez que o
metabolismo microbiano intestinal tem um forte impacto em muitas vias
metabólicas de importância fisiológica primordial. Também ilustra o potencial da
metabolómica para investigar os mecanismos metabólicos de compostos
alimentares que têm como alvo a flora intestinal como os probióticos
(principalmente bactérias lácteas) ou prebióticos (principalmente fibras solúveis).
25
5. Futuro da metabolómica nas Ciências da Nutrição
5.1. Construção de redes biológicas – desenvolvimento de um novo
conceito de biomarcadores
No passado, apenas um número limitado de biomarcadores metabólicos, atributos
físicos e comportais eram utilizados para a avaliação do estado nutricional. A
investigação foi pensada para resolver hipóteses sobre as relações existentes
entre deficiências nutricionais e doenças (48). Na abordagem metabolómica, os
metabolitos devem ser medidos de tal forma que as diferenças ao nível do
metabolismo sejam identificadas antes dos indivíduos se tornarem doentes (101). A
MN permite também estender o conceito de biomarcadores ao estudo dos efeitos
metabólicos de micronutrientes na saúde (51).
Dos futuros estudos metabolómicos realizados poderão emergir diferentes tipos
de biomarcadores:
Marcadores de exposição a micronutrientes
Claramente, a concentração do micronutriente, a sua forma bioactiva e
marcadores moleculares directamente relacionados que reflectem a ingestão de
micronutrientes e o estado nutricional a curto prazo, representam as peças chave
de análises mais complexas envolvendo vias metabólicas e interacções múltiplas.
Porém, as alterações transientes nos níveis plasmáticos podem influenciar pouco
o estado nutricional a longo prazo, as reservas corporais e a saúde.
As concentrações plasmáticas do micronutriente, os níveis de enzimas
dependentes ou as concentrações de marcadores moleculares relacionados
dependem da ingestão alimentar ou da síntese endógena. A utilização de
isótopos permite construir modelos matemáticos capazes de descrever o fluxo de
26
micronutrientes entre diferentes compartimentos corporais e assim determinar a
sua origem (endógena ou exógena).
Este tipo de marcadores é pouco útil para alguns micronutrientes, como o cálcio,
onde há uma influência predominante de mecanismos homeostáticos na
manutenção das concentrações plasmáticas (51).
Marcadores de função e de resposta biológica
Os marcadores funcionais de micronutrientes estão directamente relacionados
com o seu papel bioquímico primordial. Por exemplo, a actividade das enzimas
das quais alguns micronutrientes são co-factores está directamente relacionada
com a biodisponibilidade do micronutriente. Outros factores afectam os
marcadores de função de um micronutriente tais como os polimorfismos genéticos
e o estado redox. A partir destas observações, pode entender-se a
conceptualização de uma rede biológica onde muitas vias metabólicas
interligadas se relacionam por meio das quais os micronutrientes exercem acção
na saúde metabólica (51).
Metabolitos relacionados com estado de saúde
As tecnologias metabolómicas permitem determinar uma grande gama de
metabolitos plasmáticos (102). As bases de dados em criação possibilitam a
descrição do metaboloma plasmático (103). Estes pré-requisitos permitem
complementar a abordagem orientada e funcional anteriormente descritas, com
uma abordagem aberta e holística.
Uma aplicação primordial será a determinação do perfil metabólico de distintos
fenótipos (saudável/doente, magro/obeso, dieta rica em gordura/dieta pobre em
gordura, etc). A análise das concentrações dos metabolitos será feita sem ideias
27
pré-concebidas, da estatística multivariada emergirão biomarcadores holísticos
(de perfil) explicados, posteriormente, com argumentos mecanísticos o que
conduzirá à descoberta.
Parâmetros de doença relacionados com micronutrientes
As deficiências relacionadas com micronutrientes têm sido associadas a
patologias tais como a hipertensão (104), cancro do cólon e da próstata (105), cancro
da mama, doenças cardiovasculares e osteoporose. Mas, em muitos casos, o
nosso conhecimento actual não nos permite fazer uma ligação causal com a
deficiência, apesar desta poder ser descrita como um factor de risco precoce de
doença.
Do ponto de vista bioquímico uma doença manifestar-se-á sempre por uma
alteração transiente ou crónica das concentrações de um ou, mais provavelmente,
muitos metabolitos. Para uma melhor compreensão desta abordagem, Van
Ommen e colegas definiram conceptualmente, um “espaço de saúde”, ou seja,
um espaço multidimensional construído a partir das concentrações de todos os
metabolitos ou proteínas que constituem a rede metabólica. Este “espaço de
saúde” pode ser visualizado reduzindo-o a duas dimensões com o uso de
ferramentas estatísticas como a ACP. Os indivíduos “normais” (com valores
“normais” para todos os biomarcadores) são projectados numa zona definida, e os
indivíduos (com estados de doença) são projectados nas regiões extremas à zona
saudável (51). A Figura 4 (Anexo 9) ilustra este conceito.
28
5.2. O papel da metabolómica na nutrição personalizada
Após a Segunda Guerra Mundial, vários governos começaram por estabelecer
recomendações alimentares para as suas populações de modo a identificar
doenças relacionadas com deficiências nutricionais e a tratar doenças
relacionadas com as deficiências nutricionais através de políticas de Saúde
Pública (1). Em vez de causados por deficiências de nutrientes essenciais, os
novos problemas de saúde, são o resultado de desequilíbrios alimentares e da
incapacidade de controlar rigorosamente o metabolismo dentro de um estilo de
vida (106).
Na maioria das pessoas, escolhas inapropriadas resultam em desequilíbrios
metabólicos e desta maneira acentuam os riscos de doenças tais como
aterosclerose, obesidade, diabetes tipo 2, hipertensão, alergias alimentares e
intolerâncias, distúrbios gastrointestinais e doenças inflamatórias (5). A solução
poderia ser tão simples como escolher uma melhor alimentação. No entanto, o
que é uma melhor alimentação? A mesma dieta é ideal para todos os indivíduos?
Deveria ser meta da nutrição, construir um conjunto recomendações que devam
ser seguidas por todos? Ou o objectivo das ciências da nutrição é construir um
conhecimento que permita que os seres humanos alcancem um óptimo estado de
saúde, dentro do estilo de vida que aspira para si próprio (101)? Vários autores
afirmam que as variações genéticas e fenotípicas entre humanos são tão vastas
que uma dieta óptima para um indivíduo pode predispor outro à doença (5, 101). A
estrutura de conhecimento científico básico necessário para entender a relação
indivíduo/dieta, pré-requisito de escolhas alimentares individualizadas, está,
actualmente, em construção (5).
29
Na Europa, trabalha desde o início de 2007, um Rede de Excelência financiada
pela Comunidade Europeia ao abrigo do VI Programa Quadro (13 milhões de
euros, 2007-2011) - “EURRECA - Harmonising nutrient recommendations across
Europe with special focus on vulnerable groups and consumer understanding”
(www.eurreca.org) (107), cujo objectivo primordial é criar uma rede colaborativa
sustentável para o desenvolvimento de ferramentas de apoio aos governantes na
elaboração de recomendações nutricionais harmonizadas ao longo da Europa. No
seio desta rede irá ser investigado se as recomendações podem ser dadas em
função do fenótipo nutricional de cada um (108). Nesta tarefa, especificamente, a
EURRECA colabora directamente com a “NuGO - European Nutrigenomics
Organisation” (www.nugo.org), uma Rede de Excelência, financiada pela
Comissão Europeia ao abrigo do VI Programa Quadro (17 milhões de euros,
2004-2009), com o objectivo de promover e integrar a investigação da Genómica
Nutricional na Europa. A NuGO desenvolve investigação fundamental e aplicada
em quatro vectores estruturantes: Definição do Metaboloma Nutricional;
Desenvolvimento do metaboloma nutricional – Ferramentas Analíticas; Definição
a interacção Nutrição – Metaboloma; Construção de uma Base de Dados de
Metabolómica Nutricional (109).
6. Análise crítica e conclusões
Seria errado deixar a impressão de que a ciência e tecnologia metabolómica são
apenas importantes na área da saúde humana. A metabolómica aplica-se em
vários domínios da ciência vegetal, da saúde animal e no desenvolvimento de
organismos modelo para a investigação (leveduras, bactérias ou sistemas in
30
vitro). Actualmente, o estado da arte da metabolómica encontra-se em tal
momento, que algumas destas possibilidades, e ainda outras estão à beira de ser
realidades.
A metabolómica está a desenvolver-se como uma importante ferramenta da
genómica funcional, mas ainda há muito espaço para melhorias técnicas na
determinação em larga escala de metabolitos dentro de uma amostra biológica, e
na disseminação de dados da investigação metabolómica. Entre os desafios
tecnológicos que marcam o crescimento da metabolómica, destacam-se a
necessidade de novos modelos metabólicos para facilitar a interpretação dos
resultados metabolómicos, a falta de ferramentas para a integração da
metabolómica e outros níveis da genómica funcional, o desenvolvimento de novos
métodos quantitativos sensíveis que permitam a predição de perturbações das
vias metabólicas e a necessidade de coordenar investigadores de várias áreas
(necessidade de padronização internacional dos procedimentos analíticos e
estruturação de dados), entre outros factores.
A questão chave é saber se as tecnologias genómicas, combinadas com uma
análise avançada de dados e ferramentas interpretativas, permitem uma
reconstrução e compreensão dos mecanismos metabólicos e definir melhor o
papel da nutrição humana na saúde e na doença (36).
Dadas as várias iniciativas científicas internacionais na área da metabolómica,
algumas delas referidas ao longo deste trabalho, há razões para acreditar que as
falhas e necessidades de desenvolvimento apontadas serão colmatadas num
futuro próximo e que se tornará então possível medir milhares de metabolitos em
pequenas quantidades de tecido e fluidos biológicos a custo moderado.
31
Relembre-se que há 15 anos atrás nenhum organismo vivo tinha sido
completamente sequenciado. Naquela altura, tínhamos apenas estimativas
incorrectas do número de genes que podiam ser encontrados no genoma humano
e um conhecimento escasso da complexidade da maioria dos outros genomas.
Hoje em dia, o mesmo acontece com o metaboloma humano. Temos apenas
boas estimativas sobre o seu tamanho e diversidade. Certamente que, tentar
aplicar a metabolómica em humanos actualmente, é o mesmo que tentar aplicar a
genética no início dos anos 90 do século XX (67).
A tarefa de topo da metabolómica é clara: completar o metaboloma humano.
Apenas a informação do que é o metaboloma humano normal, pode permitir a
distinção entre situações normais e anormais. No início de 2007 o grupo
Canadiano da Universidade de Alberta, liderado por David Wishart, alegou ter
construído o primeiro esboço do metaboloma humano ao publicar a Human
Metabolome Database (103). Essa notícia foi recebida com um misto de surpresa e
desconfiança pela comunidade científica que alega que os 2500 metabolitos
previstos para a base de dados representam no máximo 10% do metaboloma
humano (110).
Acredita-se que em breve seremos capazes de prever a probabilidade de uma
pessoa desenvolver uma doença durante a sua vida e assim adequar o
tratamento curativo ou preventivo de forma mais eficaz. Evidentemente que o
estudo do comportamento de moléculas como o ADN, ARNm e proteínas, apenas
nos permitirá obter parte da informação de que precisamos para observar a
resposta de um organismo complexo, como o homem, a um ambiente em
alteração constante. Para dar um retrato mais completo, temos de ser capazes de
observar marcadores dinâmicos do estado biológico – sinais em tempo real que
32
reflectem a função integrada do organismo de maneira que permitam o
diagnóstico e a predição. É aqui que a metabolómica está a demonstrar um
grande potencial.
A tabela 6 resume uma análise SWOT (111) (forças, fraquezas, oportunidades e
ameaças) da metabolómica (Anexo 9)
As Ciências da Nutrição devem ser um motor primário no desenho e realização de
cada vez mais estudos metabolómicos objectivando avanços na descoberta de
biomarcadores de estado nutricional, na variabilidade inter-individual, na definição
do fenótipo nutricional e no aperfeiçoamento das recomendações nutricionais.
A conceptualização de um fenótipo nutricional fornece uma base concreta para o
reconhecimento da nutrição como uma área que está a desenvolver e aplicar
instrumentos adequados das ciências mais actuais para compreender o
metabolismo (5, 112). A caracterização do fenótipo nutricional irá exigir a
participação de cientistas com uma ampla gama de competências (Figura 2,
Anexo 4), e os nutricionistas deverão conduzir esforços para envolver estes
potenciais colaboradores (48).
É razoável esperar que a implementação da metabolómica na prática clínica e
saúde pública irá enfrentar grandes desafios. Os nutricionistas terão a
oportunidade de influenciar a politica nutricional e as organizações de saúde a
perceber o potencial da medição dos fenótipos metabólicos e construir bases de
dados de referência do metabolismo humano durante os próximos 10 anos (5). A
redefinição do papel do nutricionista resultante da extensão da ciência e
tecnologias “ómicas” às Ciências da Nutrição Humana deverá compreender a
ampliação dos currículos, que deverão incluir uma formação adequada de
bioinformática.
33
O estabelecimento de protocolos que ligam as análises metabolómicas por RMN
ou EM aos fenótipos num padrão internacional, e a crescente criação e
disponibilização das bases de dados correspondentes, está a permitir grandes
avanços nas Ciências da Nutrição Humana. German e colegas defendem que
estas bases de dados deverão ser usadas em programas de graduação como um
eixo sobre o qual se ensina e ilustra as relações entre alimentação e saúde,
alimentação e desenvolvimento, alimentação e comportamento, genética e
resposta à alimentação, genética e escolhas alimentares e a na aplicação de
ferramentas epidemiológicas. Tal como os vários genomas estão a guiar e inspirar
a próxima geração de geneticistas e bioquímicos em volta de um consenso único
de conhecimentos básicos, as bases de dados metabolómicas irão guiar e unir os
nutricionistas na sua prossecução de associações entre alimentação,
metabolismo e saúde (5).
Claramente, a metabolómica vai ter um grande impacto na investigação na área
das Ciências da Nutrição. A sua aplicabilidade, em termos comerciais, aumentará
na medida em que novos biomarcadores baseados na metabolómica começarem
a surgir e que métodos com boa relação custo/eficácia forem estabelecidos. A
este respeito, importa ainda dizer que as estratégias analíticas, para medição de
metabolitos, são mais susceptíveis de miniaturização e monitorização remota do
que a genómica ou a proteómica, este facto aumenta a sua importância na
avaliação individual da saúde (4, 5).
34
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42
ANEXOS
Índice de Anexos
ANEXO 1 ............................................................................................................ 1�
ANEXO 2 ............................................................................................................ 2�
ANEXO 3 ............................................................................................................ 3�
ANEXO 4 ............................................................................................................ 5�
ANEXO 5 ............................................................................................................ 6�
ANEXO 6 ............................................................................................................ 7�
ANEXO 8 ............................................................................................................ 9�
ANEXO 9 .......................................................................................................... 16�
ANEXO 10 ........................................................................................................ 17�
a1
ANEXO 1
Gráfico 1 – Artigos divididos por ano de publicação obtidos na base de dados ISI Web of
Knowledge através de uma pesquisa restrita aos termos [metabolomics OR metabonomics AND
nutrition] a 28 de Agosto de 2008. Não foram incluídos os números relativos a 2008 pois seriam
apenas uma projecção do número de artigos para o ano inteiro.
a2
ANEXO 2
Figura 1 – Os alimentos são digeridos, absorvidos e distribuídos no corpo. Os diferentes alimentos
contêm macronutrientes e micronutrientes. Estes nutrientes induzem alterações ao nível do ARN,
das proteínas e dos metabolitos em células, tecidos ou organismos. As técnicas de caracterização
do perfil correspondentes, nomeadamente a transcritómica (análise da expressão genética),
proteómica (análise da expressão proteica) e a metabolómica (caracterização do perfil dos
metabolitos) são aplicadas para uma melhor compreensão e avaliação destes efeitos. Adaptada
de Kussmann, 2008 (36).
a3
ANEXO 3
Tabela 1 – Diferentes tipos e estruturas de bases de dados metabólicas
Tipos de Bases de dados
Bases de dados de laboratórios
Específicas e restritas a um assunto;
Informação muito detalhada;
Capacidade para exportar dados em formatos padronizados de modo
a permitir troca de informação com outras bases de dados.
Bases de dados baseadas em espécies
Armazenamento de perfis de metabolitos relativamente simples
através da compilação de experiências publicadas para uma espécie;
Fornecem dados para outros tipos de experiências (por exemplo,
experiências fenotípicas, de sequenciação, transcritómicas e
proteómicas);
Principal ponto de entrada de informação para relacionar espécies.
Perfis genéricos de metabolitos
Não há armazenamento de dados em bruto, mas faz-se referência (s)
aos mesmos;
Como são genéricos devem permitir comparações entre diferentes
bases de dados e entre diferentes plataformas metabólicas;
Todos os perfis metabólicos publicados para várias espécies em
diferentes estados fisiológicos;
Provável que existam poucas deste tipo, e devem, preferencialmente
mostrar os mesmos dados.
Metabolitos conhecidos para cada espécie biológica
Específicas para cada espécie;
Lista de todos os metabolitos observados num organismo, englobando
diferentes estados biológicos;
Equivalente às bases de dados genéticas que contêm listas de todos
os potenciais metabolitos que podem ser vistos num organismo.
Exemplo: Human metabolome project (44).
Todos os metabolitos conhecidos
Não são específicas para espécies.
Lista de todos os metabolitos prováveis de encontrar, com meios para
a sua identificação (113).
A deposição de dados deve estar ao nível de um único organismo e
organizada taxonomicamente.
Bases de dados de bioquímicas de referência
Representar factos bioquímicos estabelecidos (isto é, informação de
referência para a literatura).
Bases de dados metabolómicas e padrões internacionais
Armet Architecture for metabolomics
Esquema de dados para a metabolómica (114).
SMRS Standard metabolic reporting structure
a4
Discussão de questões experimentais relativas à aquisição de dados (23).
MeMo Modelagem metabolómica
Abordagem para gestão de dados metabolómicos para a genómica
funcional (115).
MSI Metabolomics standards initiative
Grupos internacionais destinados a definir as informações mínimas
exigidas durante todo o estudo metabólico (116).
Adaptada de Mendes, 2002 (117) e Goodacre 2007 (68)
a5
ANEXO 4
Figura 2 – O conceito de fenótipo nutricional é definido como um conjunto integrado de dados
sobre genética, proteómica, metabolómica, factores funcionais e comportamentais que, quando
medidos, formam a base para a avaliação do estado nutricional.
Muitas disciplinas devem ser envolvidas no desenvolvimento do fenótipo nutricional. A nutrição
deve interagir com um conjunto diverso de ciências biológicas para desenvolver os componentes
metabolómicos, proteómicos e genéticos do fenótipo nutricional. Ao mesmo tempo, as ciências
clínicas, comportamentais, e outras ciências sociais terão de colaborar na identificação e avaliação
dos componentes funcionais do fenótipo. Adaptado de Zeisel, 2005 (48).
a6
ANEXO 5
Figura 3 – Nutrientes e não-nutrientes presentes na alimentação humana. Adaptado de Gibney,
2005 (40).
a7
ANEXO 6
Tabela 2. Comparação entre metodologias baseadas em RMN e EM
Ressonância Magnética Nuclear Espectrometria de Massa
Ausência de pré-tratamento (118) Implica pré-tratamento (4)
Não é necessária pré-separação. No entanto o
acoplamento da RMN com HPLC tem sido
desenvolvido e aplicado (119)
Geralmente necessária pré-separação
por cromatografia ou electroforese (21,
67, 120)
Vulgarmente utilizada na obtenção da assinatura
metabólica (69)
Vulgarmente utilizada na
caracterização do perfil metabólico (69)
Técnica de eleição para a caracterização do
perfil metabólico holístico (118)
Técnica cada vez mais usada para a
caracterização do perfil metabólico
holístico (121)
1H RMN mais sensível do que 13C RMN (69) Elevada sensibilidade (4)
Fornece informação estrutural Fornece elevada informação sobre a
estrutura (4, 67). Identificação molecular
Variabilidade inter-plataforma e variabilidade
inter-laboratorial mais baixas (122)
Variabilidade inter-plataforma e
variabilidade inter-laboratorial mais
altas (122)
Reprodutibilidade analítica elevada (122) Reprodutibilidade analítica ainda não
tem o sucesso satisfatório (123)
Intervalo dinâmico de concentrações elevado Intervalo dinâmico de concentrações
relativamente baixo
A combinação de RMN com EM já foi ilustrada em estudos metabolómicos (17, 124, 125)
a8
ANEXO 7
Tabela 3 – Tipos de abordagens na análise do metaboloma
Fingerprinting de Metabolitos Profiling Metabólico Targeted
Técnicas
� RMN;
� Espectroscopia por Fourier transform -
(FT)-IR;
� Espectroscopia de Raman ou;
� EM com ionização por electrospray - (ESI)-EM (69).
� Cromatografia [CG ou CL] acoplada a
EM ou;
� Electroforese capilar (EC) acoplada a
EM (67, 69).
� Podem ser usadas várias técnicas
analíticas de acordo com o(s)
metabolito(s) a detectar
� Cromatografia [CG ou CL] ou
Electroforese capilar (EC) acoplada a
EM, RMN (67, 69)
Custo Menos dispendioso (69) Mais dispendioso (69)
MetabolitosDetecção de metabolitos no material
controlo e no de teste (67, 69).
Detecção, quantificação e, quando
possível, a identificação de metabolitos
dentro de um extracto (67, 69).
Detecção e quantificação de metabolitos
que participam numa parte específica
do metabolismo (67).
a9
ANEXO 8
Tabela 4 – Algumas investigações relatadas em publicações com aplicação de abordagens metabolómicas orientadas.
Abreviaturas: CAMC – Cluster Analysis of Multivariate Correlations; PEMT – fosfatidiletanolamina N-metiltransferase; DHA – ácido docosahexanóico; AA
– ácido araquidónico.
Ref. Contexto Modelo Desenho Amostras Aquisição de dados
Análisede dados
Metabolitosrelevantes
Noguchi,
2003(83)
Avaliar a adequação da ingestão de aminoácidos Ratos Fisher -- CAMC
Matsuzaki, 2005 (80)
Efeito metabólico do excesso de leucina alimentar
Ratos Fisher masculinos
Ratos foram alimentados com dietas ricas em leucina antes de recolherem amostras
Urina, sangue e fígado
CG-EM CAMC Ureia, �-cetoisocaproato
Watson,
2006 (81)
Extracção e a análise de lipídeos biológicos – lipidómica Ratinhos 3 grupos de ratinhos: deficiente
em colina, controlo, suplementado Fígado, plasma
Técnicas de separação acopladas com EM
Watkins,
2003(82)
Caracterização quantitativa do perfil metabólico em ratinhos deficientes em PEMT
Ratinhos Ratinhos alimentados com dietas com várias concentrações em colina
Separação por cromatografia de camada fina; CG
Fosfatidilcolina, triglicerídeos, colesterol plasmático, DHA e AA.
a10
Tabela 5 – Algumas investigações relatadas em publicações com aplicação de abordagens metabolómicas holísticas.
Ref. Contexto Modelo Desenho Biofluídos Aquisição de dados
Análise de dados
Metabolitosrelevantes
Selman, 2006 (85)
Análise das alterações
metabólicas induzidas por
restrição calórica aguda
Ratos C57BL/6
20 ratos machos, durante 14
catorze semanas de
restrição calórica ou ad
libitum.
Plasma RMN ACP;
PLS
Lactato, 3-hidroxibutirato,
colesterol e VLDL,
creatina plasmática e
vários aminoácidos
glicogénicos; gicose,
VLDL.
Griffin, 2002 (87)
Estudo do efeito da
suplementação em vitamina E
Ratos com
degeneração do
neurónio motor
(dnm),
2 grupos de ratos dnm e
controlo alimentados com
uma de 3 dietas com
diferentes concentrações
em vitamina E
Plasma
sanguíneo
1H RMN;
high-
resolution
magic angle
spinning
NMR
ACP;
PLS
Glicose, lactato, sinais
metil dos lipídeos,
acetato,
�-hidroxibutirato,
fenilalanina,
glutamato, glutamina,
aspartato, creatina.
a11
Tabela 5 (continuação) – Algumas investigações relatadas em publicações com aplicação de abordagens metabolómicas holísticas.
Ref. Contexto Modelo Desenho Biofluídos Aquisição de
dados
Análise de
dados Metabolitos relevantes
Solanky, 2003 (89)
Alterações metabólicas após
intervenção alimentar com
isoflavonas de soja
5 mulheres pré-
menoupáusicas
saudáveis
Intervenção alimentar
controlada com isoflavonas
de soja
Plasma 1H RMN
Análise
estatística
multivariada
Açúcares do plasma,
lactato;
lipoproteínas, isoleucina,
valina, triglicerois, colina
Solanky, 2005 (90)
Efeitos das isoflavonas de soja
conjugadas (glicosídeos) e
não conjugadas (agliconas) no
metabolismo
Mulheres pré-
menopáusicas
saudáveis
Intervenção alimentar
controlada antes e após
consumo de soja
Urina
1H RMN
Análise
estatística
multivariada
TMAO, N-acetil-glutamato,
glutamina, glutamato,
citrato, metilamina,
dimetilamina, creatina;
creatinina, hipurato
a12
Tabela 5 (continuação) – Algumas investigações relatadas em publicações com aplicação de abordagens metabolómicas holísticas.
Ref. Contexto Modelo Desenho Biofluídos Aquisição
de dados
Análise de
dados Metabolitos relevantes
Solanky, 2003 (88)
Efeitos bioquímicos da
epicatequina
Ratos Sprague-
Dawley
Amostras recolhidas de 2
animais masculinos, duas
vezes por dia (0-8 horas e 8-
24 horas), antes da dose, e
depois recolheram-se
amostras de urina após 2
dias de ingestão de 22 mg
de epicatequina através da
água de beber.
Urina 1H RMN ACP
taurina, citrato,
dimetilamina e 2-
oxoglutarato
Wang, 2006 (91).
Consequências metabólicas
em resposta à exposição ao
stress da separação maternal
isoladamente, ou seguida de
um segundo stressante
(carência de água)
Ratos
Ratos alimentados com uma
dieta padrão e com uma
dieta enriquecida com AGPI-
CL ómega-3. Os animais
foram submetidos a stresses
simples e combinados
Urina RMN ACP;
PLS
Lipoproteínas,
triglicerídeos, aminoácidos,
glicose, lactato, creatina,
citrato, acetil-
glicoproteinas, 3-D-
hidroxibutirato, colina.
a13
Tabela 5 (continuação) – Algumas investigações relatadas em publicações com aplicação de abordagens metabolómicas holísticas.
Ref. Contexto Modelo Desenho Biofluídos Aquisição de dados
Análise de dados Metabolitos relevantes
Van Dorsten, 2006
(94)
Efeitos do consumo de chá
preto e de chá verde no
metabolismo humano
17 Indivíduos
masculinos
saudáveis
17 indivíduos masculinos
saudáveis consumiram chá
verde, chá preto ou cafeína
tomada como placebo num
estudo randomizado,
cruzado
Urina,
plasma
sanguíneo
RMM
Análise
estatística
multivariada
Ácido hipurico, 1,3-
dihidroxifenil-2-O-sulfato,
piruvato, oxaloacetato,
citrato, lipoproteínas,
glicose, acetato. Lactato,
alanina, acetato, �-
hidroxibutirato
Wang, 2005 (95)
Estudo de respostas
biológicas humanas à
ingestão de chá de camomila
40 indivíduos
masculinos e
femininos
3 fases / 2 semanas:
período de controlo, período
de dosagem com ingestão
diária de 200 ml de
camomila, período pós
dosagem. Não foram
aplicadas restrições
alimentares e foi recolhida a
informação alimentar da
noite e da manhã anteriores
à recolha da urina
Urina 1H RMN; ACP; RCP
Criatinina; glicina,
hipurato; metabolito
aromático não
identificado.
a14
Tabela 5 (continuação) – Algumas investigações relatadas em publicações com aplicação de abordagens metabolómicas holísticas.
Ref. Contexto Modelo Desenho Biofluídos
Aquisição
de dados
Análise de
dados Metabolitos relevantes
,(59)
Caracterização dos efeitos
metabólicos de dietas
vegetarianas, baixas em
carne e elevadas em carne
20 homens
saudáveis
Estudo crossover, indivíduos
alimentados com as 3
dietas.
Urina RMN ACP;
PLS
Carne: �creatinina, creatina,
carnitina, TMAO, taurina, e
1- e 3-metilhistidina.
Vegetariana: p-
hidroxifenilacetato
Lenz, 2004 (58).
Diferenças metabólicas
significativas entre dietas à
base de peixe e dietas baixas
em glicídeos, derivadas de
populações suecas e
britânicas, respectivamente
Homens e
mulheres
Britânicos;
Homens e
mulheres
Suecos
2 estudos distintos: o
primeiro com Britânicos e o
segundo com Britânicos e
Suecos. As amostras
recolhidas correspondiam à
primeira urina da manhã de
cada indivíduo, numa única
ocasião.
Urina 1H RMN;
urina ACP
Suecos: TMAO;
Britânicos: taurina (devido à
dieta Atkins)
Rezzi, 2007 (65)
Avaliação do metaboloma
associado a preferências
alimentares específicas,
exemplificadas pelo consumo
de chocolate em humanos
22 voluntários
saudáveis
masculinos
Indivíduos estratificados
segundo os seus hábitos de
consumo de chocolate com
um questionário desenhado
especificamente, numa
experiencia duplamente
cruzada com a duração de
uma semana com grupo
controlo
Plasma
sanguíneo e
urina
RMN Estatística
multivariada
“desejo por chocolate”:
3-hidroxisovalerato, citrato,
dimetilglicina, glicina,
fenilacetilglutamina, 4-
hidroxifenilacetato;
“indiferentes ao chocolate”:
Isobutirato, 2-metilsuccinato,
trimetilamina, N-acetil-
carnitina, carnitna, taurina, 2-
hidroxipurato, trigonelina.
a15
Tabela 5 (continuação) – Algumas investigações relatadas em publicações com aplicação de abordagens metabolómicas holísticas.
Ref. Contexto Modelo Desenho Biofluídos Aquisição de dados
Análise de dados Metabolitos relevantes
Kochhar, 2006 (96)
Caracterizar as assinaturas metabólicas relacionadas com o género, IMC para um melhor entendimento do papel destas variáveis confundidoras em experiencias
150 humanos saudáveis
Todos os voluntários preencheram questionários sobre saúde e estilo de vida, registaram género e idade. Foram excluídos: indivíduos com doenças agudas (pirexia, gripe ou constipação), em tratamento com antibióticos ou anti-inflamatórios e mulheres grávidas. A recolha de amostras de sangue e urina das mulheres foi realizada entre o 10º e o 15º dia do ciclo menstrual.
Urina e plasma
1H RMN Estatística multivariada
Lipoproteínas, lipídeos insaturados; citrato;
Abreviaturas: IMC – Índice de Massa Corporal; ACP – Análise de Componentes; PLS – Regressão multivariada dos mínimos quadrados parciais; VLDL –
lipoproteínas de muito baixa densidade; TMAO – óxido de trimetilamina.
a16
ANEXO 9
Figura 4 – Retirada de van Ommen, 2008. “Espaço de saúde” tal como é definido pelos perfis
metabólicos. Este plano bi-dimensional (teórico) é criado por ACP de todos os parâmetros
metabólicos afectados pelo estado de micronutrientes. Um “fenótipo nutricional” produz um perfil
de metaboloma concentrado à volta do centro do plano, enquanto os extremos são representados
por estados de doença em que os micronutrientes intervêm. Conceptualmente, estes estão
organizados em efeitos metabólicos, efeitos inflamatórios, efeitos na oxidação e efeitos no ciclo
celular. Os fenótipos relacionados com a nutrição (como a obesidade) mostram diferenças subtis
do “saudável”; baixos níveis de suplementação de micronutrientes (por exemplo o folato)
demonstram uma mudança para fora do estado de saúde; ao mesmo tempo pode ser visualizado
um genótipo específico.
a17
ANEXO 10
Tabela 6 – Análise das Forças, Fraquezas, Oportunidades e Ameaças da Metabolómica
Nutricional
FORÇAS
� Plataformas analíticas robustas e estáveis;
� Excelente reprodutibilidade analítica e
biológica;
� Minimamente invasiva;
� Possibilidade de estudos exploratórios;
� Parâmetros metabólicos quantificáveis reais;
� Descoberta de biomarcadores holísticos;
� Integração de todo o sistema;
� Baixo custo por amostra/ metabolito;
� Caracterização do fenótipo nutricional.
OPORTUNIDADES
� Mais experiencia em estudos com sistemas
mamíferos (por exemplo: vias metabólicas);
� Potencial de integração das “ómicas”;
� Melhorias nas ferramentas analíticas;
� Avanços na análise de dados metabolómicos;
� Novos recursos bioinformáticos;
� Criação e disponibilização de bases de dados;
� Completar o metaboloma humano;
� Descoberta de biomarcadores;
� Definição do fenótipo nutricional;
� Compreensão da variedade inter-individual;
� Miniaturização e monitorização remota das
estratégias analíticas de medição de
metabolitos.
FRAQUEZAS
� Plataformas analíticas múltiplas;
� Sensibilidade analítica;
� Intervalos dinâmicos analíticos;
� Desequilíbrio entre precisão e amplitude das
medições de metabolitos;
� Complexidade e quantidade dos dados
obtidos;
� Efeitos de confundimento associados à MN;
� Os métodos ainda não estão padronizados;
� Necessário um organismo para atender às
necessidades formativas;
� Alto custo de capital.
AMEAÇAS
� Cepticismo quanto a estudos não orientados
para a hipótese (estudos abertos)
� Conservacionismo (abordagem “um composto
quantificado por análise”)
� Insuficiência de cientistas com elevado nível de
formação na área;
� Envolvimento de cientistas de várias áreas.
