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Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 1 piastra- 96 72561 5 piastre - 480 72562

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Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2

1 piastra- 96 72561 5 piastre - 480 72562

KIT DI SCREENING COMBINATO PER ANTICORPI ANTI-HCV E ANTIGENE VIRALE DEL VIRUS DELL'EPATITE C IN SIERO O PLASMA UMANO UTILIZZANDO UNA TECNICA DI IMMUNODOSAGGIO ENZIMATICO

862219 – 2013/09

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INDICE

1. USO PREVISTO .................................................................................................................. 52. RIEPILOGO E ILLUSTRAZIONE DEL TEST ................................................................. 53. PRINCIPI DELLA PROCEDURA ...................................................................................... 54. REAGENTI ........................................................................................................................... 65. AVVERTIMENTI E PRECAUZIONI .................................................................................. 76. CAMPIONI .......................................................................................................................... 107. PROCEDURA .................................................................................................................... 108. LIMITAZIONE DEL TEST ................................................................................................ 139. CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI ............................................................... 1410. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI ...................................................................................... 16

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1. USO PREVISTOMonolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 è un immunodosaggio enzimatico qualitativo per la determinazione dell'infezione da virus dell'epatite C (HCV) basato sulla rilevazione di anticorpi anti-HCV e antigene del capside nel siero o nel plasma umano. Il test di screening dell'epatite C può essere impiegato da laboratori diagnostici e banche del sangue.

2. RIEPILOGO E ILLUSTRAZIONE DEL TESTIl virus dell'epatite C (HCV) è un virus a senso positivo con involucro dell'RNA (9,5 kb) appartenente alla famiglia delle Flaviviridae, di cui sono stati identificati i sei principali genotipi. L'HCV è riconosciuto come causa principale dell'epatite virale non A e non B. L'infezione da HCV è caratterizzata da forma acuta e cronica che può condurre a cirrosi e carcinoma epatocellulare. Le evidenze sierologiche dell'infezione da HCV sono ottenibili tramite esami del sangue per eseguire lo screening di antigeni dell'HCV e/o anticorpi e/o RNA. Rispetto al test per lo screening dei soli anticorpi anti-HCV, l'impiego del test per lo screening combinato di anticorpi anti-HCV e antigene del capside dell'HCV può ridurre il periodo della finestra sierologica e migliorare la determinazione dell'infezione.

3. PRINCIPI DELLA PROCEDURAMonolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 si basa sull'impiego di una fase solida preparata con antigeni purificati: due proteine ricombinanti della regione non strutturale (NS3 e NS4) e un peptide della regione strutturale (capside) del virus dell'epatite C, e un anticorpo monoclonale contro il capside dell'epatite C. La fase liquida comprende due coniugati. Il primo coniugato (R6) consiste in un anticorpo monoclonale biotinilato di topo contro il capside dell'epatite C. Tale anticorpo monoclonale non reagisce con il peptide del capside impiegato nella fase solida. Il secondo coniugato (R7) è una miscela di anticorpi IgG anti-umani marcati con perossidasi di topo e streptavidina marcata con perossidasi.

La procedura di dosaggio comprende le seguenti fasi della reazione: 1) Il coniugato 1, i campioni da testare e i sieri di controllo sono distribuiti nei pozzetti della micropiastra.

Gli eventuali anticorpi per HVC saranno legati agli antigeni fissati nella fase solida. In presenza diantigene del capside dell'epatite C, tale antigene sarà legato dagli anticorpi monoclonali rivestiti nellafase solida e dagli anticorpi monoclonali biotinilati contro l'antigene del capside dell'epatite C(coniugato 1).

2) Dopo l'incubazione a 37°C per 90 minuti e la fase di lavaggio, si aggiungono il coniugato 2 contenenteanticorpi IgG anti-umani marcati con perossidasi e la streptavidina marcata con perossidasi a ognipozzetto della micropiastra. In presenza di IgG umana che abbia reagito con la fase solida, ilconiugato IgG anti-umano si lega con gli anticorpi umani Il coniugato di perossidasi/streptavidina silega alla biotina del coniugato 1, se nel campione è presente un antigene del capside dell'HCV.

3) Dopo 30 minuti di incubazione a 37°C, viene rimosso il coniugato enzimatico non legato tramite lafase di lavaggio e la presenza dei complessi di perossidasi dell'anticorpo dell'antigene vieneindividuata con l'aggiunta del substrato.

4) Dopo 30 minuti di incubazione a temperatura di laboratorio (18 - 30°C), all'interruzione della reazione,si rileva la lettura dello spettrometro a 450/620-700 nm. L'assorbanza misurata per un campioneconsente di rilevare la presenza o l'assenza di anticorpi HCV e/o di antigeni del capside dell'epatite Cnel campione. L'intensità cromatica è proporzionata alla quantità di anticorpi HCV e/o antigene delcapside dell'epatite C nella fase solida.

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4. REAGENTI 4.1. Descrizione

Identificazione sull'etichetta Descrizione

Presentazione Preparazione

72561

Presentazione Preparazione

72562

R1 MICROPLATE

Micropiastra 12 strip da 8 pozzetti ciascuna, rivestite da anticorpo monoclonale anti-capside del VHC, antigeni purificati ricombinanti dell'epatite C (NS3, NS4) e un peptide del capside dell'HCV. Numero ID specifico = 93

1 piastra Pronto per

l'uso

5 piastre Pronto per

l'uso

R2

CONCENTRATED WASHING SOLUTION

(20X)

Soluzione di lavaggio concentrata (20x) Tampone Tris NaCl pH 7,4 Conservante: ProClin™ 300 (0,04%)

1 fiala 70 ml

Da diluire

1 fiala 235 ml

Da diluire

R3 NEGATIVE CONTROL

Controllo negativo Tampone Tris HCI, contenente BSA (Siero di albumina bovina); Conservante: ProClin™ 300 (0,1%)

1 fiala 1 ml

Pronto per l'uso

1 fiala 1 ml

Pronto per l'uso

R4 POSITIVE CONTROL

Controllo positivo Siero umano contenente anticorpi dell'HCV, negativo all'antigene dell'HB e per anticorpi anti HIV-1 e anti HIV-2 diluiti in un tampone Tris HCI contenente BSA, e attivato fotochimicamente. Conservante: ProClin™ 300 (0,1%)

1 fiala 1,5 ml

Pronto per l'uso

1 fiala 3 ml

Pronto per l'uso

R5a ANTIGEN POSITIVE CONTROL

Controllo positivo antigene Controllo positivo antigene sintetico contenente un peptide del capside liofilizzato.

1 fiala q.s. ad 1 ml

Da ricostituire

1 fiala q.s. ad 1 ml

Da ricostituire

R5b ANTIGEN DILUENT

Diluente di R5a Acqua distillata contenente conservante: ProClin™ 300 (0,5 %)

1 fiala 1 ml

Da ricostituire

1 fiala 1 ml

Da ricostituire

R6 CONJUGATE 1

Coniugato 1 Anticorpi monoclonali biotinilati di topo contro antigene del capside dell'HCV. Colore porpora Conservante: Azoturo di sodio (< 0,1%), Cosmocil®

1 fiala 15 ml

CQ (0,025%)

Pronto per l'uso

2 fiale 2 x 30 ml

Pronto per l'uso

R7 CONJUGATE 2

Coniugato 2 Anticorpi di topo diretti contro IgG umana/perossidasi e streptavidina/perossidasi. Colore verde. Conservante: ProClin™ 300 (0,5 %)

1 fiala 15 ml

Pronto per l'uso

2 fiale 2 x 30 ml

Pronto per l'uso

R8 SUBSTRATE BUFFER

Substrato Soluzione di acido citrico e acetato di sodio, pH 4,0, contenente H2O2

1 fiala 60 ml

(0,015%) e dimetilsolfossido (DMSO) Da ricostituire

2 fiale 2 x 60 ml

Da ricostituire

7

4%

R9 CHROMOGEN:

TMB SOLUTION (11X)

Cromogeno: Soluzione TMB Soluzione contenente 3,3’, 5,5’ tetrametilbenzidina (TMB)

1 fiala 5 ml

Da diluire

2 fiale 2 x 5 ml

Da diluire

R10 STOPPING SOLUTION

Soluzione bloccante Soluzione di acido solforico (H2SO4

1 fiala 28 ml

1N) Pronto per

l'uso

3 fiale 3 x 28 ml

Pronto per l'uso

4.2. Condizioni di conservazione e manipolazione Conservare il kit a +2-8°C. Ogni articolo del kit conservato a +2-8°C può essere utilizzato fino dalla data di scadenza riportata sulla confezione (fatto salvo laddove diversamente indicato). Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, i reagenti R2, R3, R4, R6, R7, R8, R9 e R10 conservati a 2-8°C possono essere utilizzati fino alla data di scadenza riportata sulla confezione.

Identificazione Conservazione

R1 Dopo l'apertura del sacchetto sotto-vuoto, le strip del micropozzetto conservate a +2-8°C possono essere utilizzate per 1 mese nella confezione originale accuratamente risigillata.

R2 La soluzione di lavaggio distillata può essere conservata a +2-30°C per 2 settimane. La soluzione di lavaggio concentrata (R2) può essere conservata a +2-30°C.

R5a + R5b Dopo la ricostituzione, la soluzione di lavoro di controllo positivo antigene (R5) può essere conservata per 1 mese a +2-8°C e 2 mesi a -20°C (fino a 5 cicli di congelamento/scongelamento dopo il congelamento a -20°C).

R8 + R9 Dopo la ricostituzione, i reagenti conservati al buio possono essere utilizzati per 6 ore a temperatura ambiente (18-30°C).

5. AVVERTIMENTI E PRECAUZIONI Per l'uso diagnostico in vitro da parte di un operatore sanitario.

5.1. Precauzioni per la salute e la sicurezza • Questo kit di test deve essere maneggiato esclusivamente da personale adeguatamente addestrato

e qualificato nelle procedure di laboratorio e cosciente dei potenziali rischi connessi. Indossare abbigliamento protettivo, guanti, protezioni per occhi/viso adeguati e manipolare gli oggetti in maniera appropriata nel rispetto della buona pratica di laboratorio.

• Il kit contiene componenti ematici umani. Il materiale di origine umana nella preparazione di

reagente R4 (controllo positivo) è stato testato e risultato non reattivo all'antigene di superficie dell'epatite B (HBs Ag) e agli anticorpi dei virus dell'immunodeficienza umana (HIV-1 e HIV-2 Ab) e positivo agli anticorpi anti-HCV. Il controllo positivo R4 è inattivato tramite riscaldamento. Nessun metodo di test conosciuto è in grado di garantire con assoluta certezza l'assenza di agenti infettivi. Tutti gli emoderivati umani, i reagenti e i campioni umani, pertanto, devono essere manipolati con la consapevolezza che si tratta di sostanze in grado di trasmettere malattie infettive ed è necessario seguire le precauzioni generali per gli agenti patogeni ematici raccomandate nel rispetto di tutte le normative locali, regionali e nazionali.

• Versamenti biologici: I versamenti di materiale di origine umana devono essere trattati come

sostanze potenzialmente infettive. I versamenti non contenenti sostanze acide devono essere immediatamente decontaminati e asciugati. A questo scopo, disinfettare l'area in cui è avvenuto il versamento, i materiali ed eventuali

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superfici o apparecchiature contaminate utilizzando un disinfettante chimico appropriato efficace per i materiali a potenziale rischio biologico relativi ai campioni coinvolti (generalmente, una diluizione 1:10 di candeggina per uso domestico, 70-80% di etanolo o isopropanolo, uno iodoforo allo 0,5% quale Wescodyne™ Plus, ecc.). I versamenti contenenti sostanze acide devono essere adeguatamente assorbiti (asciugati con un panno) o neutralizzati, l'area deve essere lavata con acqua e asciugata; il materiale utilizzato per assorbire il versamento può richiedere lo smaltimento come rifiuto a rischio biologico. L'area deve essere quindi decontaminata con un disinfettante chimico.

NOTA: Non collocare le soluzioni contenenti candeggina in autoclave.

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• Procedere allo smaltimento di tutti i campioni e i materiali utilizzati per l'esecuzione del test come potenzialmente infetti. I rifiuti di laboratorio, chimici o a rischio biologico devono essere manipolati e smaltiti nel rispetto di tutte le normative locali, regionali e nazionali.

• Per le raccomandazioni su precauzioni e rischi correlati ad alcuni componenti chimici del presente

kit, consultare i simboli riportati sulle etichette e le informazioni fornite alla fine delle istruzioni per l'uso. La scheda di sicurezza è disponibile all'indirizzo www.bio-rad.com.

5.2. Precauzioni relative al protocollo 5.2.1. Preparazione

L'affidabilità dei risultati dipende dalla corretta implementazione delle seguenti pratiche di laboratorio corrette.

• Non utilizzare reagenti scaduti. • Non mescolare, né unire reagenti appartenenti a numeri di lotto differenti all'interno di un unico ciclo. • Prima dell'uso attendere 30 minuti che i reagenti si stabilizzino a temperatura ambiente (18-30°C). • La denominazione del test e il numero di identificazione specifico del test stesso sono riportati sul

telaio di ogni micropiastra. Questo numero di identificazione specifico è indicato anche su ogni strip. Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2: Numero ID specifico = 93

Verificare il numero di identificazione specifico prima dell'uso. Qualora il numero di identificazione risulti mancante o diverso dal numero indicato corrispondente al dosaggio da testare, la strip non dovrà essere utilizzata.

NOTA: Per la soluzione di lavaggio (R2, identificazione etichetta: colore verde 20X), tampone di substrato di perossidasi (R8, identificazione etichetta: tampone TMB, colore blu), cromogeno (R9, identificazione etichetta: TMB 11X, color porpora) e soluzione bloccante (R10, identificazione etichetta: 1N colore rosso), è possibile utilizzare lotti diversi da quelli contenuti nel kit, fermo restando che venga utilizzato lo stesso lotto all'interno di un determinato ciclo di test. Tali reagenti possono essere utilizzati con altre procedure della nostra azienda. Contattare l'assistenza tecnica per informazioni dettagliate.

• Ricostituire con cura i reagenti evitando eventuali contaminazioni. • Utilizzare preferibilmente materiale monouso oppure vetreria perfettamente lavata e asciugata con

acqua deionizzata. • Non far asciugare la micropiastra nell'intervallo compreso fra la fine dell'operazione di lavaggio e la

distribuzione del reagente. • La reazione enzimatica è particolarmente sensibile agli ioni metallici. Di conseguenza, evitare che

eventuali elementi di metallo entrino a contatto con le varie soluzioni contenenti coniugato o substrato.

• La soluzione di sviluppo (tampone substrato + cromogeno) deve essere di colore rosa. La variazione del colore rosa entro pochi minuti dalla ricostituzione indica che il reagente non può essere utilizzato e deve essere sostituito. La soluzione di sviluppo può essere preparata in un contenitore di vetro o in un vassoio di plastica monouso pre-lavato con 1N HCl, risciacquato accuratamente con acqua distillata e asciugato. Il reagente deve essere conservato al buio.

• Non utilizzare mai lo stesso contenitore per distribuire il coniugato e la soluzione di sviluppo.

5.2.2. Elaborazione

• Non modificare la procedura di dosaggio. • Non eseguire il test in presenza di vapori reattivi (vapori acidi, alcalini e di aldeide) o polvere

potenzialmente in grado di alterare l'attività enzimatica del coniugato. • Utilizzare una nuova distribuzione per ciascun campione. • Il lavaggio del pozzetto è una fase essenziale della procedura: attenersi al numero di cicli di lavaggio

raccomandato e assicurarsi che tutti i pozzetti, una volta riempiti, vengano completamente svuotati. Un lavaggio inadeguato può condurre a risultati inesatti.

• Seguire attentamente le procedure di lavaggio descritte per ottimizzare le prestazioni del test. Con alcuni strumenti, potrebbe essere necessario ottimizzare la procedura di lavaggio (aumento del

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numero di cicli della fase di lavaggio e/o del volume di tamponi di lavaggio per ogni ciclo) per ottenere un livello accettabile di sfondo OD per il campione negativo.

• Per gli adattamenti e le procedure speciali contattare l'azienda.

6. CAMPIONI Prelevare un campione di sangue secondo le pratiche correnti. Il test dovrà essere eseguito su plasma o siero non diluito (prelevato da EDTA, citrato di sodio o ACD). Si sconsiglia di utilizzare un campione prelevato dalle provette contenenti eparinato di litio. È stato riscontrato un segnale inferiore sui campioni risultati positivi al test per l'antigene HCV. I campioni contenenti aggregati devono essere chiarificati tramite centrifugazione prima del test. Aggregati o particelle di fibrina sospese possono produrre falsi positivi. Il campione sarà conservato a +2-8°C se il test viene eseguito entro 7 giorni oppure può essere surgelato a -20°C. Non ripetere più di 3 cicli di congelamento/scongelamento. I campioni devono essere scongelati a temperatura ambiente (18-30°C). Si consiglia di omogeneizzarli capovolgendoli prima dell'uso. I campioni contenenti fino a 120 g/l di albumina, 50 µg/l di biotina e 200 mg/l di bilirubina, i campioni contenenti fino a 33 g/l di trioleina e i campioni contenenti fino a 2 g/l di emoglobina non compromettono i risultati. Si sconsiglia tuttavia di utilizzare campioni iperemolizzati e iperlipemici contaminati. Si raccomanda di non riscaldare i campioni in quanto ciò potrebbe ridurre in modo significativo la rilevazione dell'antigene HCV. Per essere spediti, i campioni devono essere confezionati in conformità con le disposizioni vigenti in materia di trasporto di agenti eziologici e trasportati preferibilmente congelati.

7. PROCEDURA 7.1. Materiali necessari ma non forniti

• Acqua distillata. • Ipocloruro di sodio (candeggina per uso domestico) e bicarbonato di sodio. • Carta assorbente. • Pellicole adesive. • Guanti monouso. • Occhiali di sicurezza. • Provette monouso. • Pipette o multipipette automatiche o semi-automatiche, regolabili o preimpostate per misurare e

dispensare 50 μl, 80 μl, 100 μl, 200 μl e 1 ml. • Cilindri graduati da 10 ml, 200 ml e 1.000 ml. Miscelatore vortex. • Sistema di lavaggio automatico, semi-automatico o manuale per micropiastre. • Bagno d'acqua o incubatore per micropiastre equivalente, dotato di termostato impostato a 37°C ±

1°C (*). • Contenitore per rifiuti biologici potenzialmente pericolosi.. • Lettore di micropiastre dotato di filtri 450, 490 nm e 620-700 nm (*).

(*) Per informazioni dettagliate sull'apparecchiatura raccomandata, consultare il nostro reparto tecnico.

7.2. Preparazione dei reagenti 7.2.1. Reagenti pronti all'uso

Reagente 1 (R1): Micropiastra Ogni supporto del telaio contenente 12 strip è avvolto in un sacchetto di alluminio laminato sigillato. Tagliare il sacchetto con le forbici o un bisturi da 0,5 a 1 cm sopra la sigillatura. Aprire il sacchetto ed estrarre il telaio. Riporre le strip inutilizzate nel sacchetto. Chiudere con cura il sacchetto e conservarlo a +2-8°C. Reagente 6 (R6): Coniugato 1

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Omogeneizzare capovolgendo prima dell'uso. Reagente 7 (R7): Coniugato 2 Omogeneizzare capovolgendo prima dell'uso.

7.2.2. Reagenti per ricostituire

Reagente 2 (R2): Soluzione di lavaggio concentrata (20x) Diluire 1:20 in acqua distillata per ottenere una soluzione di lavaggio pronta all'uso. Preparare 800 ml per una piastra di 12 strip. Reagente 8 (R8) + Reagente 9 (R9): Soluzione di sviluppo dell'enzima Diluire 1:11 il cromogeno (R9) nel tampone di substrato (per es. 1 ml di reagente R9 + 10 ml di reagente R8) poiché 10 ml sono necessari e sufficienti a trattare 12 strip. Omogeneizzare. Reagente 5a (R5a) + Reagente 5b (R5b): Soluzione di lavoro (R5). Versare il contenuto di diluente R5b nella fiala di Ag R5 liofilizzato. Richiudere la fiala e lasciare decantare per 10 minuti a temperatura ambiente (18-30°C) agitando e capovolgendo la fiala periodicamente per favorire lo scioglimento.

7.3. Procedura di dosaggio Attenersi rigorosamente alla procedura. Utilizzare sieri di controllo negativo e positivo per ogni test al fine di confermarne la qualità. Attenersi alle pratiche di laboratorio corrette di seguito riportate: 1) Determinare attentamente il piano di identificazione e distribuzione del campione. 2) Preparare la soluzione di lavaggio diluita R2 e la soluzione di lavoro di controllo positivo

dell'antigene (R5a + R5b). (fare riferimento al § 7.2) 3) Estrarre il telaio di supporto e il numero di strip necessarie (R1) dalla confezione protettiva.

Riporre le strip inutilizzate nella confezione. Chiudere la confezione e riporla a +2-8°C. 4) Distribuire nel pozzetto nel seguente ordine (distribuzione consigliabile sulla piastra):

• 100 μl di coniugato 1 (R6) in ogni pozzetto, quindi • 50 μl di controllo negativo (R3) nel pozzetto A1, • 50 μl di controllo positivo (R4) nei pozzetti B1, C1, D1, • 50 μl di soluzione di lavoro di controllo positivo dell'antigene (R5a + R5b) nel pozzetto

E1, • 50 μl del primo campione nel pozzetto F1, • 50 μl del secondo campione in G1, ecc.

Omogeneizzare la miscela con almeno 3 aspirazioni o con un agitatore per micropiastre per 5 secondi. Se la distribuzione dei campioni richiede più di 10 minuti, si consiglia di distribuire i controlli positivi e negativi dopo i campioni da testare. A seconda del sistema impiegato, non è possibile modificare la posizione dei controlli o l'ordine di distribuzione.

NOTA: dopo la distribuzione, il pozzetto contenente il campione (o i controlli) passa da porpora a blu. È possibile verificare la presenza del (campione + coniugato 1) nei pozzetti tramite lettura spettrometrica a 620 nm (fare riferimento al § 7.7). 5) Se possibile, coprire la piastra con una nuova pellicola adesiva. 6) Incubare la micropiastra per 90 minuti (± 5 min.) a 37°C ± 1°C. 7) Se necessario, rimuovere la pellicola adesiva. Aspirare il contenuto dei pozzetti in un contenitore

per rifiuti liquidi e aggiungere almeno 370 µl di soluzione di lavaggio in ogni pozzetto. Aspirare nuovamente e ripetere il lavaggio almeno 5 volte. Il volume residuo deve essere inferiore a 10 μl (se necessario, asciugare le strip capovolgendole su carta assorbente). Se si dispone di un sistema di lavaggio automatico, seguire lo stesso ciclo operativo.

8) Distribuire rapidamente 100 μl di soluzione di coniugato 2 (R7) in ogni pozzetto nella piastra. Il coniugato deve essere agitato con delicatezza prima dell'uso. Coprire, se possibile, con una nuova pellicola adesiva e incubare per 30 minuti (± 5 min.) a 37°C ± 1°C.

NOTA: il coniugato è di colore verde. È possibile verificare la presenza del coniugato nei pozzetti tramite lettura spettrometrica a 620 nm (fare riferimento al § 7.7).

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9) Rimuovere la pellicola adesiva, svuotare tutti i pozzetti tramite aspirazione e lavare almeno 5

volte come descritto sopra. 10) Preparare una soluzione di sviluppo dell'enzima (reagente R8 + R9). 11) Distribuire rapidamente 80 μl di soluzione di sviluppo dell'enzima preparato (R8 + R9) in tutti i

pozzetti. Far sviluppare la reazione al buio per 30 minuti (± 5 minuti) a temperatura ambiente (18 - 30°C). Non utilizzare pellicole adesive durante questo periodo di incubazione.

NOTA: in questa fase della manipolazione si può controllare visivamente la distribuzione della soluzione di sviluppo, di colore rosa. Vi è una netta differenza di colorazione tra un pozzetto vuoto e un pozzetto contenente la soluzione di substrato rosa. (Fare riferimento al § 7.7) 12) Aggiungere 100 μl della soluzione bloccante (R10) utilizzando la stessa sequenza e la stessa

percentuale di distribuzione della soluzione di sviluppo.

NOTA: in questa fase di manipolazione si può controllare visivamente la distribuzione della soluzione bloccante incolore. Il colore del substrato, rosa (per i campioni negativi) o blu (per quelli positivi), sbiadisce dai pozzetti che diventano incolori (per i campioni negativi) o gialli (per quelli positivi) dopo l'aggiunta della soluzione bloccante. 13) Asciugare accuratamente il fondo di ogni piastra. Attendere almeno 4 minuti dopo l'aggiunta

della soluzione bloccante ed entro 30 minuti dal blocco della reazione, leggere la densità ottica a 450/620-700 nm con un lettore per piastre.

14) Verificare la corrispondenza tra lettura spettrofotometrica e visiva e rispetto al piano di identificazione e distribuzione di piastra e campione.

7.4. Controllo qualità Utilizzare i controlli positivi (R4 e R5) e il controllo negativo (R3) a ogni esecuzione del test per confermare il dosaggio. (Fare riferimento a §7.5)

7.5. Criteri di validazione del test Il test è confermato se le condizioni seguenti sono rispettate:

1) Per il controllo negativo R3: Il valore di assorbanza misurata deve essere inferiore al 60% del cut-off: O.D. < cut-off x 0,6

2) Per il controllo positivo degli anticorpi R4: 0,800 ≤ O.D. medio R4 ≤ 2.700 Se uno dei singoli valori del controllo positivo R4 differisce di oltre il 30% dal valore medio, ignorare il valore e ripetere il calcolo con i due valori di controllo positivi restanti.

3) Per la soluzione di lavoro R5:

O.D. > 0,500

7.6. Calcolo/Interpretazione dei risultati Il cut-off si determina con il controllo positivo R4: Calcolare il valore dell'assorbanza media misurata per il controllo positivo R4. Calcolare il valore di cut-off:

OD medio R4 CO = --------------------- 5

La presenza o l'assenza di anticorpi anti-HCV e/o di antigene del capside si determina confrontando l'assorbanza registrata con il valore di cut-off calcolato per ogni campione. Per ogni campione si calcola il seguente rapporto:

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Rapporto = OD del campione/Valore CO I campioni con densità ottica inferiore al valore di cut-off sono ritenuti negativi (rapporto < 1) da Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2. I risultati immediatamente inferiori al valore di cut-off (CO-10 % < O.D. < CO, rapporto tra 0,9 e 1) dovranno tuttavia essere interpretati con cautela. È consigliabile ritestare in duplicato i campioni corrispondenti quando consentito da sistemi e procedure di laboratorio. I campioni con densità ottica maggiore o uguale al cut-off (rapporto ≥ 1) sono considerati inizialmente positivi da Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2. Dovranno essere ritestati in duplicato prima dell'interpretazione finale. Se, dopo la ripetizione del test, il valore del rapporto di almeno uno dei 2 duplicati risulta maggiore o uguale a 1, il risultato iniziale è ripetibile e il campione è dichiarato positivo con Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2. I valori del rapporto dei 2 duplicati sono inferiori a 1, il risultato iniziale non è ripetibile e il campione è dichiarato negativo. I campioni ritestati due volte e risultati negativi con Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2, ma con un valore prossimo al valore di cut-off (rapporto tra 0,9 e 1) dovranno essere considerati con cautela. È consigliabile ritestare il paziente con un altro metodo o un altro campione. In caso di densità ottica molto bassa dei campioni testati (OD negativo) e quando si controlla la presenza di campioni e reagente, i risultati possono essere interpretati come negativi. Si consiglia di confermare i campioni positivi seguendo le attuali raccomandazioni nazionali e gli algoritmi.

7.7. Verifica spettrometrica del pipettaggio di campione e coniugato (facoltativa) Verifica del pipettaggio di campione e coniugato 1 (R6) È possibile verificare la presenza di coniugato 1 (R6) + campione nel pozzetto tramite lettura automatica a 620 nm. Ogni pozzetto contenente campione e coniugato 1 (R6) deve avere OD maggiore di 0,800. NOTA: dopo l'aggiunta del campione, il coniugato 1 (R6) passa da porpora a blu. Verifica del pipettaggio di coniugato 2 (R7) Il coniugato 2 (R7) è di colore verde. È possibile verificare la presenza di coniugato 2 (R7) nei pozzetti tramite lettura automatica a 620 nm: Il valore OD di ogni pozzetto deve essere superiore a 0,300 (un valore inferiore a questo indica normalmente una scarsa dispensazione del coniugato). Verifica del pipettaggio di soluzione di sviluppo È possibile verificare la presenza di soluzione di sviluppo rosa nel pozzetto tramite lettura automatica a 490 nm. Un pozzetto con soluzione di sviluppo deve avere una densità ottica superiore a 0,100 (un OD inferiore indica una scarsa dispensazione della soluzione di sviluppo). Si verifica una variazione cromatica significativa dei pozzetti vuoti da incolore a rosa dopo l'aggiunta della soluzione di cromogeno del substrato preparata.

8. LIMITAZIONE DEL TEST Date le diverse risposte immunologiche dei pazienti affetti dal virus dell'epatite C (soprattutto durante le sieroconversioni), si possono osservare alcune differenze di rilevazione tra test in base al tipo di proteine antigeniche impiegate. Un risultato negativo durante un test di screening non esclude quindi la possibilità di esposizione o infezione da virus dell'epatite C. Secondo la letteratura, i portatori di HCV sottoposti a trattamento di immunosoppressione o con coinfezione da HIV-HCV possono presentare livelli di anticorpi particolarmente bassi, sotto il limite di rilevazione dei test HCV. Qualsiasi tecnica ELISA può produrre reazioni con falsi positivi. Si consiglia di verificare la specificità della reazione di qualsiasi campione risultato positivo ripetibile, secondo i criteri di interpretazione del kit Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 kit, applicando un metodo idoneo: impiegare separatamente un test di screening degli anticorpi anti-HCV ELISA con test di rilevazione degli anticorpi anti-HCV immunoblot per

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dimostrare la presenza di anticorpi anti-HCV. Se necessario, utilizzare un test di biologia molecolare per lo screening del genoma HCV. Il metodo colorimetrico di verifica della deposizione di campioni e/o coniugati e/o soluzione di sviluppo non consente un controllo preciso dei volumi distribuiti e rivela soltanto la presenza del campione e/o dei coniugati e/o della soluzione di sviluppo. La percentuale di risposte errate con questo metodo è strettamente associata alla precisione del sistema utilizzato (coefficiente cumulativo di variazione di distribuzione e lettura superiore al 10% riducono notevolmente la qualità della verifica). L'impiego del test Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 non è approvato per gruppi di campioni o campioni diluiti. Eccezionalmente, si possono rilevare particelle fini nel diluente campione (R6), la cui presenza non altera comunque la qualità del reagente.

9. CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI 9.1. Misurazione di precisione

La riproducibilità e la precisione intermedia sono state determinate utilizzando campioni con diverse concentrazioni di anticorpi anti-HCV e antigeni HCV. I campioni sono stati testati 30 volte durante la stessa serie di test per determinare la ripetibilità. La precisione intermedia è stata valutata testando i campioni in duplicato ogni 20 giorni in 2 cicli indipendenti ogni giorno. Sono stati calcolati medie dei rapporti, deviazioni standard e coefficienti di variazione (CV).

9.1.1. Ripetibilità

Campioni N Media dei rapporti

Deviazione standard CV %

Negativo S1 30 0,23 0,024 10,4

Positivo antigene

HCV

S2 30 1,21 0,048 4,0 S3 30 1,43 0,053 3,7 S6 30 7,18 0,166 2,3

Positivo anticorpi anti-HCV

S4 30 1,42 0,046 3,2 S5 30 1,35 0,083 6,1 S7 30 6,73 0,153 2,3

I CV ottenuti su 6 campioni positivi sono <10%. 9.1.2. Precisione intermedia

Campioni N Media

dei rapporti

Intra-dosaggio

Inter-dosaggio/operatore In giornata Riproducibilità

totale

DS CV % DS CV % DS CV

% DS CV %

Negativo S1 80 0,22 0,017 7,5 0,028 12,5 0,029 12,7 0,043 19,4

Positivo antigene

HCV

S2bis 80 2,80 0,143 5,1 0,277 9,9 0,283 10,1 0,421 15,0 S3 80 1,56 0,124 7,9 0,129 8,2 0,083 5.3 0,197 12,6 S6 68 6,69 0,500 7,5 0,621 9,3 0,557 8,3 0,973 14,5

Positivo anticorpi anti-HCV

S4 80 1,57 0,062 3,9 0,125 8,0 0* N/A 0,140 8,9 S5 80 1,75 0,075 4,3 0,164 9,3 0* N/A 0,181 10,3 S7 80 7,69 0,285 3,7 0,531 6,9 0* N/A 0,603 7,8

*: Il valore negativo della varianza è stato stimato a 0.

I CV ottenuti su 6 campioni positivi non sono superiori al 15%.

9.2. Prestazioni cliniche Le prestazioni di Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 sono state determinate testando i campioni di donatori di sangue casuali , pazienti ricoverati, pazienti con infezioni acute e croniche da virus dell'epatite C e

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pazienti con sintomi non associati all'infezione da virus dell'epatite C. Gli studi si sono svolti presso 2 sedi di donatori di sangue, un nosocomio e un sito Bio-Rad.

9.2.1. Specificità diagnostica

Lo studio è stato svolto su campioni di siero e plasma EDTA prelevati presso 2 centri di donazione su donatori casuali. È stato inoltre eseguito uno studio di specificità sui campioni dei pazienti ricoverati. Tutti i campioni sono stati sottoposti a test anti-HCV con marcatura CE.

Popolazione Struttura Tipo di campione Numero

Campioni reattivi ripetuti

(RR) Specificità

(%) Intervallo di

confidenza 95%

Donatori di sangue

#1 siero 537 1 536/537

plasma 2002 0 2002/2002

#2 siero 2638 2 2636/2638

#1 + #2 5177 3 99,94% 5174/5177 99,83% – 99,99%

Pazienti ricoverati #3 siero 502 1 99,80%

501/502 98,92% – 100,00%

*: 3 donatori risultati indeterminati con il test di riferimento sono stati esclusi dai calcoli

9.2.2. Sensibilità diagnostica

La sensibilità diagnostica è stata studiata su 575 campioni di pazienti affetti da virus dell'epatite C. Tra questi campioni, 25 provenivano da pazienti campionati nelle 24 ore precedenti all'analisi. Sono stati testati 481 diversi campioni genotipizzati (1; 2; 3; 4; 5; 6).

Tabella 1: Genotipi testati

Genotipi 1 2 3 4 5 6 Total

e (1, 1a, 1b, 1a/b) (2 2a/c, 2a, 2b, 2b/3 (3, 3a, 3b, 3c) (4, 4a, 4a/c, 4a/c/d,

4c, 4e, 4h, 4n, 4r) (5, 5a) (6, 6a, 6a/b, 6n)

N 241 56 107 63 8 6 481

La sensibilità diagnostica di tutti i campioni testati è pari al 100% (575/575) con un intervallo di confidenza del 95% di [99,4-100,0].

Campioni di pazienti con infezione acuta: 39 gruppi di sieroconversione (10 profili di capside, 10 profili NS3 e 19 profili multipli) sono stati testati con dosaggio Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 e confrontati con un dosaggio combinato di antigeni/anticorpi e con un dosaggio di anticorpi anti-HCV entrambi con marcatura CE. In tutti i gruppi si è ottenuta una rilevazione precoce. Di questi 39 gruppi, uno non è stato rilevato da Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 e tre non sono stati rilevati dal dosaggio combinato Ag-Ab assunto come confronto. Dei 38 gruppi rilevati da Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2, 5 hanno registrato una rilevazione precoce, 27 una rilevazione equivalente e 6 una rilevazione tardiva rispetto al dosaggio combinato Ag-Ab. Rispetto a un test con anticorpi anti-HCV, 28 gruppi hanno registrato una rilevazione precoce, 9 una rilevazione equivalente e 1 una rilevazione tardiva.

Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 contro dosaggio combinato Ag-Ab

HCV Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2

contro dosaggio Anti-HCV

Numero di gruppi 38 38

Rilevazione precoce 5 28

Rilevazione equivalente 27 9

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Rilevazione tardiva 6 1

9.3. Specificità analitica / studio di reattività incrociata 365 campioni potenzialmente interferenti contenenti anticorpi contro patogeni che potrebbero provocare patologie infettive (Citomegalovirus, virus di Epstein Barr, VZV, virus del morbillo, virus della rosolia, virus della parotite, virus dell'herpes, virus dell'influenza, virus dell'epatite A, virus dell'epatite B, HIV 1/2, HTLV 1/2, sifilide, Toxoplasma gondii, Dengue, Chagas), campioni del gruppo a rischio (pazienti dializzati, affetti da cirrosi non epatica, donne in gravidanza, donne pluripare) o campioni di pazienti con disturbi del sistema immunitario (autoanticorpi, fattori reumatoidi, anticorpi anti-topo e mielomi) sono stati testati con Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 test. Due campioni sono risultati ripetutamente positivi con il test Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2. La specificità osservata in questa popolazione target pari al 99,45% (363/365) era simile alla specificità dei campioni clinici.

9.4. Effetto gancio È stata studiata l'esistenza di un possibile effetto gancio testando 5 campioni con titoli alti a varie diluizioni. L'equivalenza di risultati osservati tra i campioni diluiti e non diluiti mostra l'assenza dell'effetto gancio.

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Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare 92430 Marnes-la-Coquette - Francia Tel.: +33 (0) 1 47 95 60 00 2013/09 Fax: +33 (0) 1 47 41 91 33 862219 www.bio-rad.com